JPH04360683A - 融合タンパク質及びそれから成る免疫測定試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、融合タンパク質及びそ
れから成る免疫測定試薬に関する。

【０００２】

【従来の技術】特定の生体物質の検出及び測定は臨床検
査等の分野で非常に重要である。

【０００３】従来より、生体物質の検出方法として、そ
の物質の活性を直接測定する方法の他、抗原抗体反応を
利用した免疫測定法が広く行われている。免疫測定法に
おいては、抗原又は抗体を何らかの方法で標識する必要
がある。従来、このような標識方法として、１２５　Ｉ
等のＲＩ（ラジオアイソトープ）で標識する方法や、ホ
ースラディッシュパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）やβ−ガ
ラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）等の酵素で標識する方法
が多く採用されている。特に、最近では、大がかりな設
備を必要とせず、放射能の被爆のおそれもない酵素免疫
分析が広く行われるようになってきた。

【０００４】従来の酵素免疫分析においては、標識酵素
を抗原又は抗体等のタンパク質に化学的に結合させてい
る。この化学的結合は、例えばマレイミド法、グルタル
アルデヒド法、過ヨウ素酸法等により行なわれていた。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、タンパ
ク質に酵素を後から結合させる方法においては、精製し
たタンパク質の純度が問題となり、また、酵素と結合し
たタンパク質と酵素と結合しなかったタンパク質との分
離が不十分になるおそれがあるため測定の精度が不十分
になるおそれがある。また、酵素とタンパク質との結合
のため、タンパク質または酵素自体の活性が低下するお
それがある。さらに、酵素とタンパク質とを常に一定の
割合で結合させることが困難であるため、測定の再現性
が劣る場合もある。

【０００６】本発明は、上述した問題点を解決するため
なされたものであり、タンパク質としての活性及び酵素
としての活性の双方を有する融合タンパク質を提供する
ことを目的とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、鋭意研究
の結果、酵素をコードする遺伝子と、特定の活性を有す
るタンパク質をコードする遺伝子とから成る融合遺伝子
を発現させることによって、酵素活性を有する酵素部分
と、抗体又は抗原に対する特異的結合活性を有する部分
を含む融合タンパク質を得ることに成功し、本発明を完
成した。

【０００８】すなわち、本発明は、酵素活性を有するペ
プチドから成る酵素部分と、抗体又は抗原との特異的結
合活性を有するペプチドから成る特定ペプチド部分を含
む融合タンパク質を提供する。

【０００９】以下、本発明を詳細に説明する。

【００１０】本発明の融合タンパク質における特定ペプ
チド部分は、抗体又は抗原との特異的結合活性である。 なお、特定ペプチド部分は、特異的結合活性を発揮する
のに必要な部分のみを含んでおれば足り、必ずしも、全
分子を含んでいる必要はない。例えば、ペプチドが抗原
である場合、その抗原のうち、抗体と特異的に結合する
部分、すなわち、エピトープが含まれておればよく、必
ずしも抗原の全分子が融合タンパク質に含まれる必要は
ない。むしろ、特定ペプチド部分の大きさが大きくなる
と、融合タンパク質中で特異的結合活性を示さないこと
があるので、特異的結合活性の発揮に必要な部分だけを
融合タンパク質に含めることが好ましい。特異的結合活
性の発揮に必要な部分は、後述の実施例に記載するよう
に、例えば、複数の制限酵素でタンパク質をコードする
遺伝子を異なる部位で切断し、それぞれの遺伝子断片を
クローニングしてその遺伝子産物が当該特異的結合活性
を発揮するか否かを調べることによりその位置を限定す
ることができる。

【００１１】なお、特異的結合活性は２以上あってもよ
く、例えば、２以上の物質に対する特異的結合能であっ
てもよい。また、必要ならば、融合タンパク質は２以上
の特定ペプチド部分を含むことも可能である。

【００１２】本発明の融合タンパク質に含まれる酵素部
分は、酵素活性を有するペプチド部分である。酵素活性
は、標識として利用できるものならばいずれのものであ
ってもよく、例えば、従来から酵素免疫分析に利用され
ている、ＨＲＰ、β−ｇａｌ、ＧＯＴ、ＡＬＰ等である
。酵素部分も、上記特定ペプチド部分と同様に、酵素活
性を発揮し得るならば、必ずしも全酵素分子が含まれて
いる必要はない。

【００１３】本発明の融合タンパク質は、上記酵素部分
をコードする遺伝子と、上記特定ペプチド部分をコード
する遺伝子とが実質的に連続的に連結された融合遺伝子
を発現することにより製造することができる。ここで、
両遺伝子を実質的に連続するように連結するとは、両遺
伝子のオープンリーディングフレームをそろえて両遺伝
子が単一の構造遺伝子を構成するように連結されている
ことを意味する。融合タンパク質中で、酵素部分及び特
定ペプチド部分がそれぞれ所定の活性を維持し得るなら
ば、両遺伝子の間には、他のアミノ酸配列をコードする
塩基配列が介在していてもよい。もっとも、このような
配列が長くなると、酵素部分及び特定ペプチド部分の活
性が失われることがあるので、このような介在配列はな
るべく短いことが好ましく、可能な場合には上記両遺伝
子を直接連結することが好ましい。両遺伝子のオープン
リーディングフレームをそろえて結合することは、両遺
伝子がコードするペプチドのアミノ酸配列がわかってい
るときには常法により容易に行うことができる。特定ペ
プチドのアミノ酸配列が不明の場合でも、オープンリー
ディングフレームは３種類しか存在しないので、ルーチ
ンの実験を行うことにより、両遺伝子のオープンリーデ
ィングフレームをそろえて結合することが可能である。 両遺伝子の連結は、一方の遺伝子を適当なクローニング
ベクターのクローニングサイトに挿入した後、他方の遺
伝子を先に挿入した遺伝子の上流又は下流にオープンリ
ーディングフレームをそろえて挿入することにより行う
ことができ、個々の操作は常法により行うことができる
。なお、クローニングベクターは市販のものを用いるこ
とができる。

【００１４】このようにしてクローニングベクター中で
連結された融合遺伝子は、該ベクターで大腸菌等の宿主
を形質転換し、該宿主中で融合遺伝子を発現させること
により、本発明の融合タンパク質を製造することができ
る。形質転換や宿主中での発現等の個々の操作は常法に
より行うことができる。

【００１５】本発明の融合タンパク質は、標識として利
用できる酵素活性を有する酵素部分を含んでいるので、
免疫測定試薬として用いることができる。すなわち、従
来から用いられているこれらと標識酵素との化学的結合
物と同様な態様で免疫測定試薬として用いることができ
る。

【００１６】

【発明の効果】本発明の融合タンパク質は、酵素部分と
特定ペプチド部分を含む単一のタンパク質であるので、
従来技術における、化学的に標識酵素と特定のタンパク
質を結合した場合のように、標識酵素や特定タンパク質
の活性が化学的結合により低下するおそれがない。また
、生成した特定タンパク質の純度が低下したり、酵素と
結合したタンパク質と結合しなかったタンパク質との分
離が不十分になるおそれもない。さらに、融合タンパク
質中には常に一定の比率（通常モル比で１：１）で酵素
部分と特定ペプチド部分が含まれるので、従来のように
、酵素とタンパク質との結合比率の再現性の問題も生じ
ない。従って、本発明の融合タンパク質は、従来のタン
パク質と標識酵素の化学的結合物よりも安定した測定を
可能にする優れた免疫測定試薬を与える。

【００１７】

【実施例】以下、本発明の実施例を説明するが、本発明
はこれに限定されるものではない。

【００１８】尚、各操作は、特に断らない限り、ティー
・マニアティスら、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ　”Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、１９
８２の記載に基づいて行った。 実施例１ ガラクトース転移酵素（ＧＡＴ）のｃＤＮＡクローンＵ
Ｇ−８６０１による発現タンパク質におけるモノクロー
ナル抗体の認識部位の決定

【００１９】ＧＡＴのｃＤＮＡクローンＵＧ−８６０１
の下流側の塩基配列を欠失させたクローンを調製した。 調製したクローンの挿入遺伝子の大きさ各々以下のとう
りであった。 クローン１　　　　　　　　　　４５０塩基クローン２
　　　　　　　　　　１８０塩基クローン３　　　　　
　　　　　１２０塩基クローン４　　　　　　　　　　
　　９９塩基クローン５　　　　　　　　　　　　９０
塩基この操作は具体的には次のように行った。エキソヌ
クレアーゼＩＩＩ　とＭｕｎｇ　Ｂｅａｎヌクレアーゼ
を用いたデレーションミュータント作成法にもとずき（
Ｈｅｎｉｋｏｆｆ．Ｓ．（１９８４）　Ｇｅｎｅ，２８
，３５１−３５９）　ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　に挿入
されたＵＧ−８６０１　を下流側より欠失させることに
よって作成した。

【００２０】そして、これらの各クローンを大腸菌に導
入し、上記ＧＡＴ遺伝子又はその一部分を発現させた。

【００２１】これらのクローンが導入された大腸菌が産
生するペプチドがＧＡＴの特異的結合活性を有するか否
かを認識エピトープが互いに異なる抗ＧＡＴモノクロー
ナル抗体であるＭＡｂ８５１３（微工研菌寄託第１１２
１９号）びＭＡｂ８６２８（微工研菌寄託１１２２１号
）を用いたサンドイッチ法によって測定した。尚、前記
ＵＧ−８６０１はこれらＭａｂ８５１３及びＭａｂ８６
２８と特異的に反応するペプチド配列をコ−ドするＤＮ
Ａが挿入されたベクタ−を含むクロ−ンＤＮＡであり、
平成２年１１月１４日に本出願人によって出願された「
新規ＤＮＡ及びそれを含む組換えベクター」と題する特
許出願に記載されており、それを含む大腸菌は微工研菌
寄第１１７７６号として微工研に寄託されている。 なお、上記サンドイッチ法はより具体的には次のように
行った。ＥＬＩＳＡ　プレート（９６穴）に１０ｍｇ／
ｍｌ　のＭＡｂ８５１３／ＰＢＳを用いて、抗体を固相
化し、ＢＳＡ（１％）によるブロッキングの後、サンプ
ルを室温にて１時間インキュベーションした。二次抗体
としてＨＲＰでラベルしたＭＡｂ８６２８を用い　、ｏ
−フェニレンジアミンにて発色、検出した。また、対照
として、上記クローンを挿入しなかった（表１において
ｗｉｌｄという）を用いて同様の操作を行った。

【００２２】結果を表１に示す。 −；抗原活性なし ＋＋；抗原活性有り ＋＋＋　；抗原活性有り（強い）

【００２３】表１から明らかなように、上流側より１２
０塩基以上の大きさのクローンを挿入した大腸菌からの
みＧＡＴの抗原部位が産生されている。この結果、ＵＧ
−８６０１のモノクローナル抗体の認識部分はＵＧ−８
６０１の上流側より１２０番目の塩基部分までに存在す
ることが明らかになった。

【００２４】実施例２　　β−ｇａｌ遺伝子及び欠失さ
せたＵＧ−８６０１の導入と発現 実施例１において調製したクローン１乃至３の挿入遺伝
子とβ−ｇａｌ遺伝子を市販のベクターであるプラスミ
ドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　及びプラスミドｐＵＣ１８
　に挿入した。挿入はこれらのベクターのマルチクロー
ニング部位を利用して行ない、これらの遺伝子がコード
するペプチドが１つの融合タンパクを構成するように、
これらの遺伝子が実質的に連続するように挿入した。こ
の操作は具体的には以下のように行った。すなわち実施
例（１）で作成したクローン１、２、３、をＥｃｏＲＩ
　−Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ　部位で切り出し、これをｐＢｌ
ｕｅｓｃｒｉｐｔ　及びｐＵＣ１８　のＥｃｏＲＩ　−
Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ　部位に挿入することで挿入ｃＤＮＡ
及びベクター由来のβ−ｇａｌ遺伝子を正しい方向でか
つリーディングフレームを合わせることができる。そし
て、これらの大腸菌に導入された融合遺伝子をＩＰＴＧ
処理によって大腸菌に発現させた。

【００２５】そして、これらの大腸菌が産生するタンパ
ク質のβ−ｇａｌとしての活性（β−ｇａｌ活性）を以
下の方法により測定した。すなわち、２．３ｍＭ　　Ｏ
ＮＰＧ（ｏ−ニトロフェニル−　β−ｏ−ガラクトピラ
ノシド）を基質とし、１ｍＭ　　ＭｇＣｌ２　を含むリ
ン酸バッファー中で、３７℃でインキュベーションし、
４１０ｎｍの吸光度を測定することによって行った。ま
たサンプルは大腸菌のライセートからＭＡｂ８６２８を
固相化したゲルによって集めた発現タンパク質を用いた
。

【００２６】また、対照として、β−ｇａｌ遺伝子のみ
を挿入した大腸菌（表２においてｗｉｌｄという）を用
いて同様の操作を行った。結果を表２に示す。 −：β−ｇａｌ活性なし（バックグラウンド・レベル）
＋＋：β−ｇａｌ活性有り

【００２７】表２から明らかなように、ベクターとして
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　を用いて挿入したクローン２
のみがβ−ｇａｌ活性を有する融合タンパク質を発現さ
せることができた。尚、この融合タンパク質をβ−ＵＧ
２と命名した。

【００２８】実施例３　　競合法によるβ−ＵＧ２のＧ
ＡＴ活性の測定

【００２９】ＥＬＩＳＡ法用９６穴プレートの各ウェル
に１μｇ／ｍｌの抗ＧＡＴモノクローナル抗体ＭＡｂ８
５１３を固定化し、このモノクローナル抗体を２％ＢＳ
Ａ／ＰＢＳ溶液を用いてブロッキングした。

【００３０】そして、精製されたβ−ＵＧ２を１００ｎ
ｇ／ｍｌの濃度になるように１％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液に
溶解し、さらに、この溶液に既知量のＧＡＴを含むサン
プルを添加した。そして、この溶液を前記ＥＬＩＳＡ法
用９６穴プレート上で室温２時間インキュベートした。

【００３１】インキュベート終了後、プレートを洗浄し
た。そして、Ｍｇ２＋を含むＰＢＳ溶液中で、β−ｇａ
ｌの基質であるＯＮＰＧを添加し、４０５ｎｍにおける
吸光度を測定した。尚、このＯＮＰＧはβ−ｇａｌと反
応することにより発色する発色性基質である。

【００３２】結果を第１図に示す。第１図に示されるよ
うに、ＧＡＴの添加量が増加するに従って吸光度が低下
している。このことはβ−ＵＧ２とＧＡＴが競合的にＭ
Ａｂ８５１３に結合したことを示すものである。以上の
結果から、β−ＵＧ２はＧＡＴの対応抗体に対する特異
的結合活性も有することが明らかになった。

【００３３】また、実施例２及び実施例３の結果を総合
して勘案すると、β−ＵＧ２はβ−ｇａｌ活性及びＧＡ
Ｔの特異的結合活性の双方を有することが明らかになっ
た。

【００３４】

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の融合タンパク質を用いた競合法におけ
るＧＡＴの添加量に対する吸光度の変化を示す図。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】酵素活性を有するペプチドから成る酵素部
   分と、抗体又は抗原との特異的結合活性を有するペプチ
   ドから成る特定ペプチド部分を含む融合タンパク質。
2. 【請求項２】前記酵素部分をコードする遺伝子と、前記
   特定ペプチド部分をコードする遺伝子とが実質的に連続
   的に連結された融合遺伝子を発現させることにより製造
   された請求項１に記載の融合タンパク質。
3. 【請求項３】前記酵素部分がβ−ガラクトシダーゼ、前
   記特定ペプチド部分がガラクトース転移酵素の抗原部位
   である請求項１又は２記載の融合タンパク質。
4. 【請求項４】請求項１ないし３のいずれか１項に記載の
   融合タンパク質から成る免疫測定試薬。