JP2011507488A5 - - Google Patents

Claims (38)

1. タンデムリピートの数によって変化する複数の対立遺伝子を有することが既知である所与の多型部位における標的ポリヌクレオチド中のタンデムリピートの数を同時に決定するための方法であって、
   (a)標的ポリヌクレオチド中のタンデムリピートの2個以上が一本鎖形態である標的ポリヌクレオチドを含有する試料を提供するステップ、
   (a1)ブロッキングオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション後に、標的ポリヌクレオチド中のタンデムリピートの1個または複数が一本鎖形態のままであるように、ステップ(a)で提供される標的ポリヌクレオチド中の少なくとも1個であるがすべてではないタンデムリピートにブロッキングオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせるステップ、
   (b)標識プローブオリゴヌクレオチドを標的ポリヌクレオチドの一本鎖部分にハイブリダイズするステップであって、標的ポリヌクレオチドの一本鎖部分において、プローブオリゴヌクレオチドが前記タンデムリピートの少なくとも1個に相補的であり、かつプローブオリゴヌクレオチドの少なくとも5個のヌクレオチドが前記タンデムリピートに相補的であり、プローブオリゴヌクレオチドがその融解温度(Tm)によって標的ポリヌクレオチドの一本鎖部分中のタンデムリピートの異なる数を識別できるようにするものであり、かつプローブオリゴヌクレオチドが前記ポリヌクレオチドの一本鎖部分中の少なくとも1個のタンデムリピートに完全にまたは部分的に相補的であるステップ、および
   (c)標的ポリヌクレオチドの一本鎖部分へのプローブオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションおよびその融解温度に基づいて標的ポリヌクレオチド中のタンデムリピートの数を同時に決定するステップ
   を含む方法。
2. 標的ポリヌクレオチドがDNAである、請求項1に記載の方法。
3. ステップ(c)における決定が融解曲線分析を使用する、請求項1に記載の方法。
4. ステップ(a)において、標的ポリヌクレオチド中のタンデムリピートの3個以上が一本鎖形態である、請求項1から3のいずれかに記載の方法。
5. ステップ(b)において、プローブオリゴヌクレオチドが、標的ポリヌクレオチドの一本鎖部分中のタンデムリピートの少なくとも2個もしくは少なくとも3個に相補的である、請求項1から4のいずれかに一項に記載の方法。
6. ステップ(a)において、タンデムリピートを含有する標的ポリヌクレオチドの一本鎖部分が少なくとも8個、もしくは少なくとも16個のヌクレオチドを含有する、請求項1から5のいずれかに記載の方法。
7. ステップ(a1)において、ブロッキングオリゴヌクレオチドが標的ポリヌクレオチドの一本鎖部分中のタンデムリピートの少なくとも2個、もしくは少なくとも3個にハイブリダイズする、請求項1に記載の方法。
8. ステップ(a1)において、ブロッキングオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション後にタンデムリピートの2個以上、もしくは3個以上が一本鎖形態のままである、請求項1に記載の方法。
9. ステップ(a1)において、ブロッキングオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション後に標的ポリヌクレオチド中のタンデムリピートの1個または複数が一本鎖形態のままであるように、2つ以上のブロッキングオリゴヌクレオチドがステップ(a)において提供されるタンデムリピートの少なくとも1個であるがすべてではないタンデムリピートにハイブリダイズされる、請求項1に記載の方法。
10. ブロッキングオリゴヌクレオチドの1つまたは複数がタンデムリピートの一部の数にハイブリダイズする、請求項9に記載の方法。
11. ステップ(a)における試料が増幅反応中または増幅反応後に生成される、請求項1から10のいずれかに記載の方法であって、増幅反応がPCRを含む方法。
12. プローブオリゴヌクレオチドが蛍光標識されている、請求項1から11のいずれかに記載の方法。
13. ブロッキングオリゴヌクレオチドが標的ポリヌクレオチド中の少なくとも1個のタンデムリピートに完全に相補的である、または標的ポリヌクレオチド中の少なくとも1個のタンデムリピートに部分的に相補的である、請求項1に記載の方法。
14. ステップ(a)において、標的ポリヌクレオチド中のタンデムリピートに隣接する一方または両方の領域が一本鎖形態である、請求項1から13のいずれか一項に記載の方法。
15. ステップ(b)におけるプローブオリゴヌクレオチドが、タンデムリピートに隣接する標的ポリヌクレオチド中の領域に相補的であるアンカー部分を含有する、請求項14に記載の方法。
16. ステップ(a)において、標的ポリヌクレオチド中のタンデムリピートに隣接する一方または両方の領域が一本鎖形態であり、かつブロッキングオリゴヌクレオチドがタンデムリピートに隣接する領域に相補的であるアンカー部分を含有する、請求項1に記載の方法。
17. ステップ(b)におけるプローブオリゴヌクレオチドが、ブロッキングオリゴヌクレオチドのアンカー部分に相補的ではないタンデムリピートに隣接する領域に相補的であるアンカー部分を含有する、請求項16に記載の方法。
18. ブロッキングオリゴヌクレオチドが、プローブオリゴヌクレオチドの5'(または3')末端のクランプ部分に相補的であるクランプ部分をその3'(または5')末端に含有し、ブロッキングオリゴヌクレオチドとプローブオリゴヌクレオチドとの各対のそれぞれのクランプ部分が相互に相補的である、ブロッキングオリゴヌクレオチドとプローブオリゴヌクレオチドとの少なくとも2つの異なる対が使用される、請求項1に記載の方法。
19. 相補的クランプ部分の各対が異なるTmを有するように、クランプ部分のヌクレオチド配列が選択される、請求項18に記載の方法。
20. ステップ(a)と(a1)とが同時に実施される、請求項1に記載の方法。
21. PCRが標的DNA(ポリヌクレオチド)を生成し、標的DNA中のタンデムリピートの2個以上が一本鎖形態であり、かつPCRにおいて使用されるプライマーがブロッキングオリゴヌクレオチドも含む、請求項20に記載の方法。
22. プライマーが、3'末端にタンデムリピートの3'である標的DNA中の領域に相補的である部分を含み、かつ5'末端に前記プライマーによって合成されるPCR産物の鎖中の少なくとも1個のタンデムリピートに相補的である部分を含む、請求項21に記載の方法。
23. プライマーが、3'から5'に、(i)タンデムリピートの3'である標的DNA中の領域に相補的である部分、(ii)任意選択で、スペーサー部分、(iii)前記プライマーによって合成されるPCR産物の鎖中のタンデムリピートに隣接する領域に相補的であるアンカー部分、および(iv)前記プライマーによって合成されるPCR産物の鎖中の少なくとも1個のタンデムリピートに相補的である部分を含む、請求項22に記載の方法。
24. プライマーが(v)プローブオリゴヌクレオチドの3'末端のクランプ部分に相補的であるクランプ部分をさらに含む、請求項23に記載の方法。
25. ブロッキングオリゴヌクレオチドとプローブオリゴヌクレオチドとの各対のそれぞれのクランプ部分が相互に相補的であるPCRプライマーとプローブオリゴヌクレオチドとの少なくとも2つの異なる対が使用される、請求項23に記載の方法。
26. PCRで使用されるプライマーがプローブオリゴヌクレオチドも含む、請求項21に記載の方法。
27. プライマーが(v)スペーサー部分および(vi)プローブオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項23に記載の方法。
28. プローブオリゴヌクレオチドとタンデムリピートを含有する標的DNAの一本鎖部分との間で形成されるハイブリッドのTmの間における融解温度における差異(ΔTm)が少なくとも0.5℃である、請求項1に記載の方法。
29. ハイブリダイゼーションステップ(b)が、標的ポリヌクレオチドの一本鎖部分とプローブオリゴヌクレオチドとの間で形成される1つまたは複数のハイブリッドの融解点を含む温度範囲に近いまたはそれを超える予め定めた温度で実施される、請求項1から28のいずれかに記載の方法。
30. 標的ポリヌクレオチド中のタンデムリピートの1個または複数が一本鎖形態である、タンデムリピートの数によって変化する複数の対立遺伝子を有することが既知である所与の多型部位における標的ポリヌクレオチド中のタンデムリピートの数を決定するためのシステムであって、
    (a)標的ポリヌクレオチドの一本鎖部分において、タンデムリピートの少なくとも1つに相補的であり、かつプローブオリゴヌクレオチドの少なくとも5個のヌクレオチドがタンデムリピートに相補的であり、プローブオリゴヌクレオチドがその融解温度(Tm)によって標的ポリヌクレオチドの一本鎖部分中のタンデムリピートの異なる数を識別できるようにするものであり、かつプローブオリゴヌクレオチドが、完全にまたは部分的に前記標的ポリヌクレオチドの一本鎖部分中の少なくとも1個のタンデムリピートに相補的である標識プローブオリゴヌクレオチド、
    (b)標的ポリヌクレオチド中のタンデムリピートの少なくとも1個であるがすべてではないタンデムリピートに相補的であるブロッキングオリゴヌクレオチド、
    (c)融解温度を決定するための装置
    を含むシステム。
31. 3'から5'に、(i)タンデムリピートの3'である標的DNA中の領域に相補的である部分、(ii)任意選択で、スペーサー部分、(iii)前記プライマーによって合成されるPCR産物の鎖中のタンデムリピートに隣接する領域に相補的であるアンカー部分、および(iv)前記プライマーによって合成されるPCR産物の鎖中の少なくとも1個のタンデムリピートに相補的である部分を含む、タンデムリピートを含有する標的DNAを増幅するためのPCR反応に関与するためのオリゴヌクレオチドプライマー。
32. (v)スペーサー部分および(vi)プローブオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項31に記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
33. アンカー部分に連結した少なくとも2個のタンデムリピートを含有する部分を含み、標識されたオリゴヌクレオチドであって、アンカー部分の配列および少なくとも2個のタンデムリピートが標的ポリヌクレオチドおよび請求項31に記載のオリゴヌクレオチド中で近接して存在するオリゴヌクレオチドを含む、標的ポリヌクレオチド中のタンデムリピートの数を決定するためのシステム。
34. アンカー部分に連結した少なくとも2個のタンデムリピートを含有する部分を含み、標識されたオリゴヌクレオチドであって、アンカー部分の配列および少なくとも2個のタンデムリピートが3'末端にクランプ部分をさらに含む標的ポリヌクレオチドおよび請求項31に記載のオリゴヌクレオチドプライマー中で近接して存在するオリゴヌクレオチドを含む、(v)お互いに相補的であるクランプ部分をさらに含む標的ポリヌクレオチド中のタンデムリピートの数を決定するためのシステム。
35. 請求項34に記載のオリゴヌクレオチドの2つ以上の対を含み、オリゴヌクレオチドの前記対が相補的クランプ部分を有する、標的ポリヌクレオチド中のタンデムリピートの数を決定するためのシステム。
36. (a)タンデムリピートを含有する標的DNAを選択するステップ、
    (b)タンデムリピートの配列および隣接領域の1個または複数の配列を得るステップ、および
    (c) 3'から5'に、(i)タンデムリピートの3'である標的DNA中の領域に相補的である部分、(ii)任意選択で、スペーサー部分、(iii)前記プライマーによって合成されるPCR産物の鎖中のタンデムリピートに隣接する領域に相補的であるアンカー部分、(iv)前記プライマーによって合成されるPCR産物の鎖中の少なくとも1個のタンデムリピートに相補的である部分、および任意選択で(v)プローブオリゴヌクレオチドの5'(または3')末端のクランプ部分に相補的であるクランプ部分または任意選択で(v)スペーサー部分および(vi)プローブオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを合成するステップ、
    を含む、タンデムリピートを含有する標的DNAを増幅するためのPCR反応に関与するための請求項31または32に記載のオリゴヌクレオチドプライマーを調製するための方法。
37. (a)タンデムリピートを含有する標的DNAを選択するステップ、
    (b)タンデムリピートの配列および隣接領域の1個または複数の配列を得るステップ、
    (c)前記オリゴヌクレオチドを調製するステップ
    を含む、請求項33に記載のシステムを準備する方法。
38. 標的ポリヌクレオチドまたはDNAがヒトゲノムDNAである、請求項1から29、36もしくは37のいずれかに記載の方法、または請求項30、33もしくは35のいずれかに記載のシステム、または請求項31もしくは32に記載のオリゴヌクレオチド。