JP2011507488A - オリゴヌクレオチドおよびその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
(a)標的ポリヌクレオチド中のタンデムリピートの1個または複数が一本鎖形態である、標的ポリヌクレオチドを含有する試料を提供するステップ、
(b)標識プローブオリゴヌクレオチドを標的ポリヌクレオチドの一本鎖部分にハイブリダイズするステップであって、標的ポリヌクレオチドの一本鎖部分について、プローブオリゴヌクレオチドが前記タンデムリピートの少なくとも1個に相補的であり、かつプローブオリゴヌクレオチドの少なくとも5個のヌクレオチドが前記タンデムリピートに相補的であるステップ、および
(c)プローブオリゴヌクレオチドの標的ポリヌクレオチドの一本鎖部分へのハイブリダイゼーションに基づいて標的ポリヌクレオチド中のタンデムリピートの数を決定するステップ
を含む方法を提供する。
(a1)ブロッキングオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション後に、標的ポリヌクレオチド中のタンデムリピートの1個または複数が一本鎖形態のままであるように、ステップ(a)で提供される標的ポリヌクレオチド中のタンデムリピートの少なくとも1個であるがすべてではないタンデムリピートにブロッキングオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせるステップ
を含む。
(a)標的ポリヌクレオチド中の一本鎖部分において、少なくとも1個のタンデムリピートに相補的であり、かつプローブオリゴヌクレオチドの少なくとも5個のヌクレオチドがタンデムリピートに相補的である標識プローブオリゴヌクレオチド、および
(b)標的ポリヌクレオチド中のタンデムリピートの少なくとも1個であるがすべてではないタンデムリピートに相補的であるブロッキングオリゴヌクレオチド
を含むシステムを提供する。
(1)(a)クランプ部分を含有する標識プローブオリゴヌクレオチドおよび(b)相補的なクランプ部分を含有するブロッキングオリゴヌクレオチド、
(2)(a)標識プローブオリゴヌクレオチドおよび(b)上で論じたブロッキングオリゴヌクレオチドを含有するPCRプライマー、
(3)(a)クランプ部分を含有する標識プローブオリゴヌクレオチドおよび(b)上で論じたブロッキングオリゴヌクレオチドおよびクランプ部分含有するPCRプライマー、
(4)上で論じたブロッキングオリゴヌクレオチドおよびプローブオリゴヌクレオチドを含有するPCRプライマー
が挙げられる。
(a)タンデムリピートを含有する標的DNAを選択するステップ、
(b)タンデムリピートの配列および隣接領域の1個または複数の配列を得るステップ、
(c)アンカー部分に連結する少なくとも2個のタンデムリピートを含有する部分を含むオリゴヌクレオチドを合成するステップであって、アンカー部分の配列および少なくとも2個のタンデムリピートが標的DNA中および任意選択でその3'末端のクランプ部分中で近接して存在するステップ
を含む方法も含む。
(a)タンデムリピートを含有する標的DNAを選択するステップ、
(b)タンデムリピートの配列および隣接領域の1個または複数の配列を得るステップ、
(c)3'から5'に、(i)タンデムリピートの3'である標的DNA中の領域に相補的である部分、(ii)任意選択で、スペーサー部分、(iii)前記プライマーによって合成されるPCR産物の鎖中の隣接領域に相補的であるアンカー部分、(iv)前記プライマーによって合成されるPCR産物の鎖中の少なくとも1個のタンデムリピートに相補的である部分、および任意選択で(v)クランプ部分または任意選択で(v)スペーサー部分、および(vi)プローブオリゴヌクレオチド、を含むオリゴヌクレオチドを合成するステップ
を含む方法も含む。
オリゴヌクレオチドプローブの設計および合成
標準的DNAホスホラミダイト、固相支持体および追加的な試薬はLink TechnologiesまたはApplied Biosystems Ltdから購入した。ソラレンC6ホスホラミダイトは、Glen Research Incから購入した。すべてのオリゴヌクレオチドは、Applied Biosystems 394 automated DNA/RNA synthesizerで、酸触媒脱トリチル化、カップリング、キャップ形成およびヨウ素酸化の0.2μmoleホスホラミダイトサイクルを使用して合成した。通常の単量体(A、G、CおよびT)は25秒間、他のすべての単量体は追加的に300秒間カップリングさせた。DMT保護基を有する単量体の段階的カップリング効率および全体としての収量は、トリチル陽イオン伝導率を測定することによって決定し、すべての場合において>98.0%であった。固相支持体からのオリゴヌクレオチドの切断は、濃アンモニア水(33%)中、55℃、5時間、密封したチューブ中で実施した。フルオロフォアをC6 FAM dU(University of Southampton, UK)またはフルオレセインdT(Glen Research, Sterling, VA)のいずれかを使用してプローブ配列中の内部残基に結合させた。C6 FAM dUの場合は、当技術分野において十分に知られているDNA合成法を介して6-カルボキシフルオレセイン(FAM)を、ウラシル塩基の5位に結合させた。本発明のオリゴヌクレオチドは、プローブがリアルタイムPCRアッセイに組み込まれる場合にTaq介在伸長を阻止するための3'-リン酸成分または他のブロッキング剤を有することができる。合成から得られたプローブの量は、一定量のオリゴヌクレオチドプローブを特定の容量の水に溶解するステップおよびUV吸光度を260nmで測定するステップによって決定した。プローブの濃度はオリゴヌクレオチドのUV吸光度および260nmでのその吸光計数から算出した。オリゴヌクレオチドの吸光計数は、それが含む未修飾および蛍光標識のヌクレオシドの個々の吸光計数の合計から算出した。
オリゴヌクレオチドの精製は、Gilson 7.12ソフトウエアで管理したABI Aquapore column(C8)、8mm×250mm、孔径300Åを使用するGilsonシステム上の逆相HPLCによって実施した。以下の工程を使用した:実行時間30分間、流速1分間当たり3mL、二成分系:分による時間(%緩衝液B);0(0);3(0);5(20);22(100);25(100);27(0);30(0)。溶出緩衝液A:0.1M酢酸アンモニウムpH7.0、緩衝液B:25%アセトニトリルを含む0.1M酢酸アンモニウムpH7.0。溶出は、310nm(フルオレセインオリゴマー)または295nm(すべての他のオリゴマー)での紫外線吸光度によってモニターした。HPLC精製後、製造者の説明書を使用して使い捨てNAP10 Sephadex column(Pharmacia)を使用してオリゴヌクレオチドを脱塩し、エッペンドルフチューブに分注し、蒸留脱イオン水中、-20℃で保存した。
PCR容量は典型的には20μlであり、一般に試料2μl、1×QIAGEN PCR緩衝液、0.5μM順方向プライマー、0.1μM逆方向プライマー、Taq HotStarTaqポリメラーゼ1単位、3mM総MgCl2、5ng/μl BSA(Roche Diagnostics)、1mM dNTP(GE Healthcare)および150nMプローブを含む。標的の均一な増幅および検出を、最初の変性反応ステップ(95℃、15分間)に続いて、変性(95℃、5秒間)、プライマーアニーリング(55℃、10秒間)および産物の伸長(72℃、10秒間)を含む50サイクルを使用して標的が増幅される、LightCycler装置(Roche Diagnostics)で実施した。蛍光取得は、各プライマーアニーリングステップの最後に1サイクルごとに1回実施した。融解曲線分析を、LightCycler増幅に続いて直ちに試料を短時間変性(95℃、5秒間)および冷却(35℃、30秒間)し、次に温度変化率0.1℃/秒を使用する35℃から95℃への温度上昇および継続的な蛍光取得によって実施した。融解ピークを、LightCyclerソフトウエア(version 3.5)を使用して温度(x軸)に対して、温度に関する蛍光の負の微分値(y軸に-dF/dT)をプロットするステップによって作図した。標的は、プローブピークの融解温度(Tm)を使用して検出および同定した。
短鎖タンデムリピート(STR)を分析するためのオリゴヌクレオチドプローブの可能性を、一連のオリゴヌクレオチド標的を使用して調べた。5から15回のGATAリピートを含みうるD16S539対立遺伝子を検出および識別するために、3種のプローブを合成した(Table 1(表1))。すべてのプローブは、リピート配列に沿ったプローブの翻訳スリップの可能性を減少させることが見出された5'GGTGアンカー配列を含み、それにより幅広でノイズがある融解ピークの生成を抑制する。アンカーの非存在下でSTRプローブの5'リピートは、標的リピートの任意の1つと、全長および部分的なハイブリダイゼーション事象が生じうるように相互作用できる。リピート配列に直接隣接するアンカー配列は、特定の位置へのプローブのハイブリダイゼーションを促進し、かつDNA翻訳スリップ現象の抑制を助ける。アンカーの安定性および有効性は、主にその長さおよび配列組成によって決定される。不十分な安定性は、ある程度のDNA翻訳スリップを可能にすることがあるが、一方、極端なTmのアンカーは、STR対立遺伝子の識別を妨げる可能性がある。したがって、アンカー配列は、任意の数の位置にあるプローブへの結合よりむしろオリゴヌクレオチドプローブの最初の相同リピートと標的配列の最初のリピートとのハイブリダイゼーションを達成することを助ける。
プローブTmを低下させるためにヌクレオチド不適正塩基対を導入するステップ。不適正塩基対の数は、プローブの長さおよび配列組成ならびに使用される不適正塩基対の種類に依存する。多数の安定な不適正塩基対、G/Tなどは、Tmを減少させるためにプローブの長さに応じて複数のリピート中で使用できる。Tmにおける同程度の減少を達成するためには、より少数の非常に不安定な不適正塩基対、C/Aなどが必要である。プローブの長さに応じて不適正塩基対を分布させるための代替え法は、不適正塩基対をクラスター化することであり、それにより15リピートプローブが例えば5および9リピート成分に分離できるなどのようにオリゴヌクレオチドから1回のリピート全体が除去される。
N4-エチル-dC7-デアザ-dG、7-デアザ-dC、C-5プロピニル-dC、C-5プロピニル-dU、5-メチル-dC、2-アミノ-dA、G-クランプ1(トリサイクリックアミノエチルフェノキザジン2'-dC類似物)、ロックド核酸(LNA)、5'-トリメトキシスチルベンキャップ、5'-ピレンキャップなどの塩基類似物を組み込むステップ。プローブTmを変更するために異なるリピート長の間で観察されたデルタTmをさらに増強し、さまざまなプローブ領域の融解温度全体への寄与をさらに区別するために、そのような類似物を使用してTmを増大させることには利益がありうる。
プローブを個々の成分に分割するためにより長いHEG、TEG(または他の)スペーサーを含ませるステップ。
オリゴヌクレオチドプローブを2つ以上のフルオロフォアで標識。
などの戦略によって達成されうる。
STRF2 CAGATCCCAAGCTCTTCCTCTTCCCTAG (配列番号19)
STRR2 ACGTTTGTGTGTGCATCTGTAAGCATGTATC (配列番号20)
リピート配列は、オリゴヌクレオチドプローブを使用して分析でき、リピートの数は、標的の長さおよびハイブリダイズするプローブの割合によって決定される。60ヌクレオチドを超える長いオリゴヌクレオチドプローブが短鎖タンデムリピートを分析するために必要である。長いリピートの間でのプローブTmにおける差異は、しばしば小さく、特定の対立遺伝子を確実に同定することを妨げる。ΔTmは、プローブの不安定化を介してまたはリピート配列を非蛍光ブロッカーと長さが短縮された蛍光プローブとに分離するステップによって、増強されうる。本明細書において記載する種々のブロッキング戦略は、プローブΔTmならびに多数のリピートを有するD16S539およびTH01対立遺伝子を区別する能力を増強している。本発明の実施例は、それだけに限らないがD19S433およびD18S51を含む他のSTRにも拡大できる。
D8S1179およびD3S1358遺伝子座の両方は(TCTA)nリピート配列を含む。プローブおよびブロッカーは、交差ハイブリダイズし、効果的な標的検出を妨げるか、または誤った結果を生じる。ブロッカーのプライマーへの結合(すなわち単分子ブロッキング)は、交差ハイブリダイゼーションを抑制する。プローブの単分子構築物への結合は、不正確な標的対立遺伝子の検出を抑制する。ハイブリダイゼーションの安定化のためにブロッカーとプローブ成分とを2つの別々の部分に分離するオリゴヌクレオチドスペーサーを、これを達成するために使用する(図16を参照されたい)。
英国において使用されるSGM+遺伝子座は、
D3S1358、VWA、D16S539、D2S1338、D8S1179、D21S11、D18S51、D19S433、THO1 FGA
である。
CSF1PO、FGA、TH01、TPOX、VWA、D3S1358、D5S818、D7S820、D8S1179、D13S317、D16S539、D18S51およびD21S11
である。
Claims (66)
- 標的ポリヌクレオチド中のタンデムリピートの数を決定するための方法であって、
(a)標的ポリヌクレオチド中のタンデムリピートの1個または複数が一本鎖形態である標的ポリヌクレオチドを含有する試料を提供するステップ、
(b)標識プローブオリゴヌクレオチドを標的ポリヌクレオチドの一本鎖部分にハイブリダイズするステップであって、標的ポリヌクレオチドの一本鎖部分において、プローブオリゴヌクレオチドが前記タンデムリピートの少なくとも1個に相補的であり、かつプローブオリゴヌクレオチドの少なくとも5個のヌクレオチドが前記タンデムリピートに相補的であるステップ、および
(c)標的ポリヌクレオチドの一本鎖部分へのプローブオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションに基づいて標的ポリヌクレオチド中のタンデムリピートの数を決定するステップ
を含む方法。 - 標的ポリヌクレオチドがDNAである、請求項1に記載の方法。
- ステップ(a)の後にまたはステップ(a)と共にさらなるステップ
(a1)ブロッキングオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション後に、標的ポリヌクレオチド中のタンデムリピートの1個または複数が一本鎖形態のままであるように、ステップ(a)で提供される標的ポリヌクレオチド中のタンデムリピートの少なくとも1個であるがすべてではないタンデムリピートにブロッキングオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせるステップ
を含む、請求項1または2に記載の方法。 - ステップ(a)において、標的ポリヌクレオチド中のタンデムリピートの2個以上が一本鎖形態である、請求項1から3のいずれかに記載の方法。
- ステップ(a)において、標的ポリヌクレオチド中のタンデムリピートの3個以上が一本鎖形態である、請求項1から4のいずれかに記載の方法。
- ステップ(b)において、プローブオリゴヌクレオチドが標的ポリヌクレオチドの一本鎖部分中のタンデムリピートの少なくとも2個に相補的である、請求項4または5に記載の方法。
- ステップ(b)において、プローブオリゴヌクレオチドが標的ポリヌクレオチドの一本鎖部分中のタンデムリピートの少なくとも3個に相補的である、請求項5に記載の方法。
- ステップ(a)において、タンデムリピートを含有する標的ポリヌクレオチドの一本鎖部分が少なくとも8個のヌクレオチドを含有する、請求項1から7のいずれかに記載の方法。
- ステップ(a)において、タンデムリピートを含有する標的ポリヌクレオチドの一本鎖部分が少なくとも16個のヌクレオチドを含有する、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(b)において、プローブオリゴヌクレオチドが標的ポリヌクレオチドの一本鎖部分に存在するタンデムリピート中の少なくとも8個のヌクレオチドに相補的である、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(b)において、プローブオリゴヌクレオチドが標的ポリヌクレオチドの一本鎖部分に存在するタンデムリピート中の少なくとも16個のヌクレオチドに相補的である、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(a1)において、ブロッキングオリゴヌクレオチドが標的ポリヌクレオチドの一本鎖部分中のタンデムリピートの少なくとも2個にハイブリダイズする、請求項3に記載の方法。
- ステップ(a1)において、ブロッキングオリゴヌクレオチドが標的ポリヌクレオチドの一本鎖部分中のタンデムリピートの少なくとも3個にハイブリダイズする、請求項12に記載の方法。
- ステップ(a1)において、ブロッキングオリゴヌクレオチドが標的ポリヌクレオチドの一本鎖部分中に存在するタンデムリピート中の少なくとも8個のヌクレオチドに相補的である、請求項3に記載の方法。
- ステップ(a1)において、ブロッキングオリゴヌクレオチドが標的ポリヌクレオチドの一本鎖部分中に存在するタンデムリピート中の少なくとも16個のヌクレオチドに相補的である、請求項14に記載の方法。
- ステップ(a1)において、ブロッキングオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション後にタンデムリピートの2個以上が一本鎖形態のままである、請求項3に記載の方法。
- ステップ(a1)において、ブロッキングオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション後にタンデムリピートの3個以上が一本鎖形態のままである、請求項16に記載の方法。
- ステップ(a1)において、ブロッキングオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション後にタンデムリピートの少なくとも8個のヌクレオチドが一本鎖形態のままである、請求項3に記載の方法。
- ステップ(a1)において、ブロッキングオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション後にタンデムリピートの少なくとも16個のヌクレオチドが一本鎖形態のままである、請求項18に記載の方法。
- ステップ(a1)において、ブロッキングオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション後に標的ポリヌクレオチド中のタンデムリピートの1個または複数が一本鎖形態のままであるように、2つ以上のブロッキングオリゴヌクレオチドがステップ(a)において提供されるタンデムリピートの少なくとも1個であるがすべてではないタンデムリピートにハイブリダイズされる、請求項3に記載の方法。
- ブロッキングオリゴヌクレオチドの1つまたは複数がタンデムリピートの一部の数にハイブリダイズする、請求項20に記載の方法
- ステップ(a)における試料が増幅反応中または増幅反応後に生成される、請求項1から21のいずれかに記載の方法。
- 増幅反応がPCRである、請求項22に記載の方法。
- ステップ(a)における試料がゲノムDNAからの増幅によって生成される、請求項22または23に記載の方法。
- ステップ(a)における試料がin vitro転写によって生成される一本鎖標的RNAを含有する、請求項1から21のいずれか一項に記載の方法。
- プローブオリゴヌクレオチドが蛍光標識されている、請求項1から25のいずれかに記載の方法。
- プローブオリゴヌクレオチドがHyBeacon(登録商標)プローブである、請求項26に記載の方法。
- ブロッキングオリゴヌクレオチドがフルオロフォアを含み、かつプローブオリゴヌクレオチドが消光物質を含む、またはその逆である、請求項3に記載の方法。
- プローブオリゴヌクレオチドおよびブロッカーオリゴヌクレオチドが相互にFRETに関与できるフルオロフォアで標識されている、請求項3に記載の方法。
- プローブオリゴヌクレオチドが標的ポリヌクレオチドの一本鎖部分中の少なくとも1個のタンデムリピートに完全に相補的である、請求項1から29のいずれかに記載の方法。
- プローブオリゴヌクレオチドが標的ポリヌクレオチドの一本鎖部分中の少なくとも1個のタンデムリピートに部分的に相補的である、請求項1から27のいずれかに記載の方法。
- ブロッキングオリゴヌクレオチドが標的ポリヌクレオチド中の少なくとも1個のタンデムリピートに完全に相補的である、請求項3に記載の方法。
- ブロッキングオリゴヌクレオチドが標的ポリヌクレオチド中の少なくとも1個のタンデムリピートに部分的に相補的である、請求項3に記載の方法。
- ステップ(a)において、標的ポリヌクレオチド中のタンデムリピートに隣接する一方または両方の領域が一本鎖形態である、請求項1から33のいずれかに記載の方法。
- ステップ(b)におけるプローブオリゴヌクレオチドが、タンデムリピートに隣接する標的ポリヌクレオチド中の領域に相補的であるアンカー部分を含有する、請求項34に記載の方法。
- ステップ(a)において、標的ポリヌクレオチド中のタンデムリピートに隣接する一方または両方の領域が一本鎖形態であり、かつブロッキングオリゴヌクレオチドがタンデムリピートに隣接する領域に相補的であるアンカー部分を含有する、請求項3に記載の方法。
- ステップ(b)におけるプローブオリゴヌクレオチドが、ブロッキングオリゴヌクレオチドのアンカー部分に相補的ではないタンデムリピートに隣接する領域に相補的であるアンカー部分を含有する、請求項36に記載の方法。
- ブロッキングオリゴヌクレオチドが、プローブオリゴヌクレオチドの5'(または3')末端のクランプ部分に相補的であるクランプ部分をその3'(または5')末端に含有する、請求項3に記載の方法。
- ブロッキングオリゴヌクレオチドとプローブオリゴヌクレオチドとの各対のそれぞれのクランプ部分が相互に相補的である、ブロッキングオリゴヌクレオチドとプローブオリゴヌクレオチドとの少なくとも2つの異なる対が使用される、請求項38に記載の方法。
- 相補的クランプ部分の各対が異なるTmを有するように、クランプ部分のヌクレオチド配列が選択される、請求項39に記載の方法。
- ステップ(a)と(a1)とが同時に実施される、請求項3に記載の方法。
- PCRが標的DNA(ポリヌクレオチド)を生成し、標的DNA中のタンデムリピートの1個または複数が一本鎖形態であり、かつPCRにおいて使用されるプライマーがブロッキングオリゴヌクレオチドも含む、請求項41に記載の方法。
- プライマーが、3'末端にタンデムリピートの3'である標的DNA中の領域に相補的である部分を含み、かつ5'末端に前記プライマーによって合成されるPCR産物の鎖中の少なくとも1個のタンデムリピートに相補的である部分を含む、請求項42に記載の方法。
- プライマーが、3'から5'に、(i)タンデムリピートの3'である標的DNA中の領域に相補的である部分、(ii)任意選択で、スペーサー部分、(iii)前記プライマーによって合成されるPCR産物の鎖中の隣接領域に相補的であるアンカー部分、および(iv)前記プライマーによって合成されるPCR産物の鎖中の少なくとも1個のタンデムリピートに相補的である部分を含む、請求項43に記載の方法。
- プライマーが(v)プローブオリゴヌクレオチドの3'末端のクランプ部分に相補的であるクランプ部分をさらに含む、請求項44に記載の方法。
- ブロッキングオリゴヌクレオチドとプローブオリゴヌクレオチドとの各対のそれぞれのクランプ部分が相互に相補的であるPCRプライマーとプローブオリゴヌクレオチドとの少なくとも2つの異なる対が使用される、請求項44に記載の方法。
- クランプ部分のヌクレオチド配列が異なるTmを有する、請求項46に記載の方法。
- PCRで使用されるプライマーがプローブオリゴヌクレオチドも含む、請求項42に記載の方法。
- プライマーが(v)スペーサー部分および(vi)プローブオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項44に記載の方法。
- 標的ポリヌクレオチドの一本鎖部分中のタンデムリピートの数を融解温度(Tm)により識別できるように、プローブオリゴヌクレオチドを選択する、請求項1から49のいずれかに記載の方法。
- プローブオリゴヌクレオチドとタンデムリピートを含有する標的DNAの一本鎖部分との間で形成されるハイブリッドのTmの間における融解温度における差異(ΔTm)が少なくとも0.5℃である、請求項50に記載の方法。
- ハイブリダイゼーションステップ(b)が、標的ポリヌクレオチドの一本鎖部分とプローブオリゴヌクレオチドとの間で形成される1つまたは複数のハイブリッドの融解点を含む温度範囲に近いまたはそれを超える予め定めた温度で実施される、請求項1から51のいずれかに記載の方法。
- 標的ポリヌクレオチド中のタンデムリピートの1個または複数が一本鎖形態である、標的ポリヌクレオチド中のタンデムリピートの数を決定するためのシステムであって、
(a)標的ポリヌクレオチドの一本鎖部分において、タンデムリピートの少なくとも1つに相補的であり、かつプローブオリゴヌクレオチドの少なくとも5個のヌクレオチドがタンデムリピートに相補的である標識プローブオリゴヌクレオチド、
(b)標的ポリヌクレオチド中のタンデムリピートの少なくとも1個であるがすべてではないタンデムリピートに相補的であるブロッキングオリゴヌクレオチド
を含むシステム。 - アンカー部分に連結した少なくとも2個のタンデムリピートを含有する部分を含むオリゴヌクレオチドであって、アンカー部分の配列および少なくとも2個のタンデムリピートが標的ポリヌクレオチド中で近接して存在するオリゴヌクレオチド。
- 3'末端にクランプ部分をさらに含む、請求項54に記載のオリゴヌクレオチド。
- 標識された、請求項54または55に記載のオリゴヌクレオチド。
- 3'から5'に、(i)タンデムリピートの3'である標的DNA中の領域に相補的である部分、(ii)任意選択で、スペーサー部分、(iii)前記プライマーによって合成されるPCR産物の鎖中の隣接領域に相補的であるアンカー部分、および(iv)前記プライマーによって合成されるPCR産物の鎖中の少なくとも1個のタンデムリピートに相補的である部分を含む、タンデムリピートを含有する標的DNAを増幅するためのPCR反応に関与するためのオリゴヌクレオチドプライマー。
- (v)クランプ部分をさらに含む、請求項57に記載のオリゴヌクレオチド。
- (v)スペーサー部分および(vi)プローブオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項57に記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
- 請求項56に記載のオリゴヌクレオチドおよび請求項57に記載のオリゴヌクレオチドを含む、標的ポリヌクレオチド中のタンデムリピートの数を決定するためのシステム。
- クランプ部分が相互に相補的である請求項55に記載のオリゴヌクレオチドおよび請求項58に記載のオリゴヌクレオチドプライマーを含む、標的ポリヌクレオチド中のタンデムリピートの数を決定するためのシステム。
- 請求項55に記載のオリゴヌクレオチドの2つ以上の対および請求項58に記載のオリゴヌクレオチドプライマーを含み、オリゴヌクレオチドの前記対が相補的クランプ部分を有する、請求項61に記載のシステム。
- (a)タンデムリピートを含有する標的DNAを選択するステップ、
(b)タンデムリピートの配列および隣接領域の1個または複数の配列を得るステップ、
(c)アンカー部分に連結した少なくとも2個のタンデムリピートを含有する部分を含むオリゴヌクレオチドを合成するステップであって、アンカー部分の配列および少なくとも2個のタンデムリピートが標的DNA中および任意選択でその3'末端のクランプ部分において近接して存在するステップ
を含む、請求項54または55に記載のオリゴヌクレオチドを調製するための方法。 - (a)タンデムリピートを含有する標的DNAを選択するステップ、
(b)タンデムリピートの配列および隣接領域の1個または複数の配列を得るステップ、
(c) 3'から5'に、(i)タンデムリピートの3'である標的DNA中の領域に相補的である部分、(ii)任意選択で、スペーサー部分、(iii)前記プライマーによって合成されるPCR産物の鎖中の隣接領域に相補的であるアンカー部分、(iv)前記プライマーによって合成されるPCR産物の鎖中の少なくとも1個のタンデムリピートに相補的である部分、および任意選択で(v)クランプ部分または任意選択で(v)スペーサー部分および(vi)プローブオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを合成するステップ、
を含む、タンデムリピートを含有する標的DNAを増幅するためのPCR反応に関与するための請求項57から59のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドプライマーを調製するための方法。 - (a)タンデムリピートを含有する標的DNAを選択するステップ、
(b)タンデムリピートの配列および隣接領域の1個または複数の配列を得るステップ、
(c)オリゴヌクレオチドが標識される請求項63の方法によって請求項54または55に記載のオリゴヌクレオチドを調製するステップ、および請求項64の方法によって請求項57から59のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドを調製するステップ
を含む、請求項60に記載のシステムを準備する方法。 - 標的DNAがヒトゲノムDNAである、請求項1から52もしくは63から65のいずれかに記載の方法、または請求項53もしくは60から62のいずれかに記載のシステム、または請求項54から59のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
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