ES2395240T3

ES2395240T3 - Oligonucleótidos y usos de los mismos

Info

Publication number: ES2395240T3
Application number: ES08842916T
Authority: ES
Inventors: Nittaya Gale; Paul Debenham; David John French; Rebecca Howard; David Gordon Mcdowell; Tom Brown
Original assignee: LGC Ltd
Current assignee: LGC Ltd
Priority date: 2007-10-22
Filing date: 2008-10-21
Publication date: 2013-02-11
Anticipated expiration: 2028-10-21
Also published as: CA2703227C; CN101896623B; JP5604302B2; AU2008315791B2; WO2009053679A1; US20110003290A1; JP2011507488A; PT2217719E; AU2008315791A1; NZ584739A; CA2703227A1; ATE516371T1; EP2217719B1; HK1147524A1; US9404148B2; EP2217719A1; CN101896623A

Abstract

Un metodo para determinar simultaneamente el niimero de repeticiones en tandem enpolinucleOtidos diana en un locus polimOrfico dado del que se sabe que tiene multiples alelos quevarian en el ntImero de repeticiones en tandem, el metodo comprendiendo:(a) proporcionar una muestra que contiene los polinucleotidos diana, donde dos o mas de lasrepeticiones en tandem en los polinucleOtidos diana se encuentran en forma de cadena simple,(al) hibridar un oligonucleOtido de bloqueo a por lo menos una pero no todas las repeticiones entandem en los polinucleOtidos diana proporcionados en el paso (a) para que una o mas de lasrepeticiones en tandem en los polinucleOtidos diana permanezca en forma de cadena simpledespues de la hibridaciOn de los oligonucleotidos de bloqueo,(b) la hibridar un oligonucleotido sonda etiquetado con la parte de cadena simple de lospolinucleotidos diana, donde el oligonucleotido sonda es complementario de al menos una de lasrepeticiones en tandem, y al menos 5 nucleOtidos del oligonucleotido sonda son complementariosde las repeticiones en tandem, en la parte de cadena simple de los polinucleotidos diana, endonde el oligonucleotido sonda es uno que permite la discriminacion entre diferentes nOmeros derepeticiones en tandem en la parte de cadena simple de los polinucleOtidos diana de acuerdo asu temperatura de fusion (Tm), y donde el oligonucleotido sonda es total o parcialmentecomplementario de al menos una repetici6n en tandem en la parte de cadena simple de lospolinucleotidos diana.(c) determinar simultaneamente el nOrnero de repeticiones en tandem en los polinucleOtidosdiana en base a la hibridaci6n del oligonucleotido sonda a la porci6n de cadena simple de lospolinucleotidos diana y su temperatura de fusion.

Description

[0001] La presente invención se refiere a oligonucleótidos, yen particular a su uso en la detección de repeticiones en tándem en ADN. [0002] Se conocen multitud de técnicas y sistemas de sonda para la detección de secuencias específicas de ADN y anotación de polimorfismo de nucleótido simple (SNP), incluyendo la reacción homogénea en cadena de la polimerasa (PCR), sondas TaqMan TM, sondas Eclipse, balizas moleculares, iniciadores Scorpion, sondas de hibridación simples, sondas ResonSense, Sondas Gene-Pin y Balizas de Hibridación(HyBeacons ®). Estas se discuten, por ejemplo, en nuestras solicitudes de patente anteriores WO 01/73118 y WO 2007/010268. [0003] Aunque muchos polimorfismos y mutaciones de ADN son SNP, muchos se deben a repeticiones en tándem de secuencias de ADN. Por lo general, en la actualidad, tales repeticiones en el ADN genómico son analizadas por un análisis del tamaño o por secuenciación del ADN, por ejemplo después de la amplificación por PCR de la secuencia de ADN diana. Aunque se han hecho intentos de usar sistemas de sondas de oligonucleótidos para identificar repeticiones en tándem en el ADN (por ejemplo, ver Radtkey et al (2000) Nucl. Acids Res. 28, E17 (i-vi», hasta ahora no ha habido una forma práctica de analizar estas secuencias repetidas utilizando sondas de hibridación. [0004] las huellas o el perfil del ADN fueron descubiertos por Alec Jeffreys después del descubrimiento de secuencias repetidas de ADN en el genoma humano (Jeffreys, 1985a, 1985b). Las secuencias repetidas denominadas STRs (repeticiones cortas en tandem) o VNTR (número variable de repeticiones en tándem) resultaron ser de longitudes diferentes en diferentes individuos. En la primera descripción del perfil de ADN, un número de estos loci fueron tipificados mediante el uso de enzimas de restricción, enzimas que cortan el ADN en secuencias específicas de nucleótidos, para liberar fragmentos de diferentes longitudes basados en el número de iteraciones de la secuencia repetida entre las secuencias de reconocimiento de enzimas. En aquellos primeros días de identificación del ADN, los fragmentos fueron separados en geles de agarosa y los fragmentos específicos conteniendo STRs de interés identificados utilizando sondas de ADN radiactivo. Este fue un proceso complejo y lento, y desde la primera descripción del perfil de ADN y la determinación de la identidad una serie de mejoras y desarrollos han impactado de manera espectacular en el perfeccionamiento de la metodología y por lo tanto en la facilidad de análisis, y por tanto en el número de muestras que pueden ser procesadas así como en la energía y el coste discriminatorios. [0005] En la forma más corriente del método, se utiliza la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar los loci STR que luego son separados por una técnica tal como la electroforesis capilar (CE). En el Reino Unido, cientos de miles de muestras se procesan anualmente que van desde raspados bucales de rutina a muestras del lugar de los hechos en delitos graves para comparación con la base de datos nacional de ADN que actualmente tiene más de 2 millones de tales perfiles. [0006] A pesar de la capacidad de los laboratorios para generar perfiles a partir de muestras simples tales como muestras bucales en tan sólo un día de trabajo para los casos urgentes, resulta difícil imaginar cómo podría lograrse esto de forma rutinaria para todas las muestras. Además, si se tiene en cuenta el tiempo transcurrido desde la toma de muestra hasta su llegada al laboratorio, es evidente que la mayoría de los perfiles no se pueden determinar a tiempo. En consecuencia, un sospechoso bajo custodia a menudo debe ser liberado en ausencia de evidencias adicionales antes de que se pueda obtener un perfil de ADN mediante un análisis. La consecuencia de esto puede ser que un individuo, detenido por delitos relativamente leves y subsiguientemente liberado, puede después determinarse que era el autor de un delito grave, teniendo que ser detenido de nuevo si es que puede ser localizado. Esto no es sólo un proceso lento y costoso, sino que también existe el riesgo de que una persona pueda cometer delitos adicionalespotencialmente graves que hubieran sido totalmente evitables si el perfil genético

hubiera estado disponible mientras todavía estaba bajo custodia. [0007] En el actual método basado en la PCR que comprende extracción de ADN, amplificación de STR, separación y análisis por tamaños en base a CE, aspectos del proceso, costo y complejidad de los equipos utilizados significan que el perfil de STR está confinado principalmente al laboratorio especializado con la restricción consiguiente en los tiempos de respuesta que en última instancia se pueden lograr. Sin embargo, si el perfil llega a hacerse lo suficientemente rápido para que los resultados puedan obtenerse de forma rutinaria, mientras un individuo está todavía detenido, entonces se debe encontrar un modo mediante el cual se pueda realizar un análisis in situ. [0008] En otro análisis no forense de ADN un enfoque adecuado ha sido usar PCR homogénea en la que el ADN es a la vez amplificado y analizado en un solo tubo por simples cambios en la fluorescencia. Varias de estos sistemas de sondas basados en fluorescencia incluyendo sondas HyBeacon y TaqMan (revisado en WO 01/73118 y WO 2007/010268) se han utilizado para determinar variaciones en secuencia del ADN tal como inserciones y supresiones de polimorfismos de nucleótido único (SNPs). Sin embargo, tales sondas no se han utilizado para determinar polimorfismos de longitud más larga como se requiere para STR u otro análisis de la secuencia de ADN ni tampoco es obvio cómo polimorfismos de tal longitud podrían ser determinados usando sistemas de sonda homogéneos. [0009] Varios grupos han descrito sistemas de sonda homogénea permitiendo el análisis de los productos de PCR en un solo tubo utilizando por ejemplo el ciclo en el que la amplificación es lo primero que se detecta con el fin de proporcionar una cuantificación relativa de una secuencia de ADN dentro de otra, como por ejemplo para mezclas de especies animales en el análisis de alimentos, o de una variante alélica dentro de otra, como por ejemplo un análisis genotípico y estado de portador con respecto a un polimorfismo de nucleótido simple o SNP. Hemos descrito previamente el nuevos sistemas de sonda fluorescente, HyBeacons, que pueden identificar diferencias sutiles en la secuencia tales como SNPs o pequeñas inserciones o supresiones, debido a su gran influencia sobre la temperatura de fusión y la nueva naturaleza de la estructura de HyBeacons que permite que esto se logre. Estos enfoques podrían ser utilizados para identificar a los individuos por perfiles SNP en formato homogéneo y potencialmente portátil. Sin embargo, las bases de datos existentes se basan actualmente en STRs que, debido a la naturaleza mucho más variable de los STRs cuya media en la región de 10 alelos por locus, en comparación con los SNPs que por lo general sólo tienen dos alelos por locus. En consecuencia, el estándar de la industria en el Reino Unido de perfilado forense de ADN es el kit SGM+ de Applied Biosystems que comprende 10 STRs y un test de género con preferencia a los paneles de tipificación de SNP que requerirían del orden de 50-100 SNPs para alcanzar niveles comparativos de discriminación individual. Por supuesto, mientras que un panel SNP se podría utilizar para la comparación de muestras individuales actualmente sólo hay una base de datos basada en STR con la cual se puedan comparar muestras individuales. [0010] En un intento de posibilitar que el tipado STR sea aplicado en entornos fuera de un laboratorio especializado, se han hecho esfuerzos para combinar varios pasos del método estándar de identificación de perfiles en un formato homogéneo utilizando CE en miniatura. La mayor ventaja de estos sistemas en miniatura es que cuanto más corto es el capilar más rápido es el análisis. Estos capilares son a menudo grabados en el portaobjetos de un microscopio y tienen generalmente 10-50 IJm de profundidad por 50 IJm de ancho con una longitud de pocos centímetros y sellados con un cubreobjetos de vidrio (Wooley y Mathies, 1994). Se han descrito formatos alternativos también como el plástico moldeado por inyección (McCormick et al, 1997). [0011] Las columnas CE miniaturizadas con una longitud de unos pocos centímetros, en contraste con los sistemas ABI más comunes con una columna de 36 cm de longitud, pueden reducir los tiempos de separación de unos 45 minutos a tan sólo 2,5 minutos para el kit Promega

PowerPlex™ 1.1 STR (Schmalzing et al, 1999). También se han descrito sistemas de conjuntos capilares que pueden analizar hasta 96 muestras simultáneamente en tan sólo dos minutos (Shi et al, 1999) y, más recientemente, se han desarrollado los sistemas multicolor aunque tienen tiempos de separación relativamente largos (Goedecke et al, 2004). [0012] Sistemas portátiles de PCR para amplificar el ADN antes de la separación también son requeridos y han sido probados varios de tales sistemas que van desde sistemas alimentados por batería para uso con cuatro loci (Belgrader et al, 1998), a sistemas integrados con dispositivos CE con microchip (Lagally et al, 2001). Uno de los retos para el futuro será el uso de kits STR multiplex con tecnología de amplificación rápida. El sistema Multiplex PCR requiere una optimización cuidadosa y necesariamente implica compromiso y equilibrio entre la reacción óptima para los diferentes pares cebadores. La PCR rápida es por lo general más estricta en sus condiciones de reacción y por lo tanto menos tolerante con algunos compromisos requeridos particularmente en los sistemas de PCR múltiple. [0013] En un intento de simplificar aún más el análisis de los STRs, Nanogen Inc. (San Diego, CA) intentó el uso de un formato de hibridación en el cual las moléculas diana amplificadas por PCR fueron hibridadas para capturar sondas inmovilizadas de diferentes longitudes en varias posiciones de un microchip de silicio. Se utilizó entonces una sonda de longitud constante con una etiqueta terminal para detectar el resto de la secuencia diana y que fue dirigida predominantemente hacia una secuencia no repetitiva. Bajo unas condiciones muy estrictas que se requerían para ser estrechamente controladas por campo eléctrico y temperatura con objeto de controlar el deslizamiento durante la hibridación de las unidades de repetición, sólo las dianas que permiten sondar y capturar secuencia para hibridar con otra inmediatamente adyacente permitieron a las bases terminales participar en el apilamiento de bases y estabilizaron esta estructura. Dichos complejos fueron suficientemente estabilizados para permitir que varios alelos de un locus dado se identificaran por la posición de la fluorescencia en el microchip (Radtkey et al, 2000, Westin et al, 2000) aunque la señal también fue producida a partir de secuencias más cortas de sonda de captura. Estas sondas se marcaron en el extremo con un fluoróforo simple y no cambiaron en fluorescencia en base a su estado de hibridación. En consecuencia, era necesario confiar en la captura de la sonda y en que cualquier sonda no hibridada sea arrastrada a fin de detectar una determinada secuencia en una localización determinada. [0014] US-B1-6 664 064 (16 de diciembre de 2003) describe un método para determinar el número de repeticiones en tándem en polinucleótidos diana en un determinado locus polimórfico. [0015] La identificación de polimorfismos de longitud, particularmente polimorfismos de repetición de longitud, ha tenido un alto contenido informativo en el entorno forense. Sin embargo, dichos polimorfismos tienen muchos otros usos. Hay más de 15.000 STR marcadores a través del genoma humano y, dependiendo de la informidad, pueden ser usados para excluir hasta varios centimorgans del genoma en estudios de mapeo (Weissenbach et al, 1992). A modo de ejemplo, se han utilizado estudios de mapeo STR para identificar nuevos loci asociados con cardiomiopatía hipertrófica (Watkins et al, 1993, Carrier et al, 1993, Thierfelder et al, 1993). [0016 Se sabe que otros polimorfismos de longitud, particularmente expansiones de repetición triple, causan enfermedades, en particular en las áreas de las enfermedades neurodegenerativas y otras, como distrofia miotónica, síndrome X frágil, enfermedad de Huntington, varias ataxias espinocerebelosas y la ataxia de Friedreich (Sinden, 1999). Aun otros polimorfismos de longitud pueden estar asociados con predisposición a enfermedad. Por ejemplo, un minisatélite compuesto por unidades de repetición de 14pb de 600 pares de bases aguas arriba del gen de la insulina influye en el riesgo de un individuo de padecer diabetes (Bell et al, 1982), mientras que la inestabilidad' y la pérdida de heterozigosidad de los microsatélites también es una característica en muchos tipos de cáncer incluyendo carcinomas de pulmón (Ionov et al, 1993). La inest~bilidad de los microsatélites se ha correlacionado con una alta tasa de mutación y procesos de reparación del AON (Loeb, LA 1994, Frayling, 1M, 1999). [0017] Los polimorfismos de longitud se encuentran en muchas otras especies y pueden ser ventajosamente utilizados con fines de tipificación. Por ejemplo, el Paracoccidioides brasiliensis es el agente etiológico de la paracoccidioidomicosis una micosis endémica en América Latina, donde se estima que 10 millones de personas están afectadas (Restrepo-Moreno, 2003). El estudio de las cepas individuales y las especies filogenéticas con el fin de entender mejor este organismo de importancia clínica ha sido hasta hace poco obstaculizado por la falta de marcadores moleculares con propósitos de tipificación recientemente subsanada esta carencia por Matute (Matute et al, 2006) basándose en el éxito de otros. Los sistemas de marcadores microsatélites han proporcionado métodos muy eficaces para la descripción del perfil de AON de otros organismos, y ha sido utilizado con éxito para la tipificación de hongos como Saccharomyces cerevisiae (Hennequin 2001), Aspergillus fumigatus (Bart-Oelabesse et al, 2001) Y Candida spp. (Foulet et al, 2005). [0018] Otros métodos similares para la tipificación de especies de plantas también han sido publicados. Más de 2.000 marcadores de secuencias simples repetidas han sido identificados dentro del genoma· secuenciado del arroz (McCouch et al, 2002) y otros marcadores también identificados dentro del genoma del trigo (Roder et al, 1998), del genoma del arroz (Brondani et al, 1998, 2003) Y otros. [0019La mención o discusión en esta especificación de un documento aparentemente publicado con anterioridad no debe ser necesariamente admitido como un reconocimiento de que este documento es parte del estado de la técnica o es de conocimiento general común.

[0020] La presente invención proporciona oligonucleótidos y métodos utilizar los mismos, que pueden ser usados para detectar y discriminar entre diferentes números de repeticiones en tándem en una secuencia de polinucleótidos. Así, la invención encuentra utilidad no solo en el campo del diagnóstico médico y la ciencia forense; también encuentra aplicaciones en pruebas de paternidad y relación, mapas de conexiones, tipificación microbiana, trazabilidad dentro de la cadena alimentaria, etcétera. [0021] Un primer aspecto proporciona un método para determinar el número de repeticiones en tándem en un polinucleótido diana, el método comprendiendo

(a): proporcionar una muestra que contiene el polinucleótido diana, donde una o más de las repeticiones en tándem en el polinucleótido diana está en forma de cadena simple,

(b): hibridar una sonda etiquetada de oligonucleótido con la parte de cadena simple del polinucleótido diana, donde el oligonucleótido sonda es complementaria de al menos una de las repeticiones tándem, y al menos 5 nucleótidos de la sonda de oligonucleótidos son complementarios de las repeticiones tándem, en la parte de cadena simple del polinucleótido diana, y

(c): determinar el número de repeticiones en tándem en el polinucleótido diana en base a la hibridación de la sonda de oligonucleótidos a la porción de cadena simple del polinucleótido diana.

([0022] El método también puede ser considerado como un ensayo del número de repeticiones en tándem en un polinucleótido diana. [0023] El polinucleótido diana puede ser AON o ARN. Por lo general, es AON. [0024] Como es bien sabido, muchos de los polinucleótidos de origen natural, en particular, las moléculas de AON, contienen repeticiones en tándem, tales como repeticiones de la forma (ABCO....)n donde A, B, C y O son nucleótidos y n es el número de veces que la secuencia de nucleótidos se repite. Las repeticiones pueden ser más complejas que estas y repeticiones particulares pueden estar intercalada con otras repeticiones. Por lo general, cada repetición en tándem contiene dos, tres, cuatro, cinco o seis nucleótidos y se puede repetir de 2 a 50 veces o

más, esto es n puede ser de 2 a 50 o más. Puede haber repeticiones parciales dentro de una secuencia diana repetida. Por otra parte, los alelos STR pueden comprender más de un tipo de repetición y pueden contener secuencias no repetitivas situadas entre elementos repetitivos, por ejemplo (TGCC)m (TTCC)n y (TTTCh TTTTTTCT (CTTT)n CTCC (TTCCh para loci D251338 y STR FGA, respectivamente (SEC ID N 0: 1 y 2). Las secuencias comunes repetidas en tándem se indican en la Tabla 21. [0025] Ejemplos de repeticiones en tándem comunes son (GATA)n, (CAG)n, y (TCTTA)n. [0026] En algunas repeticiones en tándem, la secuencia de repetición puede ser polimórfica de forma que, por ejemplo, una o más de las secuencias repetidas varían ligeramente respecto a la secuencia repetida central. Por ejemplo, STR TH01 tiene una secuencia central repetida específica AATG. Sin embargo, en un alelo llamado 9.3, en la séptima repetición falta la base A. Como se discute con más detalle en el Ejemplo 12, algunos STRs contienen repeticiones variables TCTA y TCTG. [0027] En el punto (a) del método se proporciona una muestra que contiene el polinucleótido diana, en el que una o más de las repeticiones en tándem en el polinucleótido diana se encuentran en forma de cadena simple. Esto permite a el oligonucleótido sonda hibridarse a la región de cadena simple de la diana como se explica con más detalle a continuación. El polinucleótido diana puede ser parte de una molécula de ADN sintética o puede ser parte de una molécula de ADN natural. Normalmente, cuando el polinucleótido diana es ADN se genera por la amplificación de una región de otra molécula de ADN, tal como una molécula de ADN natural. En esta realización, el proceso de amplificación en sí mismo, o el posterior procesamiento del producto de la amplificación, produce el ADN diana en el que una o más de las repeticiones en tándem son en forma de cadena simple. Por ejemplo, se puede utilizar una reacción PCR en la cual se empleen cebadores que hibriden a regiones que flanquean la repetición en tándem en un ADN natural (por ejemplo, ADN genómico humano). El producto de la PCR puede ser de cadena simple, por ejemplo, usando PCR asimétrica en la que un cebador tiene exceso de molaridad con respecto al otro como es bien sabido en la técnica, o un producto de PCR de doble cadena se puede hacer de cadena simple, por ejemplo por fusión. [0028] Se puede apreciar que, repeticiones en tándem dadas pueden ocurrir en más de una región del ADN natural. Por lo tanto, es generalmente deseable para el particular polinucleótido diana (por ejemplo ADN) de interés ser amplificado a partir del ADN natural (ADN genómico), por ejemplo mediante cebadores de PCR que hibridan a las regiones únicas que flanquean la región de la repetición tándem de interés que se encuentra en el ADN natural. [0029] Por lo general, cuando el polinucleótido diana es una molécula de ARN, es generado por la transcripción de una plantilla adecuada de ADN. Por ejemplo, el ARN diana puede ser generado por la transcripción in vitro de una molécula de ADN que contiene un promotor_aguas arriba (hacia el extremo 5') dellocus que se quiere analizar. Las polimerasas de RNA adecuadas para la producción de ARN diana incluyen polimerasas SP6 y T7 ARN. Así, por ejemplo, el ADN

puede ser amplificado a partir de un ADN natural mediante PCR en la que uno de los cebadores

incluyen el sitio de reconocimiento para polimerasa RNA. En presencia de polimerasa RNA y

nucleótidos adecuados, se puede generar ARN de cadena simple.

[0030] En una realización preferida, el método incluye el paso adicional después de o con el paso

(a) de (a1) hibridar un oligonucleótido de bloqueo a al menos una pero no todas las repeticiones en tándem en el polinucleótido diana proporcionado en el paso (a) para que una o más de las repeticiones en tándem en el polinucleótido diana sigan teniendo forma de cadena simple después de la hibridación de los oligonucleótidos de bloqueo.

[0031] En una realización de la etapa (a1) dos o más oligonucleótidos de bloqueo son hibridados a al menos una pero no a todas las repeticiones en tándem que proporciona el paso (a) de forma

que una o más repeticiones en tándem en el polinucle6tido diana siga en forma de cadena simple después de la hibridación de los oligonucleótidos de bloqueo. [0032] Se puede apreciar que mediante el uso de un oligonucleótido de bloqueo (u oligonucleótidos de bloqueo), es posible limitar el número de repeticiones en tándem presentes en forma de cadena simple en el polinucleótido diana en la muestra. Por ejemplo, si el polinucleótido diana (en ausencia de oligonucleótidos de bloqueo) contiene 12 repeticiones en forma de cadena simple, y el oligonucleótido de bloqueo es capaz de hibridar a tres de ellas (ya que contiene una parte de polinucleótido complementario de las tres repeticiones en tándem), el número de repeticiones presentes en forma de cadena simple en el polinucleótido diana de la muestra en presencia del oligonucleótido de bloqueo es nueve. [0033] Convenientemente, el oligonucleótido de bloqueo (u oligonucleótidos de bloqueo) hibrida al menos con dos repeticiones en tándem en la parte de cadena simple del ADN diana, por ejemplo, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30 o 40. El número de repeticiones en tándem en el oligonucleótido de bloqueo se determina por el número posible de repeticiones en tándem que pueden estar presentes en un locus determinado que se va a analizar. Normalmente, el oligonucleótido de bloqueo es complementario de al menos 8 nucleótidos (o al menos 12, 16 ó 20 nucleótidos) en la(s) repetición(es) en tándem presente(s) en la parte de cadena simple del ADN diana. Con las tecnologías actuales, puedan sintetizarse oligonucleótidos con más de 250 unidades de nucleótido, y se espera que sea posible sintetizar en el futuro aún más. [0034] Preferiblemente, el 0ligonucle6tido de bloqueo (cuando es complementario a lo largo de su longitud a la cadena simple de ADN en el ADN diana) es de 12 a 150 nucleótidos de longitud, por ejemplo de 12 a 120 o de 12 a 100 o de 12 a 90. Cuando el oligonucleótido de bloqueo tiene una función adicional (como se describe más adelante) el oligonucleótido puede ser más largo, por ejemplo de 20 a 180 nucleótidos, normalmente de 30 a 150 nucleótidos de longitud, por ejemplo, de 30 a 120, de 30 a 100, de 30 a 80 nucleótidos de longitud. [0035] El 0ligonucle6tido o los oligonucleótidos de bloqueo no tienen que ser un múltiplo entero de las bases en una repetición tándem. Más bien, pueden incluir repeticiones parciales a fin de que el oligonucleótido de bloqueo se una a la repetición en tándem de forma desplazada. [0036] El uso de oligonucleótidos de bloqueo desplazados se prefiere particularmente cuando se utilizan dos o más oligonucleótidos de bloqueo, y el uso de estos oligonucleótidos de bloqueo desplazados es útil como se ejemplifica en las siguientes circunstancias. [0037] Una muestra que contiene tipos de repeticiones 8,10 analizadas en presencia de un bloqueante de repetición 7 revela una combinación de 1 y 3 unidades de repetición para la sonda a hibridar. Sin embargo, esto aparecerá como un resultado similar al de una muestra que contiene repeticiones 11,13 si se analiza en presencia de un bloqueante de repetición 10. Así, con ambos bloqueantes presentes, es difícil determinar qué combinación de repeticiones está presente en la muestra. [0038] En el ejemplo antes descrito, si en vez usar un bloqueante de repetición 10 usamos un bloqueante de repeticion 10.2 (el ".2" designa las dos primeras bases de la repetición siguiente), entonces la muestra que contiene repeticiones 11,13 ahora sólo tiene una secuencia de repetición 0.2 y 2.2 a la que hibridar lo cual se traducirá en un cambio en puntos de fusión desplazados. Así, el planteamiento de bloqueante desplazado es especialmente útil donde de otra manera los picos de fusión estarían superpuestos. Este planteamiento de bloqueante desplazado puede, por ejemplo, ser utilizado para la combinación de hasta 4 bloqueantes con una secuencia de repetición de 4 bases (usando bloqueantes con un rango de tamaño de intervalo cada vez mayor con longitudes desplazadas mediante la adición de una base), o bloqueante 5 para repetición de 5 bases, y así sucesivamente. [0039] De esta manera, los oligonucleótidos de bloqueo pueden ser "superpuestos" para proporcionar un ensayo todo-en-un-tubo que se podría usar para distinguir diferentes números de

45 lOen tándem en forma de cadena simple usando un oligonucleótido de bloqueo u oligonucleótidos

repeticiones en la misma muestra. Por lo general, los diferentes oligonucleótidos de bloqueo desplazados superponibles con repeticiones parciales se seleccionan de modo que haya una diferencia en pico de fusión T m de al menos 0.5 C entre cada variante de diferente longitud (en

o

número de repeticiones en tándem). Normalmente, con el uso de diferentes oligonucleótidos bloqueo desplazados es posible analizar un único locus variable, que puede contener múltiples alelos que difieren en el número de repeticiones en tándem en una sola PCR. Esta realización se describe con más detalle en el Ejemplo 12. [0040] Para evitar dudas, un ADN diana como se ha descrito que contiene x repeticiones tandem en la forma de cadena simple se puede convertir en ADN diana que contiene x -y repeticiones

de bloqueo que son capaces de hibridar a repeticiones en tándem y. [0041] Por lo general, hay 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14 o 15 repeticiones en tándem en el polinucleótido diana en forma de cadena simple. Preferiblemente, hay entre 2 y 10, más preferiblemente entre 4 y 8. Estos números típicos de repeticiones en tándem en el polinucleótido diana en forma de cadena simple pueden estar disponibles en presencia de oligonucleótidos de bloqueo o en su ausencia. Convenientemente, la parte de cadena simple de los polinucleótidos diana que contiene repeticiones en tándem contiene al menos 8, preferentemente al menos 12, más preferiblemente al menos 16 o al menos 20 nucleótidos. [0042] Como es bien sabido, un tipo común de polimorfismo está relacionado con el número de repeticiones en tándem en un locus determinado el cual puede variar significativamente. Se apreciará que el método que se describe es para usarse en la determinación del número de repeticiones en tándem y se prefiere que cualquier ensayo dado un número pequeño de repeticiones en tándem estén en forma de cadena simple. Por lo tanto, con el fin de determinar el número de repeticiones en tándem que pueden estar presentes en un locus determinado, puede ser necesario llevar a cabo el método sin oligonucleótidos de bloqueo, y también llevar a cabo el método por separado con uno o más oligonucleótidos de bloqueo que pueden hibridar a diferentes números de repeticiones en tándem. De esta manera, para cualquier locus dado del que se conoce que tiene múltiples alelos que varían en el número de repeticiones en tándem, es posible generar polinucleótidos diana que tienen porciones de tamaños similares de cadena simple (por ejemplo, con una variabilidad reducida en el número de repeticiones en la parte de cadena simple). Se observará que se puede usar más de un oligonucleótido de bloqueo, siempre y cuando se conserven una o más repeticiones en tándem en el polinucleótido diana que permanecen en forma de cadena simple tras la hibridación de los oligonucleótidos de bloqueo. [0043] En una realización, en la que las secuencias de repetición en tándem son polimórficas (por ejemplo en STR THO 1, o en STRs descritas en el Ejemplo 12), es deseable que el oligonucleótido de bloqueo bloquee la región de variabilidad de modo que el polinucleótido diana en forma de cadena simple contenga solamente las mismas repeticiones. Por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 12, el oligonucleótido de bloqueo para el STR D8S 1179 deja sólo repeticiones TCTA disponibles para hibridación con el oligonucleótido sonda. [0044] Preferiblemente, a menos que se usen bloqueantes desplazados como se mencionó antes, es preferible que se generen por los bloqueantes diferentes polinucleótidos diana que contengan una o más repeticiones en tándem permaneciendo en forma de cadena simple tras la hibridación de los oligonucleótidos de bloqueo a fin de evitar el mismo Tm para diferentes alelos. [0045] Como se discute con más detalle a continuación, el oligonucleótido de bloqueo puede ser un oligonucleótidoque es también utilizado para generar polinucleótidos diana en el que una o más de las repeticiones tándem en el polinucleótido diana está en forma de cadena simple, por ejemplo, como parte de un cebador utilizado anteriormente en una reacción PCR. [0046] La sonda de oligonucleótido etiquetada en el paso (b) puede ser cualquier oligonucleótido sonda adecuada. Convenientemente, el oligonucleótido sonda es complementaria de al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 de las repeticiones tándem y esto se puede determinar en base allocus que se va a analizar. Preferiblemente, el oligonucleótido sonda es complementaria a de 4 a 10 de las repeticiones en tándem, aunque para una repetición dinucleótida puede preferirse que el oligonucleótido sonda sea complementaria de al menos 5 o 6 repeticiones tándem. Convenientemente, una parte de entre 5 y 40 nucleótidos de el oligonucleótido sonda es complementaria a las repeticiones tándem en la región de cadena simple del polinucleótido diana. Normalmente, el oligonucleótido sonda es complementaria de al menos 8 nucleótidos en la(s) repetición(es) tándem presente(s) en la parte de cadena simple del polinucleótido diana: más preferiblemente es complementaria de al menos 10, 12, 15 o 20 nucleótidos en la(s) repetición(es) tándem presente(s). [0047] Se prefiere que la sonda de oligonucleótidos sea capaz de unirse al polinucleótido diana de cadena simple con un Tm en el intervalo de 40°C a 70°C como se describe con más detalle más adelante. [0048] En una realización preferida la sonda de oligonucleótido está etiquetada con fluorescencia. La sonda puede contener una única etiqueta fluorescente o puede contener varias etiquetas fluorescentes. Normalmente, el marcador fluorescente está unido a un residuo interno. [0049] Por lo general, el oligonucleótido tiene 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 residuos internos etiquetados con un fluoróforo. El número puede depender de la longitud del oligonucleótido. Normalmente hasta aproximadamente un tercio de los residuos internos son etiquetados con un fluoróforo, pero pueden ser menos. [0050] Preferiblemente la longitud de la sonda de oligonucleótido descrita será tal que sea la adecuada para la hibridación con una parte de cadena simple del polinUcleótido diana, para proporcionar un híbrido estable cuya temperatura de fusión depende de la secuencia exacta de la diana y del número de repeticiones en tándem en la parte monocatenaria de la diana, pero que normalmente se encuentra dentro del intervalo de 40°C a 70°C. Los oligonucleótidos que contienen menos de 15 residuos de nucleótidos en muchos casos no forman híbridos suficientemente estables, sobre todo cuando las dos secuencias de hibridación no son totalmente complementarias, aunque puedan ser usadas en algunas circunstancias. Los oligonucleótidos que tienen una longitud de más de 40 residuos de nucleótidos pueden formar híbridos cuya temperatura de fusión es relativamente insensible a la posible presencia de un nucleótido simple desajustado, aunque se pueden utilizar en algunas circunstancias. La hibridación de sondas de oligonucleótido largas con largas secuencias de repetición produce pequeñas diferencias en T m, con dianas que presentan polimorfismos de longitud. El uso de sondas de oligonucleótidos que hibridan a más de 30 040 nucleótidos de un polinucleótido diana generalmente requiere el uso de métodos de alta sensibilidad para la curva de fusión y el análisis del pico de fusión, como se discute más adelante. [0051] Por lo general, la sonda de oligonucleótido tiene una longitud dEf 10 a 60 residuos de

nucleótidos, preferiblemente una longitud de 15 a 50 residuos de nucleótidos, más preferiblemente una longitud de 15 a 40 residuos de nucleótidos. Por lo tanto, en general, el oligonucleótido tiene una longitud de 10, 11, 12, 13, 14 o 15 residuos de nucleótidos hasta (e incluyendo) 35, 36, 37, 38, 39, 40 o 45. Por lo tanto, el uso de sonda de oligonucleótidos dentro de cualquiera de los rangos de tamaño mencionado está incluido. [0052] Un oligonucleótido dentro del intervalo de tamaño de 15 a 60 nucleótidos puede estar etiquetado individualmente o puede tener hasta aproximadamente 14 (para oligonucleótidos

60mer) de sus residuos de nucleótido interno etiquetados con un fluoróforo, pero convenientemente un oligonucleótido en este intervalo de tamaño tiene 2, 3, 4, 5 o 6 de sus residuos internos etiquetados con un fluoróforo. Por lo general, hay alrededor de 3 bases entre

nucleótidos no-terminales etiquetados con fluorescencia.

[0053] Los residuos de nucleótidos generalmente son derivados de los nucleósidos naturales A, C, G, T Y U. Sin embargo, análogos de nucleótidos pueden ser usados en una o más localizaciones de la sonda de oligonucleótidos utilizada en el presente documento, tales análogos de nucleótidos estando modificados, por ejemplo en la parte de base y/o la parte de azúcar y/o el enlace fosfato. Las modificaciones de la base, como propinil dU (anáologo-dT) y 2-amino dA (análogo dA), generalmente modifican las propiedades de hibridación y pueden hacer atractivo el uso de oligonucleótidos que tienen menos de 15 residuos de nucleótidos. En el caso de oligonucleótidos que contienen propinil dU, hay alrededor de 10 residuos de longitud que dependen de la temperatura de fusión con la secuencia diana requerida. Las modificaciones de la base, tales como N4-etil-DC (análogo dC) también pueden ser empleadas para desestabilizar sondas largas de oligonucleótidos, lo que aumenta las diferencias en la temperatura de fusión con secuencias diana largas. Por lo tanto, en algunas realizaciones las modificaciones en la base pueden ser utilizadas para lograr un cambio adecuado en Tm. [0054] Alternativamente, los oligonucleótidos compuestos de o que comprenden ácido nucleico péptídico (ANP), ácido nucleico bloqueado (LNA), 2'-O-metil ARN, ADN fosforamidita, ADN fosforotioato, ADN metil fosfonato o ADN fosfotriéster pueden ser empleados para formar interacciones más estables química o enzimáticamente con las secuencias diana. [0055] Se prefiere que se use el mismo fluoróforo en la sonda de oligonucleótidosque para uso en este documento. Sin embargo, el uso de dos o más fluoróforos diferentes en el mismo oligonucleótido puede ser especialmente ventajoso cuando los oligonucleótidos se utilizan en multiplexación. Por ejemplo, fluoróforos espectralmente distintos pueden ser también empleados en diferentes sondas para analizar simultáneamente múltiples alelos STR en un único tubo de reacción. Cualquier fluoróforo que pueda ser fijado a un residuo de nucleótido se podrá utilizar, siempre y cuando no impida que el oligonucleótido hibride con su secuencia diana. (Los análisis

Multiplex también se pueden mejorar mediante el uso de diferentes longitudes de sondas de oligonucleótidos empleadas con o sin diferentes oligonucleótidos de bloqueo, especialmente con alelos STR muy largos). [0056] Los fluoróforos adecuados incluyen fluoróforos basados en fluoresceína como FAM (6-carboxifluoresceína), TET (Tetraclorofluoresceína), HEX (hexaclorofluoresceína); fluoróforos basados en rodamina como ROX (6-carboxi-X-rodamina) y TAMRA (6-Carboxitetrametilrodamina); la familia de tintes Cy, especialmente Cy3 y Cy5, todos disponibles de Glen Research, 22825 Davis, Sterling, VA 20164, EE.UU .. [0057] Se pueden utilizar otros colorantes de fluoresceína, por ejemplo, aquellos con diferentes espectros de emisión, tales como NEO y JOE. También se puede utilizar otros fluoróforos, como los de las familias de colorantes Alexa, Atto, Dyomics, Megastokes Dyomics y Thilyte que se detallan en las Tablas 14 a 20 más adelante.

[0058] En una realización preferida, la sonda de oligonucleótido se etiqueta en la posición 5 de las bases internas uracilo/timina usando C6FAMdU (disponible de la Universidad de Southampton, Reino Unido) o Fluoresceína dT (disponible de Glen Research, Sterling, VA), respectivamente (en este contexto, las estructuras de dT y dU son idénticas y los términos por tanto intercambiables). Las fosforamiditas protegidas con FMOC pueden ser incorporadas en las posiciones internas de T dentro de los oligonucleótidos y pueden ser utilizadas como punto de unión para varios tintes fluorescentes, incluyendo pero no limitado a la FAM, TET, HEX, ROX, TAMRA, Cy3 Y Cy5, todos disponibles de Glen Research. Después de la síntesis de oligonucleotidos, el grupo FMOC puede ser eliminado de la uridina protegida en 2' y una fosforamidita fluorófora, tal como 6-carboxifluoresceína fosforamidita protegida, y puede acoplarse al grupo 2'-hidroxi libre. En otra realización, los oligonucleótidos pueden ser etiquetados en posiciones internas de A, C o G, donde los nucleótidos etiquetados son incorporados bien como fosforamiditas durante la síntesis de oligonucleótidos en fase sólida o como fluoróforos unidos después de la síntesis de oligonucleótidos utilizando fosforamiditas

protegidas (por ejemplo, 8-aminoalquilo-dA, 7-aminoalquilo 7-deaza-dA, N (4)-aminoalquilo dC y 5-aminoalquilo-dC). [0059] Se prefiere particularmente que la sonda de oligonucleótidos etiquetada sea una sonda HyBeacon ® , como se describe en la patente WO 01/73118, o una sonda de oligonucleótidos, como se describe en la patente WO 2007/010268. [0060] Se puede apreciar, en otra realización posterior, que la sonda de oligonucleótidos se puede etiquetar con una molécula que detiene la reacción y el polinucleótido diana contiene una molécula fluorescente cuya fluorescencia se disipa cuando la sonda de oligonucleótido se une al polinucleótido diana. Alternativamente, la sonda de oligonucleótido se puede etiquetar con una molécula fluorescente, y el polinucleótido diana contiene una molécula que detiene la reacción y disipa la fluorescencia de la molécula fluorescente en la sonda de oligonucleótidos, cuando la sonda de oligonucleótidos se une al polinucleótido diana. En otra realización, la sonda y los oligonucleótidos bloqueantes pueden ser etiquetados con fracciones de f1uoróforo y grupos que detienen la reacción para aumentar/apagar la emision de fluorescencia en la hibridación a (o en la disociación de) secuencias diana adyacentes. [0061] En una alternativa más, la sonda de oligonucleótidos está etiquetada con un f1uoróforo y el polinucleótido diana contiene otro fluoróforo de tal manera que tras la unión de la sonda de oligonucleótidos al polinucleótido, hay una resonancia de fluorescencia y una transferencia de energía (FRET) que se puede medir. En otra realización la sonda y los oligonucleótidos de bloqueo pueden estar etiquetados con un dador o aceptor de fluoróforos para facilitar FRET al hibridar secuencias diana adyacentes. [0062] En la realización del método descrita en el que se usa el paso (a1) y por lo tanto son empleados uno o más oligonucleótidos de bloqueo, es conveniente si el oligonucleótido de bloqueo comprende un fluoróforo y la sonda oligonucleótido comprende un apagador, o viceversa. Los pares adecuados fluoróforo/ apagador son bien conocidos en la técnica. Del mismo modo, es conveniente si la sonda de oligonucleótidos y el oligonucleótido de bloqueo se etiquetan con fluoróforos que puedan participar en FRET entre sí. Una vez más, pares fluoróforos adecuados son conocidos en la técnica. [0063] Se apreciará que los dos fluoróforos que son capaces de participar en FRET deben estar a una distancia adecuada para que ocurra FRET cuando el oligonucleótido o los oligonucleótidos que llevan los fluoróforos son hibridados en una configuración para indicar un resultado deseado en particular. Del mismo modo, el fluoróforo y el apagador deben estar a una distancia adecuada para que ocurra la extinción de la fluorescencia cuando se indica un resultado en particular. En la realización en la que el oligonucleótido de bloqueo contiene una apagador molécula que detiene la reacción (apagador) y la sonda de oligonucleótidos contiene un fluoróforo (o en la realización en la que la sonda y los oligonucleótidos de bloqueo contienen respectivos fluoróforos capaces de provocar FRET), los oligonucleótidos de bloqueo y la sonda de oligonucleótidos se hibridan de forma adyacente a las repeticiones en tándem de modo que los pares fluoróforo/ apagador (o fluoróforo/fluoróforo) estén adyacentes. [0064] Se puede apreciar que en una realización preferida, la etiqueta (por ejemplo, molécula apagadora o molécula fluorescente), pueden estar asociadas con, y formar parte del polinucleótido diana, tras la unión con un oligonucleótido de bloqueo debidamente etiquetado. [0065] En una realización preferida, el oligonucleótido sonda es totalmente complementario a por lo menos una repetición en tándem en la parte de cadena simple en el polinucleótido diana. [0066] En otras palabras, en la región de hibridación entre la porción de cadena simple del

polinucleótido diana y la sonda de oligonucleótidos, se produce el apareamiento de bases Watson-Crick . Sin embargo, se apreciará que pueden ocurrir ciertos desajustes o apareamientos de bases no-Watson-Crick, pero aún la sonda sigue siendo capaz de hibridar. En este caso, la sonda de oligonucleótidos es parcialmente complementaria al polinucleótido diana de cadena simple. En algunas circunstancias podría ser deseable que la sonda de oligonucleótidos sea parcialmente complementaria a la parte de cadena simple del polinucleótido diana, ya que los desajustes pueden reducir la T m de un híbrido oligonucleótido-diana, lo que permite un cierto grado de control sobre la Tm (y IITm es decir diferencia en Tm que ocurre dependiendo del número de repeticiones en tándem con las cuales la sonda de oligonucleótidos hibride). [0067] De manera similar, el oligonucleótido de bloqueo puede ser totalmente complementario al polinucleótido diana de cadena simple (preferido) o parcialmente complementario (menos preferido). [0068] En una realización preferida adicional, las repetición(es) en tándem en el polinucleótido diana está flanqueada por una o dos regiones que son de cadena simple. En este caso, ya sea el oligonucleótido de bloqueo (si es usado) o la sonda de oligonucleótidos o ambos (si ambas regiones que flanquean son de cadena simple en el polinucleótido diana) puede contener una parte de anclaje que es complementaria a una región que flanquea la repetición en tándem. Se puede apreciar que si se utiliza tanto un oligonucleótido de bloqueo como una sonda de oligonucleótidos que contienen una región de anclaje, la región de anclaje en uno de los oligonucleótidosserá complementaria a una región flanqueante y la parte de anclaje en el otro oligonucleótido será complementaria a la otra región flanqueante. [0069] Por lo general, la región de anclaje del oligonucleótido de bloqueo o de la sonda de oligonucleótidos contiene de 3 a 40 nucleótidos; convenientemente de 4 a 30 nucleótidos, por ejemplo, de 4 a 20 nucleótidos. Convenientemente, para la sonda de oligonucleótidos, la región de anclaje es de 5 a 10 nucleótidos. Normalmente, la porción de anclaje es totalmente complementaria de la región flanqueante. Se puede apreciar que el tamaño y la composición de la región de anclaje del oligonucleótidos de bloqueo [0070] (si se usa) y la sonda de oligonucleótidos pueden influir en la T m del oligonucleótido de bloqueo y en la sonda de oligonucleótido, y por consiguiente cambios en la región de anclaje de la sonda de oligonucleótidos pueden permitir un cierto grado de control sobre T m (y IITm). [0071] También, se apreciará que la región de anclaje es útil para reducir o evitar el "deslizamiento" (es decir ancla la hibridación de los oligonucleótidos a la región flanqueante). Esto permite una mejora de la selectividad de hibridación del oligonucleótido al polinucleótido diana, y también una mejora en la discriminación entre diferentes números de repeticiones en tándem a las cuales se une el oligonucleótido (en particular al oligonucleótido sonda).

[0072] En una realización preferida, los pasos (a) y (a1) del método son llevados a cabo de forma simultánea. En esta realización, por lo tanto, se provee una muestra que contiene el polinucleótido diana al mismo tiempo que se provee un oligonucleótido u oligonucleótidos de bloqueo, de tal manera que el polinucleótido diana en la muestra contiene algunas repeticiones en tándem que son bloqueadas por el oligonucleótido de bloqueo u oligonucleótidos de bloqueo y algunos que están (y permanecen) en forma monocatenaria en presencia del oligonucleótido u oligonucleótidos de bloqueo y por lo tanto están libres para la hibridación con una sonda de oligonucleótidos. En una realización, el oligonucleótido de bloqueo está separado de (es decir, no unido covalentemente al) polinucleótido diana. Esta realización se ilustra esto mediante un diagrama, en una realización, la Figura 6. Se puede considerar como una reacción bimolecular, al menos con respecto a la generación y el bloqueo del polinucleótido diana. [0073] En una realización particularmente preferida, una PCR genera el ADN diana en el que una

o más de las repeticiones en tándem en el ADN diana está en forma de cadena simple, y un cebador utilizado en la PCR también comprende el oligonucleótido de bloqueo. Esto se ilustra mediante un diagrama, en una realización, en la Figura 8. Esto puede ser considerado como una reacción unimolecular, por lo menos en lo que respecta a la generación y el bloqueo del polinucleótido diana. Es preferible que el cebador PCR que también comprende el

oligonucleótido de bloqueo no posea ninguna de las regiones importantes de auto-complementariedad. [0074] En una realización preferida, el cebador usado en la PCR (que también comprende el oligonucleótido de bloqueo) incluye en su extremo 3'terminal una parte que es complementaria a una región enel ADN diana que es 3' de las repeticiones en tándem a analizar e incluye en su extremo S ' una parte que es complementaria de al menos una repetición en tándem en la cadena del producto PCR sintetizado por dicho cebador. Por lo tanto, este cebador es uno que, en una reacción de PCR, genera una hebra de ADN que incluye las repeticiones en tándem en el ADN diana. Debido a que el cebador también contiene una parte que es complementaria de una o más de estas repeticiones en tándem, forma una estructura de horquilla por hibridación intramolecular de la parte S 'del cebador (que también es en esta realización un oligonucleótido de bloqueo) con una o más de las repeticiones en tándem sintetizadas por uso del cebador en la PCR. La parte S' del cebador no es complementaria a ninguna región de ya sea el cebador o la sonda de oligonucleótidos no participará en la hibridación hasta después de que la secuencia diana es amplificada por PCR. Se apreciará que si el cebador contiene en su extremo S' una parte que es complementaria a y de las repeticiones en tandem, y será bloqueada. Si x repeticiones están presentes en ellocus amplificado en la PCR, repeticiones en tándem x-y se presentarán en forma de cadena simple en el ADN diana producido. [007S] En esta realización es particularmente preferido que el cebador comprenda, desde 3 'a S',

(i) una parte que sea complementaria a una región en el ADN diana que es 3' de las repeticiones en tándem, (ii) opcionalmente, una parte espaciadora, (iii) una parte de anclaje que sea complementaria de la región flanqueante en la cadena del producto PCR sintetizado por dicho cebador, y (iv) una parte que sea complementaria de al menos una repetición en tándem en la cadena del producto PCR sintetizado por dicho cebador. [0076] En otra realización, el cebador comprende además (v) una parte de enganche que es complementaria a una parte de enganche en el extremo 3' de la sonda de oligonucleótidos. La parte de enganche se localiza en S' de (iv) (la parte que es complementaria de al menos una de las repeticiones en tándem en la cadena del producto PCR sintetizado por dicho cebador). [0077] En otra realización más, se utilizan por lo menos dos pares diferentes de cebadores de PCR y sonda de oligonucleótidos en los que las respectivas partes de enganche de cada par de oligonucleótido del bloqueo y de sonda de oligonucleótidos son complementarios entre sí. Preferiblemente, la secuencia de nucleótidos de la parte de enganche se selecciona para que cada par de partes de enganche complementarias tenga un diferente Tm. Normalmente, los T m diferentes difieren en al menos O.S ·C. [0078] En las realizaciones en las que el cebador PCR contiene una parte de enganche, ésta tiene las propiedades de la parte de enganche de los oligonucleótidos de bloqueo analizados con más detalle a continuación. [0079] Esta realización se muestra mediante un diagrama en la figura 1S. [0080] Se prefiere particularmente si se usa PCR asimétrica para mejorar la hibridación del bloqueador y de la sonda a dianas sintetizadas. Por ejemplo, el oligonucleótido de bloqueo

, unimolecular I cebador puede estar presente en un exceso de concentración comparado con el otro cebador en la PCR el cual puede ser empleado en concentración limitante de tal manera que se agote temprano en la PCR generando de este modo ADN diana de cadena simple. [0081] Un ejemplo de esta realización se muestra mediante un diagrama en la figura 8 (en esta realización, el cebador de PCR y la sonda de oligonucleótidos no contienen partes de enganche). [0082] En una realización diferente, el cebador usado en la PCR (que también tiene un oligonucleótido de bloqueo) también comprende la sonda de oligonucleótido. Esta realización se muestra mediante un diagrama en la figura 16. Por lo general, una parte espaciadora está presente entre la sonda de oligonucleótidos y el oligonucleótido de bloqueo. Por lo tanto, en una realización típica, el iniciador comprende, de 3 'a 5', (i) una parte que es complementaria a una región en el ADN diana que es 3' de las repeticiones en tándem, (ii) opcionalmente, una parte espaciadora, (iii) una parte de anclaje que es complementaria de la región flanqueante en la cadena del producto PCR sintetizado por dicho cebador, y (iv) una parte que es complementaria de al menos una repetición en tándem en la cadena del producto PCR sintetizado por dicho cebador, (v) una segunda parte espaciadora, y (vi) una sonda de oligonucleótidos. La sonda de

oligonucleótidos (vi) está comprendida dentro del cebador de PCR y puede ser considerada como una parte de la sonda. Está normalmente etiquetada por fluorescencia, y es complementaria de al menos una repetición en tándem en la cadena del producto PCR sintetizado por dicho cebador. La parte del iniciador que es complementaria a una región en el ADN diana, que es de 3 'de las repeticiones en tándem es capaz de hibridar 3' de las repeticiones en tándem, por ejemplo bajo condiciones de PCR. Por lo general, esta parte del cebador contiene de 10 a 30 nucleótidos, por ejemplo de 15 a 30 o de 15 a 20 nucleótidos, que son complementarios a la región flanqueante 3'. Preferiblemente, contiene de 18 a 25 nucleótidos. La región flanqueante 3' se localiza por lo general 1 a 200 nucleótidos 3'de la secuencia diana. [0083] Preferiblemente, esta parte es totalmente complementaria a la región en el ADN diana que es 3' de las repeticiones en tándem; Sin embargo, puede ser parcialmente complementaria, siempre y cuando pueda todavía hibridar y participar en PCR. El extremo 3' del cebador está libre para participar en una reacción de extensión de cadena y por lo tanto contiene un grupo OH 3'. Los cebadores también pueden contener bases "universales", como 5-nitroindol e inosina, con el fin de "neutralizar" polimorfismos nucleótidos simples conocidos identificados dentro de la población. [0084] La parte espaciadora (ii) es opcional. Cuando está presente, puede contener cualquier espaciador adecuado, en el cual incluimos el significado de una unidad química que ocupa la la longitud de desde 1 a 20 residuos de nucleótidos, pero que no participa en el apareamiento de bases. Por lo general, el separador puede ser una fracción de hexaetilenglicol (HEG) o tetraetilenglicol (TEG). En otra realización, el separador puede ser uno o más residuos abásicos. Los residuos abásicos mantienen el espaciamiento de un residuo de nucleótido, pero no participan en el emparejamiento de las bases (ya que la base está ausente). En otra realización, los residuos de nucleótidos están presentes, pero no ajustan con los residuos de nucleótidos en la cadena diana y por lo tanto no participan en el apareamiento de bases. [0085] Por lo general, el separador ocupa una longitud de alrededor de 1, 2, 3, 4 o 5 residuos de nucleótidos. [0086] En la realización en la que la sonda de ologonucleótidos está incluida en el cebador de PCR (Figura 16), el espaciador (v) entre la sonda de oligonucleótidos yel oligonucleótido de bloqueo tiene por lo general las siguientes propiedades: actúa como un separador físico que permite a la sonda de oligonucleótidos y al oligonucleótido de bloqueo hibridarse de forma independiente, sin un efecto acumulativo en la estabilidad y T m de la sonda. Adecuadamente, se usa una molécula lineal simple, como un polímero de carbohidratos o un péptido para tener restricciones mínimas rotacionales tridimensionales, y es suficientemente largo para completar una estructura circular en el espacio (de modo que los extremos puedan llegar a estar próximos). Preferiblemente, el separador no tiene afinidad intrínseca por, y no se une a, el ácido nucleico. El espaciador es preferentemente neutro al proceso de hibridación· a la secuencia diana. Claramente, el separador debe ser capaz de unirse químicamente al oligonucleótido de bloqueo y a la sonda de oligonucleótidos. [0087] La parte de anclaje del cebador que es complementaria a la región flanqueante en la cadena del producto PCR sintetizado por dicho cebador contendrá de 5 a 25 nucleótidos, convenientemente 5 a 20 nucleótidos, tal como de 10 a 20. Esto puede variar dependiendo de la composición de la secuencia de la región flanqueante. Convenientemente, la parte de anclaje del

cebador tiene un valor de Tm mayor que la parte de anclaje de la sonda de oligonucleótidos. Normalmente, la parte de anclaje es enteramente complementaria a la región flanqueante. [0088] La parte que es complementaria de al menos una repetición en tándem en la cadena del producto PCR sintetizado por el cebador (del que forma parte) es complementaria a al menos una, dos, tres, cuatro o cinco repeticiones en tándem. Por lo general, es complementaria entre 2 y 20 repeticiones en tándem, por ejemplo, entre 4 y 8. Se prefiere que esta parte sea totalmente complementaria a las repeticiones en tándem, pero puede ser parcialmente complementaria, siempre y cuando pueda aún hibridarse con las repeticiones en tándem en el producto PCR sintetizado por el cebador.

[0089] Las porciones espaciadoras como antes se han descrito también pueden estar presentes en los oligonucleótidos de sonda y en oligonucleótidos de bloqueo. En estos casos, se prefiere que el separador tenga una longitud de alrededor de 1 o 2 o 3 o 4 o 5, o más, nucleótidos.

[0090] Se puede apreciar que, en la realización donde el oligonucleótido de bloqueo no es parte de un iniciador de PCR, es preferible que su extremo 3' no contenga un grupo OH. Esto es para que no pueda participar en una reacción de extensión de cadena. Por tanto, el extremo 3' suele estar bloqueado, por ejemplo con un grupo fosfato u octanediol.

[0091] Del mismo modo, se apreciará que es generalmente deseable que la sonda de oligonucleótidos no contenga OH en 3', y esté bloqueada para evitar extensión de cadena, por ejemplo, con un fosfato u octanediol. De esta manera, cuando el método descrito se lleva a cabo utilizando PCR, la sonda de oligonucleótidos (si está presente durante la PCR) no puede ser extendida por polimerasa ADN presente. [0092] En otra realización, el oligonucleótido de bloqueo contiene en su extremo 3' (o 5') una parte de enganche que es complementaria a una parte de enganche que está presente en el extremo 5' (o 3'), de la sonda de oligonucleótidos. En esta realización, la_parte de enganche de los oligonucleótidos debloqueo y la porción de enganche de la sonda de olig'onucleótidos hibridan juntas cuando el oligonucleótido de bloqueo y la sonda de oligonucleótidos hibridan con la porción de cadena simple del polinucleótido diana. Esta realización se ilustra mediante un diagrama, en una realización particular, en la Figura 12. Las partes de enganche tienen normalmente de 3 a 10 nucleótidos, por ejemplo de 4 a 8, tal como de 6 a 8. Por lo general, parte de la porción de enganche contiene una mayoría de residuos G o C; preferentemente más del 75% de las bases son residuos G o C. La secuencia de la parte de enganche es preferiblemente no complementaria a ninguna parte de STR. Convenientemente, la parte de enganche contribuye de 10 . C a 30 • C en la estabilidad térmica, y por lo general garantiza que la sonda hibride con la secuencia correcta y evita el deslizamiento. La T m de la parte de enganche no debería incrementar la Tm de la sonda de oligonu~leótidos en la medida en que esto impide la discriminación de repeticiones diana de longitud similar. En una realización, la parte de enganche de la sonda de oligonucleótidos contiene una etiqueta fluorescente y la parte de enganche de los oligonucleótidos de bloqueo contiene una molécula apagadora que detiene la reacción (o viceversa) de manera que tras unirse a la parte de la cadena simple del polinucleótido diana, el fluoróforo y el apagador interactúan. Alternativamente, las partes de engan'che de ambos tanto la sonda de oligonucleótidos como el oligonucleótido de bloqueo contienen fluoróforos y al hibridar al polinucleótido diana son capaces de participar en FRET (ver Figura 17). [0093] En una realización preferida, se usan al menos dos pares diferentes de oligonucleótido de bloqueo y sonda de oligonucleótidos en las que las respectivas partes de enganche de cada par de oligonucleótido de bloqueo y sonda de oligonucleótidos son complementarias entre sí.

Normalmente, los diferentes pares de oligonucleótido de bloqueo y sonda de oligonucleótidos

difieren en las partes de sujección. Así, una pareja puede tener partes de enganche

45 lOen 5' o 3' de las repeticiones en tándem, (ii) una parte que es complementaria de al menos una

representadas por A 1: Al' (A 1 Y A l' son complementarias),y otro par puede tener partes de enganche representadas por 81: 81', y así sucesivamente, donde, por ejemplo A1 está presente en el oligonucleótido de bloqueo y A 1 'está presente en la sonda de oligonucleótidos. Normalmente, la secuencia de nucleótidos de la parte de enganche se selecciona de manera que cada par de partes complementarias de enganche tengan diferente Tm. [0094] Eloligonucleótido de bloqueo con la parte de enganche y la sonda de oligonucleótidos con la parte de enganche pueden ser considerados como oligonucleótidos de unión. [0095] En un formato bimolecular, el oligonucleótido de bloqueo normalmente comprenderá: (i) una parte de anclaje que es complementaria a la región flanqueante localizada inmediatamente

repeticion en tándem en el producto PCR sintetizado y (iii) una secuencia corta de enganche enriquecida en G/C complementaria a una secuencia de enganche unida al extremo 5' o 3' de la sonda de oligonucleótido a usar. [0096] En un formato unimolecular, el oligonucleótido de bloqueo / cebador típicamente podrían comprender de 3' a 5' (i) una parte que es complementaria a una región en el ADN diana que es 3' de las repeticiones en tándem, (ii) opcionalmente, una parte espaciadora, (iii) una parte de anclaje que es complementaria de la región flanqueante en la cadena del producto PCR sintetizado por dicho cebador, (iv) una parte que es complementaria de al menos una repetición en tándem en la cadena del producto PCR sintetizado por dicho cebador y, (v) una secuencia corta de enganche rica en G/ C complementaria a una secuencia de enganche unida al extremo 5 'de la sonda de oligonucleótido a utilizar. [0097] El método descrito se lleva a cabo convenientemente, en el cual la sonda de oligonucleótidos es seleccionada para permitir discriminación entre el número de repeticiones en tándem en la parte de cadena simple del polinucleótido diana de acuerdo con su temperatura de fusión (T m). Así, la misma sonda de oligonucleótidos es capaz de discriminar entre diferentes números de repeticiones en tándem presentes. Normalmente, la sonda de oligonucleótidos puede discriminar entre 2, 3 y 4 repeticiones en tándem, o 3, 4 Y 5 o 4, 5 Y 6 o 5, 6 y 7 o 6, 7 Y 8 07, 8 Y 9 u 8, 9 Y 10 o 9, 10 Y 11 Y así sucesivamente, que están presentes en forma de cadena simple en el polinucleótido diana. Convenientemente, la sonda de ologonucleótidos puede discriminar entre 2, 3, 4, 5 Y 6 repeticiones en tándem que están presentes en forma de cadena simple en el polinucleótido diana. Sin embargo, con el uso de oligonucleótidos de bloqueo adecuados, es posible analizar los STRs con una muy amplia gama de posibles repeticiones en tándem. [0098] Es preferible que .llTm (es decir, la diferencia en T m que se produce en función del número de repeticiones en tándem con las que hibrida la sonda de oligonucleótidos) no sea inferior a 0.5 oC entre un número consecutivo de repeticiones. Más preferentemente, el .ll Tm es por lo menos 1 oC, típicamente por lo menos 2 oC, por ejemplo por lo menos 3 oC. Las propiedades de hibridación de la sonda de oligonucleótidos se pueden ajustar alterando su longitud, composición, grado de complementariedad con el polinucleótido diana de cadena simple, parte de anclaje (si existe) o parte de enganche (si existe). [0099] Preferiblemente, la etapa de hibridación (b) del método es llevada a cabo a una temperatura predeterminada próxima a la Tm o Tms del híbrido o híbridos formados entre la parte de cadena simple del polinucleótido diana y la sonda de oligonucleótidos. La temperatura predeterminada puede ser elegida en función del número de repeticiones en tándem a ser ensayados en la parte de cadena simple del polinucleótido diana, haya o no una cadena simple presente flanqueando la región, y las propiedades de la sonda de oligonucleótidos como se indicó anteriormente. [0100] Más preferiblemente, la etapa de la hibridación (b) se lleva a cabo en un intervalo de temperaturas que comprende las Tms del híbrido o híbridos formados entre la parte de cadena

simple del polinucleótido diana y la sonda de oligonucleótidos. [0101] Convenientemente, el intervalo de temperatura puede ser de 30°C a 75°C. Por lo general, los híbridos formados tienen un valor de Tm en un rango de 40°C a 65°C. Para el análisis del pico de fusión normalmente se aplica un conjunto de algoritmos que suavizan los datos (por ejemplo, elimina e.! ruido de fluorescencia), reduciendo el potencial de discriminación de alelo cuando l:!.Tms son pequeños. El número de repeticiones es determinado por el valor de Tm de los picos de fusión. El análisis de curvas de fusión de alta resolución promedia los niveles de emisión de fluorescencia en las regiones alta y baja del intervalo de temperatura para una corrección de fondo. Los alelos polimórficos que exhiben l:!.Tms pequeños tienen más probabilidad de ser diferenciados con el análisis de curvas de fusión de alta resolución. Los alelos TRS pueden ser diferenciados por la forma de las curvas de fusión, pero la determinación del número de repeticiones puede requerir una gama completa de patrones de longitud para su comparación. [0102] Existen varios instrumentos disponibles que tienen límites bajos de resolución térmica, y que pueden ser utilizados para discriminar entre la fusión de moléculas cuyas Tms son muy próximas. Por ejemplo, el instrumento HR-1 de fusión de alta resolución (HRM) de Idaho Technologies puede discriminar entre Tms que varían en menos de 1°C, por ejemplo, O.soC, o incluso sólo 0.1 oC. Otros instrumentos adecuados incluyen LightScanner (Idaho Technologies), Light Cycler 480 (Roche Diagnostics) y Rotor Gene-6000 (Corbett Life Sciences), de los que se ha descrito que procesan resoluciones térmicas superiores a 1.0oC. Corbett afirma que su Rotor-Gene 6000 tiene una resolución térmica de 0.02 oC, aunque esto se basa en curvas de fusión en lugar de picos. [0103] El polinucleótido diana puede ser cualquier polinucleótido diana que contenga repeticiones en tándem. Por lo general, el polinucleótido diana es ADN o ARN generados a partir de un ADN natural a analizar. Normalmente, el ADN natural es ADN genómico de una planta o un animal o un microorganismo. Como se describe en la introducción, las secuencias de repetición en tándem se encuentran en muchos genomas, y sus análisis son útiles en muchas situaciones. Los análisis de repeticiones en tándem del ADN en humanos y otros mamíferos pueden ser utilizados para diagnóstico médico, ciencia forense, pruebas de paternidad y parentesco y mapeo de ligamento. [0104] El análisis de las repeticiones en tándem en los genomas de los microorganismos puede ser utilizado en el control de enfermedades (por ejemplo, determinación de cepa) y en un entorno industrial (por ejemplo, determinación de la cepa de levadura utilizada en la fabricación de la cerveza y cocción del pan). [0105] El análisis de repeticiones en tándem en el ADN en productos alimenticios es útil para el traceado de materiales en la cadena alimentaria, por ejemplo tipo de material vegetal utilizado y así sucesivamente. [0106] Un ADN natural particularmente preferido es el ADN genómico humano. Como se ha discutido anteriormente, el ADN diana suele ser generado por una reacción de amplificación, tal como una PCR. [0107] Un segundo aspecto proporciona un sistema para determinar el número de repeticiones en tándem en un polinucleótido diana en las que una o más de las repeticiones en tándem en el polinucleótido diana están en forma de cadena simple, el sistema comprendiendo

(a) una sonda de oligonucleótido etiquetada que es complementaria de al menos una de las repeticiones en tándem, y al menos 5 nucleótidos de la sonda de oligonucleótidos son complementarios a las repeticiones en tándem, en la parte de cadena simple del polinucleótido diana, y

(b ) un oligonucleótido de bloqueo de que es complementario de al menos una pero no todas las repeticiones en tándem en el polinucleótido diana.

[0108] La sonda de oligonucleótido etiquetada y el oligonucleótido de bloqueo preferentemente tienen los atributos discutidos con respecto al método del primer aspecto. [0109] Los sistemas convenientes incluyen pero no están limitados a:

(1): (a) una sonda de oligonucleótidos etiquetada que contiene una parte de enganche y (b) un oligonucleótido de bloqueo que contiene una parte de enganche complementaria;

(2): (a) una sonda de oligonucleótidos etiquetada y (b) un cebador de PCR que contiene un oligonucleótido de bloqueo como se discutió anteriormente;

(3): (a) una sonda de oligonucleótidos etiquetada que contiene una parte de enganche y

(b): un iniciador de PCR que contiene un oligonucleótido de bloqueo y una parte de enganche como se discutió anteriormente, y

(4): un iniciador de PCR que contiene un oligonucleótido de bloqueo y una sonda de oligonucleótidos como se discutió anteriormente.

[0110] El sistema puede ser considerado como un "kit de partes" que contiene los dos oligonucleótidos (o un oligonucleótido en cierta realización). Convenientemente, el kit también puede incluir componentes de una PCR para producir el polinucleótido diana a partir de una molécula de ADN que ocurre de forma natural. El kit también puede contener métodos para detectar la hibridación de la sonda de oligonucleótidos con el polinucleótido diana. [0111] Un tercer aspecto proporciona un oligonucleótido que comprende una parte que al menos contiene dos repeticiones en tándem unidas a una parte de anclaje, donde la secuencia de la porción de anclaje y al menos dos repeticiones en tándem se producen de forma contigua en un polinucleótido diana. [0112] Preferiblemente, el oligonucleótido está etiquetado. Preferiblemente, el etiquetado de los oligonucleótidos es como se describió anteriormente. En este tercer aspecto, el ADN diana es todo o una parte de un STR humano y su región flanqueante. Preferentemente, el ADN diana es todo o una parte de cualquiera de los STRs y regiones flanqueantes mostradas en la Tabla 21. [0113] Preferiblemente, la porción de anclaje tiene las mismas características que se prefieren con respecto al oligonucleótido de bloqueo o la sonda de oligonucleótidos como se mencionó anteriormente. [0114] Preferiblemente, el oligonucleótido de este aspecto también contiene una parte espaciadora. Preferiblemente, la parte espaciadora que tiene las características de las partes espaciadoras descritas anteriormente. [0115] Un cuarto aspecto proporciona un cebador oligonucleótido para participar en una reacción de PCR para amplificar un ADN diana que contiene repeticiones en tándem que comprenden, de 3' aS', (i) una parte que es complementaria a una región en el ADN diana que es 3' de las repeticiones en tándem (ii) opcionalmente, una parte espaciadora, (iii) una parte de anclaje que es complementaria a la región flanqueante en la cadena del producto PCR sintetizado por dicho iniciador, y (iv) una parte que es complementaria de al menos una repetición en tándem en la cadena del producto PCR sintetizado por dicho iniciador. [0116] Opcionalmente, el oligonucleótido además puede comprender (v) una parte de enganche. Este oligonucleótido se puede utilizar en las realizaciones apropiadas como se mencionó anteriormente. [0117] Opcionalmente, en una realización diferente, el oligonucleótido puede además comprender (v) una parte espaciadora y (vi) una sonda de oligonucleótidos. Este oligonucleótido se puede utilizar en las realizaciónes adecuadas como se mencionó anteriormente.

[0118] El iniciador oligonucleótido preferiblemente no posee ninguna de las regiones de importante auto-complementariedad. La parte de anclaje y la parte de bloqueo (es decir, la porción (iv» no participan en la hibridación hasta después de la síntesis del ADN diana. [0119] En este cuarto aspecto, el ADN diana es preferiblemente como se describe con respecto el tercer aspecto anteriormente descrito. [0120] De modo similar, las parte de anclaje y las partes espaciadoras son preferiblemente como se describen con respecto al tercer aspecto discutido anteriormente. [0121 ]Se incluye también un sistema para determinar el número de repeticiones en tándem en un ADN diana, comprendiendo el sistema un oligonucleótido de acuerdo con el tercer aspecto y el cuarto aspecto. [0122] Se incluye también un método para la preparación de un oligonucleótido de acuerdo con el tercer aspecto, el método comprendiendo

(a): seleccionar unaADN diana que contenga repeticiones en tándem,

(b): obtener la secuencia de las repeticiones en tándem y la secuencia de uno o más de las regiones flanqueantes,

(c): sintetizar un oligonucleótido que comprende una parte que contiene al menos dos repeticiones en tándem unidas a una parte de anclaje, en la que la secuencia de la parte de anclaje y las al menos dos repeticiones en tándem están contiguas en un ADN diana, y, opcionalmente, una parte de enganche en su extremo 3 '.

[0123] Se incluye también un método para preparar un oligonucleótido de acuerdo con el cuarto aspecto, el método comprendiendo

(a): seleccionar un ADN diana que contenga repeticiones en tándem,

(b): obtener la secuencia de las repeticiones en tándem y la secuencia de uno o más de las partes flanqueantes,

(c): sintetizar un oligonucleótido que comprende, de 3' a 5', (i) una parte que es complementaria de una región en el ADN diana que es 3' de las repeticiones en tándem (ii) opcionalmente, una parte espaciadora, (iii) una parte de anclaje que es complementaria de la región flanqueante en la cadena del producto PCR sintetizado por dicho iniciador, (iv) una parte que es complementaria de al menos una repetición en tándem en la cadena del producto PCH sintetizado por dicho iniciador, y, opcionalmente, (v) una parte de enganche u, opcionalmente, (v) una parte espaciadora y (vi) una sonda de oligonucleótido.

[0124] Se comprende que si el oligonucleótido es un iniciador que posee repeticiones de bloqueo, puede ser preferible si el espaciador está presente con el fin de permitir la formación de la estructura de horquilla para la hibridación. [0125] El ADN diana seleccionado en estos aspectos puede ser cualquier ADN que contenga una repetición en tándem. Por lo general, el ADN diana es el ADN genómico. Preferentemente, es ADN genómico de mamíferos, más preferiblemente ADN genómico humano. Sin embargo, puede ser ADN de una planta, levadura o bacteria. [0126] Preferiblemente, el ADN diana contiene un STR humano, incluyendo las secuencias flanqueantes. Más preferentemente, el STR es uno que se describe en la Tabla 21. [0127] La invención se describirá a continuación con más detalle con referencia a las siguientes figuras y ejemplos. Figura. 1. Picos de fusión generados con el oligonucleótido STRV2 hibridado con oligonucleótidos diana. Los picos de fusión de izquierda a derecha fueron generados con dianas que poseen 5, 7, 8,10 Y 11 repeticiones en tándem de TATC. Figura. 2: A) análisis de la curva de fusión de 150nM de oligonucleótido STRV2 hibridado con oligonucleótidos diana 75nM de RC7 y 75nM de RC11. Se generaron dos picos de fusión claros con un LlTm de 6.6°C. B) Análisis de la curva de fusión de 150nM de la sonda STRV2 hibridada con oligonucleótidos diana 75nM RC10 y 75nM RC11. Se produce un pico de fusión ancho que impide una clara identificación de los alelos constituyentes. C) La hibridación de la sonda STRV2 con una mezcla de oligonucleótidos RC8 y RC10 produce dos picos de fusión claros con un LlTm de 3.TC. Figura. 3: A) Picos de fusión generados con la sonda STRV3 hibridada con los oligonucleótidos diana RC10d y RC11d. B) La hibridación de la sonda HYBSTR con el oligonucleótido diana RC10e da como resultado dos picos de fusión anchos y ruidosos debido a la ausencia de una secuencia de anclaje. Figura. 4: Secuencia del STR D16S539 obtenida de la base de datos NCBI (número de acceso G07925) (SEC ID. N 0: 70). Figura. 5: A) Amplificación y detección de secuencias D16S539 en tiempo real utilizando un instrumento LightCycler y la sonda de oligonucleótido HYBSTR. B) Picos de fusión generados con una muestra heterocigótica de 11 y 13 repeticiones C) Picos de fusión generados con una muestra heterocigótica de 8 y 13 repeticiones. Figura. 6: a) análisis de dianas STR usando la estrategia de bloqueante bimolecular. Las dianas STR están representadas por recuadros de color negro, las repeticiones en el oligonucleótido bloqueante se representan por recuadros ajedrezados y las repeticiones en la sonda fluorescente se representan por recuadros de color gris. El largo anclaje del bloqueante y el exceso molar empleado (en relación a la sonda) impide que la sonda hibride totalmente con las dianas cuando el número de repeticiones es inferior a 15. B) Picos de fusión generados con oligonucleótidos diana usando la sonda FL 1 en presencia del bloqueante B1. Picos de fusión de izquierda a derecha generados con dianas que poseen 8, 9, 10, 11 Y12 repeticiones de GATA. C) Picos de fusión se generaron con oligonucleótidos diana usando la sonda FL1 en ausencia de bloqueante B1. Picos de fusión de izquierda a derecha se generaron con dianas que poseen 5, 6, 7, 8, 9 Y 10 repeticiones de GATA. Figura. 7: A) Amplificación en tiempo real de dianas STR a partir de ADN extraído y muestras de saliva usando un instrumento LightCycler, la sonda FL 1 Y bloqueador B1. El bloqueador B1 bimolecular reduce la eficiencia de la PCR, de tal manera que los ciclos umbrales (Cts) se retrasan hasta aproximadamente 38 -40 ciclos. Omitiendo el bloqueador de los ensayos PCR da Cts de aproximadamente 32 ciclos. B) Picos de fusión generados con una muestra heterocigótica para alelos de 9 y 12 repeticiones. Figura. 8: a) Análisis de dianas STR utilizando la estrategia bloqueador unimolecular /cebador. Las dianas STR están representadas por recuadros en negro, las repeticiones en el oligonucleótido bloqueante están representadas por recuadros ajedrezados y las repeticiones en la sonda fluorescente por recuadros en color gris. Las repeticiones del bloqueador, la secuencia de anclaje y el cebador delantero están incluidas en un único nucleótido. El bloqueador y la secuencia diana amplificada se hacen parte la misma cadena de ADN, por lo tanto, el bloqueador unimolecular puede no inhibir la PCR al obstruir la progresión de Taq polimerasa. La unión unimolecular del bloqueador con las repeticiones amplificadas está termodinámicamente favorecida frente a la hibridación de la sonda, evitando la unión de la sonda de longitud total cuando el número de repeticiones es inferior a 15. Se presenta un ejemplo de la hibridación de la sonda con alelos D16S539 que poseen 8 y 13 repeticiones.

Figura. 9: A) Amplificación en tiempo real de dianas STR a partir de ADN extraído y muestras de saliva usando un instrumento LightCycler, la sonda FL 1 Ybloqueador unimolecular BP1/cebador. Los Cts de detección para los productos amplificados fueron aproximadamente de 32 ciclos. B) De izquierda a derecha, picos de fusión generados con muestras homocigotas para alelos de 11, 12 Y13 repeticiones. C) Picos de fusión generados con una muestra heterocigótica para alelos de 8 Y13 repeticiones. D) Una muestra heterocigótica que posee alelos de 9 y 12 repeticiones. E) Una muestra heterocigótica que posee alelos de 11 y 13 repeticiones. F) Una muestra heterocigótica que posee alelos de 11 y 12 repeticiones. G) Una muestra heterocigótica que posee alelos de 12 y 13 repeticiones. Figura. 10: Picos de fusión generados con la sonda FL4 y el bloqueador BP1. A) Un heterocigótico extraído de muestra de ADN para alelos de 9 y 12 repeticiones. B) Análisis directo de una muestra de saliva no purificada del genotipo 11/13. C) Análisis directo de una muestra de saliva no purificada del genotipo 8/13. D) Una muestra extraída de ADN de genotipo 10/11. E) Una muestra extraída de ADN de genotipo 10/13. Figura. 11: Capilares LightCycler que contienen secuencias diana amplificadas, bloqueador unimolecular BP1/cebador y oligonucleótido FL 1 fueron reanalizados usando un instrumento de de alta resolución de fusión HR-1. A) De izquierda a derecha, picos de fusión generados con alelos de 11, 12 Y13 repeticiones. Los genotipos homocigóticos 11/11, 12/12 Y13/13 generan un pico de fusión único, mientras que los genotipos heterocigóticos 11/12 y 12/13 dieron picos anchos con resaltes. B) Los datos de la curva de fusión de alta resolución muestran una diferenciación fiable de alelos de 11, 12 Y 13 repeticiones. C) los genotipos 11/12 y 12/13 se diferencian de los genotipos 11/11, 12/12 Y 13/13. D) Reanálisis de los datos LightCycler utilizando un software OriginPro 7.5 (Origin Lab, Massachusetts, EE.UU.). La sonda FL 1, en presencia del bloqueador BP1, generó un pico de fusión ancho con una muestra de saliva del genotipo 11/13, presentando sólo un pequeño resalte de pico para el alelo de 11 repeticiones. El software OriginPro identificó el resalte como un pico verdadero y representó los dos picos de fusión componentes para los alelos de 11 y 13 repeticiones. Figura. 12: Se sintetizaron oligonucleótidos bloqueantes con 5 y 7 repeticiones TATC, una secuencia de anclaje y un enganche rico en GC. Se sintetizaron oligonucleótidos con 10 Y 8 repeticiones TATC con un enganche GC complementario al del bloqueador. A) Sólo 5 repeticiones del oligonucleótido 1 OSFL1 se hibridarían con una diana de 10 repeticiones en presencia del bloqueador 5LSB1. B) Sólo tres repeticiones del oligonucleótido 8SFL2 podrían hibridarse con una diana de 10 repeticiones en presencia del bloqueador 7LSB2. C) Picos de fusión generados con 5LSB1 y 1 OSFL1 utilizando oligonucleótidos complementarios que poseen 8-14 repeticiones GATA. D) Picos de fusión generados con 7LSB2 y 8SFL2 usando oligonucleótidos complementarios que poseen 10-15 repeticiones GATA. Figura. 13: Secuencia del STR TH01 obtenida a partir de la base de datos NCBI (Número de Acceso NT _009237) (SEC ID N 0: 71). Figura. 14: Picos de fusión obtenidos con alelos STR TH01 amplificados, utilizando la sonda HYBTH01 y el bloqueador bimolecular TH01_BL. Se presentan picos de fusión que representan alelos de 8, 9, 9.3 Y10 repeticiones ..

Figura. 15: Los bloqueadores unimoleculares pueden poseer porciones de enganche de longitud variable y / o composición (A 1, A1, A3, etc), y la sonda de oligonucleótidos puede contener partes de enganche complementarias a las partes de enganche de los iniciadores de la PCR (A1', A2', A3', etc).

Figura. 16: Sonda de oligonucleótidos unido al cebador de PCR en una formación unimolecular.

Figura. 17: Partes complementarias de enganche conteniendo fluoróforo, capaz de FRET, o

pares fluoróforo:apagador.

Figura. 18: Resultados utilizando dos bloqueadores "desplazados" D8S 1179, que permiten la detección de alelos de 8, 9, 10, 11, 12 repeticiones. El pico de fusión "+", surge de la hibridación

sonda de longitud completa con las repeticiones diana no bloqueadas.

Figura. 19: Detección de de los alelos D8S1179 de 11 y 15 repeticiones. Los alelos de 11 y 15

repeticiones se detectan de forma simultánea utilizando la sonda HYBD8 en combinación con los

bloqueadores de repetición 7.2 y 10.3 respectivamente, incluyendo todos los oligonucleótidos en un solo tubo.

Ejemplo.1 Materiales y métodos para los ejemplos Diseño y síntesis de la sonda de oligonucleótidos [0128] Fosforamiditas ADN estándar, soportes sólidos y reactivos adicionales se adquirieron de Link Technologies o Applied Biosystems Ud. La fosforamidita-C6-Psoraleno fue adquirida de Glen Research Inc. Todos los oligonucleótidos fueron sintetizados en un sintetizador automático 394 de ADN I ARN de Applied Biosystems utilizando un ciclo de 0.2!Jmoles de fosforamidita de destritilación catalizada con ácido, acoplamiento, bloqueo y oxidación con yodo. A los monómeros normales (A, G, C Y T) se les dejó acoplarse 25 segundos y a todos los demás monómeros un período adicional de 300 segundos. La eficiencia del acoplamiento gradual y el rendimiento global de monómeros con protección DMT se determinaron midiendo la conductividad del catión tritilo que en todos los casos fue > 98,0%. La separación de los oligonucleótidos del soporte sólido se llevó a cabo con una solución concentrada de amoníaco (33%) a 550 C durante 5 horas en tubo sellado. Se unieron fluoróforos a residuos internos en la secuencia de la sonda usando C6 FAM dU (Universidad de Southampton, Reino Unido) o Fluoresceína dT (Glen Research, Sterling, VA). En el caso de C6 FAM dU, 6-carboxifluoresceína (FAM) se acopló a la posición 5 de la base uracilo a través de métodos de síntesis de ADN, que son bien conocidos en la técnica. Los oligonucleótidos pueden poseer un componente 3'-fosfato u otro agente de bloqueo para evitar la extensión mediada por Taq cuando las sondas se incorporan en ensayos de PCR en tiempo real. La cantidad de sonda obtenida a partir de la síntesis se determinó disolviendo una alícuota de la sonda de oligonucleótidos en un volumen específico de agua y midiendo la absorbancia UV a 260 nm. La concentración de la sonda se calculó a partir la absorbancia UV del oligonucleótido y su coeficiente de extinción a 260 nm. El coeficiente de extinción del oligonucleótido se calculó a partir de la suma de los coeficientes de extinción individuales de los nucleósidos sin modificar y etiquetados por fluorescencia que lo componen.

Purificación de oligonucleótidos.

0129] La purificación de oligonucleótidos se llevó a cabo por HPLC de fase inversa en un sistema Gilson utilizando una columna ABI Aquapore (C8), 8 mm x 250 mm, tamaño de poro 300 A controlado por un software Gilson 7.12. Se utilizó el siguiente protocolo: tiempo de ejecución 30 minutos, velocidad de flujo 3 mL por minuto, sistema binario: Tiempo en minutos (% de buffer B); O(O), 3 (O), 5 (20); 22 (100); 25 (100); 27 (O); 30 (O). Buffer elución A: acetato de amonio 0.1 M, pH 7.0, buffer B: acetato de amonio 0.1 M con un 25% de acetonitrilo pH 7.0. La elución fue supervisada por absorción ultravioleta a 310 nm (oligómeros de fluoresceína) o 295nm (todos los demás oligómeros). Después de la purificación por HPLC se desalaron los oligonucleótidos usando columnas desechables Sephadex NAP10 (Pharmacia) siguiendO las instrucciones del fabricante, se sacaron alícuotas en tubos Eppendorf y se almacenaron a -20 C en agua

o

destilada desionizada.

Reacción en cadena de la polimerasa

[0130] Los volúmenes de PCR fueron normalmente de 20 !JI, comprendiendo en general 2 !JI de muestra, 1 x tampón QIAGEN PCR, 0.5!JM de cebador delantero, 0,1 !Jm de cebador inverso, una unidad de polimerasa Taq HotStarTaq, 3mM total MgCb, 5ng/!J1 BSA (Roche Diagnostics), 1 mM dNTPs (GE Healthcare) y 150 nM de sonda. Se llevó a cabo una amplificación homogénea y una detección de dianas con un instrumento LightCycler (Roche Diagnostics), donde después de un paso inicial de desnaturalización (95 C 15 min), las dianas fueron amplificadas utilizando 50

o

ciclos que comprenden desnaturalización (95 o C 5 s), hibridación del cebador (55 o C 10 s) y extensión de productos (72 o C 10 s).La adquisición de fluorescencia se llevó a cabo una vez por ciclo al final de cada paso de hibridación del cebador. El análisis de la curva de fusión se llevó a cabo inmediatamente después de la amplificación con LightCycler, mediante una breve desnaturalización (95 o C 5 segundos) y enfriamiento (35 o C 30 segundos) de las muestras antes de aumentar la temperatura de 35 oC a 95 oC utilizando una velocidad de transición de 0.1 oC I seg y una adquisición continua de fluorescencia. Los picos de fusión fueron construídos utilizando el software LightCycler (versión 3.5) por trazado de la derivada negativa de la fluorescencia con respecto a la temperatura (-dF/dT en el eje y) frente a la temperatura (eje x). Las dianas fueron detectadas e identificadas usando las temperaturas de fusión (T m) de los picos de la sonda. [0131] La amplificación de secuencias diana se realizó también usando placas de PCR blancas de 384 pocillos (Bio-Rad) y un termociclador Tetrad de 384 pocillos (MJ Research Inc). En general los protocolos térmicos consistieron en una fase inicial de desnaturalización (95 oC 15 minutos) para activar la enzima Hot Start, seguido por 50 ciclos de PCR que incluyen desnaturalización (95 oC 15 s), hibridación del cebador (55 oC 30 s) y extensión de productos (72 oC 30). El análisis de la curva de fusión se realizó inmediatamente después de la amplificación utilizando un instrumento LightTyper (Ro che Oiagnostics), calentando las muestras gradualmente de 35 oC a 75 oC usando una velocidad de transición de bien 0.1 oC I seg o 0.05 oC I seg .

Análisis de repeticiones cortas aleatorias [0132] El potencial de las sondas de oligonucleótidos para analizar repeticiones cortas en tándem (STRs) se investigó usando una serie de oligonucleótidos diana. Tres sondas fueron sintetizadas para detectar y discriminar alelos 016S539 (tabla 1), que pueden incluir entre 5 y 15 repeticiones GATA. Todas las sondas constan de una secuencia de anclaje 5 'GGTG que se halló que reduce la posibilidad de deslizamiento de la sonda a lo largo de la secuencia de repetición, evitando de este modo la generación de picos de fusión anchos y ruidosos. En ausencia de un anclaje, la repetición en S' de la sonda de STR podría interactuar con cualquiera de repeticiones diana, de tal manera que podría ocurrir una hibridación de longitud total o parcial. La secuencia de anclaje, que flanquea inmediatamente a la secuencia repetitiva, favorece que la sonda hidride en localizaciones específicas y ayuda a prevenir el fenómeno de deslizamiento de AON. La estabilidad y eficacia del anclaje se determina en gran medida por su longitud y la composición de la secuencia. Una insuficiente estabilidad puede permitir un grado de deslizamiento de AON, mientras que un anclaje con excesivo Tm podría impedir la diferenciación de alelos STR. Oe este modo, una secuencia de anclaje ayuda a lograr la hibridación de la primera repetición homóloga de la secuencia diana con la primera repetición homóloga de la sonda de oligonucleótidos con preferencia a la unión de la sonda en cualquier número de posiciones. [0133]Las sondas STRV2 y STRV3 también comprendían modificaciones con hexaetilenglicol (HEG) en un intento de separar la sonda en dos componentes separados, reduciendo por ello la Tm total de la sonda y mejorando la capacidad de discriminación de alelos. Las sondas se etiquetaron con dos fracciones de fluoresceína y poseían un 3' fosfato para evitar extensión por Taq polimerasa cuando se incluyen en los ensayos de PCR.

Tabla 1 Oligonucleótidos y secuencias de oligonucleótidos diana, donde 5, (HEG) Y 3P representan el fluoróforo FAM e6 dU, hexaetilenglicol y 3 'fosfato, respectivamente.

« « «

. --.

•

OllGO: SIC"" SECUENCIA COMENTARIO

HVasm: 3 GGTOCMTACMMCMTAC:IAIACMTAGATAOATA GATAdATAOA1:AGATAGATAGATAGATASP 1. ~1aMs

STRVa: ... GGTOCMTAGATAGATA(HEG)GATAGAtWMTAGAMlIATAGATACMTAGATA3P 11 RIIpaIcIanD

STRW: S GCl18CMTAMTAGATA(ICO)(HIGJ(MTAGAI AGATA.GNMIIATAGATNlATNlATNlATMAT AGATAdATAIP 18 ............

Res: • lATCTATCTATCTATCTATCeACC 6~

Re7: 7 TATCTATCTATCTATCTATCTATCTATCCACC 7.."..1CioNIa

Reí: í TATCTATCTATCTATCTATCTATCTATCTAl'CC ACC 8 RepalaIaMs

RO 'O: t TATCTATCTATCTATCTATCTATCTATCTAlCT ATCTATCCACC 10 ~1aMs

ROll': 10 TATCTATCTATCTATCTATCTATCTATCTATCT ATCTATCTATCCACC l' ,..~

RC1Qtt: 11 fATCTGtCfA1'ClGTCTATCTGTCTATClGTCT ATCTGTCCACC 5QIT DIuJu....

R010c: 12 TG1CTG1'CT'GTCT'GTCTaTCTGTCTGTC TGTClGTCCACC , 10QITDHaJu....

ROIOd: 13 TATCTAlCTATCTATCcccTTATCTATCTATCT ATCTATCCACC •.~

R010e: ,. TATCTATCTATCTATCTATCTATCTATCTATCT ATCTATC :::,a_

RC11b: 1i TATCTGTCTATCTGTCTATCTGTCTATCTCWCT ATCTOlCTATCCACC - 500 DeSajustes

Re11Q:: ,. TGTCTGTCTGTCTG1CTGTClGTCTGTCTCTC 1VI'CTG'I'C1'Q1C 11 GIT aMa)!....

RC11d: 11 TAlCTATCTATCTATCTATcCCClTAtCTA'fCT ATCTATCTATCCACC ~8'Imock__

ROl1.: ,. TATCTATCTATCTATCTATCTATCTATCTATCT ATCTATCTATC ¡Anctlje.bp retirado

[0134) La sonda HYBSTR fue el punto de partida para el desarrollo. Las mejoras en Tm de la sonda A y la discriminación de alelosdeberán ser referidos a esta sonda. [0135 Se sintetizaron oligonucleótidos sonda para simular varios alelos 016S539, que poseen 5, 7, 8, 10 Y11 Y11 repeticiones T A TC junto con una secuencia complementaria 3' CACC a la

5 sonda de anclaje (tabla 1). 150nM de la sonda de oligonucleótidos 016 se hibridaron con 150nM de cada oligonucleótido diana en un buffer PCR Takara y un total de 3 mM de MgCI2. El análisis de la curva de fusión se llevó a cabo con un instrumento LightCycler donde, después de una desnaturalización inicial (95 oC 5 segundos) y enfriamiento (35 oC 30 segundos), las reacciones se calentaron de 35 oC a 95 oC usando una velocidad de transición de temperatura de 0.1 oC /

10 seg. Las temperaturas de fusión de la sonda observadas con secuencias diana sintéticas se detallan en la Tabla 2. Los picos de fusión generados con la sonda STRV2 y cada oligonucleótido diana se presentan en la figura. 1. [0136 Las sondas fueron también analizadas con combinaciones de oligonucleótidos diana, simulando genotipos heterocigóticos que poseen alelos con diferente número de repeticiones

15 (Tabla 2). La capacidad de genotipar muestras heterocigóticas depende del ~Tm de los dos alelos 016 presentes. Normalmente se requiere por el equipo LightCycler una diferencia de Tm de al menos 3 oC para generar señales de fusión heterocigóticas con picos constituyentes claros (sin embargo, hay otros instrumentos disponibles que proporcionan discriminaciones mayores, como por ejemplo un instrumento High Resolution Melt como HR-1 de Idaho Technologies). Las

20 dianas más cortas 016 (por ejemplo 5 y 7 repeticiones) muestran ~Tms mucho mayores que secuencias más largas (por ejemplo 10 Y 11 repeticiones) y por lo tanto son más fáciles de discriminar. La figura 2 demuestra que mientras que los genotipos 7/11 y 8/10 pueden ser claramente discriminados con STRV2 Tms de las repeticiones 10 Y11 son demasiado similares para permitir una detección simultánea. (Sin embargo, como más discute adelante, la detección

25 simultánea de .10 Y11 repeticiones se logra utilizando un oligonucleótidode bloqueo (BP1) Yuna sonda de oligonucleótido diferente (FL 1), demostrando un ~Tm de 3.5°C)

Tabla 2: Tms and ATms de sonda derivados de la hibridación con secuencias de oligonucleótidos diana. 30

~Dn.l1Ipdci6n: 1m. CAn..

KW'IMTR: 111M 8l'R'n

M: 41••'C -

717: i5.óff'C

...: 68.0"(:

'0110: fa#e tQ.80'(: $$.$4'(:

UI11: 64.$4'(: 81.70'(: 81.8a'(:

fJI1: {U'C)

MJ: {t.:rC)

eil1.: (12"'C)

eiln: (1~()'Q

718: (1.TC)

rJi.: (5,1$'<::)

1111: (G.e'C)

811.: F (ltTC)

8111: (4.t'C)

10111: (CuZ'e) (t1'C) (1••'C}

Ejemplo 2

[0137 Las muestras heterocigóticas que comprenden secuencias largas de repetición no siempre son tipificadas con precisión utilizando los diseños de oligonucleótidos descritos en el Ejemplo 1. Ya que la magnitud del IITm de la sonda depende de la longitud y la composición de las dianas STR, la desestabilización de la hibridación puede aumentar la sensibilidad a los polimorfismos de longitud. La desestabilización de la sonda se puede lograr mediante una estrategia como:

•: La introducción de nucleótidos desajustados para reducir Tm de la sonda. El número de desajustes depende de la longitud y la composición de la secuencia de la sonda y el tipo de desajuste empleado. Mayores números de desajustes estables, tales como G / T, pueden ser empleados en repeticiones múltiples a lo largo de la longitud de la sonda para reducir Tm. Se requerirían menos desajustes altamente desestabilizadores, tales como C/A, para conseguir la misma reducción de Tm. Una alternativa para distribuir los desajustes a lo largo de la longitud de la sonda es agrupar los desajustes eliminando de esta manera una repetición completa del oligonucleótido, de forma que una sonda de 15 repeticiones puede, por ejemplo, separarse en 5 y 9 componentes de repetición.

•: Incorporando análogos de bases, tales como la N4-etil-dC7 -deaza-dG, 7 -deaza dC, C-5 propinil-dC, C-5-propinil dU, 5-metil-dC, 2-amino-dA, G-enganche1 (un análogo de aminoetilfenoxazina tricíclica 2'-dC), de ácido nucleico cerrado (LNA), 5'-trimetoxiestilbeno cap., 5'-pireno cap. Puede haber ventajas de aumentar Tm utilizando tales análogos a fin de diferenciar adicionalmente la contribución de las diferentes regiones de la sonda a la temperatura de fusión total con el fin de fin de mejorar aún más el IITm observado entre diferentes longitudes de repetición para modificar el Tm de la sonda.

•: Incluir espaciadores HEG, TEG (u otros) más largos para dividir la sonda en componentes individuales.

•: Etiquetar la sonda de oligonucleótidos con más de dos fluoróforos.

[0138] Para investigar el efecto de los desajustes de nucleótidos en el Tms y IITm de la sonda, se incluyeron sustituciones de bases en dianas de oligonucleótido en lugar de las sondas para facilitar la evaluación experimental. Las modificaciones hechas a las secuencias diana comprenden 10 Y11 repeticiones se detallan en la Tabla 1. [0139] Los RC10b, RC10c, RC11 b y RC11 c incorporaron 5 y 10 desajustes de nucleótidos GIT regularmente distribuidos por el duplex sonda/diana. Las sustituciones de bases redujeron la Tm del duplex sonda/diana considerablemente (compárense los cuadros 2 y 3) Y también incrementaron elllTm de las sondas HYBSTR, STRV2 y STRV3. Sin embargo, la magnitud del incremento de IITm fue insuficiente para una discriminación fiable de alelos de 10 Y 11 repeticiones STR usando el software LightCycler. [0140] Los oligonucleótidos RC1 Od y RC11 d incorporaron cuatro desajustes de nucleótidos en la sexta repetición común de los STR diana. Estos desajustes redujeron la Tm de los oligonucleótidos D16 e incrementaron la IITm entre oligonucleótidos de repetición 10 Y11 (Tabla 3). Ambos picos de las repeticiones 10 Y11 se hicieron visibles utilizando la sonda STRV3 (Figura 3A). Sin embargo, son necesarias nuevas mejoras de la sonda IITm para identificar y discriminar de forma fiable largas dianas STR usando el software LightCycler, y esto se demuestra a continuación. [0141] Los oligonucleótidos diana RC10e y RC11e han demostrado la necesidad del anclaje 4bp con la sonda HYBSTR. El oligonucleótido generó curvas suaves definidas con todas las otras dianas modificadas y no modificadas, pero generó señales anchas y·ruidosas en ausencia de anclaje (Figura 3B). Esta reducción en la calidad del pico, fue causada por el deslizamiento de la sonda a lo largo de la secuencia diana. Curiosamente, la sonda STRV2 no mostró tal reducción en la calidad del pico en ausencia de anclaje, posiblemente debido a la presencia de la modificación interna HEG.

Tabla 3: Tms y Il. Tms de la sonda con oligonucleótidos diana desajustados.

Sonda: Re10.. Reit .. A.T. ROiO. MU. A.T. Re10d RC11d AT.

&a••: 51.A" 1."11 48.301 40.37 U)3 51.· •.a 1.66

12.18 It.•: 13.'" II.U 1.21 2.4t ....03 0.22 MUI2 ¡fA•• 1.01 1.• 51.2 M.S7 •.3 ••03 2.1 1.al

[0142] Las secuencias diana D16S539 se amplificaron mediante Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) utilizando los cebadores STRF2 y STRR2. La tamaños de los productos de amplificación varían con el número de repeticiones y el intervalo desde 133bp a 173bp 01er Figura 4 para secuencia de genes).

STRF2 CAGATCCCAAGCTCTTCCTCTTCCCTAG (SEC ID NO: 19)

STRR2 ACGTTTGTGTGTGCATCTGTAAGCATGTATC (SEC ID NO: 20)

15 [0143] Siete muestras de saliva fueron analizadas directamente, sin purificación de ADN, usando la sonda HYBSTR y un instrumento Light-Cycler. Las muestras de saliva eran todas de genotipo heterocigótico y tenían genotipos de repeticiones 9/12, 13/15, 9/13, 11/14, 9/12, 11/13 Y8/13. La fluorescencia en tiempo real aumentó y la generación de picos de fusión confirmó que las dianas D16 fueron amplificadas de manera eficiente a partir de muestras de saliva. Los genotipos

20 heterocigóticos que poseen alelos D16 que difieren en 2, 3 o 4 repeticiones no generaron picos individuales claros para cada alelo constituyente. En su lugar se generaron perfiles de fusión amplios, combinando los picos de cada repetición D16. Una diferencia en la repetición cinco de un genotipo D16 8/13 fue suficiente para generar picos claros para cada alelo (figura 5).

25 Ejemplo 4

[0144] El efecto de un sitio abásico en la estabilidad del dúplex fue investigado usando sondas que poseen secuencias de anclaje en 5 'y 3' de y sondas que sólo tienen anclaje en 3 '(Tabla 4). Las sondas fueron diseñadas para la cadena menos de ADN incrementando el número de sitios

30 potenciales de unión a fluoróforo. Las sondas se hibridaron a oligonucleótidos complementarios que poseen 5, 7, 10, 12 Y15 repeticiones (Tabla 5).

Tabla 4: Sonda de oligonucleótidos empleadas para analizar el efecto de un sitio abásico, donde 4 y 5 representan el sitio abásico y etiquetas fluorescentes de fluoresceína dT, 35 respectivamente.

.

-

Sonda: seclO Secuencia

U4IIIIR: 21 CAATGATAIICTATCTASCTATCTASCTATCTASCTATCTASCTATCTASCTATCTATCTATCTATCCACC

U461R: 22 CAATGATASCTATCTASCTATCTASCTATCTASCTATCTASCTATCTA!C4I\TCTATCTATCTATCCACC

OaüM: 23 TASCTATCTASCTATCTAlSCTATCTASCTATCTASCTATCTATCTATCTATCTATCTATCCACC

."...: 24 TMCTATCTAlSCTATCTASCTATCTAlSCTATCTASCTATC4ATCTATCTATCTATCTATCCACC

Tabla 5: Oligonucleótidos empleados como dianas para evaluación de la sonda, donde (GATA)" representa el número de repeticiones STR

OlIDO: aeclD IIOUINQA

es: 25 CCCTAGA.TCMT~ (GAT.A),TOAlTGAAAG

C7: 26 CCCTAGATCMT~G fGATAqTOAlTGAAJIIJ

ca: 21 CCCTAGATCMT~G (GAT.A)aTCAlTGAAAG

ct: a <::CCTN.MTeMT~~G (GA"A)gTCA~

C1a: 29 (:CCT.t.GA"CMT~~TG (GATA)ttTCAtTGAAAG

CU: ao CCCTNMTOMT~(J (GAT~lTCA1TOAAAO

C"2: 31 COOTNMTCMT~TG (GAT.A)fZTCAtTGAAAG

c.a: 32 eCCTAGATCMT~G ((MT~.TCAJ1'GAAAO

C.4: 33 eQCTAGATCMT~G (GAT.A)""CAl'T~

c...: 34 CCCTNMTCMT~ (GAT~5TCATTGMAG

[0145] La inclusión de un sitio abásico generalmente redujo el Tm de la sonda de hibridación en

5 aproximadamente 1-2 oC. Sin embargo, no se logró mejorar elll. Tm (Tabla 6). Se generaron picos de fusión de alta calidad con sondas que comprenden cinco y seis bases T etiquetadas con fluorescencia. Otros diseños de sonda generaron picos de fusión de alta calidad cuando se etiquetaron con hasta 8 bases fluorescentes. Las sondas que poseen más de 8 fluoróforos no se han ensayado hasta la fecha, pero se espera que sean funcionales dada una longitud de sonda

10 Yun espaciamiento adecuado entre etiquetas.

Tabla 6: Efecto de un sitio abásico en Tm de la sonda.

Repeticiones: IZ4RR IUIIR

S: 451.«)%0

7: 10.6''0 N.erO

10: 64.8''0 11.1"0

121.: I1Jt''O • .I'fO 64.8'0 •.I~C 17..4''0 a.l~c leU~D 118.0"0

ATmfar7JtS: '.3"'0 1.2'0 14.trC

Ejemplo 5

[0146] Los alelos de D16S539 siempre poseen al menos 5 repeticiones de GATA. Por lo tanto, la

30 Tm de hibridación DE sonda puede reducirse si las repeticiones STR están separadas en dos oligonucleótidos (Tabla 7). El primer oligonucleótido es no-fluorescente y actúa como un bloqueador, y comprende las primeras cinco repeticiones en común. El segundo oligonucleótido es una sonda fluorescente que hibrida sólo con repeticiones adicionales, es decir, sólo detectará cinco repeticiones de un alelo de 10 repeticiones (Figura 6A). El propósito del bloqueador es reducir el número de repeticiones STR disponibles para la sonda fluorescente, y de este modo aumentar /1Tms entre alelos de similar longitud. [0147] El oligo de bloqueo (81) consiste en 5 repeticiones de d (TATC), una secuencia de anclaje

5 31-mero para evitar deslizamiento (que es totalmente complementaria a la secuencia flanqueante) y un grupo fosfato en 3' para evitar la extensión de la sonda durante la PCR. La sonda de oligonucleótidos fluorescente (FL 1) tiene 10 repeticiones de d(TA TC), 5 bases internas de fluoresceína dT (Glen Research), un anclaje corto de seis nucleótidos (que es totalmente complementario a la otra secuencia flanqueante) y un bloqueador octanediol de PCR en el extremo 3 '(Tabla 7).

Tabla 7: Análisis de STR utilizando un bloqueador bimolecular y sonda de oligonucleótidos, donde P, 5 Y 6T representan 3 'fosfato, fluoresceína dT y octanediol respectivamente.

01110: seo 10 Secuencia

81: 36 TATCTAfCfATeTATCTAT~QTCTGfCTGTeTG1'AT1GATeTAGQG pi

FU: 38 MTClATCSATCTATOIATCtATCSATCTATCSATCTATClT

[0148] Se empleó un exceso molar del oligonucleótido de bloqueo para favorecer la hibridación a las cinco repeticiones comunes. Se empleó 100 nM de la sonda FL 1 con 600 nM del bloqueador 81 para analizar oligonucleótidos complementarios que tienen 8, 9, 10, 11 Y 12 repeticiones GATA (Figura 68). Los Tms y /1Tms de la sonda para cada diana se presentan en la Tabla 8. La división de la sonda STR diseñada en dos componentes mejoró considerablemente los /1Tms y la capacidad para diferenciar alelos de longitud similar. Por ejemplo, el/1 Tm para un genotipo 10/11

25 fue de 0.92 oC cuando se analizó con la longitud completa de la sonda HY8STR, pero se incrementó a 2.2 oC con esta estrategia de bloqueo bimolecular. [0149] La detección de los alelos de 5 y 7 repeticiones podría requerir que fuera omitido el oligonucleótido de bloqueo en las reacciones. La figura 6C muestra los picos de fusión generados con la sonda FL 1 1 en ausencia del bloqueador 81. Puede ser necesario realizar ensayos con y sin el oligonucleótido de bloqueo en paralelo para detectar e identificar la serie completa de alelos D16S539.

Tabla 8: Tms y ~Tms de la sonda derivados de la hibridación de la sonda FL 1 con las secuencias diana de oligonucleótidos en presencia del bloqueador bimolecular 81. 35

Combinación de repetición: Tm&(ATm)

MI: 40.0'0

QII: 41.5'0

101tO: IU'O -

11/11: 54.0'0

t2tf2: 51.0'0

lit: (T.5'O)

&I1G: (11.8'0)

8/11: (t.UO)

&112: (tU'O)

.,,0: (4.1'0)

.,,1: (6,5'0)

if12: (U'O}

10111: (U'O)

10112: (U'O}

11112: (D'C)

EJEMPLO 6

[0150] Las secuencias diana de 016S539 fueron amplificadas de AON extraído y directamente de

muestras de saliva utilizando los cebadores STRF2 y STRR2. Las concentraciones relativas del bloqueador 81 y la sonda de oligonucleótidos FL 1 requirieron una optimización para posibilitar una amplificación eficiente de la diana mientras que se evita la hibridación de la longitud total de la sonda con dianas de menos de 15 repeticiones. La optimización se logró mediante analizando varias concentraciones y proporciones de los oligonucleótidos de bloqueo y el oligonucleótido sonda. Una proporción 6: 1 de oligonucleótidos de bloqueo y oligonucleótido sonda se demostró útil. Una cantidad insuficiente de bloqueante 81 generó un pico común a aproximadamente 59 oc donde la sonda FL 1 no estaba totalmente bloqueada permitiendo que las 10 repeticiones hibridasen. Por el contrario, demasiado bloqueador 81 inhibió la amplificación de la diana aumentando el número de ciclos en los cuales la diana fue detectada (FIG) 7 A. Se vió que la concentración óptima fue 37.5 nM de la sonda FL 1 que fue empleada junto con 225nM de bloqueador 81. El análisis se realizó con el AON extraído y muestras de saliva con genotipos 11/11, 10/11, 12/12, 10/13, 11/12, 13/13, 12/13 Y 9/12. Los Tms de los picos de fusión que corresponden a 9, 10, 11, 12 Y 13 repeticiones fueron 47.0oC, 51.5 oC, 53.5 oC, 56.0 oC y 57,5 oC, respectivamente. La muestra del genotipo 9 / 12 fue el único perfil de fusión que produjo dos picos claros (Fig. 78). El pico de la repetición 10 no se detectó de manera eficiente con ninguna muestra. El pico de la repetición 10 tuvo una altura reducida comparado con el de las repeticiones 11 y 13. El pequeño IITm significaba que el pico de la repetición 10 estaba oculto dentro de la traza de las trazas de las repeticiones 11 y 13, de tal manera que ni siquiera era visible un resalte. Un aumento de IITm como se muestra con FL4 o un intento de estandarizar o mejorar las alturas de pico de repeticiones más cortas debería superar este problema. Las muestras heterocigóticas 11/12 Y 12/13· generaron picos de fusión únicos con Tms intermedias entre los picos homocigóticos (es decir, aproximadamente 54.5 oC y 57.0 oC, respectivamente). El uso de instrumentos HRM es útil en la identificación de heterocigóticos usando estos Tms intermedios de picos. ~ [0151] La estabilidad del bloqueador se incrementó mediante la incorporación de bases modificadas propinil dU y propinil dC y por inclusión de un enganche-G y una modificación trimetoxiestilbeno en 5'.

Ejemplo 7 [0152] El cebador delantero STRF2 y las secuencias del bloqueador 81 se combinaron en un solo oligonucleótido no fluorescente usando un hexaetilenglicol (HEG) como un conector y bloqueador de PCR. El oligonucleótido unimolecular cebador/ bloqueador (8P1) comprendía 5 repeticiones de d(TATC), una secuencia de anclaje de 1 O-mero para evitar el deslizamiento, HEG y el cebador delantero (Tabla 9).

Tabla 9: Análisis de STR usando un bloqueador/cebador unimolecular y sonda de oligonucleótido, donde P, 5, 6T Y (HEG) representan 3 'fosfato, fluoresceína dT, octanediol y hexaetilenglicol respectivamente.

011;0: sec ID Secuencia

IPt: 31 TATCTATCTATt;TATCTATCCACCTGTt;TO(1-EG) CAT~."'.GCfC1'TCC1'CTT

FL1: ti CMTGMATCtATClATCTATCWCTATC6ATCTATC&ATCtATr::eT

FU: $$ CMTGATATCMTCTATCSATCTATCTATCTATCTATClATCTATCP

'U: 40 CMTQMATCT.-eTATC&ATCTMCTA~~$A'feTMCfATC$ATCP

FIA: 41 CNt.TCATATCMTCTABCTATCTATCTATCtATCTATC&ATCTATCP

'LS: 42 CMTGA.TATCTABCTATCTNiCTATCTMCTATCTNiCTATCTATceT

[0153] La ventaja de este enfoque es que el bloqueador y la secuencia diana forman parte de la misma cadena de AON después de la amplificación. La interacción unimolecular entre bloqueador y diana está termodinámicamente favorecida en relación con la hibridación de la sonda. Además, la eficiencia de la PCR no est~ comprendida ya que el bloqueador no puede hibridar hasta después de que la secuencia diana es amplificada (FIG 8). [0154] Las secuencias diana de 016S539 fueron amplificadas de AON extraído y directamente de muestras de saliva con 0.5 IJM de BP1 y 0.05 IJM de cebador inverso STRR2. Se emplearon 50 nM de sonda FL 1 para detectar e identificar las secuencias diana amplificadas a partir de muestras de genotipo 11/11,12/12,13/13,10/11,10/13,11/12,12/13.9/12.11/13 Y 8/13. Los datos de fluorescencia con LightCycler en tiempo real demuestran que la eficiencia de amplificación y detección de diana es superior a la lograda utilizando el método de bloqueador bimolecular (Fig. 9A). La amplificación de la diana se realizó utilizando placas PCR con 384 pocillos seguida por un análisis de fusión usando un instrumento LightTyper. Los Tms de los picos de fusión correspondientes a las repeticiones 8, 9, 11, 12 Y13 fueron 40.0 oC, 46.0 oC, 53.0 oC, 55.5 oC, 57.5 oC, respectivamente (FIG. 9). El pico de la repetición 10 no fue detectado de forma fiable en ninguna de estas muestras, ya que se ocultaba dentro de las trazas de las repeticiones 11 y 13 debido a una pequeña ll.Tm y a una altura reducida del pico. Esto se puede superar como se mencionó anteriormente. Las muestras de genotipos 8/13, y 9/12 generaron dos picos de fusión claros que representan alelos componentes (FIG 9C-O). Mientras que las muestras heterocigóticas de genotipo 11/12, 12/13 dieron un solo pico de fusión de Tm intermedio entre los Tms de los alelos homocigóticos (es decir, aproximadamente 54.5 oC y 56.0 oC, respectivamente, tal como se presenta en FIG. 9F-G). [0155] El análisis de AON y muestras de saliva fueron repetidas utilizando BP1 y las sondas de oligonucleótidos FL2, FL3, FL4 Y FL5 las cuales poseíann diferentes números de bases etiquetadas con fluoróforo y diferentes espacios entre fluoróforos (Tabla 9). Los Tms de picos de fusión generados con dianas amplificadas de STR se presentan en la Tabla 10. Oe forma similar a FL 1, las sondas FL3 y FL5 fueron incapaces de detectar de manera fiable alelos con 10 repeticiones dentro de los genotipos heterocigóticos tales como 10/11 Y 10/13. El número y el espaciamiento de las bases etiquetadas con fluorescencia influye en la proporción ruido-señal de la sonda y la calidad de los picos de fusión. Las sondas FL2 y FL4 sólo poseen tres bases etiquetadas con fluoróforos y fueron capaces de detectar el alelo de 10 repeticiones en ambos genotipos 10/11 Y10/13 (FIG. 100-E). La sonda lineal sin modificar HYBSTR mostró una Tm de

0.92 oC con alelos de 10 Y11 repeticiones. Se obtuvo un ll.Tm de 3.5 oC usando un bloqueador unimolecular BP1 y la FL4 HyBeacon.

Tabla 10: Tms de picos de fusión generados con dianas amplificadas de muestras de ADN extraído y de saliva no extraída usando el bloqueador/cebador unimolecular BP1.

RepatidDl181: Pico Tm

FI..1: 1" fU FLA FU

,: 40.0 42.1 39.0 41~0 42.1

•: 41,0 48.0 44.5 41.6 41.0

10: I2.S U.!

11: 13.0 ~.S 51.0 58.0 13.1

12: •.1 9.0 12.5 11.0 S.I

.: 11 51.1 •.0 54.1 80.0 sr,o

Ejemplo 8

[0156 ] Los capilares de LightCycler que contienen dianas amplificadas 016S539, bloqueador BP1 y oligonuCleótido F6A fueron reanalizados usando un instrumento de curvas de fusión de alta resolución (HR-1, Idaho Technology Inc, Utah, EE.UU.). El HR-1 podría claramente discriminar picos de fusión generados con secuencias de 11, 12 Y13 repeticiones (FIG. 11A). Sin embargo, como se describió anteriormente, los picos de fusión no podían ser empleados para identificar genotipos heterocigóticos tales como 11/12. El software de curva de fusión de alta resolución permitió que los genotipos 9/12, 11/11, 11/12, 12/12, 12/13 Y 13/13 estuvieran claramente diferenciados (FIG 11 BC). El análisis de alta resolución no requerirá que las Tms

5 superen los 3 oC para diferenciar alelos de similar longitud. Por otra parte, métodos mejorados de análisis de datos permitirán que los picos amplios y los hombros estén claramente separados en alelos componentes. (FIG. 11 D).

Ejemplo 9

[0157] Una realización alternativa al enfoque del bloqueador de repetición es anclar la sonda al bloqueador en lugar de que las secuencias de ADN flanqueen la diana repetitiva. Este enfoque aumenta la estabilidad de hibridación de la sonda en presencia del bloqueador, lo que aumenta la eficiencia de bloqueo. En un formato bimolecular, el oligonucleótido de bloqueo comprendería 15 un número determinado de repeticiones de secuencias, una secuencia de anclaje adecuada para evitar el deslizamiento y un enganche rico en GC (FIG. 12). El enganche del oligonucleótido de bloqueo hibrida con un enganche complementario en el oligonucleótido sonda. En un formato unimolecular, las repeticiones del bloqueador, la secuencia de anclaje y el enganche rico en GC podrían unirse a uno de los cebadores PCR a través de un apropiado espaciador / bloqueador

20 de PCR (por ejemplo, HEG). Las sondas fluorescentes empleadas con estos bloqueadores podrían tener una secuencia rica en GC complementaria a la del bloqueador. Los enganches ricos en GC formarán una unión cuando el bloqueador y los oligonucleótidos sonda hibriden adyacentemente. Se evitará la hibridación de la longitud total de la sonda cuando el número de repeticiones diana sea inferior a 15 en el caso de D16S539 (FIG. 12A-B).

25 [0158] Los oligonucleótidos de bloqueo que poseen 5 repeticiones D16 (5LSB1) y 7 repeticiones (7LSB2) se combinaron con sondas fluorescentes que poseen 10 repeticiones (1 OSFL1) Y 8 repeticiones (8SFL2), respectivamente. Estas sondas de unión y los bloqueantes (Tabla 11) se hibridaron con los oligonucleótidos diana complementarios que poseían 8-15 repeticiones (Tabla 5) y fueron analizados con un instrumento LightCycler (FIG. 12C-D). Las Tms de sonda se

30 presentan en la Tabla 12. Los llTms de 7LSB2 se destacan debido a la reducida longitud de la sonda. Los alelos que tienen 9 repeticiones o menos pueden ser analizados en ausencia de una molécula de bloqueo.

Tabla 11: Secuencias de sondas de empalme y bloqueadores, donde 6 es 35 pirrolo-deoxicitosina (PDC), 5 es fluoresceína dT, P es 3 'fosfato y (HEG) es hexaetilenglicol.

algo: Re lE) 8ecuendI

5L8B1: es OCGGCTA1'CTATCfATCrA1CI'A~C1G1'CTG1'C'fG'IIi(ta)CM.~ AOCI'CI IQCTGI I

1LS82: 4.t GCGGCTATCfATCTATCTATCTATCTATCTA'RX:ACe'IUIC,aIC1GfUIG1'A11'G ATCfArIQCIP

106fL1 t;sFl2: • TATCTATCTARTATCTATCTAHTATCTAT8MTCTATCOCOOOP

•: TATCTA11!ATCTATlMTGTATeATCTATOOOCOOP

40

Tabla 12 Tms de picos de fusión generados por sondas de empalme y bloqueadores

usando oligonucleótidos homólogos.

45

Repeticiones: 1m 5SIP1/10SfL'1 T", 1LS82IISFL2

,: 31.1'0

,: 44."0

10: 51.3'0 34,&'0

11: fU'O 44."<C

12: 61.8'0 5O.I'C

13: ".2'0 H,ere

14: IU'C 67.'·C

15: 82.1 "C H.rc

[0159] Como una variación a lo anterior, los bloqueadores unimoleculares (cebadores PCR) pueden poseer partes de enganche de varias longitudes y/o composiciones (A 1, A2, A3, etc.), y la sonda de oligonucleótidos puede contener partes de enganche complementarias a las partes de enganche en los cebadores de PCR (A 1', A2', A3', etc.). Oe esta manera, por ejemplo, tres o más sondas pueden ser incluidas en ensayos de PCR y la secuencia de las partes de enganche se puede utilizar para modificar las Tms pico. Esta variación se muestra esquemáticamente en la figura 15.

Ejemplo 10

[0160] Un segundo locus de STR fue investigado para demostrar que la detección y diferenciación de las secuencias de repetición por análisis de la curva de fusión no es única para 016S539. Ellocus TH01 comprende repeticiones de (AATG)n, con alelos descritos que poseen entre 3 y 14 repeticiones (ver FIG. 13 para secuencia de genes). Las secuencias de TH01 pueden contener repeticiones parciales, como en el alelo 9.3 (AATT)eATG(AAGT)s (SEC ID NO: 47.). Sólo los alelos de repetición más comunes fueron considerados al diseñar el ensayo de prueba de principio para TH01, donde 99.5% de los alelos comprenden 6 repeticiones (23%),7 repeticiones (24.1%),8 repeticiones (11.6%),9 repeticiones (20%),

9.3 repeticiones (17.9%) o 10 repeticiones (2.9%). El desafío adicional para el análisis de los alelos TH01 era discriminar no sólo los alelos completos de repetición que difieren en longitud en uno o más múltiplos de 4 bases, sino también los alelos de repetición parcial 9.3 y de repetición completa 10 que difieren en longitud en un solo nucleótido. [0161] La sonda HYBTH01fue diseñada para detectar y diferenciar alelos TH01. La sonda comprendía 6.1 repeticiones de AATG (Tabla 13) y una secuencia de anclaje 5 'de TGGFG. La sonda fue etiquetada con dos tintes de fluoresceína dT, separados por 7 nucleótidos, uno de los cuales estaba localizado dentro de la secuencia de anclaje. Se empleó una estrategia de bloqueo bimolecular como se muestra en la figura.

6. El bloqueador bimolecular TH01_BL fue diseñado para evitar que la sonda de HYBTH01 hibridara totalmente con las secuencias diana cuando el número de repeticiones en el alelo diana fuera inferior a 10. El bloqueador TH01_BL comprende 3.3 repeticiones de AATG y una secuencia de anclaje en 3 'de AGGGAAATAAGGG (Tabla 13). [0162] Se amplificaron secuencias diana TH01 de muestras de ADN purificadas y salivas no purificadas utilizando los cebadores TH01_F y TH01_R (Tabla 13). Se utilizó PCR asimétrica para mejorar la eficiencia de hibridación de la sonda a secuencias diana amplificadas, donde las concentraciones de los iniciadores TH01_F y TH01_R fueron 0.1 IJM Y1 IJM, respectivamente. Los oligonucleótidos de sonda y de bloqueo fueron empleados en concentraciones de 75nM y 375nM, respectivamente Se empleó un el exceso molar de cinco veces de oligonucleótido de bloqueo para evitar la hibridación de la sonda a las repeticiones comunes 3.1AATG compartidas por los alelos TH01. El oligonucleótido de bloqueo limita la cantidad de secuencia diana disponible para hibridación de la sonda, reduciendo eficazmente la longitud de alelos de 6-10 repeticiones 'a 2.1-6.1 repeticiones, mejorando de esta forma la capacidad de diferenciar alelos TH01 sobre la base del Tm de pico de fusión.

Tabla 13: ·Análisis de las repeticiones de TH01 donde 5 y P representan fluoresceína dT y fosfato 3

• respectivamente

OIgo: SEO 10 Secuencia

HVITH01: 48 TG05QMTQAAlQAATGMtGM.TGMTGAP

TI*IJI.: 4' ATCAATQMTCMt~TMGGGP

TI*L': • $SC'IT~

THOI_R: 11 GGT~TTCCCATTGQCCTQ

[0163] La combinación de la sonda HYBTH01 y el bloqueador TH01_BL permitió una detección e identificación fiables de alelos amplificados de 8,9,9.3 Y10 repeticiones, mostrando unos Tms de picos dE'! fusión de aproximadamente 53 oC, 57 oC, 60.5 oC y 61.5°C respectivamente (Figura 14). Las temperaturas de fusión de los alelos de 6 y 7 repeticiones eran demasiado bajas para permitir una detección fiable por esta versión particular de la estructura de sonda que fue diser'lada para detectar las secuencias de repetición más largas con más problemas en este locus. Es obvio que el mismo principio podría aplicarse a la detección de alelos de 6 y 7 repeticiones disminuyendo el número de repeticiones en el bloqueador, incrementando el número de repeticiones en la sonda o aumentando el Tm de la sonda (ya sea mediante el aumento de la longitud de la secuencia de anclaje, por inclusión de análogos de bases de ADN o fosforamiditas cap como 5'-Trimetoxiestilbeno). Del mismo modo, también se espera que el ensayo TH01 funcione de forma eficiente en un formato unimolecular con un oligonucleótido largo que comprenda secuencias de bloqueador TH01_BL y de cebador TH01_R separadas por una modificación hexaetilenglicol (HEG).

CONCLUSION [0164] Las secuencias repetitivas pueden ser analizadas usando sondas de oligonucleótidos, donde el número de repeticiones es determinado por la longitud de la diana y la proporción de sonda hibridada. Se requieren sondas de oligonucleótidos largas de más de 60 nucleótidos para analizar repeticiones cortas en tándem. La diferencia en Tm de la sonda entre repeticiones largas es con frecuencia pequer'la, impidiendo que ciertos alelos sean debidamente identificados. El b.Tm se puede mejorar por desestabilización de la sonda o separando la secuencia de repetición en un bloqueador no fluorescente y una sonda fluorescente de longitud reducida. Las diversas estrategias de bloqueo aquí descritas han mejorado los b.Tms de sonda y la capacidád de diferenciar entre alelos D16S539 y TH01 que poseen un gran número de repeticiones. Los ejemplos pueden extenderse a otros STRs, incluyendo pero no limitándose a D19S433 y D18S51. Ejemplo 11 Prevención de hibridación cruzada de sondas y bloqueadores [0165] Los loci D8S 1179 Y D3S 1358 comprenden secuencias repetidas (TCT A)n. Las sondas y los bloqueadores pueden tener una hibridación cruzada impidiendo una detección eficaz de la diana o causar resultados erróneos. Unir los bloqueadores a los cebadores (es decir, bloqueo unimolecular) impide la hibridación cruzada. Unir la sonda al constructo unimolecular impide la detección de alelos diana incorrectos. Con el propósito de conseguir una estabilidad en la hibridación, se usa un oligonucleótido espaciador que separa los componentes bloqueador y sonda en dos entidades separadas (ver Figura 16). Ejemplo 12 [0166] La inclusión de múltiples bloqueantes en un solo tubo utiliza un desplazamiento en los Tms de picos de fusión con el fin de detectar alelos de repetición adicionales. Esto se logra usando bloqueadores con repetición parcial (off-set), que permiten que la sonda (longitud I secuencia) hibride más o menos. [0167 Mientras se ha informado que los alelos D8S 1179 comprenden ambos elementos TCTA y TCTG, las repeticiones TCTG están restringidas a alelos que poseen 13 y más repeticiones y están localizadas sólo en las posiciones de repetición segunda, tercera y cuarta (GenBank Accession No. AF216671). Las repeticiones variables TCTA y TCTG estaban~ por tanto, localizadas dentro de oligonucleótidos de bloqueo, dejando sólo repeticiones TCTA disponibles para hibridación con la sonda. Se ha informado que en loci D8S 1179 con entre 6 y 25 repeticiones de tetranucleótido, sin embargo, sólo los alelos de repeticiones más comunes fueron considerados al diser'lar el ensayo D8S1179, donde 99.9% de los alelos comprenden 8 repeticiones (0.9%),9 repeticiones (0.8%), 10 repeticiones (8.8%), 11 repeticiones (7.3%), 12 repeticiones (12.6%),13 repeticiones (27.6%),14 repeticiones (22.6%),15 repeticiones (14.1%),16 repeticiones (4.3%) y 17 repeticiones (0.9%). [0168] La sonda HYBD8 fue diser'lada para detectar y diferenciar alelos D8S 1179. La sonda comprende 8 repeticiones de TeTA (Tabla 14) y una secuencia de anclaje 3 'de FTCCCCP. La sonda fue etiquetada con dos colorantes dT fluoresceína, separados por 5 nucleótidos, uno de los cuales se situó dentro de la secuencia de anclaje. Se empleó como se muestra en la FIG. 6 una estrategia de bloqueo bimolecular, con tres oligonucleótidos de bloqueo para detectar y diferenciar todo el conjunto de alelos comunes D8S1179. Los bloqueadores bimoleculares D8BL5, D8BL8 YD8BL11 (Tabla 14) fueron diser'lados para evitar que la sonda HYBD8 hibride totalmente con las secuencias diana cuando el número de repeticiones en el alelo

diana era menor de 13,16 Y19 respectivamente. [0169] las secuencias diana D8S1179 fueron amplificadas de muestras de ADN purificado y salivas no purificadas utilizando los cebadores D8F y D8R (Tabla 14). Se empleó PCR asimétrica para mejorar la eficiencia de hibridación de la sonda a secuencias diana amplificadas, donde las concentraciones de los cebadores D8F y D8R fueron de 0.1 IJM Y1 IJM respectivamente. Se emplearon oligonucleótidos de sonda y de bloqueo en concentraciones de 75nM y 375nM, respectivamente. Se empleó un exceso molar de cinco veces en el oligonucleótido de bloqueo para evitar la hibridación de la longitud total de la sonda a repeticiones diana inapropiadas. [0170] El análisis de la curva de fusión en presencia de D8Bl5 permite la detección e identificación fiables de alelos de 8, 9 Y10 repeticiones (tabla 15). El bloqueador D8Bl8 se utiliza para detectar alelos de 11, 12 Y13 repeticiones y D8Bl11 permite la identificación de alelos de 14,15, 16 Y17 repeticiones. [0171] la hibridación de la sonda HYBD8 con alelos diana de 9 repeticiones, 12 repeticiones y 15 repeticiones da unas Tm de picos de fusión de 44.73 oC, 44.4 oC y 44.4 oC cuando se usan en combinación con los bloqueadores D8Bl5, D8Bl8 YD8Bl11 respectivamente. Ya que cada uno de D8Bl5, D8Bl8 Y D8Bl11 deja tres repeticiones diana disponibles para hibridación con la sonda, se espera que los alelos de 9, 12 Y15 repeticiones den Tms similares de picos de fusión. Por esta razón, los oligonucleótidos de bloqueo D8Bl5, D8Bl8 YD8Bl11 no se pueden utilizar simultáneamente para detectar los alelos de 9, 12 Y15 repeticiones en un solo tubo.

Tabla 14: Análisis de las repeticiones en 0851179, donde 5, P Y X representan fluoresceína dT, 3' fosfato y 3' amino C7, respectivamente

0I11j1O: SECla SECUENCIA '.

OIF: a CGGCCT$~ATAT<rr

DaR: 53 GCCTTMTTTATTTACCTATCCTGTAGA

HYBDI: 54 TeTATGTATGTATCTATCTATCTATClATCTAITCCC CP

8L5: 66 GTATTTCATGTGTACAlTCGTA(TCTA)aX

DalLe: • GTATTTCATGTGTACAJTeGTA(TCTAlaX

DalL11: 61 GTAlTTCATGTGTACAl1'eGTA('rCl'A)11X

DaBL1.2: • GTATTTCATGTGTACATTCGTA(TCTA)¡TeX

DaBL10~: 59 GTAlTTCATGJGTACAlTCGTA(TCTA)toTClX

JJ

[0172] Utilizar oligonucleótidos de bloqueo con repeticiones parciales causará un desplazamiento en los Tms de los picos de fusión ("off-set"), incrementándose el número de alelos STR que pueden ser detectados simultáneamente. los bloqueadores de repeticiones parciales que comprende 7.2 (es decir, (TCTAhTC) y 10.3 (es decir, (TCTA)10TCT) repeticiones fueron evaluados con dianas amplificadas entre 11 y 17 repeticiones. la reducción en la longitud del bloqueador, relativa a D8Bl8 y D8Bl11, permite hibridar más de la sonda causando un incremento en Tms de pico de fusión (Tabla 15). Por ejemplo, en presencia del bloqueador D8Bl7.2, la hibridación de la sonda con una diana de 12 repeticiones produce un pico de fusión con Tm de 46.88 oC, de tal manera que los bloqueadores D8Bl5 y D8Bl7.2 pueden ser usados al mismo tiempo para detectar alelos de 9 y 12 repeticiones(Figura 18). la Figura 19 ilustra la detección simultánea de alelos de 11 y 15 repeticiones con los bloqueadores D8Bl7.2 y D8Bl1 0.3 en un solo tubo. Tabla 15

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F1uo~HeackJM te: lIInm lI8mt RoM

CJI (fa....... Qu~570): U8nm 583nm RDID

s..TAURA: 541_ M8mI RoA

8-TAMRA: 541nm 11IIn RoA

RadmondRad: 17IDm 19IIm RtIJo

Cy3,$: lIImt ecMftm ~

ROX: UIam 110m RtIJo

Pul...150: 41Cmm tIIOIm Porpura

c,I-(Ta""'", Qn..87D: NII1m .2Im Vlaleta

o,s.5: M3nm 707m1 AzulOIcuro

TinteAlexa: HUft Hlni.

AllDluorUO: 350nm +t2N'l\

AlOtftuora: 4G5nm 421.

AliIUfIUor_: QOmI MOftm

AllDluor4H: 48Inm 118t1m

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l. ea Ilgun..J'IfIrtrId..d.1IB1'8bD. _IOCUJIU "gna DeSa b. R plIIIIde rapl1l8lllldarll!l nudlar6llida Ao G

IOI1'4J Los Ioel ... SMG utilizados en el ReIno Unido son:

0381358, VWA, 0168539, 0281338. 0881179. 021811. 018851, 0198433, TH01 FGA. [0175] Los 1310ci COOl8 utilizados en los EE.UU. son: C8F1PO, FGA, TH01, TPOX, VWA, 0381358, 058818, 078820, 0881179, 0138317, 0168539,018851, Y021811 [0176 Un conjunto básico delloci de 8TR del cromosoma Y (Y-8TR) es ampliamente utilizado en laboratorios de todo el mundo para el ensayo de identidad humana y la genealogía genética. Los loci de haplotipos mínimos (MHL) fueron seleccionados a finales de 1990 de un pequer'\o conjunto de Y-8TRs disponibles. Los MHL incluyen OY819, OY8389i, OY838911 , OY8390, OY8391, OY8392, OY8393, Y el marcador polimórfico multi-copia OY8385. En 2003, el subcomité del cromosoma Y del Grupo de Trabajo Científico sobre Métodos de Análisis de AON (8WGOAM) recomiendó dos Y-8TRs adicionales llamados OY8438 y OY8439.

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LISTADO DE SECUENCIAS [0178]

<110>: dTdT Universidad de Southampton

<110>: LGC Limitado

<120> oligonucleótidos y sus usos

<130> LGCBW/P41789PC

<150> GB 0720675.8

<151> 22 Octubre 2007

<160> 71

<170>. SeqWin99

<210> 1

<211> 16

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> repeticiones STR

<400> 1 tgcctgcctt ccttcc 16 <210> 2 <211>40

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> repeticiones STR

<400> 2 tttctttctt tcttttttct ctttctttct ccttccttcc 40

<210> 3

<211> 61

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> HYBSTR

<220>

<221> Base modificada

<222> (11) ... (11)

<223> C6 FAM du

<220>

<221> Base modificada

<222> (19) ... (19)

<223> C6 FAM du

<220>

<221> característica miscelánea

<222> (61) ... (61)

<223> 3 grupo bloqueador 3 prima fosfato

<400> 3

gatggataga nagatagana gatagataga tagatagata gatagataga tagatagata ~

<210> 4

<211> 50

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> STRV2

<220>

<221> característica miscelánea

<222> (17) ... (17)

<223> espaciador liexaetilenglicol

<220>

<221> Base modificada

<222> (24) ... (24)

<223> C6 FAM du

<220>

<221> Base modificada

<222> (32) ... (32)

<223> C6 FAM du

<220>

<221> característica miscelánea

<222> (50) ... (50)

<223> grupo bloqueador 3 prima fosfato

<400>4 ggtggataga tagatangat aganagatag anagatagat agatagatan: 50

<210> 5 <211> 67 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> STRV3

<220> <221> característica miscelánea <222> (17) .. (18) <223> Espaciador hexaetilenglicol

<220> <221> Base modificada <222> (25) ... (25) <223> C6 FAM du

<220> <221> Base modificada <222> (33) ... (33) <223> C6 FAM du

<220> <221> característica miscelánea <222> (67) ... (67) <223> grupo bloqueador 3 prima fosfato

<400> 5

ggtggataga tagatannga taganagata ganagataga tagatagata gatagataga tagatan: 60 67

<210> 6 <211>24 <212>ADN <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> RC5

<400> 6 tatctatcta tctatctatc cacc: 24

<210> 7 <211> 32 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> RC7

<400> 7 tatctatcta tctatctatc tatctatcca cc <210> 8 <211> 36 <212>ADN <213> Secuencia Artificial: 32

<220> <223> RC8

<400> 8 tatctatcta tctatctatc tatctatcta tccacc: 36

<210> 9

<211> 44

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> RC10

<400> 9 tatctatcta tctatctatc tatctatcta tctatctatc cacc 44

<210> 10 <211>48

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> RC11

<400> 10 tatctatcta tctatctatc tatctatcta tctatctatc tatccacc 48

<210> 11

<211> 44

<212>ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> RC10b

<400> 11 tatctgtcta tctgtctatc tgtctatctg tctatctgtc cacc 44

<210> 12

<211> 44

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> RC10c

<400> 12 tgtctgtctg tctgtctgtc tgtctgtctg tctgtctgtc cacc 44

<210> 13

<211> 44

<212>ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> RC10d

<400> 13 tatctatcta tctatcccct tatctatcta tctatctatc cacc 44

<210> 14

<211> 40

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> RC10e

<400> 14 tatctatcta tctatctatc tatctatcta tctatctatc

<210> 15

<211> 48

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> RC11b

<400> 15 tatctgtcta tctgtctatc tgtctatctg tctatctgtc tatccacc 48

<210> 16

<211> 48

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> RC11c

<400> 16 tgtctgtctg tctgtctgtc tgtctgtctg tctgtctgtc tgtccacc 48

<210> 17

<211> 48

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> RC11d

<400> 17 tatctatcta tctatctatc cccttatcta tctatctatc tatccacc 48

<210> 18 <211>44

<212>ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> RC11e

<400> 18 tatctatcta tctatctatc tatctatcta tctatctatc tatc 44

<210> 19

<211> 28

<212>ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> STRF2

<400> 19 cagatcccaa gctcttcctc ttccctag 28

<210> 20

<211> 31

<212>ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> STRR2

<400> 20 acgtttgtgt gtgcatctgt aagcatgtat c 31

<210> 21

<211> 70

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> 02466R

<220> <221> Base modificada <222> (9) ... (9) <223> f1uoresceina dT

<220> <221> Base modificada <222> (17) ... (17)

<223> f1uoresceina dT

<220> <221> Base modificada <222> (25) ... (25) <223> f1uoresceina dT

<220> <221> Base modificada <222> (33) ... (33) <223> f1uoresceina dT

<220> <221> Base modificada <222> (41) ... (41) <223> f1uoresceinadT

<220> <221> Base modificada <222> (49) ... (49) <223> f1uoresceina dT

<400> 21

caltgatanctatctancta tctanctatc tanctatcta nctatctanc tatctatcta tctatccacc: 60 70

<210> 22 <211> 70 <212>ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> 02467R

<220> <221> Base modificada <222> (9) .;. (9) <223> f1uoresceina dT

<220> <221> Base modificada <222> (17) ... (17) <223> f1uoresceina dT

<220> <221> Base modificada <222> (25) ... (25) <223> f1uoresceina dT

<220> <221> Base modificada <222> (33) ... (33) <223> f1uoresceina dT

<220>

<221> Base modificada

<222> (41) (41)

<223> f1uoresceinadT

<220>

<221> Base modificada

<222> (49) (49)

o o o

<223> f1uoresceina dT

<220>

<221> característica miscelánea

<222> (51) (51)

<223> sitio abásico

<400> 22

, ,

caatgatanc tatctancta tctanctatc tanctatcta nctatc:tanc natctatcta

tC1atccacc:

<210> 23

<211> 64

<212>ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> 02468R

<220>

<221> Base modificada

<222> (3) (3)

<223> f1uoresceina dT

<220>

<221> Base modificada

<222> (11) (11)

<223> f1uoresceina dT

<220>

<221> Base modificada

<222> (19) (19)

<223> f1uoresceina dT

<220>

<221> Base modificada

<222> (27) (27)

<223> f1uoresceina dT

<220>

<221> Base modificada

<222> (35) (35)

<223> f1uoresceina dT

<400> 23

tanctatC'ta nctatctanc tatctanc:ta tctanctatc tatctatc:ta tctatctatc cace

<210> 24

<211> 64

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> 02469R

<220>

<221> Base modificada

<222> (3) ... (3)

<223> f1uoresceina dT

<220>

<221> Base modificada

<222> (11) ... (11)

<223> f1uoresceina dT

<220>

<221> Base modificada

<222> (19) ... (19)

<223> f1uoresceinadT

<220>

<221> Base modificada

<222> (27) ... (27)

<223> f1uoresceina dT

<220>

<221> Base modificada

<222> (35) ... (35)

<223> f1uoresceina dT

<220>

<221> característica miscelánea

<222> (41) ... (41)

<223> sitio abásico

<400> 24

tanc~atcta nctatctanc tatctancta tctanctatc natctatcta tctatctatc 60

cace 64

<210> 25 <211>61

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> C5

<400> 25

ccctagatca-atacagacag acagacaggt ggatagatag atagatagat atcattgaaa 60 9' 61

<210> 26

<211> 69

<212>ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> C7

<400> 26

c.cctagatc.a atacagac:ag"acagiÍcaggt'ogatagatag aiagatagat agatagatat 60

cattgaaag

<210> 27

<211> 73

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> C8

<400> 27

ccctagatca atacagacag acagacaggt ggatagatag atagatagat agatagatag 60

atatcattga aag 73

<210> 28 <211>77.

<212>ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> C9

<400> 28

ccctagatca atacagacag acagacaggt ggatagata, atagatagat agatagata, 60

atagatatca ttgaaag 77

<210> 29

<211> 81

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> C10

<400> 29

ccctagatca atacagacag acagacaggt ggatagatag atagatagat agatagatag 60

atagatagat atcattgaaa 9 81

<210> 30

<211> 85

<212>ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> C11

<400> 30

ccetagatea atacagacag acagaealgt goatagatag atagatagat agatagatag 60

atagatagat agatatcatt gaaag 85

<210> 31

<211> 89

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> C12 <400> 31

ccctagatca aucagacag acagacaggt ggatagatag atagatagat a9&tag&tag 60

atagatag&t agatagatat clttga09 89

<210> 32 <211>93

<212>ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> C13

<400> 32

ccetagatea atacagacag &cagacaggt 9gatagatag atagatagat agatagatag 60 atagatagat agatagatag ata1:Catt9' a'9 93

<210> 33

<211> 97

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> C14

<400> 33

ccctagatca atacagacag leagaeaggt ggatagatag atagatagat agatagatag 60

atagatagat a9&t&gatag atagatatea ttgaaa9 91

<210> 34 <211>101

<212>ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> C15

<400> 34

ccctagatea atacagaeag acagacaggt "atagatag atagatagat agatagatag 60

atagatagat agatagatag atagata9a1: atcattgaaa 9 101

<210> 35

<211> 52

<212>ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> 81

<220>

<221> característica miscelánea

<222> (52) (52)

<223> grupo bloqueador 3 prima fosfato

<400> 35

tatctatcta tctatctatc cacctgtctg tctgtctgta ttgatctagg gn 52 <210> 36 <211>41

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> FL1

<220>

<221> Base modificada

<222> (1) ... (1)

<223> fluoresceina dT

<220>

<221> Base modificada <222> (9) ... (9)

<223>: (9) ... (9) dT

<223>: fluoresceina dT

<220>

<221> Base modificada

<222> (17) ... (17)

<223> fluoresceinadT

<220>

<221> Base modificada

<222> (25) ... (25)

<223> fluoresceina dT

<220>

<221> Base modificada

<222> (33) ... (33)

<223> fluoresceina dT

<220>

<221> característica miscelánea

<222> (41) (41)

<223> grupo bloqueador octanodiol

<400> 36 natctatcna tctatcnatc tatcnatcta tcnatctatc n 41

<210> 37

<211> 51

<212>ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> BP1

<220>

<221> característica miscelánea

<222> (31) ... (31)

<223> espaciador hexaetilenglicol

<400> 37 tatctatcta tctatctatc cacctgtctg ngatcccaag ctcttcctct t

<210> 38

<211> 47

<212>ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> FL1

<220>

<221> Base modificada

<222> (7) ... (7)

<223> fluoresceina dT

<220> <221> Base modificada <222> (15) ... (15) <223> f1uoresceina dT

<220> <221> Base modificada <222> (23) ... (23) <223> f1uoresceina dT

<220> <221> Base modificada <222> (31) ... (31) <223> f1uoresceina dT

<220> <221> Base modificada <222> (39) ... (39) <223> f1uoresceina dT

<220>

<221> característica miscelánea <222> (47) ... (47) <223> grupo bloqueador octanodiol

<400> 38 caatganatc tatcnatcta tcnatctatc natctatcna tctatcn: 47

<210> 39 <211> 47 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> FL2

<220> <221> Base modificada <222> (11) ... (11) <223> f1uoresceina dT

<220> <221> Base modificada <222> (19) ... (19) <223> f1uoresceina dT

<220> <221> Base modificada <222> (39) ... (39) <223> f1uoresceina dT

<220> <221> característica miscelánea <222> (47) ... (47) <223> grupo bloqueador 3 prima fosfato

<400> 39 caatgatatc natctatcna tctatctatc tatctatcna tctatcn: 47

<210> 40 <211>47 <212>ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> FL3 <220> <221> Base modificada

<222> (7) ... (7)

<223> f1uoresceina dT

<220>

<221> Base modificada

<222> (13) ... (13)

<223> f1uoresceina dT

<220>

<221> Base modificada

<222> (19) ... (19)

<223> f1uoresceina dT

<220>

<221> Base modificada

<222> (25) ... (25)

<223> f1uoresceina dT

<220>

<221> Base modificada

<222> (31) ... (31)

<223> f1uoresceina dT

<220>

<221> Base modificada

<222> (37) ... (37)

<223> f1uoresceina dT

<220>

<221> Base modificada

<222> (43) ... (43)

<223> f1uoresceina dT

<220>

<221> característica miscelánea

<222> (47) '" (47)

<223> grupo bloqueador 3 prima fosfato

<400> 40 caatganatc tanctatcna tctanctatc natctancta tcnatcn

<210> 41

<211> 47

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> FL4

<220>

<221> Base modificada

<222> (11) ... (11)

<223> f1uoresceina dT

<220>

<221> Base modificada

<222> (17) ... (17)

<223> f1uoresceina dT

<220>

<221> Base modificada

<222> (39) ... (39)

<223> f1uoresceina dT

<220>

<221> característica miscelánea

<222> (47) ... (47)

<223>: grupo bloqueador 3 prima fosfato

<223>: HYBD8

<400> 41 caatgatatc natctancta tctatctatc tatctatcna tctatcn: 47

<210> 42 <211> 47 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> FL5

<220> <221 > Base modificada <222> (13) ... (13) <223> fluoresceina dT

<220> <221> Base modificada <222> (21) ... (21) <223> fluoresceina dT

<220> <221> Base modificada <222> (29) ... (29) <223> fluoresceina dT

<220> <221> Base modificada <222> (37) ... (37) <223> fluoresceina dT

<220> <221> característica miscelánea <222> (47) ... (47) <223> grupo bloqueador octanodiol

<400> 42 caatgatatc tanctatcta nctatctanc tatctancta tctatcn: 47

<210> 43

<211> 66

<212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> 5LSB1

<220> <221> característica miscelánea <222> (46) ... (46) <223> espaciador hexaetilenglicol

<400> 43

gc:ggctatct atctatctat c:tatcc:acc:t gtctgtctgt ctgtangatc ccaagctc:ttcctctt .: 6~ v

<210> 44 <211>65 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> 7LSB2

<220> <221> característica miscelánea <222> (65) ... (65) <223> grupo bloqueador 3 prima fosfato

<400> 44

gcggctatct atctatctat ctatctatct ateeacctgt etgtctgtct gtattgatcta999n: 60 65

<210> 45 <211> 46 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> 1 OSFL1

<220> <221> Base modificada <222> (11) ... (11) <223> f1uoresceina dT

<220> <221> Base modificada <222> (12) ... (12) <223> pirrolo -desoxicitosina

<220> <221> Base modificada <222> (23) ... (23) <223> f1uoresceina dT

<220> <221> Base modificada <222> (24) ... (24) <223> pirrolo -desoxicitosina

<220> <221> Base modificada <222> (32) ... (32) <223> pirrolo -desoxicitosina

<220> <221> Base modificada

<222> (33) ... (33) <223> f1uoresceina dT

<220> <221> característica miscelánea <222> (46) ... (46) <223> grupo bloqueador 3 prima fosfato

<400>45 tatctatcta nntatctatc tanntatcta tnnatctatc gccgcn: 46

<210> 46 <211> 38 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> 8SFL2

<220>

<221> Base modificada <222> (8) (8) <223> pirrolo -desoxicitosina

<220> <221> Base modificada <222> (9) ... (9) <223> fluoresceina dT

<220> <221> Base modificada <222> (16) ... (16) <223> pirrolo -desoxicitosina

<220> <221> Base modificada <222> (17) ... (17) <223> fluoresceina dT

<220> <221> Base modificada <222> (25) ... (25) <223> fluoresceina dT

<220> <221> característica miscelánea <222> (38) ... (38) <223> grupo bloqueador 3 prima fosfato

<400> 46 tatctatnna tctatnnatc tatnnatcta tcgccgcn: 38

<210> 47

<211> 39 <212>ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> alelo TH01 9.3 <400> 47 aatgaatgaa tgaatgaatg aatgatgaat gaatgaatg: 39

<210> 48 <211>31 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> HYBTH01

<220> <221> Base modificada <222> (4) ... (4) <223> fluoresceina dT

<220> <221> Base modificada <222> (12) .... (12) <223> fluoresceina dT

<220> <221> característica miscelánea <222> (31) ... (31) <223> grupo bloqueador 3 prima fosfato

<400> 48 tggngaatga angaatgaat gaatgaatga n: 31

<210> 49 <211> 29 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> THOLBL

<220> <221> característica miscelánea <222> (29) ... (29) <223> grupo bloqueador 3 prima fosfato

<400> 49 atgaatgaat gaatgaggga aataagggn: 29

<210> 50 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> TH01 F-<400> 50 ggcttccgag tgcaggtca: 19

<210> 51 <211>19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> THOLR

<400> 51 ggtgattccc attggcctg: 19

<210> 52 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> D8F

<400> 52 cggcctggca acttatatgt: 20

<210> 53 <211> 28 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> D8R

<400> 53 gccttaattt atttacctat cctgtaga: 28

<210> 54 <211> 39 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220>

<220>

<221> Base modificada

<222> (27) ... (27)

<223> f1uoresceina dT

<220>

<221> Base modificada

<222> (33) ... (33)

<223> f1uoresceina dT

<220>

<221> característica miscellanea

<222> (39) ... (39)

<223> grupo bloqueador 3 prima fosfato

<400> 54 tctatctatc tatctatcta tctatcnatc tantccccn 39

<210> 55

<211> 43

<212>ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> D8Bl5

<220>

<221> característica miscelánea

<222> (43) ... (43)

<223> grupo bloqueador 3 prima C7 amino

<400> 55 gtatttcatg tgtacattcg tatctatcta tctatctatc tan 43

<210> 56 <211>55

<212>ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> D8Bl8

<220>

<221> característica miscelánea

<222> (55) ... (55)

<223> grupo bloqueador 3 prima C7 amino

<400> 56 gtatttcatg tgtacattcg tatctatcta tctatctatc tatctatcta tctan

<210> 57

<211> 67

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> D8Bl11

<220>

<221> característica miscelánea

<222> (67) ... (67)

<223> grupo bloqueador 3 prima C7 amino

<400> 57

gtatttcatg tg~acattc9 tatctatcta tctatctatc tatctatcta tctatctatc 60 tatetan 67

<210> 58

<211> 53 <212> AON <213> Secuencia Artificial

<220> <223> 088L7.2

<220> <221> característica miscelánea <222> (53) ... (53) <223> grupo bloqueador 3 prima C7 amino

<400> 58 gtatttcatg tgtacattcg tatctatcta tctatctatc tatctatcta tcn: 53

<210> 59 <211> 66 <212> AON <213> Secuencia Artificial

<220> <223> 08BL10.3

<220> <221> característica miscelánea <222> (66) ... (66) <223> grupo bloqueador 3 prima C7 amino

<400> 59

gtatttcatg tgtaCattcg tatctatcta °tctatctatc titcutctl tctatctatc tatctn: 60 66

<210> 60 <211>16 <212> AON <213> Secuencia Artificial

<220> <223> 03S1358 -1

<400> 60 tctatctgtc tatcta: 16

<210> 61 <211> 20 <212> AON <213> Secuencia Artificial

<220> <223> 03S1358 -2

<400> 61 tctatctgtc tgtctatcta: 20

<210> 62 <211> 24

<212>AON <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> 03S1358 -3

<400> 62 tctatctgtc tgtctgtcta tcta 24

<210> 63

<211> 24

<212> AON

<213> Secuencia Artificial

<220> <223>vWA-3

<400> 63 tctatctgtc tgtctgtcta tcta 24

<210> 64

<211> 28

<212> AON

<213> Secuencia Artificial

<220> <223>vWA-4

<400> 64 tctatctgtc tgtctgtctg tctatcta 28

<210> 65 <211>16

<212>AON

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> 02S1338

<400> 65 tgcctgcctt ccttcc 16

<210> 66

<211> 45

<212> AON

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> 021S11

<400> 66 tctatctatc tgtctgtcta tctatctata tctatctatc tatca

<210> 67

<211> 22

<212> AON

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> 021S11 -2

<400> 67 tctatctatc catatctatc ta 22

<210> 68 <211>16

<212>AON

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> 019S433

<400> 68 aaggaaagaa ggtagg 16

<210> 69 5 <211>32

<212>ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> FGA

<400> 69 tttctttctt tcttttttct ctttctttct cc 32

15 <210> 70

<211> 420

<212>ADN

<213> Horno sapiens

<220>

<221> inseguro

<222> (38) (38)

00 o

<223> nucleótido desconocido

25 <220>

<221> inseguro

<222> (390) (390)

o o o

<223> nucleótido desconocido

<220>

<221> inseguro

<222> (397) (397)

<223> nucleótido desconocido

35 <220>

<221> inseguro

<222> (402) (402)

o o o

<223> nucleótido desconocido

<220>

<221> inseguro

<222> (413) (413)

<223> nucleótido desconocido

<400> 70 atggct9CCC tcacggctgC accoggagga t9actgtntt (e(actetea gtcctgccga 60

ggtgcctgac agccctgQC ccaggagctg gggggtctaa gagcttgtail ilUgtg'taca 120

>ceagat oetcgtt9'tg eacaaatcta aatgcagaaa agcaetgaaa ,aagaateea 180

gaauccaea 91::1:(Ccattt ttatatggga geaaacaaag gcagatc:cca agctcttcet 240

cttccetaga teaatlcaga c:agaC:ilgaca 99t998taga tagatagata gataptaga 300

tagatagata gatagatate attgaaagac aaaacagaga t99at9&ta9 &tacat9ct1:: 360

leagattCae acacaaacgt aaatggtatn aaaaatngga tneactettg tanggtt9tt 420

<210> 71

<211> 239

<212>ADN

<213> Horno sapiens

<400> 71

ceagcc:tggc ceacacagte ccc:tgtacac agggeneeg agtgcag~tc: aeagggaaea 60

cagactccat 99t9.at9aa tgaatgaatg aatgaatgaa 1:9&9gg&&at aagggaggaa 120

caggeeaatg ggaateaccc cagageeeag atICCC1:t1:g aattttge(( cctatttgcc 180

caggacccee caceltgage t9(t9(ta9a gect990aa; ggccttgggg ctgcetcce 239

Claims

Reivindicaciones

1. Un método para determinar simultáneamente el número de repeticiones en tándem en polinucleótidos diana en un locus polimórfico dado del que se sabe que tiene múltiples alelos que varían en el número de repeticiones en tándem, el método comprendiendo:

(a) proporcionar una muestra que contiene los polinucleótidos diana, donde dos o más de las repeticiones en tándem en los polinucleótidos diana se encuentran en forma de cadena simple,

(a1) hibridar un oligonucleótido de bloqueo a por lo menos una pero no todas las repeticiones en tándem en los polinucleótidos diana proporcionados en el paso (a) para que una o más de las repeticiones en tándem en los polinucleótidos diana permanezca en forma de cadena simple después de la hibridación de los oligonucleótidos de bloqueo,

(b)

la hibridar un oligonucleótido sonda etiquetado con la parte de cadena simple de los polinucleótidos diana, donde el oligonucleótido sonda es complementario de al menos una de las repeticiones en tándem, y al menos 5 nucleótidos del oligonucleótido sonda son complementarios de las repeticiones en tándem, en la parte de cadena simple de los polinucleótidos diana, en donde el oligonucleótido sonda es uno que permite la discriminación entre diferentes números de repeticiones en tándem en la parte de cadena simple de los polinucleótidos diana de acuerdo a su temperatura de fusión (Tm), y donde el oligonucleótido sonda es total o parcialmente complementario de al menos una repetición en tándem en la parte de cadena simple de los polinucleótidos diana.

(c)

determinar simultáneamente el número de repeticiones en tándem en los polinucleótidos diana en base a la hibridación del oligonucleótido sonda a la porción de cadena simple de los polinucleótidos diana y su temperatura de fusión.
2.

Un método de acuerdo a la Reivindicación 1, donde el polinucleótido diana es ADN.
3.

Un método de acuerdo a la Reivindicación 1, donde la determinación en el paso (c) hace uso de análisis de la curva de fusión.
4.

Un método de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 3 donde en el paso (a) tres

o más de las repeticiones en tándem en los polinucleótidos diana están en forma de cadena simple.
5.

Un método de acuerdo con las Reivindicaciones 3 ó 4, donde en el paso (b) el oligonucleótido sonda es complementario de al menos dos de las repeticiones en tándem de la parte de cadena simple de los polinucleótidos diana, tal como al menos tres de las repeticiones en tándem en la parte de cadena simple de los polinucleótidos diana.
6.

Un método de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones precedentes, donde en el paso

(a) la parte de cadena simple de los polinucleótidos diana que contienen repeticiones en tándem contiene al menos 8 nucleótidos; tal como al menos 16 nucleótidos.
7.

Un método de acuerdo con la Reivindicación 1, donde en el paso (a1) el oligonucleótido de bloqueo hibrida con al menos dos de las repeticiones en tándem en la parte de cadena simple de los polinucleótidos diana, tal como con al menos tres de las repeticiones en tándem en la parte de cadena simple de los polinucleótidos diana.
8.

Un método de acuerdo con la Reivindicación 1, donde en el paso (a 1) dos o más de las repeticiones en tándem permanecen en forma de cadena simple después de la hibridación del oligonucleótido de bloqueo, tal como tres o más de las repeticiones en tándem permanecen en forma de cadena simple después de la hibridación del oligonucleótido de bloqueo.
9.

Un método de acuerdo con la Reivindicación 1, donde en el paso (a1) dos o más oligonucleótidos de bloqueo se hibridan con al menos una pero no con todas las repeticiones en tándem proporcionadas en el paso (a) de forma que una o más de las repeticiones en tándem en los polinucleótidos diana permanezca en forma de cadena simple después de la hibridación de los oligonucleótidos de bloqueo.
10.

Un método de acuerdo con la Reivindicación 9, donde uno o más de los oligonucleótidos de bloqueo se hibridan a un número parcial de repeticiones en tándem.
11.

Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes donde la muestra en el paso (a) es producida durante o después de una reacción de amplificación, como una PCR.
12.

Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el oligonucleótido sonda está marcado con fluorescencia.
13.

Un método de acuerdo con la Reivindicación 1, en el que el oligonucleótido de bloqueo es totalmente complementario a la al menos una repetición en tándem en los polinucleótidos diana,

o en el que el oligonucleótido de bloqueo es parCialmente complementario a la al menos una repetición en tándem en los polinucleótidos de diana.
14. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que en el paso (a) una o ambas regiones que flanquean la repetición en tándem en los polinucleótidos diana está en forma de cadena simple.

1S. Un método de acuerdo con la Reivindicación 14 en el que el oligonucleótido sonda en el paso

(b) contiene una parte de anclaje que es complementaria a una región en los polinucleótidos diana que flanquea la repetición en tándem.
16.

Un método de acuerdo con la Reivindicación 1, en el que en el paso (a) una o ambas regiones que flanquean la repetición en tándem en los polinucleótidos diana está en forma de cadena simple, y el oligonucleótido de bloqueo contiene una parte de anclaje que es complementaria a la región que flanquea la repetición en tándem.
17.

Un método de acuerdo con la Reivindicación 16 en donde el oligonucleótido sonda en el paso

(b) contiene una parte de anclaje que es complementaria a la región que flanquea la repetición en tándem que no es complementaria a la parte de anclaje del oligonucleótido de bloqueo.
18.

Un método de acuerdo con la Reivindicación 1, donde el oligonucleótido bloqueo contiene en su extremo 3' (o S') una parte de enganche que es complementaria a una parte de enganche en el extremo S' (o 3') del oligonucleótido sonda, y donde se usan al menos dos pares diferentes de oligonucleótido de bloqueo y oligonucleótido sonda en los cuales las partes de enganche respectivas de cada par de oligonucleótido de bloqueo y oligonucleótido sonda son complementarios entre sí.
19.

Un método de acuerdo con la Reivindicación 18 donde la secuencia de nucleótidos de la parte de enganche se selecciona de manera que cada par de regiones de enganche complementarias tiene una Tm diferente.
20.

Un método de acuerdo con la Reivindicación 1 en el que los pasos (a) y (a1) se llevan a cabo de forma simultánea.
21.

Un método de acuerdo con la Reivindicación 20 en el que una PCR genera el ADN diana (polinucleótido), en el que una o más de las repeticiones en tándem en el ADN diana está en forma de cadena simple, y un cebador utilizado en la PCR comprende también el oligonucleótido de bloqueo.
22.

Un método de acuerdo con la Reivindicación 21 en el que el cebador contiene en su extremo 3' una parte que es complementaria a una región en el ADN diana que es 3' de las repeticiones en tándem y en su extremo 5' una parte que es complementaria de al menos una repetición en tándem en la cadena del producto de PCR sintetizada por dicho cebador.
23.

Un método de acuerdo con la Reivindicación 22 donde el cebador comprende, de 3 'a 5', (i) una parte que es complementaria a una región en el ADN diana que es 3' de las repeticiones en tándem, (ii) opcionalmente, una parte espaciadora, (iii) una parte de anclaje que es complementaria a una región que flanquea la repetición en tándem en la cadena del producto PCR sintetizado por dicho cebador, y (iv) una parte que es complementaria de al menos una repetición en tándem en la cadena del producto PCR sintetizado por dicho cebador.
24.

Un método de acuerdo con la Reivindicación 23 en el que el cebador comprende además (v) una parte de enganche que es complementaria a una parte de enganche en el extremo 3' del oligonucleótido sonda.
25.

Un método de acuerdo con la Reivindicación 23 en el que al menos se utilizan dos pares diferentes de cebador PCR y oligonucleótido sonda en los cuales las partes de enganche respectivas de cada par de oligonucleótido de bloqueo y oligonucleótido sonda son complementarias entre sí.
26.

Un método de acuerdo con la Reivindicación 21 en el que el iniciador de la PCR también comprende el oligonucleótido sonda.
27.

Un método según la Reivindicación 23 en el que el cebador comprende además (v) una parte espaciadora y (vi) un oligonucleótido sonda.
28.

Un método según la Reivindicación 1, en el que la diferencia en la temperatura de fusión (llTm) entre la Tm de los híbridos formados entre el oligonucleótido sonda y la parte de cadena simple del ADN diana que contiene las repeticiones en tándem es al menos 0.5 oC.
29.

Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el paso de hibridación (b) se realiza a una temperatura predeterminada cerca de, o en un intervalo de temperaturas que abarca los puntos de fusión del híbrido o de los híbridos formados entre la parte de cadena simple del polinucleótido diana y el oligonucleótido sonda.
30.

Un sistema para determinar simultáneamente el número de repeticiones en tándem en

polinucleótidos diana en un determinado locus polimórfico que se sabe que tiene alelos múltiples que varían en el número de repeticiones en tándem donde una o más de las repeticiones en tándem de los polinucleótidos diana se encuentra en forma de cadena simple, el sistema comprendiendo,

(a)

una sonda de oligonucleótidos etiquetada que es complementaria de al menos una de las repeticiones en tándem, y al menos 5 nucleótidos del oligonucleótido sonda son complementarios de las repeticiones en tándem, en la parte de cadena simple de los polinucleótidos diana, en el que el oligonucleótido sonda se selecciona para permitir la discriminación entre diferentes números de repeticiones en tándem en la parte de cadena simple de los polinucleótidos diana según su temperatura de fusión (Tm)

(b)

un oligonucleótido de bloqueo que es complementario a al menos una pero no todas las repeticiones en tándem en elpolinucleótido diana, y

(c)

instrumento para la determinación de la temperatura de fusión.
31.

Un cebador de oligonucleótido para participar en una reacción PCR para amplificar un ADN diana que contiene repeticiones en tándem que comprenden, de 3' a 5', (i) una parte que es complementaria a una región en el ADN diana que es 3' de las repeticiones en tándem (ii) opcionalmente, una parte espaciadora, (iii) una parte de anclaje, que es complementaria a una región que flanquea las repeticiones en tándem en la cadena del producto PCR sintetizada por dicho cebador, y (iv) una parte que es complementaria de al menos una repetición en tándem en la cadena del producto PCR sintetizado por dicho cebador.
32.

Un cebador de oligonucleótido según la Reivindicación 31 que comprende además (v) una parte espaciadora y (vi) un oligonucleótido sonda.
33.

Un sistema para determinar el número de repeticiones en tándem en un polinucleótido diana, el sistema comprendiendo un oligonucleótido que está etiquetado comprendiendo una parte que contiene al menos dos repeticiones en tándem unida a una parte de anclaje, en el que la secuencia de la parte de anclaje y las al menos dos repeticiones en tándem se produce de forma contigua en un polinucleótido diana y un oligonucleótido según la Reivindicación 31.
34.

Un sistema para determinar el número de repeticiones en tándem en un polinucleótido diana, el sistema comprendiendo un oligonucleótido que está etiquetado comprendiendo una parte que contiene al menos dos repeticiones en tándem unida a una parte de anclaje, en el que la secuencia de la parte de anclaje y las al menos dos repeticiones en tándem se produce de forma contigua en un polinucleótido diana que además comprende en su extremo 3' una parte de enganche y un cebador de oligonucleótido según la Reivindicación 31 y que comprende además

(v) una porción de enganche en la que dichas partes de enganche son complementarias entre sí.
35.

Un sistema para determinar el número de repeticiones en tándem en un polinucleótido diana que comprende dos o más pares de oligonucleótidos según la Reivindicación 34, donde dichos pares de oligonucleótidos tienen partes de enganche complementarias.
36.

Un método para la preparación de un cebador de oligonucleótidbpara participar en una reacción PCR para amplificar un ADN diana que contiene repeticiones en tándem de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 31 y 32, comprendiendo el método:

(a)

seleccionar un ADN diana que contiene repeticiones en tándem,

(b)

obtener la secuencia de las repeticiones en tándem y la secuencia de una o más de las regiones flanqueantes,

(c) sintetizar un oligonucleótido que comprende, de 3' a 5', (i) una parte que es complementaria a una región en el ADN diana que es 3' de las repeticiones en tándem (ii) opcionalmente, una 5 parte espaciadora, (iii) una parte de anclaje que es complementaria a una región que flanquea la repetición en tándem en la cadena del producto PCR sintetizado por dicho cebador, (iv) una parte que es complementaria de al menos una repetición en tándem en la cadena del producto PCR sintetizado por dicho cebador y, opcionalmente, (v) una parte de enganche que es complementaria a la parte de enganche en el extremo 5' (o 3') del oligonucleótido sonda u,

10 opcionalmente, (v) una parte espaciadora y (vi) un oligonucleótido sonda.
37. Un método para preparar un sistema de acuerdo con la Reivindicación 33, que comprende:

(a) seleccionar un ADN diana que contiene repeticiones en tándem,

15 (b) obtener la secuencia de las repeticiones en tándem y la secuencia de una o más de las regiones flanqueantes,

(c) preparar dichos oligonucleótidos.
38. Un método de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 29 o 36 o 37, o un sistema

20 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 30 o 33 a 35 o un oligonucleótido de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 31 y 32 donde el ADN diana es ADN genómico humano.