JP2007535928A5 - - Google Patents
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- a.(i)真核生物のゲノムDNA;
(ii)複数のフォワードおよびリバースDNAプライマーオリゴヌクレオチドの異なる対であって、
前記各異なる対の一方のプライマーは前記真核生物のDNAの第1のDNA鎖の標的セグメントの3’配列に相補的であり、他方のプライマーは前記標的セグメントの第2の鎖の3’配列に相補的であり、
前記真核生物のDNAのセグメントの長さは約50から約300塩基対であり、
各異なる対の前記プライマーの一方はその5’末端に付着した検出可能な標識を有しており、
複数の前記プライマーの異なる対には、選択された異なる目的染色体のセグメントであって、その各々が潜在的な染色体異常の指標であるセグメントに標的化された対が存在し、および、
1つの対は単一の対照遺伝子のセグメントに対して標的化されており、この対照遺伝子は標的セグメントが存在する染色体以外の染色体に存在し、潜在的な異数性の指標となりうる任意の染色体セグメントを標的としていない、
プライマーオリゴヌクレオチドの異なる対;ならびに
(iii)PCR増幅の実施に必要なPCR緩衝液および酵素;
を含む構成成分を容器中で混合することによってポリメラーゼ連鎖反応(PCR)混合物を作製するステップと:
b.PCRを約5から約60回の温度サイクルで実施して増幅PCR産物を作製するステップと;
c.ステップ(b)の前記産物を精製して検出可能な標識を有する一本鎖DNAを得るステップと、
d.マイクロアレイをステップ(c)の産物と接触させるステップであって、前記マイクロアレイは複数のスポットを有し、このスポットのそれぞれが前記標的セグメントのそれぞれの前記鎖の1つのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有するDNAオリゴヌクレオチドプローブを含むステップと;
e.前記マイクロアレイ中の前記DNAオリゴヌクレオチドプローブと、前記PCRで増幅した標識含有一本鎖産物とをハイブリダイズさせるステップと;
f.前記マイクロアレイのイメージングを行うことによって、前記マイクロアレイにハイブリダイズしたPCR増幅産物の存在および相対量を検出するステップと;
g.選択された染色体の前記各標的セグメントについて前記マイクロアレイ上の関連するスポットの前記イメージングを、前記対照遺伝子に関連するスポットの前記イメージングと比較し、その後、正常であることが知られているゲノムDNAの複数サンプルの同様の試験から得られた結果と比較することによって、前記選択された異なる染色体の1つまたは複数に関して染色体異常が存在するかどうかを診断するステップと
を含むことを特徴とする、複数の染色体異常のうち任意の1つを単一のアッセイで検出する方法。 - 前記診断ステップは、同じ性別の正常ゲノムDNAの前記結果との最終比較の前に、前記ステップ(f)の検出結果にルールベースアルゴリズムを適用することを含むことを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 選択された真核生物のゲノムDNAの前記標的セグメントの少なくとも2つは、ウィリアムズ−ビューレン症候群、ネコ鳴き症候群、およびディジョージ症候群からなる群から選択される染色体異常を生じさせる染色体DNAの潜在的な微小欠失に関連しているか、または、前記標的セグメントのうち少なくとも2つは、13トリソミー、18トリソミー、21トリソミーならびにX染色体およびY染色体異常からなる群から選択される染色体異常を検出するために選択されることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記検出可能な標識は色検出可能な標識であり、前記色検出可能な標識は前記リバースプライマーに付着しており、各対の前記フォワードプライマーはその5’末端にリン酸(phosphate)を有することを特徴とする、請求項1から3のいずれか1項に記載の方法。
- ステップ(b)の前記二本鎖産物をまず精製し、その後、前記精製産物の前記センス鎖をエキソヌクレアーゼで消化してステップ(c)の前記一本鎖の標識したアンチセンス鎖を得ることを特徴とする、請求項1から4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記プローブの大きさは約25から約60個のヌクレオチドの範囲であり、前記標的セグメントは約100から200塩基対の長さであり、前記単一の対照遺伝子はGAPDであることを特徴とする、請求項1から5のいずれか1項に記載の方法。
- 染色体異常が注目の前記異なる染色体の1または複数に関して存在するか否かを診断するステップは、注目の前記染色体の各々について前記マイクロアレイ上の関連するスポットの前記イメージングを、前記対照遺伝子に関連するスポットの前記イメージングと比較し、I比を得て、その後、各I比を、正常であることが知られているゲノムDNAの複数サンプルの同様の試験から得られたN比と比較することによって実施され、前記N比はその性別の者の正常DNAに対する平均値、すなわち、前記単一の対照遺伝子の強度に対する、注目の前記染色体の各々についての前記セグメントの各々の強度の比であることを特徴とする請求項1から6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記I−比はルールベースアルゴリズムかけられ、これにより、各I比が、最終診断にそれを用いる前に、まず全てのI比をそれぞれのN比と比較して個々のC因子を得た後に得られる平均C因子を用いることによって調整されることを特徴とする請求項7に記載の方法。
- 前記平均C因子は、0.75から1.25の前記個々のC因子の全てを平均化することにより、前記複数の個々のC因子から得られ、前記I比の各々を前記平均C因子で割ることにより、各々についての調節されたI比(A比)を得、その後、注目の前記複数の染色体の各々についての各A比をその染色体についての前記それぞれのN比と比較して、正常値からの差を決定することを特徴とする請求項8に記載の方法。
- (a)哺乳動物ゲノムDNAを増幅するためのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)においてプライマーとして機能する複数対のDNAオリゴヌクレオチドであって、各オリゴヌクレオチド対の一方のプライマーは哺乳動物ゲノムDNAの標的セグメントの第1の鎖の3ヌクレオチド配列に相補的であり、前記各オリゴヌクレオチド対の他方のプライマーは前記標的DNAセグメントの前記第2の鎖の前記3ヌクレオチド配列に相補的であり、各対の前記プライマーの一方はその5末端に共有結合した検出可能な標識を有するオリゴヌクレオチド;
(b)複数の前記DNAプライマー対は、潜在的な染色体異常の指標である選択された様々な目的染色体のセグメントを増幅することを標的としており、前記対の1つは対照遺伝子のセグメントを増幅することを標的としていること;
(c)(i)PCR、(ii)DNA−DNAハイブリダイゼーションおよび洗浄、ならびに(iii)比色定量を実施するための緩衝液および酵素;
(d)複数のスポットを有する少なくとも1つのマイクロアレイであって、スポットの少なくとも1つが、それに付着した、前記標識を保有するそれぞれの標的としたゲノムDNAセグメントの増幅した鎖に相補的なDNA配列を有するマイクロアレイ;ならびに
(e)PCR増幅産物と前記マイクロアレイ上のそれぞれのスポットとのハイブリダイゼーション反応からの強度イメージング結果を用いた染色体異常の診断手段であって、正常ゲノムDNAの同様の試験からのイメージング結果を利用する診断手段
を含むことを特徴とする、染色体異常を検出するためのキット。
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