JP2007525998A5

JP2007525998A5 -

Info

Publication number: JP2007525998A5
Application number: JP2007502004A
Authority: JP
Filing date: 2005-02-28
Publication date: 2008-04-03

Claims

（ａ）試験するゲノムＤＮＡを用いるステップと、
（ｂ）ＰＣＲを用いて、対象の全てのＳＴＲ、および前記ＳＴＲに隣接する、核酸の実質的な近接セグメントを含むゲノムＤＮＡにおける染色体上の核酸を増幅するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）の増幅したＤＮＡからの１本鎖の産物を得るステップと、
（ｄ）（ｉ）ＳＴＲ、および（ｉｉ）前記近接核酸セグメントを標的とする、比色標識したオリゴヌクレオチドを、ステップ（ｃ）の前記１本鎖の産物とハイブリダイズさせるステップと、
（ｅ）ステップ（ｃ）の前記１本鎖の産物を固相に結合させるステップと、
（ｆ）ステップ（ｄ）の前記ハイブリダイズした産物を、標識標的材料の残部から分離するステップと、
（ｇ）ステップ（ｆ）の産物から標識標的材料を回収するステップと、
（ｈ）次いで、回収されたステップ（ｇ）の標識された標的材料を、それに相補的な適切なオリゴヌクレオチドプローブを含む複数のスポットを有するマイクロアレイにハイブリダイズさせるステップと、
（ｉ）マイクロアレイへのハイブリダイゼーションの後、マイクロアレイの特定のスポットに存在するハイブリダイズした標識標的材料の比色強度（CIｓ）を測定してそれに対する個々の値を得るステップと、
（ｊ）ステップ（ｉ）の結果から得られた比色強度を既知の対照サンプルから得られた比色強度と比較して、得られたＤＮＡの対象の領域におけるＳＴＲの数を正確に定量するステップと
を含むことを特徴とする、短鎖縦列反復配列多型（ＳＴＲＰ）を検出するための方法。
前記の、ＳＴＲに対してハイブリダイズする標的は３個と７個の間の反復を含み、ＳＴＲプローブは６個と２０個の間の反復、および前記ＳＴＲ標的の少なくとも２倍の反復を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
ステップ（ｂ）は、ＤＮＡ領域の３’ボーダーに相補的な１対のフォワードプライマーおよびリバースプライマーを使用し、ＤＮＡ領域がＳＴＲ切片全体を含み、核酸の前記近接セグメントは少なくとも３０ヌクレオチドを含み、ステップ（ｂ）で使用するフォワードプライマーはＤＮＡ領域のアンチセンス鎖の３’ボーダーに相補的であり、その５’末端にアンカー部分を有し、リバースプライマーの５’末端はリン酸塩であり、前記標識標的材料はその５’末端に蛍光色素を有し、１本鎖の産物は２本鎖のＰＣＲ産物のアンチセンス鎖をエキソヌクレアーゼで消化することによりステップ（ｃ）で得られることを特徴とする、請求項１または２のいずれかに記載の方法。
脆弱Ｘ症候群を示す突然変異を検出するための請求項１に記載の方法であって、
全てのＣＧＧ反復、および翻訳されたＦＲＡＸＡ遺伝子の近接部分を含むゲノムＤＮＡにおけるＸ染色体上の核酸を増幅し、前記フォワードプライマーがその５’末端にアンカー部分を有し、ステップ（ｂ）の２本鎖の産物を精製し、エキソヌクレアーゼでそのアンチセンス鎖を消化することにより、１本鎖の産物を得て、（ＣＧＧ）反復に対する、およびＦＲＡＸＡ遺伝子の近接部分に対する蛍光標識したアンチセンス標的は、前記ハイブリダイズに使用され、
蛍光標識標的材料の測定された蛍光強度（FIｓ）を、
以下の式を用いて既知の対照サンプルからの結果と比較する
Ｎ＝３０＋（Ａ−１．０３）６６．４
式中、Ｎは反復の数であり、Ａは、近接セグメントに対するプローブにハイブリダイズした標的のＦＩに対するＣＧＧプローブとハイブリダイズした標的のＦＩの比である、既知の対照サンプルの結果と比較される、
を含むことを特徴とする方法。
請求項１に記載の方法であって、以下の式に基づいて、ＣＧＧ反復の数を求めることを特徴とする方法：
Ｎ＝３０＋（Ａ−１．０３）６６．４
式中、Ｎは反復の数であり、Ａは、近接する核セグメントに対するプローブにハイブリダイズした標的のＣＩに対するＣＧＧプローブとハイブリダイズした標的のＣＩの比であり、ステップ（ｉ）の結果を既知の対照サンプルからの結果と比較して、得られたゲノムＤＮＡのＦＲＡＸＡ遺伝子におけるＣＧＧ反復の数を正確に定量するステップと
を含むことを特徴とする方法。
請求項５に記載の方法であって、増幅された核酸は、ＣＧＧ反復、およびＸ染色体および少なくともＦＲＡＸＡ遺伝子の３’の翻訳された近接断片の実質的な部分を含み、
前記のＣＧＧ反復に対してハイブリダイズする標的は、３個と７個の間のトリプレットを含み、ＣＧＧ反復プローブは６個と２０個の間のトリプレット、および前記反復ターゲットの少なくとも２倍のトリプレットを含み、標識された標的は、その５’末端に蛍光色素を有し、ステップ（ｂ）に使用するフォワードプライマーは、ＤＮＡ領域のアンチセンス鎖の３’ボーダーに相補的であり、且つその５’末端にアンカー部分を有し、前記リバースプライマーは、配列番号２を含み且つその５’末端にリン酸を有し、ステップ（ｃ）で得られた前記１本鎖の産物はエキソヌクレアーゼで２本鎖のＰＣＲ産物のアンチセンス鎖を消化することにより得られることを特徴とする方法。
（ａ）哺乳動物のゲノムＤＮＡを増幅するためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）でフォワードプライマーおよびリバースプライマーとして機能する１対のＤＮＡオリゴヌクレオチドであって、
前記プライマーのオリゴヌクレオチドの対は、全てのＳＴＲ、および内部対照として働く実質的な近接セグメントを含むゲノムＤＮＡの領域を増幅するのに特異的であり、
フォワードプライマーは、染色体の選択された領域のアンチセンス鎖の３’ヌクレオチド配列に相補的であり、リバースプライマーは、選択された領域のセンス鎖の３’末端に相補的であり、
前記フォワードプライマーは、その５’末端に共有結合したアンカー部分を有し、
前記リバースプライマーは、その５’末端の伸長がブロックされている、
１対のＤＮＡオリゴヌクレオチドと、
（ｂ）前記ＳＴＲ領域および前記内部対照セグメントを別々に標的とする標識されたオリゴヌクレオチドと、
（ｃ）（ｉ）ＰＣＲ、（ｉｉ）アンチセンス鎖の消化、（ｉｉｉ）ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションおよび洗浄、（ｉｖ）ハイブリダイズされた標識されたオリゴヌクレオチド標的の解離、および（ｖ）比色定量、を行うためのバッファーおよび酵素と、
（ｄ）スポットが、それぞれ前記標識されたオリゴヌクレオチド標的の１つに相補的なＤＮＡプローブに付着している、複数のスポットを有する少なくとも１つのマイクロアレイと、
（ｅ）前記マイクロアレイの比色スキャニングの結果、および対照サンプルから前に生成されたデータを用いてＳＴＲの数の診断を行うための手段と
を含むことを特徴とする、脆弱Ｘ症候群を示す突然変異を検出するためのキット。
請求項７に記載のキットであって、突然変異は脆弱Ｘ症候群であり、前記キットは、前記アンカー部分に相補的なカップリング剤を有する固相材料を含み、前記ハイブリダイズする標的は３個と７個の間のＣＣＧ反復を含み、ＤＮＡプローブは６個と２０個の間の反復、および前記相補的な標的の少なくとも２倍の反復を含み、前記フォワードプライマーおよびリバースプライマーは、ＣＣＧ反復切片全体、およびその３’であり少なくとも３０ヌクレオチドを含む核酸の前記近接セグメントを含むＤＮＡ領域の３’ボーダーに相補的であり、フォワードプライマーはアンチセンス鎖の３’ボーダーに相補的でありその５’末端にビオチンを有し、リバースプライマーはその５’末端にリン酸塩を有し、前記標識した標的のオリゴヌクレオチドはその５’末端に蛍光色素を有し、内部対照領域の標的の少なくとも約１０倍の量のＳＴＲ領域の標的の量が提供され、２本鎖のＰＣＲ産物のアンチセンス鎖を消化して１本鎖のＰＣＲ産物を得るためにエキソヌクレアーゼを提供することを特徴とするキット。