JP2013540449A5 - - Google Patents

Claims (11)

1. １つ以上の標的核酸についてサンプルをアッセイする方法であって、以下のステップ：
   （ａ）１つ以上の標的核酸を含むサンプルを、以下を含む増幅反応混合物と接触させること：
   （ｉ）正方向／逆方向オリゴヌクレオチドプライマーの１つ以上の対であって、サンプル中に存在する場合、前記プライマー対は、１つ以上の標的核酸を増幅することができる、プライマー対、
   （ｉｉ）２つ以上のプローブの組であって、前記組中の少なくとも１つのプローブは二本鎖部分を含む、プローブ組、
   この場合、少なくとも１つのプローブは２つのオリゴヌクレオチドを含み：第１のオリゴヌクレオチドは、標的ハイブリダイジンングオリゴヌクレオチド（ＴＨＯ）とも呼ばれ、第２のオリゴヌクレオチドは、部分的に相補的なオリゴヌクレオチド（ＰＣＯ）とも呼ばれ、ＴＨＯおよびＰＣＯは、互いにハイブリダイズすることができ、部分的に二本鎖のプローブを形成する、
   この場合、前記組中の各プローブは、各プローブに特徴的な可変性のシグナルを生じることができる検出可能な標識または検出可能な標識の組み合わせを含む、および
   この場合、前記２つ以上のプローブは、同じ検出可能な標識、または、識別不可能な発光スペクトルを有する異なる検出可能な標識を含み、かかるプローブのそれぞれの融解特性は異なり、二本鎖部分を有する各プローブは特徴となる融解温度を有するのに対し、二本鎖部分を有さない一本鎖プローブは特徴となる融解温度を有さない；
   （ｂ）増幅条件下で、サンプル／反応混合物において増幅反応を行なうこと、この場合、標的核酸が存在する場合、その標的核酸の一部に実質的に相補的であるＴＨＯは前記標的核酸とハイブリダイズし、その結果、消費され、この場合、プローブの消費は、標識の検出可能なシグナルの変化を生じ、また、元のプローブが二本鎖部分を有する場合、消費されたプローブはもはや二本鎖部分を形成することはできない；および
   （ｃ）温度の関数としてプローブ中の標識からシグナルを検出することにより、前記反応混合物中の消費されないプローブの融解プロファイルを少なくとも一度測定すること、この場合、前記融解プロファイル分析における任意のプローブの融解特性の有無は、そのプローブの非消費または消費を示し、それにより、前記サンプル中に少なくとも１つの標的核酸が存在するか否かも示される、
   を含み、
   この場合、ＴＨＯは標的配列に相補的であり、フルオロホアおよびクエンチャーで標識され、
   この場合、ＰＣＯは、ＴＨＯに部分的に相補的であり、また、例えば、標識またはリン酸基を付けることにより修飾された３’末端を含み、その伸長を防ぎ、
   この場合、ＰＣＯの３’末端にクエンチャー（例えばリン酸基）でない標識が付けられている場合、蛍光放射はＴＨＯおよびＰＣＯのハイブリダイゼーションによって増加され、この種のプローブはプラス・プローブ（＋ＴＨＯ：ＰＣＯ）と呼ばれ、
   この場合、ＰＣＯの３’末端にクエンチャーが付けられている場合、蛍光放射はＴＨＯおよびＰＣＯのハイブリダイゼーションによって減少され、この種のプローブはマイナス・プローブ（−ＴＨＯ：ＰＣＯ）と呼ばれる、
   前記アッセイ方法。
2. 前記２つ以上のプローブの組がプラス・プローブ、又は、プラス・プローブとマイナス・プローブの組み合わせを含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記融解プロファイルが、反応／増幅が行われる前に測定され（増幅前融解プロファイル）、および／または、反応／増幅の完了後に測定され（増幅後融解プロファイル）、および／または、各サイクルもしくは選択されたサイクルにおける反応／増幅中に測定され（増幅中融解プロファイル）、
   以下のステップ（ｄ）
   （ｉ）（ｃ）で得られた少なくとも２つの融解プロファイルを比較すること、
   および／または
   （ｉｉ）ステップ（ｃ）で得られた融解プロファイルを、
   同じプローブの以前に得られた融解プロファイルと、もしくは
   対照反応中の同じ時間に同時に得られた同じプローブの融解プロファイルと、もしくは
   同じプローブの理論的融解プロファイルと比較すること、
   をさらに含み、この場合、融解プロファイルの変化は、前記サンプル／反応混合物中に少なくとも１つの標的核酸が存在するか否かを示し、
   前記増幅前融解プロファイルは、反応／増幅開始前に同じ反応容器中で測定されるか、または、反応／増幅に必要な１つ以上の成分を欠くその反応混合物により増幅が行われない個別の反応容器中で測定され、
   ステップ（ｄ）において、増幅後または増幅中融解プロファイルは、特定のプローブが消費されるか否かを調べるために、二本鎖のプローブの増幅前融解プロファイルと比較され、これにより、サンプル中の対応する標的の存在が示される、請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記プローブの消費が、前記ＴＨＯの前記標的配列へのハイブリダイゼーション、それに続く、前記ＴＨＯの前記増幅生成物への組み入れによって達成されるか、または、前記ＴＨＯが前記増幅生成物中に組み入れられ得る時、前記ＴＨＯは伸長可能なプライマーであるか、もしくは、正方向／逆方向オリゴヌクレオチドプライマー対の一つである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
5. 前記プローブの消費が、前記ＴＨＯと前記標的配列とのハイブリダイゼーション、それに続く、ＴＨＯの分解により達成され、この場合、ＴＨＯが反応中に分解される場合、前記反応混合物はヌクレアーゼ活性を有する酵素を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
6. 前記２つ以上のプローブの組が、二本鎖部分を有する少なくとも２つのプローブを含み、
   この場合、第１のプローブは、その二本鎖部分に関して融解温度Ｔｍ１を有し、
   この場合、第２のプローブは、その二本鎖部分に関して融解温度Ｔｍ２を有し、
   この場合、Ｔｍ１＞Ｔｍ２であり、
   この場合、同じ標識が、第１および第２のプローブに独立して付けられ、
   この場合、Ｔｍ１および／またはＴｍ２の任意の融解ピークの減少が、第１および／または第２のプローブの消費を示す、
   請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
7. 前記増幅反応混合物は、一塩基多型（ＳＮＰ）をアッセイするための２つの関連するＴＨＯ（プローブ）を含み、第１のＴＨＯは第１の対立遺伝子用であり、第２のＴＨＯは第２の対立遺伝子用である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
8. 一塩基多型（ＳＮＰ）をアッセイするための前記２つの関連するＴＨＯは、同じＰＣＯとハイブリダイズして、部分的に二本鎖であるプローブを形成することができる、請求項７に記載の方法。
9. 前記２つの関連するＴＨＯは、同じ標識が付けられている、請求項７に記載の方法。
10. 請求項１〜９のいずれか１項に記載の２つ以上のプローブの組を含む、１つ以上の核酸標的をアッセイするためのキットであって、以下：
    二本鎖部分を含む前記組中の少なくとも１つのプローブ、
    この場合、前記少なくとも１つのプローブは、２つのオリゴヌクレオチド：標的ハイブリダイジングオリゴヌクレオチド（ＴＨＯ）および部分的に相補的なオリゴヌクレオチド（ＰＣＯ）を含み、ＴＨＯおよびＰＣＯは、互いにハイブリダイズすることができ、部分的に二本鎖のプローブを形成する、
    この場合、前記組中の各プローブは、各プローブに特徴的な可変性のシグナルを生じることができる検出可能な標識または検出可能な標識の組み合わせを含む、および
    この場合、前記２つ以上のプローブは、同じ検出可能な標識、または、識別不可能な発光スペクトルを有する異なる検出可能な標識を含み、かかるプローブのそれぞれの融解特性は異なり、二本鎖部分を有する各プローブは特徴となる融解温度を有するのに対し、二本鎖部分を有さない一本鎖プローブは特徴となる融解温度を有さない；
    この場合、ＴＨＯは標的配列に相補的であり、フルオロホアおよびクエンチャーで標識され、
    この場合、ＰＣＯは、ＴＨＯに部分的に相補的であり、また、例えば、標識またはリン酸基を付けることにより修飾された３’末端を含み、その伸長を防ぎ、
    この場合、ＰＣＯの３’末端にクエンチャー（例えばリン酸基）でない標識が付けられている場合、蛍光放射はＴＨＯおよびＰＣＯのハイブリダイゼーションによって増加され、この種のプローブはプラス・プローブ（＋ＴＨＯ：ＰＣＯ）と呼ばれ、
    この場合、ＰＣＯの３’末端にクエンチャーが付けられている場合、蛍光放射はＴＨＯおよびＰＣＯのハイブリダイゼーションによって減少され、この種のプローブはマイナス・プローブ（−ＴＨＯ：ＰＣＯ）と呼ばれ、
    この場合、前記２つ以上のプローブの組は、プラス・プローブのみを含むか、
    または、前記２つ以上のプローブの組は、マイナス・プローブのみを含むか、
    または、前記２つ以上のプローブの組は、プラス・プローブとマイナス・プライマーの組み合わせを含むか、
    または、前記２つ以上のプローブの組は、一本鎖プローブと、プラス・プローブまたはマイナス・プローブの組み合わせを含む、
    を含む、アッセイするためのキット。
11. 前記２以上のプローブの組が、一塩基多型（ＳＮＰ）をアッセイするための２つの関連するＴＨＯ（プローブ）を含み、第１のＴＨＯは第１の対立遺伝子用であり、第２のＴＨＯは第２の対立遺伝子用であり、
    前記２つの関連するＴＨＯは、同じＰＣＯとハイブリダイズして、部分的に二本鎖であるプローブを形成することができ、
    前記２つの関連するＴＨＯは、同じ標識が付けられている、
    請求項１０に記載のキット。