JP7423603B2 - 核酸の多重検出 - Google Patents
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Description
本出願は、2018年8月9日出願の豪州仮出願番号2018902915からの優先権を主張し、その内容全体が、相互参照により本明細書に組み込まれる。
る。近年、「オリゴヌクレオチド切断および伸長のタグ付け」(TOCE)として知られているプロトコルがこの能力を拡張し、単一の波長での複数の標的の分析を可能にしている。TOCE技術は、ピッチャーおよびキャッチャーオリゴヌクレオチドを使用する。ピッチャーは、標的に相補的である標的化部分、および相補的ではなく5’端に位置するタグ付け部分の、2つの領域を有する。捕捉オリゴヌクレオチドは、二重標識されており、その3’末端にピッチャーのタグ付け部分に相補的である領域を有する。増幅中、ピッチャーは、アンプリコンに結合し、プライマーの伸長時に、ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性が、ピッチャーからタグ付け部分を切断することができる。その後、放出されたタグ付け部分は、キャッチャーオリゴヌクレオチドに結合し、相補鎖を合成するためのプライマーとして機能する。その後、二本鎖キャッチャー分子の溶融温度(キャッチャー-Tm)は、元の鋳型の代替マーカーとして作用する。異なる配列および長さを有する複数のキャッチャーを組み込むことが可能であり、それらは全て異なる温度で融解するため、依然として単一の波長で測定しながら、一連の標的を示す一連のキャッチャー-Tm値を得ることが可能である。このアプローチの制限には、固有の複雑さが含まれるが、これは、放出される断片が、人工標的に対する第2の伸長を開始および完了することを必要とするためである。
よる解釈および/または専用ソフトウェアの使用を必要とする可能性がある。したがって、融解曲線分析のより高速および/またはより簡便な代替手段に対する高い需要が存在する。
実施形態1.試料中の第1および第2の標的の存在または不在を決定するための方法であって、
-第1および/もしくは第2の標的またはそれらのアンプリコンを含むと推定される試料またはその誘導体を、
第1および第2の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドであって、閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの各々が、ハイブリダイズしていないヌクレオチドの閉鎖一本鎖ループ部分に接続されたハイブリダイズしたヌクレオチドの二本鎖ステム部分を含み、
第1および第2の閉ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分における、ハイブリダイズしたヌクレオチドの数および/またはハイブリダイズしたヌクレオチドの配列が、異なり、
二本鎖ステム部分の各々が、一方の鎖に接続されたフルオロフォア分子、および反対の鎖に接続されたクエンチャー分子を含む、第1および第2の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチド、ならびに
標的またはそのアンプリコンと接触した場合にのみ、第1および第2の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの一本鎖ループ部分を切断または分解することができる酵素と接触させることによって、反応混合物を調製することと、
-反応混合物を、
酵素が、第1および第2の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分の切断または分解を誘導して、それにより、第1および第2の開放ステムループオリゴヌクレオチドを生成するのに好適な条件下で処理することと、
-反応混合物またはその誘導体を、第1の温度であって、その温度で、第1の開放ステムループオリゴヌクレオチドの二本鎖ステム部分の鎖が解離して、それにより、第1の開放ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のフルオロフォアおよびクエンチャー分子の空間的分離を促進し、第1の検出可能なシグナルを提供する、第1の温度で、ならびに
第2の温度であって、その温度で、第2の開放ステムループオリゴヌクレオチドの二本鎖ステム部分の鎖が解離して、それにより、第2の開放ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のフルオロフォアおよびクエンチャー分子の空間的分離を促進し、第2の検出可能な蛍光シグナルを提供する、第2の温度で、処理することであって、
第1の温度が、第2の温度とは異なり、
第1の開放ステムループオリゴヌクレオチドのフルオロフォアおよび第2の開放ステムループオリゴヌクレオチドのフルオロフォアが、同じ可視スペクトルの色領域で発光する、処理することによって、該第1および第2の開放オリゴヌクレオチドの存在または不在を検出することとを含み、
第1の温度でのシグナルの検出が、試料中の第1の標的の存在を示し、第1の温度でのシグナルの検出の失敗が、試料中の第1の標的の不在を示し、
第2の温度でのシグナルの検出が、試料中の第2の標的の存在を示し、第2の温度でのシグナルの検出の失敗が、試料中の第2の標的の不在を示す、方法。
第1の多成分核酸酵素(MNAザイム)を第1の標的またはそのアンプリコンに結合させ、該第1のMNAザイムの基質アームを第1の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分にハイブリダイズして、それにより、第1のMNAザイムが、第1の開放ステムループオリゴヌクレオチドを形成することによって、第1の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分の該切断を促進するのに好適な条件下で処理することを含む、実施形態1に記載の方法。
-標的が、分析物、タンパク質、化合物、または分子であり、
-酵素が、第1の標的に結合することができるアプタマーを有する酵素を含み、
-アプタマーへの第1の標的の結合が、アプタマーを有する酵素を触媒活性にすることができる、実施形態1に記載の方法。
-標的が、分析物、タンパク質、化合物、または分子であり、
-反応混合物が、第1のMNAザイムのセンサーアームにハイブリダイズして、それにより、第1のMNAザイムの集合を促進することができるオリゴヌクレオチド配列をさらに含み、
-第1のMNAザイムが、第1の標的に結合することができるアプタマー配列を含み、
-アプタマーへの標的の結合が、第1のMNAザイムを触媒活性にすることができる、実施形態2、4、または5のいずれか一項に記載の方法。
反応混合物を、第1の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分への第1の標的またはそのアンプリコンのハイブリダイゼーションに好適な条件下で処理して、第1の制限エンドヌクレアーゼが会合する二本鎖配列を形成し、それにより、第1の開放ステムループオリゴヌクレオチドを形成する第1の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分の該切断を促進する、実施形態1~6のいずれか一項に記載の方法。
反応混合物を、
-第1の標的またはそのアンプリコンを、第1の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分にハイブリダイズして、第1の標的またはそのアンプリコンを含む第1の二本鎖配列を形成すること、
-第1のプライマーオリゴヌクレオチドを、第1の標的またはそのアンプリコンにハイブリダイズして、第1の標的またはそのアンプリコンを含む第1の二本鎖配列に対して上流(5’)に位置する第2の二本鎖配列を形成すること、
-エキソヌクレアーゼ活性を含む第1の酵素を、第1のプライマーオリゴヌクレオチドの末端にあるか、またはそれに隣接する第1の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分と会合させること、および
-エキソヌクレアーゼ活性を含む第1の酵素を触媒活性させ、それにより、第1の標的またはアンプリコンを含む第1の二本鎖配列のループ部分の分解を促進し、第1の開放ステムループオリゴヌクレオチドを形成することに好適な条件下で処理することを含む、実施形態1~8のいずれか一項に記載の方法。
反応混合物を、
-第1の標的またはそのアンプリコンを、第1の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分にハイブリダイズして、第1の標的またはそのアンプリコンを含む第1の二本鎖配列を形成すること、
-エキソヌクレアーゼ活性を含む第1の酵素を、第1の標的またはそのアンプリコンを含む第1の二本鎖配列と会合させること、および
-エキソヌクレアーゼ活性を含む第1の酵素を触媒活性させ、それにより、第1の標的またはアンプリコンを含む第1の二本鎖配列のループ部分の分解を促進し、第1の開放ステムループオリゴヌクレオチドを形成することに好適な条件下で処理することを含む、実施形態1~9のいずれか一項に記載の方法。
-該第1の補因子をDNAザイムに結合させ、かつ/または該第1の補因子をリボザイムに結合させて、DNAザイムおよび/またはリボザイムを触媒活性にすること、
-DNAザイムおよび/またはリボザイムを、第1の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分にハイブリダイズすること、
-DNAザイムおよび/またはリボザイムを触媒活性させ、それにより、第1の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分の切断を促進し、第1の開放ステムループオリゴヌクレオチドを形成することに好適な条件下で処理することを含み、
第1の標的が、第1の補因子である、実施形態1~10のいずれか一項に記載の方法。
-第2のMNAザイムを第2の標的またはそのアンプリコンに結合させ、該第2のMNAザイムの基質アームを第2の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分にハイブリダイズして、それにより、第2のMNAザイムが、第2の開放ステムループオリゴヌクレオチドを形成することによって、第2の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分の該切断を促進すること、
-第2の標的またはそのアンプリコンを第2の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分にハイブリダイズして、第2の制限エンドヌクレアーゼが二本鎖配列と会合する二本鎖配列を形成し、それにより、第2の開放ステムループオリゴヌクレオチドを形成する第2の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分の該切断を促進すること、
-第2の標的またはそのアンプリコンを、第2の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分にハイブリダイズして、第2の標的またはそのアンプリコンを含む第2の二本鎖配列を形成し、
第2のプライマーオリゴヌクレオチドを、第2の標的またはそのアンプリコンにハイブリダイズして、第2の標的またはそのアンプリコンを含む第2の二本鎖配列に対して上流(5’)に位置する第2の二本鎖配列を形成し、
エキソヌクレアーゼ活性を含む第2の酵素を、第2のプライマーオリゴヌクレオチドの末端にあるか、またはそれに隣接する第2の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分と会合させ、
エキソヌクレアーゼ活性を含む第2の酵素を触媒活性させ、それにより、第2の標的またはアンプリコンを含む第2の二本鎖配列のループ部分の分解を促進し、第2の開放ステムループオリゴヌクレオチドを形成すること、
-第2の標的またはそのアンプリコンを、第2の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分にハイブリダイズして、第2の標的またはそのアンプリコンを含む第2の二本鎖配列を形成し、
エキソヌクレアーゼ活性を含む第2の酵素を、第2の標的またはそのアンプリコンを含む第2の二本鎖配列と会合させ、
エキソヌクレアーゼ活性を含む第2の酵素を触媒活性させ、それにより、第2の標的またはアンプリコンを含む第2の二本鎖配列のループ部分の分解を促進し、第2の開放ステムループオリゴヌクレオチドを形成すること、
-第2の補因子をDNAザイムに結合させ、かつ/または第2の補因子をリボザイムに結合させて、DNAザイムおよび/またはリボザイムを触媒活性にし、
DNAザイムおよび/またはリボザイムを、第2の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分にハイブリダイズし、
DNAザイムおよび/またはリボザイムを触媒活性させ、それにより、第2の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分の切断を促進し、第2の開放ステムループオリゴヌクレオチドを形成することのうちのいずれか1つ以上に好適な条件下で処理することをさらに含み、
-第2の標的が、分析物、タンパク質、化合物、または分子であり、
-酵素が、第2の標的に結合することができるアプタマーを有する酵素を含み、
-アプタマーへの第2の標的の結合が、アプタマーを有する酵素を触媒活性にすることができる、実施形態13に記載の方法。
-第2の標的が、分析物、タンパク質、化合物、または分子であり、
-反応混合物が、第2のMNAザイムのセンサーアームにハイブリダイズして、それにより、第2のMNAザイムの集合を促進することができるオリゴヌクレオチド配列をさらに含み、
-第2のMNAザイムが、第2の標的に結合することができるアプタマー配列を含み、
-第2のMNAザイムのアプタマー配列への第2の標的の結合が、第2のMNAザイムのアプタマーに結合した阻害分子の除去を促進することによって、第2のMNAザイムを触媒活性にすることができる、実施形態13、19、または20に記載の方法。
-反応混合物が、該第1および第2のMNAザイムを含み、
-第1のMNAザイムの基質アームにハイブリダイズすることができる第1の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分の配列が、第2のMNAザイムの基質アームにハイブリダイズすることができる第2の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分の配列とは異なる、実施形態13~22のいずれか一項に記載の方法。
-試料またはその誘導体を含む反応混合物を、
第3の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドであって、第3の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドが、ハイブリダイズしていないヌクレオチドの閉鎖一本鎖ループ部分に接続されたハイブリダイズしたヌクレオチドの二本鎖ステム部分を含み、
第3の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分における、ハイブリダイズしたヌクレオチドの数および/またはハイブリダイズしたヌクレオチドの配列が、第1および第2の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のものとは異なり、
二本鎖ステム部分が、一方の鎖に接続されたフルオロフォア分子、および反対の鎖に接続されたクエンチャー分子を含む、第3の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチド、ならびに
標的またはそのアンプリコンと接触した場合にのみ、第3の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの一本鎖ループ部分を切断または分解することができる酵素と接触させることと、
-反応混合物を、酵素が、第3の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分の切断または分解を誘導して、それにより、第3の開放ステムループオリゴヌクレオチドを
生成するのに好適な条件下で処理することと、
-反応混合物またはその誘導体を、
第3の温度であって、その温度で、第3の開放ステムループオリゴヌクレオチドの二本鎖ステム部分の鎖が解離して、それにより、第3の開放ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のフルオロフォアおよびクエンチャー分子の空間的分離を促進し、第3の検出可能なシグナルを提供する、第3の温度で、処理することによって、第3のオリゴヌクレオチドの存在または不在を検出することとを含み、
第3の温度が、第1および第2の温度とは異なり、
第3の温度でのシグナルの検出が、試料中の第3の標的の存在を示し、第3の温度でのシグナルの検出の失敗が、試料中の第3の標的の不在を示す、実施形態1~24のいずれか一項に記載の方法。
-試料またはその誘導体を含む反応混合物を、
第3の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドであって、第3の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドが、ハイブリダイズしていないヌクレオチドの閉鎖一本鎖ループ部分に接続されたハイブリダイズしたヌクレオチドの二本鎖ステム部分を含み、
第3の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分における、ハイブリダイズしたヌクレオチドの数および/またはハイブリダイズしたヌクレオチドの配列が、第1または第2の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のものと同じであり、
二本鎖ステム部分が、一方の鎖に接続されたフルオロフォア分子、および反対の鎖に接続されたクエンチャー分子を含み、第3の開放ステムループオリゴヌクレオチドに接続されたフルオロフォア分子が、第1および/または第2の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのフルオロフォアとは異なる可視スペクトルの色領域で発光する、第3の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチド、ならびに
標的またはそのアンプリコンと接触した場合にのみ、第3の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの一本鎖ループ部分を切断または分解することができる酵素と接触させることと、
-反応混合物を、酵素が、第3の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分の切断または分解を誘導して、それにより、第3の開放ステムループオリゴヌクレオチドを生成するのに好適な条件下で処理することと、
-反応混合物またはその誘導体を、
第3の温度であって、その温度で、第3の開放ステムループオリゴヌクレオチドの二本鎖ステム部分の鎖が解離して、それにより、第3の開放ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のフルオロフォアおよびクエンチャー分子の空間的分離を促進し、第3の検出可能なシグナルを提供する、第3の温度で、処理することによって、第3のオリゴヌクレオチドの存在または不在を検出することとを含み、
第3の温度でのシグナルの検出が、試料中の第3の標的の存在を示し、第3の温度でのシグナルの検出の失敗が、試料中の第3の標的の不在を示す、実施形態1~24のいずれか一項に記載の方法。
-第3のMNAザイムを第3の標的またはそのアンプリコンに結合させ、該第3のMNAザイムの基質アームを第3の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分にハイブリダイズして、それにより、第3のMNAザイムが、第3の開放ステムループオリゴヌクレオチドを形成することによって、第3の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのルー
プ部分の該切断を促進すること、
-第3の標的またはそのアンプリコンを第3の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分にハイブリダイズして、第3の制限エンドヌクレアーゼが二本鎖配列と会合する二本鎖配列を形成し、それにより、第3の開放ステムループオリゴヌクレオチドを形成する第3の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分の該切断を促進すること、
-第3の標的またはそのアンプリコンを、第3の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分にハイブリダイズして、第3の標的またはそのアンプリコンを含む第3の二本鎖配列を形成し、
第3のプライマーオリゴヌクレオチドを、第3の標的またはそのアンプリコンにハイブリダイズして、第3の標的またはそのアンプリコンを含む第3の二本鎖配列に対して上流(5’)に位置する第3の二本鎖配列を形成し、エキソヌクレアーゼ活性を含む第3の酵素を、第3のプライマーオリゴヌクレオチドの末端にあるか、またはそれに隣接する第3の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分と会合させ、
エキソヌクレアーゼ活性を含む第3の酵素を触媒活性させ、それにより、第3の標的またはアンプリコンを含む第3の二本鎖配列のループ部分の分解を促進し、第3の開放ステムループオリゴヌクレオチドを形成すること、
-第3の標的またはそのアンプリコンを、第3の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分にハイブリダイズして、第3の標的またはそのアンプリコンを含む第3の二本鎖配列を形成し、
エキソヌクレアーゼ活性を含む第3の酵素を、第3の標的またはそのアンプリコンを含む第3の二本鎖配列と会合させ、
エキソヌクレアーゼ活性を含む第3の酵素を触媒活性させ、それにより、第3の標的またはアンプリコンを含む第3の二本鎖配列のループ部分の分解を促進し、第3の開放ステムループオリゴヌクレオチドを形成すること、
-第3の補因子をDNAザイムに結合させ、かつ/または第3の補因子をリボザイムに結合させて、DNAザイムおよび/またはリボザイムを触媒活性にし、
DNAザイムおよび/またはリボザイムを、第3の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分にハイブリダイズし、
DNAザイムおよび/またはリボザイムを触媒活性させ、それにより、第3の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分の切断を促進し、第3の開放ステムループオリゴヌクレオチドを形成することのうちのいずれか1つ以上に好適な条件下で処理することを含み、
第3の標的が、第3の補因子である、実施形態25~27のいずれか一項に記載の方法。
-標的が、分析物、タンパク質、化合物、または分子であり、
-酵素が、第3の標的に結合することができるアプタマーを有する酵素を含み、
-アプタマーへの第3の標的の結合が、アプタマーを有する酵素を触媒活性にすること
ができる、実施形態28に記載の方法。
実施形態33.アプタマーを有する酵素が、アプタ-DNAザイム、アプタ-リボザイム、アプタ-MNAザイムのうちのいずれか1つ以上を含む、実施形態32に記載の方法。
-第3の標的が、分析物、タンパク質、化合物、または分子であり、
-反応混合物が、第3のMNAザイムのセンサーアームにハイブリダイズして、それにより、第3のMNAザイムの集合を促進することができるオリゴヌクレオチド配列をさらに含み、
-第3のMNAザイムが、第3の標的に結合することができるアプタマー配列を含み、
-第3のMNAザイムのアプタマー配列への第3の標的の結合が、第3のMNAザイムのアプタマーに結合した阻害分子の除去を促進することによって、第3のMNAザイムを触媒活性にすることができる、実施形態28に記載の方法。
-反応混合物が、該第3のMNAザイム、ならびに該第1および第2のMNAザイムのいずれかまたは両方を含み、
-第3のMNAザイムの基質アームにハイブリダイズすることができる第3の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分の配列が、
第1のMNAザイムの基質アームにハイブリダイズすることができる第1の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分の配列、および/または
第1のMNAザイムの基質アームにハイブリダイズすることができる第2の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分の配列とは異なる、実施形態28、または30~34のいずれか一項に記載の方法。
第3の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分における、ハイブリダイズしたヌクレオチドの数および/またはハイブリダイズしたヌクレオチドの配列が、第1および第2の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のものとは異なり、
-第3の温度が、第1および第2の温度とは異なり、
-第3の閉鎖および開放ステムループオリゴヌクレオチドのフルオロフォアが、第1および第2の閉鎖および開放ステムループオリゴヌクレオチドのフルオロフォアと同じ可視スペクトルの色領域で発光する、実施形態25、または実施形態28~35のいずれか一項に記載の方法。
-第1の閉鎖および開放ステムループオリゴヌクレオチドのフルオロフォアが、第2の閉鎖および開放ステムループオリゴヌクレオチドのフルオロフォアと同じ可視スペクトルの色領域で発光し、
-第3の閉鎖および開放ステムループオリゴヌクレオチドのフルオロフォアが、第1お
よび第2の閉鎖および開放ステムループオリゴヌクレオチドのフルオロフォアとは異なる可視スペクトルの色領域で発光する、実施形態25~35、または36のいずれか一項に記載の方法。
第1および第2の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドであって、閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの各々が、ハイブリダイズしていないヌクレオチドの一本鎖ループ部分に接続されたハイブリダイズしたヌクレオチドの二本鎖ステム部分を含み、
第1および第2の閉ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分における、ハイブリダイズしたヌクレオチドの数および/またはハイブリダイズしたヌクレオチドの配列が、異なり、
二本鎖ステム部分の各々が、一方の鎖に接続されたフルオロフォア分子、および反対の鎖に接続されたクエンチャー分子を含む、第1および第2の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドを含み、
フルオロフォア分子が、同じ可視スペクトルの色領域で発光し、第1の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの二本鎖ステム部分の融解温度(Tm)が、第2の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの二本鎖ステム部分のTmとは異なる、組成物。
の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの一本鎖ループ部分の配列とは異なる、実施形態47に記載の組成物。
第1の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの閉鎖一本鎖ループ部分にハイブリダイズすることができる基質アームを含む、第1のMNAザイム、および
第2の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの一本鎖ループ部分にハイブリダイズすることができる基質アームを含む、第2のMNAザイムをさらに含む、実施形態47または実施形態48に記載の組成物。
第1のMNAザイムの基質アームが、第1の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの一本鎖ループ部分にハイブリダイズし、
第2のMNAザイムの基質アームが、第2の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの一本鎖ループ部分にハイブリダイズする、実施形態49に記載の組成物。
第1および/または第2のMNAザイムが、標的分析物、タンパク質、化合物、または分子に結合したアプタマー配列、およびオリゴヌクレオチド配列にハイブリダイズしたセンサーアームを含み、
第1のMNAザイムが、第2のMNAザイムとは異なる標的を検出するように設計されている、実施形態50に記載の組成物。
第1および/または第2のMNAザイムが、標的配列にハイブリダイズしたセンサーアームを含み、第1のMNAザイムが、第2のMNAザイムとは異なる標的を検出するように設計されている、実施形態50に記載の組成物。
第2の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの一本鎖ループ部分の配列とは異なる、第1の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの該一本鎖ループ部分にハイブリダイズし、それにより、該第1のオリゴヌクレオチドを含む二本鎖配列を形成する、第1のオリゴヌクレオチド配列、
第1の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの一本鎖ループ部分の配列とは異なる、第2の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの該一本鎖ループ部分にハイブリダイズし、それにより、該第2のオリゴヌクレオチドを含む二本鎖配列を形成する、第2のオリゴヌクレオチド配列、
該第1のオリゴヌクレオチドを含む二本鎖配列に関連し、それを切断することができる、制限エンドヌクレアーゼ、および/または
該第2のオリゴヌクレオチドを含む二本鎖配列に関連し、それを切断することができる、制限エンドヌクレアーゼをさらに含む、実施形態47~52のいずれか一項に記載の組成物。
第2の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの一本鎖ループ部分の配列とは異なる、第1の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの該一本鎖ループ部分にハイブリダイズし、それにより、該第1の標的オリゴヌクレオチドを含む第1の二本鎖配列を形成する、第1の標的オリゴヌクレオチド配列を含む、第1の二本鎖配列、
第1の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの一本鎖ループ部分の配列とは異なる、第2の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの該一本鎖ループ部分にハイブリダイズし、そ
れにより、該第2の標的オリゴヌクレオチドを含む二本鎖配列を形成する、第2の標的オリゴヌクレオチド配列を含む、第2の二本鎖配列、
該第1の二本鎖配列に対して上流(5’)の第1の標的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズした第1のプライマーオリゴヌクレオチド、および第1のプライマーオリゴヌクレオチドの末端にあるか、もしくはそれに隣接する第1の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分に関連するエキソヌクレアーゼ活性(例えば、ポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼ)を含む第1の酵素、ならびに/または
該第2の二本鎖配列第2のに対して上流(5’)の第2の標的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズした第2のプライマーオリゴヌクレオチド、および第2のプライマーオリゴヌクレオチドの末端にあるか、もしくはそれに隣接する第2の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分に関連するエキソヌクレアーゼ活性(例えば、ポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼ)を含む第2の酵素をさらに含む、実施形態47~53のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態55.
第2の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの一本鎖ループ部分の配列とは異なる、閉鎖第1のステムループオリゴヌクレオチドの該一本鎖ループ部分にハイブリダイズし、それにより、該第1の標的オリゴヌクレオチドを含む第1の二本鎖配列を形成する、第1の標的オリゴヌクレオチド配列を含む、第1の二本鎖配列、
第1の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの一本鎖ループ部分の配列とは異なる、第2の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの該一本鎖ループ部分にハイブリダイズし、それにより、該第2の標的オリゴヌクレオチドを含む第2の二本鎖配列を形成する、第2の標的オリゴヌクレオチド配列を含む、第2の二本鎖配列をさらに含み、
エキソヌクレアーゼ活性を含む第1の酵素が、第1の二本鎖配列に関連し、エキソヌクレアーゼ活性を含む第2の酵素が、第2の二本鎖配列に関連する、実施形態47~54のいずれか一項に記載の組成物。
第2の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの一本鎖ループ部分の配列とは異なる、第1の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分にハイブリダイズした第1のDNAザイムおよび/または第1のリボザイム、
第1の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの一本鎖ループ部分の配列とは異なる、第2の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分にハイブリダイズした第2のDNAザイムおよび/または第2のリボザイム、
各該DNAザイムを触媒活性にすることができ、故にループ部分にハイブリダイズした任意の該DNAザイムの切断活性を誘導する、各該DNAザイムの補因子、
第3の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドであって、第3の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドが、ハイブリダイズしていないヌクレオチドの一本鎖ループ部分に接続されたハイブリダイズしたヌクレオチドの二本鎖ステム部分を含み、
第3の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分における、ハイブリダイズしたヌクレオチドの数および/またはハイブリダイズしたヌクレオチドの配列が、第1および第2の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのものとは異なり、
第3の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの二本鎖ステム部分が、一方の鎖に接続されたフルオロフォア分子、および反対の鎖に接続されたクエンチャー分子を含み、第3の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのフルオロフォア分子が、第1および第2の閉鎖ス
テムループオリゴヌクレオチドのフルオロフォア分子と比較して、異なる可視スペクトルの色領域で発光する、第3の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドをさらに含む、実施形態47~56のいずれか一項に記載の組成物。
第3の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドであって、第3の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドが、ハイブリダイズしていないヌクレオチドの一本鎖ループ部分に接続されたハイブリダイズしたヌクレオチドの二本鎖ステム部分を含み、
第3の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分における、ハイブリダイズしたヌクレオチドの数および/またはハイブリダイズしたヌクレオチドの配列が、第1および第2の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのものとは異なり、
第3の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの二本鎖ステム部分が、一方の鎖に接続されたフルオロフォア分子、および反対の鎖に接続されたクエンチャー分子を含み、第3の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのフルオロフォア分子が、第1および第2の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのフルオロフォア分子と比較して、同じ可視スペクトルの色領域で発光する、第3の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドをさらに含む、実施形態47~56のいずれか一項に記載の組成物。
第3の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドであって、第3の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドが、ハイブリダイズしていないヌクレオチドの一本鎖ループ部分に接続されたハイブリダイズしたヌクレオチドの二本鎖ステム部分を含み、
第3の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分における、ハイブリダイズしたヌクレオチドの数および/またはハイブリダイズしたヌクレオチドの配列が、第1または第2の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのものと同じであり、
第3の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの二本鎖ステム部分が、一方の鎖に接続されたフルオロフォア分子、および反対の鎖に接続されたクエンチャー分子を含み、第3の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのフルオロフォア分子が、第1および第2の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのフルオロフォア分子と比較して、異なる可視スペクトルの色領域で発光する、第3の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドをさらに含む、実施形態47~56のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態1.試料中の第1および第2の標的の存在または不在を決定するための方法であって、
(a)第1および/もしくは第2の標的またはそれらのアンプリコンを含むと推定される試料またはその誘導体を、
第1および第2の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドであって、閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの各々が、ハイブリダイズしていないヌクレオチドの閉鎖一本鎖ループ部分に接続されたハイブリダイズしたヌクレオチドの二本鎖ステム部分を含み、
第1および第2の閉ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分における、ハイブリダイズしたヌクレオチドの数および/またはハイブリダイズしたヌクレオチドの配列が、異なる、第1および第2の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチド、ならびに
標的またはそのアンプリコンと接触した場合にのみ、第1および第2の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの一本鎖ループ部分を切断または分解することができる酵素と接触させることによって、反応混合物を調製することと、
(b)反応混合物を、
-酵素が、第1および第2の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分の切断または分解を誘導して、それにより、第1および第2の開放ステムループオリゴヌクレオチドを生成するのに好適な条件下、
-第1の温度であって、その温度以上で、第1の開放ステムループオリゴヌクレオチドの二本鎖ステム部分の鎖が解離して、それにより、第1の開放ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のフルオロフォアおよびクエンチャー分子の空間的分離を促進し、第1の検出可能な蛍光シグナルを提供する、第1の温度で、ならびに
-第2の温度であって、その温度以上で、第2の開放ステムループオリゴヌクレオチドの二本鎖ステム部分の鎖が解離して、それにより、第2の開放ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のフルオロフォアおよびクエンチャー分子の空間的分離を促進し、第2の検出可能な蛍光シグナルを提供する、第2の温度で、処理することであって、
第1の温度が、第2の温度よりも低く、
第1の開放ステムループオリゴヌクレオチドのフルオロフォアおよび第2の開放ステムループオリゴヌクレオチドのフルオロフォアが、同じ可視スペクトルの色領域で発光する、処理することと、
(c)第2の温度以上の温度を含むか、またはそれからなる1つ以上の温度で、該第1および第2の蛍光シグナルのレベルを検出して、それにより、試料中の該標的の存在または不在を決定することとを含む、方法。
第1の多成分核酸酵素(MNAザイム)を第1の標的またはそのアンプリコンに結合させ、該第1のMNAザイムの基質アームを第1の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分にハイブリダイズして、それにより、第1のMNAザイムが、第1の開放ステムループオリゴヌクレオチドを形成することによって、第1の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分の該切断を促進するのに好適な条件下で処理することを含む、実施形態1に記載の方法。
-第1の標的が、分析物、タンパク質、化合物、または分子であり、
-酵素が、第1の標的に結合することができるアプタマーを有する酵素を含み、
-アプタマーへの第1の標的の結合が、アプタマーを有する酵素を触媒活性にすることができる、実施形態1に記載の方法。
-第1の標的が、分析物、タンパク質、化合物、または分子であり、
-反応混合物が、第1のMNAザイムのセンサーアームにハイブリダイズして、それにより、第1のMNAザイムの集合を促進することができるオリゴヌクレオチド配列をさらに含み、
-第1のMNAザイムが、第1の標的に結合することができるアプタマー配列を含み、
-アプタマーへの標的の結合が、第1のMNAザイムを触媒活性にすることができる、実施形態2、4、または5のいずれか一項に記載の方法。
反応混合物を、第1の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分への第1の標的またはそのアンプリコンのハイブリダイゼーションに好適な条件下で処理して、第1の制限エンドヌクレアーゼが会合する二本鎖配列を形成し、それにより、第1の開放ステムループオリゴヌクレオチドを形成する第1の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分の該切断を促進することを含む、実施形態1~6のいずれか一項に記載の方法。
反応混合物を、
-第1の標的またはそのアンプリコンを、第1の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分にハイブリダイズして、第1の標的またはそのアンプリコンを含む第1の二本鎖配列を形成すること、
-第1のプライマーオリゴヌクレオチドを、第1の標的またはそのアンプリコンにハイブリダイズして、第1の標的またはそのアンプリコンを含む第1の二本鎖配列に対して上流(5’)に位置する第2の二本鎖配列を形成すること、
-エキソヌクレアーゼ活性を含む第1の酵素を、第1のプライマーオリゴヌクレオチドの末端にあるか、またはそれに隣接する第1の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分と会合させること、および
-エキソヌクレアーゼ活性を含む第1の酵素を触媒活性させ、それにより、第1の標的またはアンプリコンを含む第1の二本鎖配列のループ部分の分解を促進し、第1の開放ステムループオリゴヌクレオチドを形成することに好適な条件下で処理することを含む、実施形態1~6のいずれか一項に記載の方法。
反応混合物を、
-第1の標的またはそのアンプリコンを、第1の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分にハイブリダイズして、第1の標的またはそのアンプリコンを含む第1の二本鎖配列を形成すること、
-エキソヌクレアーゼ活性を含む第1の酵素を、第1の標的またはそのアンプリコンを含む第1の二本鎖配列と会合させること、および
-エキソヌクレアーゼ活性を含む第1の酵素を触媒活性させ、それにより、第1の標的またはアンプリコンを含む第1の二本鎖配列のループ部分の分解を促進し、第1の開放ステムループオリゴヌクレオチドを形成することに好適な条件下で処理することを含む、実施形態1~6のいずれか一項に記載の方法。
-該第1の補因子をDNAザイムに結合させ、かつ/または該第1の補因子をリボザイムに結合させて、DNAザイムおよび/またはリボザイムを触媒活性にすること、
-DNAザイムおよび/またはリボザイムを、第1の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分にハイブリダイズすること、
-DNAザイムおよび/またはリボザイムを触媒活性させ、それにより、第1の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分の切断を促進し、第1の開放ステムループオリゴヌクレオチドを形成することに好適な条件下で処理することを含み、
第1の標的が、第1の補因子である、実施形態1~11のいずれか一項に記載の方法。
-第2のMNAザイムを第2の標的またはそのアンプリコンに結合させ、該第2のMNAザイムの基質アームを第2の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分にハイブリダイズして、それにより、第2のMNAザイムが、第2の開放ステムループオリゴヌクレオチドを形成することによって、第2の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分の該切断を促進すること、
-第2の標的またはそのアンプリコンを第2の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分にハイブリダイズして、第2の制限エンドヌクレアーゼが二本鎖配列と会合する二本鎖配列を形成し、それにより、第2の開放ステムループオリゴヌクレオチドを形成する第2の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分の該切断を促進すること、
-第2の標的またはそのアンプリコンを、第2の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分にハイブリダイズして、第2の標的またはそのアンプリコンを含む第2の二本鎖配列を形成し、
第2のプライマーオリゴヌクレオチドを、第2の標的またはそのアンプリコンにハイブリダイズして、第2の標的またはそのアンプリコンを含む第2の二本鎖配列に対して上流(5’)に位置する第2の二本鎖配列を形成し、
エキソヌクレアーゼ活性を含む第2の酵素を、第2のプライマーオリゴヌクレオチドの末端にあるか、またはそれに隣接する第2の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分と会合させ、
エキソヌクレアーゼ活性を含む第2の酵素を触媒活性させ、それにより、第2の標的またはアンプリコンを含む第2の二本鎖配列のループ部分の分解を促進し、第2の開放ステムループオリゴヌクレオチドを形成すること、
-第2の標的またはそのアンプリコンを、第2の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分にハイブリダイズして、第2の標的またはそのアンプリコンを含む第2の二本鎖配列を形成し、
エキソヌクレアーゼ活性を含む第2の酵素を、第2の標的またはそのアンプリコンを含む第2の二本鎖配列と会合させ、
エキソヌクレアーゼ活性を含む第2の酵素を触媒活性させ、それにより、第2の標的またはアンプリコンを含む第2の二本鎖配列のループ部分の分解を促進し、第2の開放ステムループオリゴヌクレオチドを形成すること、
-第2の補因子をDNAザイムに結合させ、かつ/または第2の補因子をリボザイムに結合させて、DNAザイムおよび/またはリボザイムを触媒活性にし、
DNAザイムおよび/またはリボザイムを、第2の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分にハイブリダイズし、
DNAザイムおよび/またはリボザイムを触媒活性させ、それにより、第2の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分の切断を促進し、第2の開放ステムループオリゴヌクレオチドを形成することのうちのいずれか1つ以上に好適な条件下で処理することをさらに含み、
第2の標的が、第2の補因子である、実施形態1~13のいずれか一項に記載の方法。
クレアーゼである、実施形態14に記載の方法。
-第2の標的が、分析物、タンパク質、化合物、または分子であり、
-酵素が、第2の標的に結合することができるアプタマーを有する酵素を含み、
-アプタマーへの第2の標的の結合が、アプタマーを有する酵素を触媒活性にすることができる、実施形態14に記載の方法。
-第2の標的が、分析物、タンパク質、化合物、または分子であり、
-反応混合物が、第2のMNAザイムのセンサーアームにハイブリダイズして、それにより、第2のMNAザイムの集合を促進することができるオリゴヌクレオチド配列をさらに含み、
-第2のMNAザイムが、第2の標的に結合することができるアプタマー配列を含み、
-第2のMNAザイムのアプタマー配列への第2の標的の結合が、第2のMNAザイムのアプタマーに結合した阻害分子の除去を促進することによって、第2のMNAザイムを触媒活性にすることができる、実施形態14、20、または21に記載の方法。
-反応混合物が、該第1および第2のMNAザイムを含み、
-第1のMNAザイムの基質アームにハイブリダイズすることができる第1の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分の配列が、第2のMNAザイムの基質アームにハイブリダイズすることができる第2の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分の配列とは異なる、実施形態14~23のいずれか一項に記載の方法。
(d)試料またはその誘導体を含む反応混合物を、
第3の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドであって、第3の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドが、ハイブリダイズしていないヌクレオチドの閉鎖一本鎖ループ部分に接続されたハイブリダイズしたヌクレオチドの二本鎖ステム部分を含み、
第3の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分における、ハイブリダイズしたヌクレオチドの数および/またはハイブリダイズしたヌクレオチドの配列が、第1および第2の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のものとは異なり、
二本鎖ステム部分が、一方の鎖に接続されたフルオロフォア分子、および反対の鎖に接続されたクエンチャー分子を含む、第3の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチド、ならびに
標的またはそのアンプリコンと接触した場合にのみ、第3の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの一本鎖ループ部分を切断または分解することができる酵素と接触させることと、
(e)反応混合物を、
-酵素が、第3の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分の切断または分解を誘導して、それにより、第3の開放ステムループオリゴヌクレオチドを生成するのに好適な条件下、
-第3の温度であって、その温度以上で、第3の開放ステムループオリゴヌクレオチドの二本鎖ステム部分の鎖が解離して、それにより、第3の開放ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のフルオロフォアおよびクエンチャー分子の空間的分離を促進し、第3の検出可能な蛍光シグナルを提供する、第3の温度で、処理することであって、
第3の温度が、第1および第2の温度よりも高い、処理することと、
(f)第3の温度以上の温度を含むか、またはそれからなる1つ以上の温度で、該第1、第2、および第3の蛍光シグナルのレベルを検出して、それにより、試料中の該標的の存在または不在を決定することとによって、決定することをさらに含む、実施形態1~27のいずれか一項に記載の方法。
(d)試料またはその誘導体を含む反応混合物を、
第3の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドであって、第3の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドが、ハイブリダイズしていないヌクレオチドの閉鎖一本鎖ループ部分に接続されたハイブリダイズしたヌクレオチドの二本鎖ステム部分を含み、
第3の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分における、ハイブリダイズしたヌクレオチドの数および/またはハイブリダイズしたヌクレオチドの配列が、第1または第2の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のものと同じであり、
二本鎖ステム部分が、一方の鎖に接続されたフルオロフォア分子、および反対の鎖に接続されたクエンチャー分子を含み、第3の開放ステムループオリゴヌクレオチドに接続されたフルオロフォア分子が、第1および/または第2の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのフルオロフォアとは異なる可視スペクトルの色領域で発光する、第3の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチド、ならびに
標的またはそのアンプリコンと接触した場合にのみ、第3の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの一本鎖ループ部分を切断または分解することができる酵素と接触させることと、
(e)反応混合物を、
-酵素が、第3の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分の切断または分解を誘導して、それにより、第3の開放ステムループオリゴヌクレオチドを生成するのに好適な条件下、
-第3の温度であって、その温度で、第3の開放ステムループオリゴヌクレオチドの二本鎖ステム部分の鎖が解離して、それにより、第3の開放ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のフルオロフォアおよびクエンチャー分子の空間的分離を促進し、第3の検出可能な蛍光シグナルを提供する、第3の温度で、処理することと、
(f)第3の温度以上の温度を含むか、またはそれからなる1つ以上の温度で、該第1、第2、および第3の蛍光シグナルのレベルを検出して、それにより、試料中の該標的の存在または不在を決定することとによって、決定することをさらに含む、実施形態1~27のいずれか一項に記載の方法。
-第3のMNAザイムを第3の標的またはそのアンプリコンに結合させ、該第3のMNAザイムの基質アームを第3の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分にハイブリダイズして、それにより、第3のMNAザイムが、第3の開放ステムループオリゴヌクレオチドを形成することによって、第3の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分の該切断を促進すること、
-第3の標的またはそのアンプリコンを第3の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分にハイブリダイズして、第3の制限エンドヌクレアーゼが二本鎖配列と会合する二本鎖配列を形成し、それにより、第3の開放ステムループオリゴヌクレオチドを形成する第3の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分の該切断を促進すること、
-第3の標的またはそのアンプリコンを、第3の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分にハイブリダイズして、第3の標的またはそのアンプリコンを含む第3の二本鎖配列を形成し、
第3のプライマーオリゴヌクレオチドを、第3の標的またはそのアンプリコンにハイブリダイズして、第3の標的またはそのアンプリコンを含む第3の二本鎖配列に対して上流(5’)に位置する第3の二本鎖配列を形成し、エキソヌクレアーゼ活性を含む第3の酵素を、第3のプライマーオリゴヌクレオチドの末端にあるか、またはそれに隣接する第3の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分と会合させ、
エキソヌクレアーゼ活性を含む第3の酵素を触媒活性させ、それにより、第3の標的またはアンプリコンを含む第3の二本鎖配列のループ部分の分解を促進し、第3の開放ステムループオリゴヌクレオチドを形成すること、
-第3の標的またはそのアンプリコンを、第3の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分にハイブリダイズして、第3の標的またはそのアンプリコンを含む第3の二本鎖配列を形成し、
エキソヌクレアーゼ活性を含む第3の酵素を、第3の標的またはそのアンプリコンを含む第3の二本鎖配列と会合させ、
エキソヌクレアーゼ活性を含む第3の酵素を触媒活性させ、それにより、第3の標的またはアンプリコンを含む第3の二本鎖配列のループ部分の分解を促進し、第3の開放ステムループオリゴヌクレオチドを形成すること、
-第3の補因子をDNAザイムに結合させ、かつ/または第3の補因子をリボザイムに結合させて、DNAザイムおよび/またはリボザイムを触媒活性にし、
DNAザイムおよび/またはリボザイムを、第3の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分にハイブリダイズし、
DNAザイムおよび/またはリボザイムを触媒活性させ、それにより、第3の閉鎖ステ
ムループオリゴヌクレオチドのループ部分の切断を促進し、第3の開放ステムループオリゴヌクレオチドを形成することのうちのいずれか1つ以上に好適な条件下で処理することを含み、
第3の標的が、第3の補因子である、実施形態28~30のいずれか一項に記載の方法。
-標的が、分析物、タンパク質、化合物、または分子であり、
-酵素が、第3の標的に結合することができるアプタマーを有する酵素を含み、
-アプタマーへの第3の標的の結合が、アプタマーを有する酵素を触媒活性にすることができる、実施形態31に記載の方法。
-第3の標的が、分析物、タンパク質、化合物、または分子であり、
-反応混合物が、第3のMNAザイムのセンサーアームにハイブリダイズして、それにより、第3のMNAザイムの集合を促進することができるオリゴヌクレオチド配列をさらに含み、
-第3のMNAザイムが、第3の標的に結合することができるアプタマー配列を含み、
-第3のMNAザイムのアプタマー配列への第3の標的の結合が、第3のMNAザイムのアプタマーに結合した阻害分子の除去を促進することによって、第3のMNAザイムを触媒活性にすることができる、実施形態31に記載の方法。
-反応混合物が、該第3のMNAザイム、ならびに該第1および第2のMNAザイムのいずれかまたは両方を含み、
-第3のMNAザイムの基質アームにハイブリダイズすることができる第3の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分の配列が、
第1のMNAザイムの基質アームにハイブリダイズすることができる第1の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分の配列、および/または
第1のMNAザイムの基質アームにハイブリダイズすることができる第2の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分の配列とは異なる、実施形態31、または実施形態33~37のいずれか一項に記載の方法。
第3の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分における、ハイブリダイズしたヌクレオチドの数および/またはハイブリダイズしたヌクレオチドの配列が、第1およ
び第2の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のものとは異なり、
-第3の温度が、第1および第2の温度とは異なり、
-第3の閉鎖および開放ステムループオリゴヌクレオチドのフルオロフォアが、第1および第2の閉鎖および開放ステムループオリゴヌクレオチドのフルオロフォアと同じ可視スペクトルの色領域で発光する、実施形態28、または実施形態31~38のいずれか一項に記載の方法。
-第1の閉鎖および開放ステムループオリゴヌクレオチドのフルオロフォアが、第2の閉鎖および開放ステムループオリゴヌクレオチドのフルオロフォアと同じ可視スペクトルの色領域で発光し、
-第3の閉鎖および開放ステムループオリゴヌクレオチドのフルオロフォアが、第1および第2の閉鎖および開放ステムループオリゴヌクレオチドのフルオロフォアとは異なる可視スペクトルの色領域で発光する、実施形態28~38、または実施形態39のいずれか一項に記載の方法。
(i)第1の温度で第1の蛍光シグナルの存在を決定することが、試料中の第1の標的の存在を示し、第1の蛍光シグナルの不在を決定することが、試料中の第1の標的の不在を示し、
(ii)第2の温度で第2の蛍光シグナルの存在を決定することが、試料中の第2の標的の存在を示し、第2の蛍光シグナルの不在を決定することが、試料中の第2の標的の不在を示す、実施形態1~44のいずれか一項に記載の方法。
-第2の温度以上の温度、および
-第1の温度以上かつ第2の温度未満の温度で検出することを含む、実施形態1~44のいずれか一項に記載の方法。
(i)該第1の標的、または
(ii)該第2の標的、または
(iii)該第1の標的もしくは該第2の標的を含有しない別個の陰性対照試料上で反
復することによって、陰性対照蛍光シグナルを生成することをさらに含む、実施形態46~59のいずれか一項に記載の方法。
-閾値が、実施形態1~3のいずれか一項に記載の方法に従って試験された一連の試料に由来する蛍光シグナルを使用して生成され、
(i)無鋳型対照および第1の標的
(ii)無鋳型対照および第2の標的
(iii)無鋳型対照、第1の標的、および第2の標的
のうちのいずれか1つ以上を含むことで、それにより、試料中の第1および第2の標的の該存在または不在を決定する、実施形態46~61のいずれか一項に記載の方法。
第1および第2の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドであって、閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの各々が、ハイブリダイズしていないヌクレオチドの一本鎖ループ部分に接続されたハイブリダイズしたヌクレオチドの二本鎖ステム部分を含み、
第1および第2の閉ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分における、ハイブリダイズしたヌクレオチドの数および/またはハイブリダイズしたヌクレオチドの配列が、異なり、
二本鎖ステム部分の各々が、一方の鎖に接続されたフルオロフォア分子、および反対の
鎖に接続されたクエンチャー分子を含む、第1および第2の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドを含み、
フルオロフォア分子が、同じ可視スペクトルの色領域で発光し、第1の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの二本鎖ステム部分の融解温度(Tm)が、第2の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの二本鎖ステム部分のTmとは異なる、組成物。
第1の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの閉鎖一本鎖ループ部分にハイブリダイズすることができる基質アームを含む、第1のMNAザイム、および
第2の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの一本鎖ループ部分にハイブリダイズすることができる基質アームを含む、第2のMNAザイムをさらに含む、実施形態69または実施形態70に記載の組成物。
第1のMNAザイムの基質アームが、第1の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの一本鎖ループ部分にハイブリダイズし、
第2のMNAザイムの基質アームが、第2の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの一本鎖ループ部分にハイブリダイズする、実施形態71に記載の組成物。
第1および/または第2のMNAザイムが、標的分析物、タンパク質、化合物、または分子に結合したアプタマー配列、およびオリゴヌクレオチド配列にハイブリダイズしたセンサーアームを含み、
第1のMNAザイムが、第2のMNAザイムとは異なる標的を検出するように設計されている、実施形態72に記載の組成物。
第1および/または第2のMNAザイムが、標的配列にハイブリダイズしたセンサーアームを含み、第1のMNAザイムが、第2のMNAザイムとは異なる標的を検出するように設計されている、実施形態72に記載の組成物。
第2の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの一本鎖ループ部分の配列とは異なる、第1の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの該一本鎖ループ部分にハイブリダイズし、それにより、該第1のオリゴヌクレオチドを含む二本鎖配列を形成する、第1のオリゴヌクレオチド配列、
第1の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの一本鎖ループ部分の配列とは異なる、第2の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの該一本鎖ループ部分にハイブリダイズし、それにより、該第2のオリゴヌクレオチドを含む二本鎖配列を形成する、第2のオリゴヌクレオチド配列、
該第1のオリゴヌクレオチドを含む二本鎖配列に関連し、それを切断することができる、制限エンドヌクレアーゼ、および/または
該第2のオリゴヌクレオチドを含む二本鎖配列に関連し、それを切断することができる、制限エンドヌクレアーゼをさらに含む、実施形態69~74のいずれか一項に記載の組成物。
第2の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの一本鎖ループ部分の配列とは異なる、第1の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの該一本鎖ループ部分にハイブリダイズし、それにより、該第1の標的オリゴヌクレオチドを含む第1の二本鎖配列を形成する、第1の標的オリゴヌクレオチド配列を含む、第1の二本鎖配列、
第1の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの一本鎖ループ部分の配列とは異なる、第2の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの該一本鎖ループ部分にハイブリダイズし、それにより、該第2の標的オリゴヌクレオチドを含む二本鎖配列を形成する、第2の標的オリゴヌクレオチド配列を含む、第2の二本鎖配列、
該第1の二本鎖配列に対して上流(5’)の第1の標的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズした第1のプライマーオリゴヌクレオチド、および第1のプライマーオリゴヌクレオチドの末端にあるか、もしくはそれに隣接する第1の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分に関連するエキソヌクレアーゼ活性(例えば、ポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼ)を含む第1の酵素、ならびに/または
該第2の二本鎖配列第2のおよび第2の酵素に対して上流(5’)の第2の標的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズした第2のプライマーオリゴヌクレオチド、および第2のプライマーオリゴヌクレオチドの末端にあるか、もしくはそれに隣接する第2の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分に関連するエキソヌクレアーゼ活性(例えば、ポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼ)を含む第2の酵素をさらに含む、実施形態69~75のいずれか一項に記載の組成物。
第2の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの一本鎖ループ部分の配列とは異なる、閉鎖第1のステムループオリゴヌクレオチドの該一本鎖ループ部分にハイブリダイズし、それにより、該第1の標的オリゴヌクレオチドを含む第1の二本鎖配列を形成する、第1の標的オリゴヌクレオチド配列を含む、第1の二本鎖配列、
第1の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの一本鎖ループ部分の配列とは異なる、第2の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの該一本鎖ループ部分にハイブリダイズし、それにより、該第2の標的オリゴヌクレオチドを含む第2の二本鎖配列を形成する、第2の標的オリゴヌクレオチド配列を含む、第2の二本鎖配列をさらに含み、
エキソヌクレアーゼ活性を含む第1の酵素が、第1の二本鎖配列に関連し、エキソヌクレアーゼ活性を含む第2の酵素が、第2の二本鎖配列に関連する、実施形態69~76のいずれか一項に記載の組成物。
第2の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの一本鎖ループ部分の配列とは異なる、第1の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分にハイブリダイズした第1のDNAザイムおよび/または第1のリボザイム、
第1の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの一本鎖ループ部分の配列とは異なる、第2の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分にハイブリダイズした第2のDNAザイムおよび/または第2のリボザイム、
各該DNAザイムを触媒活性にすることができ、故にループ部分にハイブリダイズした任意の該DNAザイムの切断活性を誘導する、各該DNAザイムの補因子、
各該リボザイムを触媒活性にすることができ、故にループ部分にハイブリダイズした任意の該リボザイムの切断活性を誘導する、各該リボザイムの補因子をさらに含む、実施形態69~77のいずれか一項に記載の組成物。
第3の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドであって、第3の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドが、ハイブリダイズしていないヌクレオチドの一本鎖ループ部分に接続され
たハイブリダイズしたヌクレオチドの二本鎖ステム部分を含み、
第3の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分における、ハイブリダイズしたヌクレオチドの数および/またはハイブリダイズしたヌクレオチドの配列が、第1および第2の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのものとは異なり、
第3の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの二本鎖ステム部分が、一方の鎖に接続されたフルオロフォア分子、および反対の鎖に接続されたクエンチャー分子を含み、第3の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのフルオロフォア分子が、第1および第2の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのフルオロフォア分子と比較して、異なる可視スペクトルの色領域で発光する、第3の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドをさらに含む、実施形態69~78のいずれか一項に記載の組成物。
第3の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドであって、第3の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドが、ハイブリダイズしていないヌクレオチドの一本鎖ループ部分に接続されたハイブリダイズしたヌクレオチドの二本鎖ステム部分を含み、
第3の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分における、ハイブリダイズしたヌクレオチドの数および/またはハイブリダイズしたヌクレオチドの配列が、第1および第2の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのものとは異なり、
第3の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの二本鎖ステム部分が、一方の鎖に接続されたフルオロフォア分子、および反対の鎖に接続されたクエンチャー分子を含み、第3の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのフルオロフォア分子が、第1および第2の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのフルオロフォア分子と比較して、同じ可視スペクトルの色領域で発光する、第3の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドをさらに含む、実施形態69~78のいずれか一項に記載の組成物。
第3の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドであって、第3の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドが、ハイブリダイズしていないヌクレオチドの一本鎖ループ部分に接続されたハイブリダイズしたヌクレオチドの二本鎖ステム部分を含み、
第3の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分における、ハイブリダイズしたヌクレオチドの数および/またはハイブリダイズしたヌクレオチドの配列が、第1または第2の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのものと同じであり、
第3の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの二本鎖ステム部分が、一方の鎖に接続されたフルオロフォア分子、および反対の鎖に接続されたクエンチャー分子を含み、第3の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのフルオロフォア分子が、第1および第2の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのフルオロフォア分子と比較して、異なる可視スペクトルの色領域で発光する、第3の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドをさらに含む、実施形態69~78のいずれか一項に記載の組成物。
この出願で使用される場合、単数形の「a」、「an」、および「the」には、別段文脈が明確に指示しない限り、複数の参照対象が含まれる。例えば、「ポリヌクレオチド」という語句はまた、複数のポリヌクレオチドも含む。
塩基とウラシル(U)塩基との間、アデニン(A)塩基とチミン(T)塩基との間、シトシン(C)塩基とグアニン(G)塩基との間のワトソン-クリック塩基対合を介して形成され得る。ゆらぎ塩基対は、ポリヌクレオチド二重鎖(例えば、グアニン-ウラシル、イノシン-ウラシル、イノシン-アデニン、およびイノシン-シトシン)の2つのヌクレオチド間の非ワトソン-クリック塩基対合である。「相補的」と称されるヌクレオチドまたは互いの「相補体」であるヌクレオチドは、それらのそれぞれの塩基間のワトソン-クリック塩基対合またはゆらぎ塩基対合のいずれかによって一緒にハイブリダイズする能力を有するヌクレオチドである。
ブリッド分子もしくは複合体)を意味することが理解される。二本鎖ステム構成成分は、相補的塩基対合によって相補的逆方向鎖にハイブリダイズした順方向鎖を含み、順方向鎖の3’ヌクレオチドは、一本鎖ループ構成成分の5’ヌクレオチドに接合し、逆方向鎖の5’ヌクレオチドは、一本鎖ループ構成成分の3’ヌクレオチドに接合する。
しくはDNA含有分子もしくは複合体、またはRNAもしくはRNA含有分子もしくは複合体、またはそれらの組み合わせ(すなわち、DNA-RNAハイブリッド分子もしくは複合体)を意味するものとする。触媒核酸のヌクレオチド残基は、塩基A、C、G、T、およびU、ならびにそれらの誘導体および類似体を含み得る。上記の用語は、少なくとも1つの基質を認識し、その少なくとも1つの基質の修飾(切断など)を触媒し得るDNA-RNAハイブリッド分子である、単一のDNAもしくはDNA含有分子(当該技術分野では「DNA酵素」、「デオキシリボザイム」、もしくは「DNAザイム」としても知られている)、またはRNAもしくはRNA含有分子(当該技術分野では「リボザイム」としても知られている)、またはそれらの組み合わせを含み得る単分子核酸酵素を含む。上記の用語は、少なくとも1つの基質を認識し、その少なくとも1つの基質の修飾(切断など)を触媒し得るDNA-RNAハイブリッド複合体である、DNAもしくはDNA含有複合体、またはRNAもしくはRNA含有複合体、またはそれらの組み合わせを含む核酸酵素を含む。「核酸酵素」、「触媒核酸」、「触媒活性を有する核酸」、および「触媒核酸酵素」という用語は、それらの意味の中に、MNAザイムを含む。
性を監視するための「検出可能な効果」を提供し得る。「ポリヌクレオチド基質」または「基質」は、MNAザイム、アプタMNAザイム、DNAザイム、アプタザイム、リボザイムなどの触媒核酸酵素、および/またはエキソヌクレアーゼもしくはエンドヌクレアーゼなどのタンパク質酵素を含むがこれらに限定されない、1つ以上の酵素による切断または分解が可能であり得る。
Acids Res.6,3543を参照されたい)。配列組成が融解温度に与える効果は、以下の式、Tm(℃)=ΔH°/(ΔS°+R ln[oligo])-273.15によって支配される最近傍法を使用して理解することができる。ステムの長さおよび配列組成に加えて、融解温度に影響を与えることが知られている他の因子には、イオン強度およびオリゴヌクレオチド濃度が含まれる。より高いオリゴヌクレオチドおよび/またはイオン濃度は、融解温度の増加につながる二重鎖形成の可能性を増加させる。対照的に、より低いオリゴヌクレオチドおよび/またはイオン濃度は、融解温度の低下につながるステムの解離を支持する。
別段記載されない限り、説明の目的で、本明細書に参照される全ての文書の全体が、これにより、参照により本明細書に組み込まれる。
以下の略語が、本明細書および本明細書全体を通して使用される。
LOCS:ステムに接続されたループ
MNAザイム:多成分核酸酵素、または多成分核酸酵素、
パートザイム:オリゴヌクレオチドを含有する部分酵素、
PCR:ポリメラーゼ連鎖反応、
gDNA:ゲノムDNA
NTC:無鋳型対照
qPCR:リアルタイム定量化PCR
Ct:閾値サイクル
R2:相関係数
nM:ナノモル
mM:ミリモル
μL:マイクロリットル
dNTP:デオキシリボヌクレオチド三リン酸
NF-H2O:無ヌクレアーゼ水、
LNA:ロックされた核酸、
F:フルオロフォア、
Q:クエンチャー、
N=A、C、T、G、またはそれらの類似体、
N’=Nに相補的であるか、またはNと塩基対合することができる任意のヌクレオチド。
(N)x:任意の数のN、
(N’)x:任意の数のN’、
W:AまたはT、
R:A、G、またはAA、
rN:任意のリボヌクレオチド塩基、
(rN)x:任意の数のrN、
rR:AまたはG、
rY:CまたはU、
M:AまたはC、
H:A、C、またはT、
D:G、A、またはT、
JOEまたは6-JOE:6-カルボキシ-4’,5’-ジクロロ-2’,7’-ジメトキシフルオレセイン、
FAMまたは6-FAM:6-カルボキシフルオレセイン、
BHQ1:Black Holeクエンチャー1
BHQ2:Black Holeクエンチャー2
RT-PCR:逆転写ポリメラーゼ連鎖反応
SDA:鎖変位増幅
HDA:ヘリカーゼ依存増幅
RPA:リコンビナーゼポリメラーゼ増幅
LAMP:ループ媒介等温増幅
RCA:ローリングサークル増幅
TMA:転写媒介増幅
3SR:自家持続配列複製
NASBA:核酸配列ベースの増幅
IB:Iowa Black(登録商標)FQ
IBR:Iowa Black(登録商標)RQ
shRNA:低分子ヘアピン型RNA
siRNA:低分子干渉RNA
mRNA:メッセンジャーRNA
tRNA:転移RNA
snoRNA:核小体低分子RNA
stRNA:小分子一過性RNA
smRNA:小分子調節性調節RNA
プレマイクロRNA:前駆体マイクロRNA
プリマイクロRNA:一次マイクロRNA
LHS:左側
RHS:右側
DSO:二本鎖オリゴヌクレオチド
Tm:融解温度
RFU:相対蛍光単位
本発明の例示的なLOCSオリゴヌクレオチドを、図1に示す。例示的な無傷の(閉鎖)LOCSオリゴヌクレオチド(図1A、LHS)は、ループ領域、ステム領域、およびフルオロフォア(F)/クエンチャー(Q)色素対を有する。図1は、無傷のLOCS Aおよび無傷のLOCS Bと表される2つの例示的なLOCSオリゴヌクレオチドを示す。これらのLOCSオリゴヌクレオチドは、異なるループ配列および異なるステム配列を有する。組み合わせて使用される場合、本発明の2つの所与のLOCSオリゴヌクレオチドは一般に、ステムの配列および/または長さが異なる。非限定的な例としてのみ、無傷のLOCS AのステムAは、Tm1と表される第1の温度で融解するように設計することができる一方、無傷のLOCS BのステムBは、Tm3と表される異なる温度で融解するように設計することができる。無傷のLOCSオリゴヌクレオチドのループ領域の切断または分解は、開放LOCS構造をもたらす(図1A、RHS)。
ゼ活性による分解のための基質として機能することができる、標的特異的配列であり得る。図3Bに示されるさらに別の例示的な実施形態では、ループ内の標的特異的配列は、二本鎖制限酵素認識部位の一本鎖をさらに含み得る。標的配列へのループ配列のハイブリダイゼーションは、機能的で切断可能な制限部位をもたらし得る。好ましい実施形態では、制限酵素は、標的を無傷のまま残しながら、LOCSオリゴヌクレオチドのループ鎖を切断することができるニッキング酵素である。
マイクロRNA、他の非コードRNA、リボソームRNA、それらの誘導体、それらのアンプリコン、またはそれらの任意の組み合わせ(デオキシリボヌクレオチド塩基とリボヌクレオチド塩基との混合ポリマーを含む)が含まれる。
開放LOCS構造の解離によって生成される蛍光シグナルは、本発明の方法に従って、標的分子を検出、鑑別、および/または定量化するための任意の好適な方法で分析することができる。
ポーターの検出は、試料中の対応する標的の存在を示す。
-標的増幅中または増幅後の標的の検出
本発明のLOCSオリゴヌクレオチドを使用して、増幅された標的核酸配列の存在を決定することができる。LOCSレポーターが適用され得る増幅技術に関して、具体的な制限は存在しない。標的アンプリコンの存在が、LOCSレポーターの切断または分解を促進して、開放LOCS構造を生成することができることを条件として、様々な反応によって生成されるアンプリコンは、LOCSレポーターによって検出することができる。LOCS構造内に含有されるループ領域の切断または分解に有用な方法の非限定的な例には、MNAザイム、DNAザイム、リボザイム、制限酵素、エンドヌクレアーゼによる切断、またはポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性を含むがこれらに限定されない、エキソヌクレアーゼによる分解が含まれる。
鎖反応(PCR)、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)、鎖置換増幅(SDA)、ヘリカーゼ依存増幅(HDA)、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅(RPA)、ループ媒介等温増幅(LAMP)、ローリングサークル増幅(RCA)、転写媒介増幅(TMA)、自家持続配列複製(3SR)、核酸配列ベースの増幅(NASBA)のうちの1つ以上が含まれる。
上記に考察したように、本発明のLOCSレポーターは、任意のポリヌクレオチド増幅技術で利用することができ、その非限定的な例には、PCR、RT-PCR、SDA、HDA、RPA、LAMP、RCA、TMA、3SR、またはNASBAが含まれる。
LOCSオリゴヌクレオチドは、本明細書に記載の方法に従って、診断および/または予後の目的で使用することができる。診断および/または予後の方法は、エクスビボまた
はインビトロで実行することができる。しかしながら、本発明の方法は、必ずしも診断および/または予後の目的で使用される必要はなく、それ故に診断または予後ではない用途もまた、企図される。
本発明は、本発明の方法を実行するための1つ以上の薬剤を含むキットを提供する。典型的には、本発明の方法を実行するためのキットは、本方法の実行に必要な全ての試薬を含有する。
以下の実施例では、LOCSレポーターを使用して、単一の蛍光チャネルから検出することができる標的の数を増加させる。この実施例では、2つのLOCSレポーターを、フルオロフォア(FAM)で5’標識し、クエンチャーで3’標識する。LOCSレポーターのループ領域は、核酸基質を含有し、ステム領域は、LOCSレポーターをステムループ構成に拘束する一連の相補的な塩基対を含有する。この構成では、フルオロフォアおよびクエンチャーは近接しており、標的の不在下では蛍光がクエンチされる。
この実験に特異的なオリゴヌクレオチドには、LOCS-1(配列番号1)、LOCS-2(配列番号2)、パートザイムA1(配列番号3)、パートザイムB1(配列番号4)、パートザイムA2(配列番号5)、パートザイムB2(配列番号6)、順方向プライマー1(配列番号7)、逆方向プライマー1(配列番号8)、順方向プライマー2(配列番号9)、および逆方向プライマー2(配列番号10)が含まれる。配列は、配列表に列挙する。MgPaの増幅および検出に特異的なオリゴヌクレオチドは、LOCS-1、パートザイムA1、パートザイムB1、順方向プライマー1、および逆方向プライマー1である。TV-Btubの増幅および検出に特異的なオリゴヌクレオチドは、LOCS-2、パートザイムA2、パートザイムB2、順方向プライマー2、および逆方向プライマー2である。
BioRad(登録商標)CFX96熱サイクラーを使用して、20μLの合計反応体積で標的配列のリアルタイム増幅および検出を実行した。サイクリングパラメータは、95℃で2分間、95℃で5秒間および61℃で30秒間のタッチダウンサイクルを10回(1サイクルあたり0.5℃の減衰)、ならびに95℃で5秒間および52℃で40秒間のサイクルを40回(データは52℃のステップで収集)であった。融解曲線パラメータは、20℃から90℃まで0.5℃の増分で、5秒間保持した(データ収集は保留)。全ての反応は、二連で実行し、40nMの各順方向プライマー、200nMの各逆方向プライマー、200nMの各パートザイムA、200nMの各パートザイムB、200nMの各LOCSレポーター、2mMのMgCl2(Bioline)、および1つのSensiFASTプローブNo-ROX混合物(Bioline)を含有した。反応は、MgPaおよび/もしくはTV-Btub遺伝子に相同なG-Block鋳型(10,000もしくは40コピー)を含有するか、または標的なし(無ヌクレアーゼH2O(NF H2O))のいずれかであった。
PCRとして知られているインビトロ標的増幅法を使用して、2つのMNAザイム(MNAザイム1およびMNAザイム2)を使用して、それらの対応するLOCSレポーター(それぞれLOCS-1およびLOCS-2)の切断を介して標的核酸の増幅をリアルタイムで監視する。MNAザイム1は、MgPa遺伝子(Mycoplasma genitalium)に相同な配列を検出し、LOCS-1を切断および開放するように設計し、MNAザイム2は、TV-Btub(Trichomonas vaginalis)に相同な配列を検出し、LOCS-2を切断および開放するように設計した。この実験では、増幅および検出は、全てのMNAザイム、プライマー、およびLOCSオリゴヌクレオチドを含有する単一の管内で実行した。MgPaもしくはTV-Btubのいずれか、またはMgPaおよびTV-Btubの両方(同時感染を有する試料を表す)の存在は、FAMチャネルにおけるシグナルの増加によって検出した。
この実施例では、2つのLOCSレポーター(LOCS-1およびLOCS-2)を使用して、様々な異なる遺伝子標的を区別して、対象となる任意の標的の分析に対するそれらのユニバーサルおよび適用性を実証する。PCR増幅を使用して、いくつかのMNAザイム(MNAザイム1~6)を使用して、それらの特定の遺伝子標的を検出し、それらの対応するLOCSレポーター(LOCS-1およびLOCS-2)を切断した。MNAザイム1、3、および4は各々、それらの対応する遺伝子標的の存在下でLOCS-1を切断する能力を有する。MNAザイム2、5、および6は各々、それらの対応する遺伝子標的の存在下でLOCS-2を切断する能力を有する。この実施例では、表1に要約される二重鎖の組み合わせを実証し、増幅および検出を単一の管内で同時に実行する。
この実験に特異的なオリゴヌクレオチドには、LOCS-1(配列番号1)、LOCS-2(配列番号2)、パートザイムA1(配列番号3)、パートザイムB1(配列番号4)、パートザイムA2(配列番号5)、パートザイムB2(配列番号6)、順方向プライマー1(配列番号7)、逆方向プライマー1(配列番号8)、順方向プライマー2(配列番号9)、逆方向プライマー2(配列番号10)、パートザイムA3(配列番号11)、パートザイムB3(配列番号12)、パートザイムA4(配列番号13)、パートザイムB4(配列番号14)、順方向プライマー3(配列番号15)、逆方向プライマー3(配列番号16)、順方向プライマー4(配列番号17)、逆方向プライマー4(配列番号18)、パートザイムA5(配列番号19)、パートザイムB5(配列番号20)、パートザイムA6(配列番号21)、パートザイムB6(配列番号22)、順方向プライマー5(配列番号23)、逆方向プライマー5(配列番号24)、順方向プライマー6(配列番号25)、および逆方向プライマー6(配列番号26)が含まれる。配列は、配列表に列挙する。
BioRad(登録商標)CFX96熱サイクラーを使用して、20μLの合計反応体積で標的配列のリアルタイム増幅および検出を実行した。サイクリングパラメータは、95℃で2分間、95℃で5秒間および61℃で30秒間のタッチダウンサイクルを10回(1サイクルあたり0.5℃の減衰)、ならびに95℃で5秒間および52℃で40秒間のサイクルを40回(データは52℃のステップで収集)であった。融解曲線パラメータは、20℃から90℃まで0.5℃の増分で、5秒間保持した(データ収集は保留)。全ての反応は、表1に示されるオリゴヌクレオチドを含有する二連の反応として実行した。各反応は、40nMの各順方向プライマー、200nMの各逆方向プライマー、200nMの各パートザイムA、200nMの各パートザイムB、200nMの各LOCSレポーター、2mMのMgCl2(Bioline)、および1つのSensiFASTプローブNo-ROX混合物(Bioline)を含有した。反応は、G-Block鋳型(10,000もしくは40コピー)を含有するか、または標的なし(NF H2O)のいずれかであった。図5および6に示される結果は、Microsoft Excel(バージョン14)を使用してプロットした二連の平均である。
図5(上部パネル)に示される結果は、10,000コピー(黒線)、40コピー(灰色線)、または0コピー(点線)のMgPa(図5A1)、HMPV(図5B1)、およびCT-ompA(図5C1)を含有する反応について得られたPCR増幅プロットを示す。下部パネルに示される結果は、10,000コピー(黒線)および40コピー(灰色線)のMgPa(図5A2)、HMPV(図5B2)、およびCT-ompA(図5C2)遺伝子標的を含有する反応から得られた融解曲線特性である。3つの標的は、MNAザイム1、3、および5で特異的に検出され、これらの各々は、標的特異的センサーアームを有したが、これらの全ては、同一の基質結合アームを有した。各MNAザイムは、その標的集合促進剤の存在下で形成されると、第1のユニバーサル基質および第1のユニバーサルステムを含む同じユニバーサルLOCS-1に結合し、それを切断し、それを開放す
ることができた。したがって、各標的の存在は、第1のユニバーサルステムのTmに対応する40℃にピークを有する融解曲線を生成した。
この実施例では、異なるステム組成を含むLOCSレポーターを使用して、最終融解特性に対するステムの長さおよび塩基対組成の効果を実証する。本実施例では、4つのLOCSレポーターを、フルオロフォア(FAM)で5’標識し、クエンチャーで3’標識する。LOCS-1およびLOCS-3は、基質1を含有する同一のループ領域を含有するが、LOCS-3のステム領域(ステム3)は、LOCS-1のステム領域(ステム1)よりも単一の塩基対だけ長く、無傷の(閉鎖)状態および開放状態の両方でわずかにより高い予測Tmを有する構造がもたらされる。標的集合促進剤(AF-CT-Cds)の存在下で集合を指向することができる標的センサーアーム、ならびにLOCS-1またはLOCS-3のいずれかのループ内で基質1に結合し、それを切断することができる基質アームを有するMNAザイムを使用して、等温シグナル検出を監視した。
同様に、LOCS-2およびLOCS-4は、基質2を含有する同一のループ領域を含有するが、LOCS-2のステム領域(ステム2)は、LOCS-4のステム領域(ステム4)よりも2塩基対だけ長く、無傷の(閉鎖)状態および開放状態の両方でより高い予測Tmを有する構造がもたらされる。標的集合促進剤(AF-TFRC)の存在下で集合を指向することができる標的センサーアーム、ならびにLOCS-2またはLOCS-4のいずれかのループ内で基質2に結合し、それを切断することができる基質アームを有するMNAザイムを使用して、PCR増幅を監視した。
この実験に特異的なオリゴヌクレオチドには、LOCS-1(配列番号1)、LOCS-2(配列番号2)、LOCS-3(配列番号27)、LOCS-4(配列番号28)、パートザイムA7(配列番号29)、パートザイムB7(配列番号30)、パートザイムA8(配列番号31)、パートザイムB8(配列番号32)、AF-CT-Cds(配列番号33)、およびAF-TFRC(配列番号38)が含まれる。配列は、配列表に列挙する。
表2および図7に示される結果は、標的を欠如する反応において存在する無傷の閉鎖LOCSレポーター(点線)、ならびに特定のLOCSレポーターを切断および開放することができるMNAザイムの集合を指向した標的を含有する反応における開放LOCSレポーター(黒い線)と一致するものについて得られた融解曲線特性の差を示す。
ーターとは異なる固有の融解特性を生成する。この実験は、ステム領域の長さおよび組成を修飾することによって、異なる融解特性を生成することができることを実証する。したがって、一式のLOCSレポーターを同時に使用して、単一のチャネルからの複数の標的の検出を達成することができる。さらに、この実験で生成されたデータは、等温標的検出を使用して達成され、これは、LOCSレポーターを一連の異なるバイオセンシング技術で使用することができることを例証する。
この実施例では、2つのLOCSレポーターを、一般的に使用されるいくつかのPCRプラットフォームにわたるそれらの互換性について試験する。2つのMNAザイム(MNAザイム1およびMNAザイム2)を使用して、それらの対応するLOCSレポーター(それぞれLOCS-1およびLOCS-2)の切断を介して標的核酸の増幅をリアルタイムで監視する。この実施例では、2つの異なる遺伝子、つまりMgPa遺伝子(Mycoplasma genitalium)およびTV-Btub(Trichomonas
vaginalis)の増幅および検出を、単一の管内で同時に実行し、これらの両方が、FAMチャネルでシグナルを生成することができる。
この実験に特異的なオリゴヌクレオチドには、LOCS-1(配列番号1)、LOCS-2(配列番号2)、パートザイムA1(配列番号3)、パートザイムB1(配列番号4)、パートザイムA2(配列番号5)、パートザイムB2(配列番号6)、順方向プライマー1(配列番号7)、順方向プライマー2(配列番号8)、逆方向プライマー1(配列番号9)、および逆方向プライマー2(配列番号10)が含まれる。MgPaの増幅および検出に特異的なオリゴヌクレオチドは、LOCS-1、パートザイムA1、パートザイムB1、順方向プライマー1、および逆方向プライマー1である。
R熱サイクラーを使用して実行した。
図8および図9の結果は、BioRad(登録商標)CFX96熱サイクラー(パネルA)、またはLightcycler480熱サイクラー(パネルB)、またはABI7500熱サイクラー(パネルC)、またはXXpress PCR熱サイクラー(パネルD)で増幅を実行した場合に、それぞれMgPaおよびTV-Btub標的の増幅後に得られた融解曲線を示す。両方の標的は、全ての機械のFAMチャネルで監視した。図8Dおよび図9Dに示される結果は、3分間の融解曲線プロトコルを使用して得たものであり、故にLOCSレポーターを使用する融解曲線の区別を、迅速な条件を使用して達成することができることを実証する。このデータは、2つの異なるLOCSレポーターを使用して異なるプラットフォームにわたって得られた同等の融解曲線特性を生成する能力を実証する。さらに、このデータは、様々な融解曲線パラメータを使用して得られた同等の融解曲線特性を生成する能力を実証する。
この実施例では、10個のLOCSレポーターを、一般的に使用されるいくつかの蛍光チャネルにわたる互換性について試験する。2つのMNAザイム(MNAザイム1およびMNAザイム2)を使用して、それらの対応するLOCSレポーターの切断を介して標的核酸の増幅をリアルタイムで監視する。この実施例では、同じLOCSレポーター配列を使用するが、LOCSは、異なるフルオロフォアおよびクエンチャー対で標識する。2つの異なる遺伝子、つまりMgPa遺伝子(Mycoplasma genitalium)およびTV-Btub(Trichomonas vaginalis)の増幅および検出を、単一の管内で同時に実行し、これらの両方が、同じチャネルでシグナルを生成することができる。FAM、HEX、テキサスレッド、およびCy5を含む、いくつかの蛍光チャネルを試験した。
この実験に特異的なオリゴヌクレオチドには、LOCS-1(配列番号1)、LOCS-2(配列番号2)、パートザイムA1(配列番号3)、パートザイムB1(配列番号4)、パートザイムA2(配列番号5)、パートザイムB2(配列番号6)、順方向プライマー1(配列番号7)、順方向プライマー2(配列番号8)、逆方向プライマー1(配列番号9)、逆方向プライマー2(配列番号10)、LOCS-5(配列番号35)、LOCS-6(配列番号36)、LOCS-7(配列番号37)、LOCS-8(配列番号38)、LOCS-9(配列番号39)、およびLOCS-10(配列番号40)が含まれる。MgPaの増幅および検出に特異的なオリゴヌクレオチドは、パートザイムA1、パートザイムB1、順方向プライマー1、逆方向プライマー1、およびLOCS-1、LOCS-5、LOCS-7、またはLOCS-9のいずれかである。TV-Btubの増幅および検出に特異的なオリゴヌクレオチドは、パートザイムA2、パートザイムB2、順方向プライマー2、逆方向プライマー2、およびLOCS-2、LOCS-6、LOCS-8、またはLOCS-10のいずれかである。配列は、配列表に列挙する。
iFASTプローブNo-ROX混合物(Bioline)を含有した。BioRad(登録商標)CFX96熱サイクラーを使用して、20μLの合計反応体積で標的配列のリアルタイム増幅および検出を実行した。反応は、G-Block鋳型(10,000もしくは40コピー)を含有するか、または標的なし(NF H2O)のいずれかであった。
図10の結果は、BioRad(登録商標)CFX96熱サイクラーで増幅を実行した場合に、それぞれMgPaおよびTV-Btub標的の増幅後に得られた融解曲線を示す。両方の標的を、単一の蛍光チャネルで同時に監視した。黒色で示される結果は、MgPa遺伝子の存在下で得られた融解曲線を示し、灰色で示される結果は、TV-Btub標的の存在下で得られた融解曲線特性を示す。実線は、10,000コピーの標的濃度を表し、点線は、40コピーの標的濃度を表す。図10Aに示される結果は、FAMチャネルでLOCS-1およびLOCS-2を使用して得られた融解曲線を示す。図10Bに示される融解曲線は、HEXチャネルでLOCS-5およびLOCS-6を使用して得た。図10Cに示される融解曲線は、テキサスレッドチャネルでLOCS-7およびLOCS-8を使用して得、図10Dに示される融解曲線は、Cy5チャネルでLOCS-9およびLOCS-10を使用して得た。このデータは、同じ2つのLOCSステムおよび基質を使用するが、フルオロフォアおよびクエンチャー対を変化させた、異なる蛍光チャネルにわたって得られた同等の融解曲線特性を生成する能力を実証する。
以下の実施例では、LOCSレポーターを使用して、単一の蛍光チャネルから検出することができる標的の数を増加させる。この実施例では、3つのLOCSレポーターを、フルオロフォア(FAM)で5’標識し、クエンチャーで3’標識する。LOCSレポーターのループ領域は、核酸基質を含有し、ステム領域は、LOCSレポーターをループステム構成に拘束する一連の相補的な塩基対を含有する。この構成では、フルオロフォアおよびクエンチャーは近接しており、標的の不在下では蛍光がクエンチされる。
この実験に特異的なオリゴヌクレオチドには、LOCS-1(配列番号1)、LOCS-2(配列番号2)、パートザイムA1(配列番号3)、パートザイムB1(配列番号4)、パートザイムA2(配列番号5)、パートザイムB2(配列番号6)、順方向プライマー1(配列番号7)、逆方向プライマー1(配列番号8)、順方向プライマー2(配列番号9)、逆方向プライマー2(配列番号10)、LOCS-11(配列番号45)、パートザイムA9(配列番号43)、パートザイムB9(配列番号44)、順方向プライマー7(配列番号41)、および逆方向プライマー7(配列番号42)が含まれる。配列は、配列表に列挙する。MgPaの増幅および検出に特異的なオリゴヌクレオチドは、LOCS-1、パートザイムA1、パートザイムB1、順方向プライマー1、および逆方向プライマー1である。TV-Btubの増幅および検出に特異的なオリゴヌクレオチドは、LOCS-2、パートザイムA2、パートザイムB2、順方向プライマー2、および逆方向プライマー2である。CTcryの増幅および検出に特異的なオリゴヌクレオチドは、LOCS-11、パートザイムA9、パートザイムB9、順方向プライマー7、および逆方向プライマー7である。
BioRad(登録商標)CFX96熱サイクラーを使用して、20μLの合計反応体積で標的配列のリアルタイム増幅および検出を実行した。サイクリングパラメータは、95℃で2分間、95℃で5秒間および61℃で30秒間のタッチダウンサイクルを10回(1サイクルあたり0.5℃の減衰)、ならびに95℃で5秒間および52℃で40秒間
のサイクルを35回(データは52℃のステップで収集)であった。融解曲線パラメータは、20℃から90℃まで0.5℃の増分で、5秒間保持した(データ収集は保留)。全ての反応は、二連で実行し、40nMの各順方向プライマー、200nMの各逆方向プライマー、200nMの各パートザイムA、200nMの各パートザイムB、200nMの各LOCSレポーター、2mMのMgCl2(Bioline)、および1つのSensiFASTプローブNo-ROX混合物(Bioline)を含有した。反応は、MgPaおよび/もしくはTV-Btubおよび/もしくはCTcry遺伝子に相同なGブロック鋳型(10,000コピー)を含有するか、または標的なし(NF H2O)のいずれかであった。
PCRとして知られているインビトロ標的増幅法を使用して、3つのMNAザイム(MNAザイム1、MNAザイム2、およびMNAザイム9)を使用して、それらの対応するLOCSレポーター(それぞれLOCS-1、LOCS-2、およびLOCS-11)の切断を介して標的核酸の増幅をリアルタイムで監視する。MNAザイム1は、MgPa遺伝子(Mycoplasma genitalium)に相同な配列を検出し、LOCS-1を切断および開放するように設計し、MNAザイム2は、TV-Btub(Trichomonas vaginalis)に相同な配列を検出し、LOCS-2を切断および開放するように設計し、MNAザイム9は、CTcry(Chlamydia trachomatis)に相同な配列を検出し、LOCS-11を切断および開放するように設計した。この実験では、増幅および検出は、全てのMNAザイム、プライマー、およびLOCSオリゴヌクレオチドを含有する単一の管内で実行した。MgPa、TV-Btub、CTcryのいずれか、またはこれら3つの様々な組み合わせ(複数の感染を有する試料を表す)の存在は、FAMチャネルにおけるシグナルの増加によって検出した。
以下の実施例では、一連の二本鎖オリゴヌクレオチド(DSO)を、ユニバーサルステムとしての使用に好適であるかどうかについてスクリーニングした。ループによって接続されていないこれらのDSOを、SYBRグリーンI挿入色素の存在下で徐々に増加する温度に供した。この融解曲線スクリーニングアッセイを使用して、様々な配列の長さおよび組成を調べて、目立たない温度で融解し、その後ユニバーサルステムとしてLOCSレポーターオリゴヌクレオチドに組み込むことができる一連のDSOを特定することができる。SYBRグリーンIは、二本鎖DNA構造への結合時に蛍光シグナルを生成する挿入色素である。増加する温度勾配に曝露されると、DSOの2つのオリゴヌクレオチド鎖が解離し、蛍光が低下する。以下の実施例は、2つのオリゴヌクレオチドが解離する温度(Tm)を、ステムの長さおよび組成を変更することによって制御することができることを実証する。さらに、DSOを様々な濃度で試験して、オリゴヌクレオチド濃度を修飾することによって、Tmをいかにさらに操作することができるかを実証した。
この実験に特異的なオリゴヌクレオチドには、DSO-1A(配列番号56)、DSO-1B(配列番号57)、DSO-2A(配列番号58)、DSO-2B(配列番号59
)、DSO-3A(配列番号60)、DSO-3B(配列番号61)、DSO-4A(配列番号62)、DSO-4B(配列番号63)、DSO-5A(配列番号64)、DSO-5B(配列番号65)、DSO-6A(配列番号66)、DSO-6B(配列番号67)、DSO-7A(配列番号68)、DSO-7B(配列番号69)、DSO-8A(配列番号70)、およびDSO-8B(配列番号71)が含まれる。配列は、配列表に列挙する。
融解曲線分析は、BioRad(登録商標)CFX96熱サイクラーを使用して、20μLの合計反応体積で実行した。融解曲線パラメータは、15℃から70℃まで0.5℃の増分で、5秒間保持した(データ収集は保留)。全ての反応は、二連で実行し、100nM、200nM、または300nMのDSO-AおよびDSO-Bオリゴヌクレオチド、1μMのSYBRグリーンI、8mMのMgCl2(Bioline)、ならびに1×NH4緩衝液(Bioline)のいずれかを含有した。
表4に示される結果は、DSOを増加する温度勾配に供したときに得られた融解温度(Tm)を示す。結果は、Microsoft Excel(バージョン14)を使用してプロットした二連の反応の平均である。
以下の実施例では、同じステム組成を含み、異なる基質(ループ)に接続された複数のLOCSレポーターを、単一の反応容器内で組み合わせて、同じステム領域を複数回使用して、単一の反応における複数の標的を同時に検出および鑑別することができることを実証する。本実施例では、2つのステム(ステム1およびステム2)を使用して、2つの蛍光チャネルにわたる4つの異なる標的を鑑別する。この実施例では、2つのLOCSレポーターは、FAMフルオロフォア(LOCS-12およびLOCS-13)で5’標識し、他の2つは、テキサスレッドフルオロフォア(LOCS-7およびLOCS-8)で5’標識する。4つ全てのLOCSレポーターは、クエンチャーで3’標識する。4つのLOCSレポーターのループ領域の各々は、異なる核酸基質(基質1、基質2、基質3、および基質4)を含有する。2つのLOCSレポーター(各フルオロフォアに1つ)は、ステム1(LOCS-7およびLOCS-12)を含有し、他の2つのLOCSレポーターは、ステム2(LOCS-8およびLOCS-13)を含有する。ステム領域は、LOCSレポーターをループステム構成に拘束する一連の相補的な塩基対を含有する。この構成では、フルオロフォアおよびクエンチャーは近接しており、標的の不在下では蛍光がクエ
ンチされる。ステム1は、ステム2よりも低い融解温度を有し、第1の検出温度(40℃)での標的MgPaおよびNGopaの検出のためにループ1および3に接続されているが、ステム2は、より高融解温度を有し、第2の検出温度(50℃)での標的TV-Btubおよびgpdの鑑別のためにループ2および4に接続されている。
この実験に特異的なオリゴヌクレオチドには、LOCS-7(配列番号37)、LOCS-8(配列番号38)、パートザイムA1(配列番号3)、パートザイムB1(配列番号4)、パートザイムA2(配列番号5)、パートザイムB2(配列番号6)、順方向プライマー1(配列番号7)、逆方向プライマー1(配列番号8)、順方向プライマー2(配列番号9)、逆方向プライマー2(配列番号10)、LOCS-12(配列番号46)、LOCS-13(配列番号47)、パートザイムA10(配列番号48)、パートザイムB10(配列番号49)、パートザイムA11(配列番号50)、パートザイムB11(配列番号51)、順方向プライマー8(配列番号52)、逆方向プライマー8(配列番号53)、順方向プライマー9(配列番号54)、および逆方向プライマー9(配列番号55)が含まれる。配列は、配列表に列挙する。MgPaの増幅および検出に特異的なオリゴヌクレオチドは、LOCS-7、パートザイムA1、パートザイムB1、順方向プライマー1、および逆方向プライマー1である。TV-Btubの増幅および検出に特異的なオリゴヌクレオチドは、LOCS-8、パートザイムA2、パートザイムB2、順方向プライマー2、および逆方向プライマー2である。NGopaの増幅および検出に特異的なオリゴヌクレオチドは、LOCS-12、パートザイムA10、パートザイムB10、順方向プライマー8、および逆方向プライマー8である。gpdの増幅および検出に特異的なオリゴヌクレオチドは、LOCS-13、パートザイムA11、パートザイムB11、順方向プライマー9、および逆方向プライマー9である。
BioRad(登録商標)CFX96熱サイクラーを使用して、20μLの合計反応体積で標的配列のリアルタイム増幅および検出を実行した。サイクリングパラメータは、95℃で2分間、95℃で5秒間および61℃で30秒間のタッチダウンサイクルを10回(1サイクルあたり0.5℃の減衰)、ならびに95℃で5秒間および52℃で40秒間のサイクルを35回(データは52℃のステップで収集)であった。融解曲線パラメータは、20℃から90℃まで0.5℃の増分で、5秒間保持した(データ収集は保留)。全ての反応は、二連で実行し、40nMの各順方向プライマー、200nMの各逆方向プライマー、200nMの各パートザイムA、200nMの各パートザイムB、200nMの各LOCSレポーター、2mMのMgCl2(Bioline)、および1つのSensiFASTプローブNo-ROX混合物(Bioline)を含有した。反応は、MgPa、TV-Btub、NGopa、もしくはgpd遺伝子のいずれかに相同なGブロック鋳型(10,000コピー)を含有するか、または標的(NF H2O)を含有しなかった。
PCRとして知られているインビトロ標的増幅法を使用して、4つのMNAザイム(MNAザイム1、MNAザイム2、MNAザイム10、およびMNAザイム11)を使用して、それらの対応するLOCSレポーター(それぞれLOCS-7、LOCS-8、LOCS-12、およびLOCS-13)の切断を介して標的核酸の増幅をリアルタイムで監視する。MNAザイム1は、MgPa遺伝子(Mycoplasma genitalium)に相同な配列を検出し、LOCS-7を切断および開放するように設計し、MNAザイム2は、TV-Btub遺伝子(Trichomonas vaginalis)に相同な配列を検出し、LOCS-8を切断および開放するように設計し、MNAザイム10は、NGopa遺伝子(Neisseria gonorrhoeae)に相同な配列
を検出し、LOCS-12を切断および開放するように設計し、MNAザイム11は、gpd遺伝子(単純ヘルペスウイルス2型)に相同な配列を検出し、LOCS-13を切断および開放するように設計した。この実験では、増幅および検出は、全てのMNAザイム、プライマー、およびLOCSオリゴヌクレオチドを含有する単一の管内で実行した。
以下の実施例では、3つのLOCSレポーターを使用して、同じステムを異なるループ配列(基質)と対合させて、同等の融解特性を生成することができることを実証する。この実施例では、3つ全てのLOCSレポーターを、FAMフルオロフォアで5’標識し、
クエンチャーで3’標識する。3つのLOCSレポーターのループ領域の各々は、核酸酵素(MNAザイム)の異なる基質を含有するが、3つ全てが、同じステム配列(ステム2)を含有する。
この実験に特異的なオリゴヌクレオチドには、順方向プライマー10(配列番号72)、逆方向プライマー10(配列番号73)、LOCS-2(配列番号2)、LOCS-14(配列番号78)、LOCS-15(配列番号79)、パートザイムA8(配列番号31)、パートザイムB8(配列番号32)、パートザイムA12(配列番号74)、パートザイムB12(配列番号75)、パートザイムA13(配列番号76)、およびパートザイムB13(配列番号77)が含まれる。配列は、配列表に列挙する。TFRC遺伝子の増幅に特異的なオリゴヌクレオチドは、順方向プライマー10(配列番号72)および逆方向プライマー10(配列番号73)である。TFRCアンプリコンの検出およびLOCS-2の切断に特異的なオリゴヌクレオチドは、パートザイムA8(配列番号31)およびパートザイムB8(配列番号32)である。TFRCアンプリコンの検出およびLOCS-14の切断に特異的なオリゴヌクレオチドは、パートザイムA12(配列番号74)およびパートザイムB12(配列番号75)である。TFRCアンプリコンの検出およびLOCS-15の切断に特異的なオリゴヌクレオチドは、パートザイムA13(配列番号76)およびパートザイムB13(配列番号77)である。
BioRad(登録商標)CFX96熱サイクラーを使用して、20μLの合計反応体積で標的配列のリアルタイム増幅および検出を実行した。サイクリングパラメータは、95℃で2分間、95℃で5秒間および61℃で30秒間のタッチダウンサイクルを10回(1サイクルあたり0.5℃の減衰)、ならびに95℃で5秒間および52℃で40秒間のサイクルを35回(データは52℃のステップで収集)であった。融解曲線パラメータは、20℃から90℃まで0.5℃の増分で、5秒間保持した(データ収集は保留)。全ての反応は、二連で実行し、40nMの各順方向プライマー、200nMの各逆方向プライマー、200nMの各パートザイムA、200nMの各パートザイムB、200nMの各LOCSレポーター、2mMのMgCl2(Bioline)、および1つのSensiFASTプローブNo-ROX混合物(Bioline)を含有した。反応は、ヒトトランスフェリン受容体(TFRC)遺伝子に相同なGブロック鋳型(10,000コピー)を含有するか、または標的(NF H2O)を含有しなかった。
この実験では、PCR増幅、シグナル検出、および融解曲線の鑑別を、一重反応として単一の管内で実行した。PCR中、3つのMNAザイム(MNAザイム8、MNAザイム12、およびMNAザイム13)を使用して、それらの対応するLOCSレポーター(それぞれLOCS-2、LOCS-14、およびLOCS-15)の切断を介して標的核酸の増幅をリアルタイムで監視した。3つ全てのMNAザイムは、同じ標的配列(TFRC遺伝子)を検出するように設計されているが、各MNAザイムは、異なる基質配列(ループ)にハイブリダイズし、それを切断することができ、故に異なるLOCSレポーターを開放する。
子の不在は、閾値を超えたPCR増幅曲線の不在(データ示さず)、ならびに切断されていないLOCS-2、LOCS-14、およびLOCS-15にそれぞれ相関する74℃、75℃、および75℃のTmでの融解ピーク(それぞれ図14A、14B、および14C)の存在によって決定した。結果は、Microsoft Excel(バージョン14)を使用してプロットした二連の反応の平均である。この実施例のデータは、同じユニバーサルステム領域を、異なる基質(ループ)とともに利用して、同等の融解曲線特性を生成することができることを実証する。異なる基質を有するLOCSレポーターを操作するための同じステム配列の使用は、高度に多重化されたアッセイの単純明快な設計を促進し、選択した任意の遺伝子標的の検出のためのLOCSプローブの迅速かつ容易な適合を可能にする。
以下の実施例では、ニッキングエンドヌクレアーゼ(Nt.AlwI)を使用して、MNAザイム切断の代替的な方法として、ニッキングエンドヌクレアーゼによる切断後にLOCSレポーターのループ部分を開放した場合に、同等の融解特性が生成されることを実証する。一般的な戦略を、図3Bに示す。この実施例では、二重標識されたLOCSレポーターは、標的配列に相補的なループ領域、および標的に相補的ではないステム領域を含有する。LOCSレポーターのループ領域と標的とのハイブリダイゼーションにより、ニッキングエンドヌクレアーゼ認識部位が完成し、これは、ニッキングエンドヌクレアーゼによるLOCSレポーターの切断を促進し、標的を無傷のまま残す。分子内結合は分子間結合よりも強いため、無傷のLOCS構造のステム領域は、切断された開放LOCS構造のステムよりも高温で融解する。
この実験に特異的なオリゴヌクレオチドには、AF-NE-TV1(配列番号82)、LOCS-16(配列番号80)、AF-NE-R5b(配列番号83)、およびLOCS-17(配列番号81)が含まれる。配列は、配列表に列挙する。
BioRad(登録商標)CFX96熱サイクラーを使用して、20μLの合計反応体積で標的配列のリアルタイム検出を実行した。反応を、52℃の一定温度でインキュベートし、合計200回のデータ収集になるように20秒ごとにデータを収集した。融解曲線パラメータは、20℃から90℃まで0.5℃の増分で、5秒間保持した(データ収集は保留)。全ての反応は、二連で実行し、5mMのMgCl2(Ambion)、1×PCR緩衝液II(ABI)、4単位のNt.AlwI(NEB)、および200nMのLOCS(LOCS-16またはLOCS-17のいずれか)を含有した。反応は、AF-NE-TV1もしくはAF-NE-R5b(200nM)のいずれかを含有するか、または標的を含有しなかった(NF H2O)。
シグナル検出および融解曲線の鑑別は、単一の管内で実行した。図15Aおよび15Bに示される結果は、200nMの標的(黒線、それぞれAF-NE-TV1もしくはAF-NE-R5b)を含有するか、または標的なし(灰色線、NF H2O)の反応からFAMチャネルで得られたLOCS-16およびLOCS-17のそれぞれの融解曲線特性を示す。結果は、Microsoft Excel(バージョン14)を使用してプロットした二連の反応の平均である。標的AF-NE-TV1の存在は、経時的な蛍光の迅速な増加、および切断されたLOCS-16に対応する29℃での融解ピークの存在の両方によって検出した。標的AF-NE-TV1の不在は、(i)経時的な蛍光増加の欠如、(ii)29℃での融解ピークの不在、および(iii)切断されていないLOCS-1
6に対応する65℃での融解ピークの存在によって決定した(図15A)。標的AF-NE-R5bの存在は、経時的な蛍光の迅速な増加、および切断されたLOCS-17に対応する48℃での融解ピークの存在の両方によって検出した。標的AF-NE-R5bの不在は、(i)経時的な蛍光増加の欠如、(ii)48℃での融解ピークの不在、および(iii)切断されていないLOCS-17に対応する76℃での融解ピークの存在によって決定した(図15B)。
以下の実施例では、TaqMan/加水分解プローブ様の方法を使用して、ループのMNAザイム切断の代替的な方法として、エキソヌクレアーゼ分解後にLOCSレポーターのステム部分を開放した場合に、同等の融解特性が生成されることを実証する。この実施例の一般的な戦略を、図3Aに示す。この実施例では、二重標識されたLOCSレポーターは、標的配列に相補的なループ領域、および標的に相補的ではないステム領域を含有する。PCR増幅中、LOCSレポーターのループ領域は、標的および/またはアンプリコン配列とハイブリダイズし得る。PCRのプライマー伸長段階中、上流のプライマーは、LOCSレポーターが標的とハイブリダイズする領域に伸長し、ポリメラーゼは、LOCSレポーターのループ領域の5’末端を漸進的に切断するが、ステム領域をそのまま残す。2つのLOCSステム断片間の分子間力は、閉鎖LOCS分子内でそれらの間に生じる分子内力よりも有意に弱いため、ループ領域の分解は、LOCSステムの融解温度を低減する。
この実験に特異的なオリゴヌクレオチドには、順方向プライマー2(配列番号9)、逆方向プライマー2(配列番号10)、およびLOCS-18(配列番号84)が含まれる。配列は、配列表に列挙する。
BioRad(登録商標)CFX96熱サイクラーを使用して、20μLの合計反応体積で標的配列のリアルタイム増幅および検出を実行した。サイクリングパラメータは、95℃で2分間、95℃で5秒間、および52℃で40秒間を50サイクル(52℃のステップでデータ収集)であった。融解曲線パラメータは、20℃から90℃まで0.5℃の増分で、5秒間保持した(データ収集は保留)。全ての反応は、二連で実行し、400nMの各プライマー、200nMのLOCS-16、2mMのMgCl2(Bioline)、および1×SensiFASTプローブ無ROX混合物(Bioline)を含有した。反応は、合成Gブロック鋳型(10,000コピー)を含有するか、または標的を含有しなかった(NF H2O)。
この実験では、PCR増幅、シグナル検出、および融解曲線の鑑別を、単一の管内で実行した。標的遺伝子(TV-btub)の存在は、PCR増幅曲線の存在、および分解された開放LOCS-18に対応する40°のTmでの融解ピークによって検出した。標的遺伝子の不在は、PCR増幅曲線の不在、40℃のTmでの融解ピークの不在、および切断されていない閉鎖LOCS-18に対応する61℃のTmでの融解ピークの存在によって決定した。図16Aおよび16Bに示される結果は、10,000コピーの遺伝子標的(黒線)を含有するか、または標的なし(灰色線)のいずれかの反応からFAMチャネルで得られたそれぞれの増幅曲線および融解曲線特性を示す。結果は、Microsoft
Excel(バージョン14)を使用してプロットした二連の反応の平均である。
以下の実施例は、LOCSレポーターが、PCR中にリアルタイムで2つの別々の温度で蛍光読み取りを収集することによって、単一の蛍光チャネル内の複数の標的の同時検出および定量化を可能にするアプローチを実証する。この戦略は、上記の様々な実施例で実証したPCR後の融解曲線分析の必要性を排除する。さらに、この実施例は、試料中に存在する場合、いずれかの標的の量の定量化を促進するデータ分析のための2つの代替的な方法について説明する。
ンチしたままであるように、より低い検出温度(TL)を選択する。開放LOCS-Yのステムが融解(解離)し、増加した蛍光をもたらす一方、閉鎖LOCS-Yのステムが会合およびクエンチしたままであるように、より高い温度(TH)を選択する。LOCS-Xのステムは、より低いTmを有するため、それは、このより高い温度で融解(解離)し、開放立体構造にあるか閉鎖立体構造にあるかにかかわらず、増加した蛍光をもたらすが、閉鎖LOCS-Xから生じる蛍光は、バックグラウンド/ベースラインの増加にのみ寄与する。
TL39℃およびTH72℃でLOCS-Xの切断された種単独から生じる2つの増幅曲線は、同じ効率およびCqを有するが、それぞれ異なる終点EX1およびEX2で定常に達する。したがって、72℃での増幅曲線(F-LOCS-XFAF)においてLOCS-Xの切断された種から生じる蛍光シグナルは、蛍光調整係数(FAF)を適用することによって、39℃での増幅曲線から外挿することができる。FAFは、終点EX1およびEX2の比である。72℃での増幅曲線における合計蛍光シグナル(F合計)は、LOCS-X(F-LOCS-XFAF)およびLOCS-Y(F-LOCS-Y)の両方の切断された種から生じる蛍光シグナルから生じる。このことから、LOCS-Yから生じる72℃での増幅曲線は、以下のように外挿することができる。
F合計=F-LOCS-XFAF+F-LOCS-Yであるため、
F-LOCS-Y=F合計-F-LOCS-XFAF
∴LOCS-Yから生じる72℃での増幅曲線
=72℃での実験増幅曲線-39℃での実験増幅曲線*FAF
標的XおよびYの両方が存在する場合、72℃で実験的に決定されたCq値(Cq観察)は、標的Xを有しない同じ濃度の標的Yを含有する試料のCq値からシフトする。標的Xの不在下、72℃で標的Yの標準曲線から決定される、Cq観察値と期待Cq値との間の関係性(Cq標準曲線標的Y)を、以下に説明する。
Cq観察=Cq標的Yの標準曲線+Cqの相対シフト
式中、Cq標的Yの標準曲線=f(標的Yのコピー数)である
および
Cqの相対シフト=f(標的Yのコピー数)
Cq標的Yの標準曲線およびCqの相対シフトは両方とも、標的Yのコピー数の関数であるため、標的Yのコピー数は、実験的に決定されたCq値(Cq観察)から計算することができる。このCq値の相対シフトは、(標的Yのコピー数/標的Xのコピー数)の自然対数と数学的な関係性(ロジスティック)を有する。72℃で測定した増幅曲線の最大蛍光レベルの半分を閾値として、Cq値を決定した場合、ロジスティック関係性は、以下の式として表すことができる。
式中、y=Cqの相対シフト、L=Cqの可能な最大シフト、k=急勾配係数、x=ln(標的Yのコピー数/標的Xのコピー数)であり、標的Xのコピー数は、39℃での増幅曲線から決定されることに留意されたい。
標的Xの不在下で決定された標的Yの標準曲線方程式にCq値のシフト係数を組み込むことにより、標的Xの存在下でのCq値の補正が可能となり、その後に標的Yの正確な定量化につながる。
この実験に特異的なオリゴヌクレオチドには、LOCS-19、LOCS-20、パートザイムA9、パートザイムB9、パートザイムA10、パートザイムB10、順方向プライマー7、逆方向プライマー7、順方向プライマー8、および逆方向プライマー11が
含まれる。配列は、配列表に列挙する。CTcryの増幅および定量化に特異的なオリゴヌクレオチドは、LOCS-19、パートザイムA9、パートザイムB9、順方向プライマー7、および逆方向プライマー7である。NGopaの増幅および定量化に特異的なオリゴヌクレオチドは、LOCS-20、パートザイムA10、パートザイムB10、順方向プライマー8、および逆方向プライマー11である。
BioRad(登録商標)CFX96熱サイクラーを使用して、20μLの合計反応体積で標的配列のリアルタイム検出を実行した。サイクリングパラメータは、95℃で2分間、その後95℃で5秒間および61℃で30秒間のタッチダウンサイクルを10回(1サイクルあたり0.5℃の減衰)、ならびに95℃で5秒間、52℃で40秒間、39℃で1秒間、および72℃で1秒間のサイクルを40回(データは39℃および72℃のステップの両方で収集)であった。各反応は、40nMの各順方向プライマー、200nMの各逆方向プライマー、200nMの各パートザイム、100nMのLOCS-19レポーター、200nMのLOCS-20レポーター、および1×PlexMastermix(Bioline)を含有した。反応は、標的を含有しない(NF H2O)か、または合成GブロックX(20,000、4,000、800、160、もしくは32コピー)、NGopa遺伝子の合成Gブロック(20,000、4,000、800、160、もしくは32コピー)、CTcry遺伝子の合成Gブロック(20,000、4,000、800、160、もしくは32コピー)のバックグラウンドでのCTcry遺伝子の様々な濃度の合成Gブロック(20,000、4,000、800、160、もしくは32コピー)、もしくはCTcry遺伝子の合成Gブロック(20,000、4,000、800、160、もしくは32コピー)のバックグラウンドでのNGopa遺伝子の様々な濃度の合成Gブロック(20,000、4,000、800、160、もしくは32コピー)のいずれかを含有した。
PCR中、2つのMNAザイム(MNAザイム9およびMNAザイム10)を使用して、それらの対応するLOCSレポーター(それぞれLOCS-19およびLOCS-20)の切断を介して標的核酸の増幅をリアルタイムで監視する。MNAザイム9は、Chlamydia trachomatisの検出のためにCTcryに相同な配列を検出し、LOCS-19を切断および開放するように設計した。MNAザイム10は、Neisseria gonorrhoeaeの検出のためにNGopaに相同な配列を検出し、LOCS-20を切断および開放するように設計した。
CTcryの定量化に使用することができる。0、32、160、800、4,000、および20,000コピーのCTcry遺伝子標的、ならびに0、32、160、800、4,000、および20,000コピーのNGopa遺伝子標的の全ての組み合わせの試料中のCTcryの定量化の結果を、表6に要約する。NULLは、39℃で決定してCq値が存在しないため、試料中にCTcryが存在しない場合を指す。
800、4,000、および20,000コピーのCTcry遺伝子標的、ならびに0、32、160、800、4,000、および20,000コピーのNGopa遺伝子標的の全ての組み合わせの試料の72℃での増幅の分析である。NULLは、72℃で決定してCq値が存在しないため、試料中に標的Yが存在しない場合である。
上記の式は、72℃でCTcryの不在下で決定されるNGopaの標準曲線方程式に、以下のように組み込むことができる。
Cq観察=CqNGopaの標準曲線+Cqの相対シフト
CTcryのコピー数は、39℃で取得したデータから決定されるため、上記の式を使用して、数学的溶媒和プログラムによって、72℃での実験的なCq(Cq観察)から、試料中のNGopaのコピー数を決定することができる。表11は、二連の平均として示される、0、32、160、800、4,000、および20,000コピーのCTcry遺伝子標的、ならびに0、32、160、800、4,000、および20,000コピーの計算されたNGopa遺伝子標的の全ての組み合わせの試料についてCqの相対シフト係数を計算した、72℃で観察されたCqを示す。表12は、同じ試料の相対シフト係数で正規化したCq値を使用する、コピー数の決定を示す。
以下の実施例では、LOCSレポーターを使用して、2つの蛍光チャネルにわたって検出することができる標的の数を増加させる。この実施例では、2つの蛍光チャネルの各々において、3つの標的を検出する。この実施例では、6つ全てのLOCSレポーターを、フルオロフォア(JOEまたはAtto101)で5’標識し、クエンチャー(それぞれ3IABkFQまたは3IAbRQSp)で3’標識する。LOCSレポーターのループ領域は各々、異なる核酸基質を含有し、ステム領域は、LOCSレポーターをループステム構成に拘束する一連の相補的な塩基対を含有する。この構成では、フルオロフォアおよびクエンチャーは近接しており、標的の不在下では蛍光がクエンチされる。
この実験に特異的なオリゴヌクレオチドには、LOCS-21(配列番号88)、LOCS-22(配列番号89)、LOCS-23(配列番号90)、LOCS-24(配列番号91)、LOCS-25(配列番号92)、LOCS-26(配列番号93)、パートザイムA14(配列番号94)、パートザイムB14(配列番号95)、パートザイムA15(配列番号96)、パートザイムB15(配列番号97)、パートザイムA16(配列番号98)、パートザイムB16(配列番号99)、パートザイムA17(配列番号100)、パートザイムB17(配列番号101)、パートザイムA18(配列番号102)、パートザイムB18(配列番号103)、パートザイムA19(配列番号104)、パートザイムB19(配列番号105)、順方向プライマー12(配列番号106)、逆方向プライマー12(配列番号107)、順方向プライマー9(配列番号54)、逆方向プライマー9(配列番号55)、順方向プライマー13(配列番号108)、逆方向プライマー13(配列番号109)、順方向プライマー14(配列番号110)、逆方向プライマー2(配列番号10)、順方向プライマー1(配列番号7)、逆方向プライマー1(配列番号8)、順方向プライマー15(配列番号111)、逆方向プライマー15(配列番号112)が含まれる。配列は、配列表に列挙する。gpdの増幅および検出に特異的なオリゴヌクレオチドは、LOCS-21、パートザイムA14、パートザイムB14、順方向プライマー12、および逆方向プライマー12である。gpd3の増幅および検出に特異的なオリゴヌクレオチドは、LOCS-22、パートザイムA15、パートザイムB15、順方向プライマー9、および逆方向プライマー12である。porAの増幅および検出に特異的なオリゴヌクレオチドは、LOCS-23、パートザイムA16、パートザイムB16、順方向プライマー13、および逆方向プライマー13である。TV-Btubの増幅および検出に特異的なオリゴヌクレオチドは、LOCS-24、パートザイムA17、パートザイムB17、順方向プライマー14、および逆方向プライマー2である。MgPaの増幅および検出に特異的なオリゴヌクレオチドは、LOCS-25、パートザイムA18、パートザイムB18、順方向プライマー1、および逆方向プライマー1である。LGVの増幅および検出に特異的なオリゴヌクレオチドは、LOCS-26、パートザイムA19、パートザイムB19、順方向プライマー15、および逆方向プライマー15である。
BioRad(登録商標)CFX96熱サイクラーを使用して、20μLの合計反応体積で標的配列のリアルタイム増幅および検出を実行した。サイクリングパラメータは、40℃で1秒間、70℃で1秒間、85℃で1秒間、95℃で2分間、95℃で5秒間および61℃で30秒間のタッチダウンサイクルを10回(1サイクルあたり0.5℃の減衰)、ならびに95℃で5秒間、52℃で40秒間、および65℃で1秒間を40サイクル(データは65℃のステップで収集)、その後40℃で1秒間、70℃で1秒間、および85℃で1秒間であった。融解曲線パラメータは、20℃から95℃まで0.5℃の増分で、5秒間保持した(データ収集は保留)。全ての反応は、二連で実行し、40nMの各
順方向プライマー、200nMの各逆方向プライマー、200nMの各パートザイムA、200nMの各パートザイムB、各々200nMのLOCS-21、LOCS-22、LOCS-24、およびLOCS-25、および、各々150nMのLOCS-23およびLOCS-26、8mMのMgCl2(Bioline)、0.2mMのdNTP(Bioline)、2単位のMyTaqポリメラーゼ(Bioline)、ならびに1×NH4緩衝液(Bioline)を含有した。反応は、gpdおよび/もしくはgpd3および/もしくはporAもしくはTV-Btubおよび/もしくはMgPaおよび/もしくはLGV遺伝子に相同なGブロック鋳型(10,000コピー)を含有するか、または標的なし(NF H2O)のいずれかであった。
PCRとして知られているインビトロ標的増幅法を使用して、6つのMNAザイム(MNAザイム14、MNAザイム15、MNAザイム16、MNAザイム17、MNAザイム18、およびMNAザイム19)を使用して、それらの対応するLOCSレポーター(それぞれLOCS-21、LOCS-22、LOCS-23、LOCS-24、LOCS-25、およびLOCS-26)の切断を介して標的核酸の増幅をリアルタイムで監視する。各チャネル(JOEおよびテキサスレッド)のいずれかまたは全ての標的の存在は、PCRの増幅相での蛍光の増加によって決定し(データ示さず)、その後固有のLOCS融解特性に基づいて個々の標的を識別した。MNAザイム14は、gpd遺伝子に相同な配列を検出し、LOCS-21を切断および開放するように設計し、MNAザイム15は、gpd3遺伝子に相同な配列を検出し、LOCS-22を切断および開放するように設計し、MNAザイム16は、porA遺伝子に相同な配列を検出し、LOCS-23を切断および開放するように設計し、MNAザイム17は、TV-Btub遺伝子に相同な配列を検出し、LOCS-24を切断および開放するように設計し、MNAザイム18は、MgPa遺伝子に相同な配列を検出し、LOCS-25を切断および開放するように設計し、MNAザイム19は、LGV遺伝子に相同な配列を検出し、LOCS-26を切断および開放するように設計した。この実験では、増幅および検出は、全てのMNAザイム、プライマー、およびLOCSオリゴヌクレオチドを含有する単一の管内で実行した。gpd、gpd3、porA、TV-Btub、MgPa、LGV遺伝子、またはこれら6つの遺伝子の様々な組み合わせ(複数の感染を有する試料を表す)の存在は、JOEチャネルおよびテキサスレッドチャネルのいずれかまたは両方のシグナルの増加によって検出した(データ示さず)。
TV-Btub遺伝子標的(Tm=30℃、42℃、66℃、および82℃)の存在下で生成されるLOCS融解特性は、MgPa(53℃、66℃、および82℃)ならびにLGV(Tm=68℃)遺伝子標的の存在下で生成されるLOCS融解特性とは異なる。さらに、単一のチャネルから読み取った2つ以上の遺伝子標的の存在下でのLOCS融解特性はまた、単一の遺伝子標的のみが存在する前述の融解特性とも異なる。JOEチャネルでは、gpdおよびgpd3遺伝子標的が単一の反応に存在する場合、固有のLOCS融解特性(Tm=30℃、43℃、53℃、および85℃)は、両方の標的が検出されたことを示した。同様に、gpdおよびporAまたはgpd3およびporAが単一の反応に存在する場合、固有の融解曲線特性(それぞれ、Tm=53℃および68℃ならびにTm=30℃、43℃、68℃、および77℃)は、どの2つの標的が検出されたかを具体的に示した。同様に、テキサスレッドチャネルでは、LOCS融解特性は、標的の各組み合わせ、TV-BtubおよびMgPa(Tm=30℃、42℃、53℃、および82℃)、TV-BtubおよびLGV(Tm=30℃、42℃、および68℃)、またはMgPaおよびLGV(Tm=53℃および68℃)について固有であった。gpd、gpd3、およびporA遺伝子標的が全て単一の反応に存在する場合、JOEチャネル内の固有のLOCS融解特性(Tm=30℃、43℃、53℃、および68℃)は、3つ全ての標的が検出されたことを示した。同様に、テキサスレッドチャネルでは、単一におけるTV-Btub、MgPa、およびLGV標的の存在は、固有のLOCS融解特性(Tm=30℃、42℃、53℃、および68℃)をもたらした。
以下の実施例では、LOCSレポーターを使用して、各チャネル内で検出することができる標的の数を増加させることによって、5つの蛍光チャネルを使用して単一のウェル内で同時に検出することができる標的の数を増加させる。この実施例では、5つの蛍光チャネルの各々において、2つの標的を検出する。この実施例では、10個全てのLOCSレポーターを、フルオロフォア(FAM、JOE、AttoRho101、Cy5、またはCy5.5)で5’標識し、クエンチャー(3IABkFQまたは3IAbRQSp)で3’標識する。LOCSレポーターのループ領域は、核酸基質を含有し、ステム領域は、LOCSレポーターをループステム構成に拘束する一連の相補的な塩基対を含有する。この構成では、フルオロフォアおよびクエンチャーは近接しており、標的の不在下では蛍光がクエンチされる。
この実験に特異的なオリゴヌクレオチドには、LOCS-10(配列番号40)、LOCS-15(配列番号79)、LOCS-21(配列番号88)、LOCS-22(配列番号89)、LOCS-24(配列番号91)、LOCS-27(配列番号113)、LOCS-28(配列番号114)、LOCS-29(配列番号115)、LOCS-30(配列番号116)、LOCS-31(配列番号117)、パートザイムA9(配列番号43)、パートザイムB9(配列番号44)、パートザイムA10(配列番号48)、パートザイムB10(配列番号49)、パートザイムA14(配列番号94)、パートザイムB14(配列番号95)、パートザイムA15(配列番号97)、パートザイムB15(配列番号98)、パートザイムA16(配列番号98)、パートザイムB16(配列番号99)、パートザイムA17(配列番号100)、パートザイムB17(配列番号101)、パートザイムA18(配列番号102)、パートザイムB18(配列番号103)、パートザイムA19(配列番号104)、パートザイムB19(配列番号105)、パートザイムA20(配列番号118)、パートザイムB20(配列番号119)、パートザイムA21(配列番号120)、パートザイムB21(配列番号121)、順方向プライマー1(配列番号7)、逆方向プライマー1(配列番号8)、逆方向プライマー2(配列番号10)、順方向プライマー7(配列番号41)、逆方向プライマー7(配列番号42)、順方向プライマー8(配列番号52)、順方向プライマー9(配列番号54)、逆方向プライマー9(配列番号55)、順方向プライマー10(配列番号72)、逆方向プライマー10(配列番号73)、逆方向プライマー11(配列番号85)、順方向プライマー12(配列番号106)、逆方向プライマー12(配列番号107)、順方向プライマー13(配列番号108)、逆方向プライマー13(配列番号109)、順方向プライマー14(配列番号110)、順方向プライマー15(配列番号111)、逆方向プライマー15(配列番号112)、順方向プライマー16(配列番号122)、および逆方向プライマー16(配列番号123)が含まれる。配列は、配列表に列挙する。
び逆方向プライマー13である。TV-Btubの増幅および検出に特異的なオリゴヌクレオチドは、LOCS-24、パートザイムA17、パートザイムB17、順方向プライマー14、および逆方向プライマー2である。MgPaの増幅および検出に特異的なオリゴヌクレオチドは、LOCS-28、パートザイムA18、パートザイムB18、順方向プライマー1、および逆方向プライマー1である。LGVの増幅および検出に特異的なオリゴヌクレオチドは、LOCS-10、パートザイムA19、パートザイムB19、順方向プライマー15、および逆方向プライマー15である。polAの増幅および検出に特異的なオリゴヌクレオチドは、LOCS-30、パートザイムA20、パートザイムB20、順方向プライマー16、および逆方向プライマー16である。TFRCの増幅および検出に特異的なオリゴヌクレオチドは、LOCS-31、パートザイムA21、パートザイムB21、順方向プライマー10、および逆方向プライマー10である。
BioRad(登録商標)CFX96熱サイクラーを使用して、20μLの合計反応体積で標的配列のリアルタイム増幅および検出を実行した。サイクルパラメータは、31℃で1秒間、42℃で1秒間、53℃で1秒間、60℃で1秒間、95℃で2分間、95℃で5秒間および61℃で30秒間のタッチダウンサイクルを10回(1サイクルあたり0.5℃の減衰)、ならびに95℃で5秒間、52℃で40秒間、および65℃で5秒間を40サイクル(データは65℃のステップで収集)、その後31℃で1秒間、42℃で1秒間、53℃で1秒間、および60℃で1秒間であった。融解曲線パラメータは、20℃から95℃まで0.5℃の増分で、5秒間保持した(データ収集は保留)。全ての反応は、二連で実行し、40nMの各順方向プライマー、200nMの各逆方向プライマー、200nMの各パートザイムA、200nMの各パートザイムB、各々200nMのLOCS-10、LOCS-15、LOCS-21、LOCS-22、LOCS-24、LOCS-27、LOCS-29、およびLOCS-31レポーター、ならびに各々150nMのLOCS-28およびLOCS-30、8mMのMgCl2(Bioline)、0.2mMのdNTP(Bioline)、2単位のMyTaqポリメラーゼ(Bioline)、ならびに1×NH4緩衝液(Bioline)を含有した。反応は、NGopaおよび/もしくはporA、gpdおよび/もしくはgpd3、TV-Btubおよび/もしくはMgPa、CTcryおよび/もしくはLGV、またはpolA遺伝子に相同なGブロック鋳型(10,000コピー)を含有するか、あるいは標的なし(NF H2O)のいずれかであった。全ての反応は、内因性対照として機能するTFRC遺伝子標的を含有する10,000コピーのヒトゲノムDNAのバックグラウンドを含有した。TFRC遺伝子の検出は、Cy5.5チャネルの蛍光の増加による内部対照として全ての反応で監視した(データ示さず)。
PCRとして知られているインビトロ標的増幅法を使用して、10個のMNAザイム(MNAザイム9、MNAザイム10、およびMNAザイム14~21)を使用して、それらの対応するLOCSレポーター(LOCS-29、LOCS-15、LOCS-21、LOCS-22、LOCS-27、LOCS-24、LOCS-28、LOCS-10、LOCS-30、およびLOCS-31)の切断を介して標的核酸の増幅をリアルタイムで監視する。各チャネル(FAM、HEX、テキサスレッド、Cy5、およびCy5.5)内の一方または両方の標的の存在は、PCRの増幅相中の蛍光の増加によって決定し、その後LOCS融解特性を使用して個々の標的を識別した。
ザイム15は、gpd3遺伝子に相同な配列を検出し、LOCS-22を切断および開放するように設計し、MNAザイム17は、TV-Btubに相同な配列を検出し、LOCS-24を切断および開放するように設計し、MNAザイム18は、MgPa遺伝子に相同な配列を検出し、LOCS-28を切断および開放するように設計し、MNAザイム9は、CTcry遺伝子に相同な配列を検出し、LOCS-29を切断および開放するように設計し、MNAザイム19は、LGV pmpH遺伝子に相同な配列を検出し、LOCS-10を切断および開放するように設計し、MNAザイム20は、polA遺伝子に相同な配列を検出し、LOCS-30を切断および開放するように設計し、MNAザイム21は、ヒトTFRC遺伝子を検出し、LOCS-31を切断および開放するように設計した。
TFRC(39℃および80℃)単独の存在下で生成されるLOCS融解特性とは異なり、これは、polAを含有する反応(polAおよびTFRC融解特性)とpolAを欠如する反応(TFRC LOCS融解特性のみ)との間の鑑別を提供する。
以下の実施例は、実施例1~6で前述したように、広範囲の温度にわたる完全な融解曲線分析を必要とすることなく、単一波長で複数の標的を検出および識別するための代替的なプロトコルを提供する。この実施例では、単一波長で3つの標的を検出および特定するいくつかの方法を、分析戦略の選択と組み合わせた修飾されたLOCSプロトコルの使用を通して実証する。標的X、Y、およびZは、3つのLOCSレポーターX、Y、およびZを使用して検出することができ、これらは全て、同じフルオロフォアで標識することができる。3つのLOCSレポーターの各々は、LOCS-XのTm<LOCS-YのTm<LOCS-ZのTmである、異なる融解温度を有する異なるステム領域を含む。加えて、LOCSレポーターの各々は、それぞれMNAザイムX、Y、またはZに特異的な基質を含む異なるループ領域を含有する。MNAザイムX、Y、またはZは、それぞれ標的X、Y、およびZを認識および検出し、それぞれLOCSレポーターX、Y、およびZを切断するように設計されている。標的のPCR増幅の前および/または後に、限定された数の蛍光測定(合計6つ以下)を得ることができる。様々な分析方法が、特定の温度および時点で取得した測定を利用することができる。これらを、表15に要約する。
第1の特定の温度TXaで、LOCS-Xの切断は、無鋳型対照と比較して、有意な蛍光シグナルを生成し、これは、閾値FXaを超える。同じ温度で、切断されたLOCS-Yおよび/またはLOCS-Zの存在は、これらのLOCSのステムのより高いTmのために、有意な蛍光シグナルの生成に寄与せず、その結果、蛍光レベルが、無鋳型対照と比較して、閾値FXa未満に留まる。温度TXaでの蛍光の増幅後測定は、切断されたLOCS-Xの特異的な検出を可能にする。
よりも有意に小さい。したがって、温度TYaでの蛍光の増幅後測定は、切断されたLOCS-Yの特異的な検出を可能にする。
閾値を使用する代わりに、アルゴリズムを使用して、試料中で1つ以上のLOCS種が切断された場合に、切断されたLOCS種を決定することができる。このアルゴリズムは、3つの検出温度(温度TXa、TYa、およびTZa)の各々で測定した無鋳型対照の蛍光レベルに対する、蛍光レベルの比を使用する。上記の3つの温度で測定した相対蛍光レベルの比は、切断されたLOCS種の可能な組み合わせの各々に固有であり、試料中の対応する標的遺伝子(複数可)の存在を示すフィンガープリントとして機能する。このアルゴリズムは、一連の7つの論理試験を含み、1つの論理試験は、1つ以上の切断されたLOCS種の存在を決定するために、切断されたLOCSおよび切断されていないLOCSの可能な各組み合わせに割り当てられる。可能な組み合わせは、(Xのみ)、(Yのみ)、(Zのみ)、(XおよびYのみ)、(XおよびZのみ)、(YおよびZのみ)、または(X、Y、およびZ)である。試料が、標的の特定の組み合わせに対して陽性であると決定されるためには、それは、特定の論理試験についてTRUEと決定される必要がある。論理試験は、(1)3つの異なる温度で測定した蛍光シグナルの比が、事前に定義された値の範囲内にあるかどうか、および(2)蛍光シグナルが、無鋳型対照よりも有意に大きいかどうかを決定する。試料は、LOCS-X、LOCS-Y、およびLOCS-Zの切断された種の特定の組み合わせを示すため、対応する標的(複数可)の存在を特定する最大1組の論理試験について、TRUEであると決定することができる。試料が全ての論理試験に対してFALSEであると決定された場合、この試料は、陰性であると決定され、LOCSの切断された種は含有せず、これは、この試料が、3つの標的のいずれも含有しないことを示す。
第1の特定の温度T0bで、LOCS-X、LOCS-Y、またはLOCS-Zの切断された種のいずれも、無鋳型対照よりも有意に高い蛍光シグナルを生成しない。T0bよりも高い第2の特定の温度TXbで、切断されたLOCS-Xは、有意な蛍光シグナルを生成するが、切断されたLOCS-Yおよび/またはLOCS-Zは、これらのLOCSのステムのより高いTmのために、有意な蛍光シグナルの生成に寄与しない。温度T0bとTXbとの間の増幅後の蛍光シグナルの差は、切断されたLOCS-Xの存在下で、閾値FXbよりも高く、切断されたLOCS-Xの不在下で閾値FXbよりも低いため、これは、切断LOCS-Xの特異的な検出を可能にする。TXbよりも高い第3の特定温度TYbで、切断されたLOCS-Yは、有意な蛍光シグナルを生成する。一方、切断されたLOCS-Zは、そのステムのより高いTmのために、温度TYbで有意な蛍光シグナルの生成に寄与しない。切断されたLOCS-Xは、温度TXbと比較して、温度TYbでの有意な蛍光の生成の増加にさらに寄与しない。温度TXbとTYbとの間の増幅後の蛍光シグナルの差は、切断されたLOCS-Yの存在下で、閾値FYbよりも高く、切断されたLOCS-Yの不在下で閾値FYbよりも低いため、これは、切断されたLOCS-Yの特異的な検出を可能にする。TYbよりも高い第4の特定温度TZbで、切断されたLOCS-Zは、有意な蛍光シグナルを生成する。切断されたLOCS-Xおよび/またはLOCS-Yは、温度TZbでの有意な蛍光の生成の増加にさらに寄与しない。温度
TYbとTZbとの間の増幅後の蛍光シグナルの差は、切断されたLOCS-Zの存在下で、閾値FZbよりも高く、切断されたLOCS-Zの不在下で閾値FZbよりも低いため、これは、切断されたLOCS-Zの特異的な検出を可能にする。
切断されたLOCS-Xの存在の決定について、
温度TXbでの増幅後の蛍光レベル-温度T0bでの増幅後の蛍光レベル>閾値FXbである場合、LOCS-Xは、試料中に存在する。
温度TYbでの増幅後の蛍光レベル-温度TXbでの増幅後の蛍光レベル>閾値FYbである場合、LOCS-Yは、試料中に存在する。
温度TZbでの増幅後の蛍光レベル-温度TYbでの増幅後の蛍光レベル>閾値FZbである場合、LOCS-Zは、試料中に存在する。
閾値を使用する代わりに、アルゴリズムを代替的に使用して、試料中の1つ以上のLOCS種が切断された場合に、T0b、TXb、TYb、およびTZbで測定した増幅後の蛍光レベル間の差から計算した値の比を使用して、切断されたLOCS種を決定することができる。値(a)(温度TXbでの増幅後の蛍光レベル-温度T0bでの増幅後の蛍光レベル)、(b)(温度TYbでの増幅後の蛍光レベル-温度TXbでの増幅後の蛍光レベル)、および(c)(温度TZbでの増幅後の蛍光レベル-温度TYcでの増幅後の蛍光レベル)の比は、切断されたLOCS種の可能な組み合わせの各々に固有であり、試料中の対応する標的(複数可)の存在を示すフィンガープリントとして機能する。このアルゴリズムは、一連の8つの論理試験を含み、1つの論理試験は、1つ以上の切断されたLOCS種の存在を決定するために、切断されたLOCSおよび切断されていないLOCSの可能な各組み合わせに割り当てられる。可能な組み合わせは、(標的なし)、(Xのみ)、(Yのみ)、(Zのみ)、(XおよびYのみ)、(XおよびZのみ)、(YおよびZのみ)、または(X、Y、およびZ)である。試料が、標的の特定の組み合わせに対して陽性であると決定されるためには、それは、論理試験についてTRUEと決定される必要がある。論理試験は、上記の3つの値の差の比が、事前に定義された値の範囲内にあるかどうかを決定する。試料は、最大1つの論理試験についてTRUEであると決定することができ、これが、LOCS-X、LOCS-Y、およびLOCS-Zの切断された種の特定の組み合わせを示し、対応する標的(複数可)の存在を示すか、または(標的なし)論理試験についてTRUEであると決定される場合に、これは、いかなる標的(複数可)も不在であることを示す。
定義された温度での切断されたLOCS種の増幅後の検出はまた、特定の温度での増幅前および増幅後の蛍光測定間の差から得られた情報を使用しても決定することができる。この方法は、それぞれプロトコルAおよびBで説明したように、無鋳型対照または参照温度(T0b)に対する相対的な増幅後の蛍光レベルを決定するための代替手段である。第1の特定温度TXcで、切断されたLOCS-Xは、有意な蛍光シグナルを生成し、温度TXcでの蛍光の増幅前および増幅後の測定間の差は、閾値FXcよりも高い。一方、切断されたLOCS-Yおよび/またはLOCS-Zの存在は、ステムのより高いTmの違
いのために、温度TXcで有意な蛍光シグナルの生成につながらず、温度TXcでの蛍光の増幅前および増幅後の測定間の差は、閾値FXc未満である。したがって、温度TXcでの蛍光の増幅前および増幅後の測定は、LOCS-Xの切断された種の特定の検出を可能にする。温度TXcに対して、第2の温度TYcで切断されたLOCS-Yによって生成される増分蛍光シグナル(TYc>TXcである場合)は、閾値FYcよりも有意に高い。一方、温度TXcに対して、温度TYcで切断されたLOCS-Xおよび/またはLOCS-Zによって生成される増分蛍光シグナルは、閾値FYcよりも有意に小さい。温度TXcに対する、TYcでの増分蛍光シグナルは、温度TYcでの増幅前および増幅後の蛍光レベル間の差、ならびに温度TXcでの増幅前および増幅後の蛍光レベル間の差の差の計算から決定される。したがって、温度TXcおよびTYcでの蛍光レベルの増幅前および増幅後の測定からの情報は、切断されたLOCS-Yの特定の検出を可能にする。温度TYcに対して、第3の温度TZcで切断されたLOCS-Zによって生成される増分蛍光シグナル(TZc>TYcである場合)は、閾値FZcよりも有意に高い。一方、温度TYcに対して、温度TZcで切断されたLOCS-Xおよび/またはLOCS-Yによって生成される増分蛍光シグナルは、閾値FZcよりも有意に小さい。温度TYcに対する、TZcでの増分蛍光シグナルは、温度TYcでの増幅前および増幅後の蛍光レベル間の差、ならびに温度TXcでの増幅前および増幅後の蛍光レベル間の差の差の計算から決定される。したがって、温度TYcおよびTZcでの蛍光レベルの増幅前および増幅後の測定からの情報は、切断されたLOCS-Zの特定の検出を可能にする。
LOCS-Xの存在の決定について、
温度TXcでの増幅後の蛍光レベル-温度TXcでの増幅前の蛍光レベル>閾値FXcである場合、LOCS-Xは、試料中に存在する。
(温度TYcでの増幅後の蛍光レベル-温度TYcでの増幅前の蛍光レベル)-(温度TXcでの増幅後の蛍光レベル-温度TXcでの増幅前の蛍光レベル)>閾値FYcである場合、LOCS-Yが、試料中に存在する。
(温度TZcでの増幅後の蛍光レベル-温度TZcでの増幅前の蛍光レベル)-(温度TYcでの増幅後の蛍光レベル-温度TYcでの増幅前の蛍光レベル)>閾値FZcである場合、LOCS-Zが、試料中に存在する。
閾値を使用する代わりに、アルゴリズムを使用して、試料中の1つ以上のLOCS種が切断された場合に、3つの検出温度TXc、TYc、およびTZcの各々で測定した増幅前の蛍光レベルと増幅後の蛍光レベルとの間の差から計算した値の比を使用して、切断されたLOCS種を決定することができる。値(i)温度TXCでの増幅後の蛍光レベル-温度TXcでの予備増幅蛍光レベル、(ii)(TYcでの増幅後の蛍光レベル-温度TYcでの増幅前の蛍光レベル)-(温度TXcでの増幅後の蛍光レベル-温度TXcでの増幅前の蛍光レベル)、および(iii)(温度TZcでの増幅後の蛍光レベル-温度TZcでの増幅前の蛍光レベル)-(温度TYcでの増幅後の蛍光レベル-温度TYcでの増幅前の蛍光レベル)の比は、切断されたLOCS種および切断されていないLOCS種の可能な組み合わせの各々について固有であり、試料中の対応する標的遺伝子(複数可)の存在を示すフィンガープリントとして機能し得る。このアルゴリズムは、一連の8つの
論理試験を含み、1つの論理試験は、1つ以上の切断されたLOCS種の存在を決定するために、切断されたLOCSおよび切断されていないLOCSの可能な各組み合わせに割り当てられる。可能な組み合わせは、(標的なし)、(Xのみ)、(Yのみ)、(Zのみ)、(XおよびYのみ)、(XおよびZのみ)、(YおよびZのみ)、または(X、Y、およびZ)である。試料が、標的の特定の組み合わせに対して陽性であると決定されるためには、それは、論理試験についてTRUEと決定される必要がある。論理試験は、値(i)、(ii)、および(iii)の差の比が、事前に定義された値の範囲内にあるかどうかを決定する。試料は、最大1つの論理試験についてTRUEであると決定することができ、これが、LOCS-X、LOCS-Y、およびLOCS-Zの切断された種の特定の組み合わせを示すため、対応する標的(複数可)を含有するか、または(標的なし)論理試験についてTRUEと決定された場合、いかなる標的も含有しない。
別の代替的な方法は、融解特性の融解ピークの高さを測定することであり、これは、切断された各LOCSのTmでのd蛍光/d温度値に相当する。しかしながら、この方法の有用性は、切断されたLOCSのTmでのd蛍光/d温度値の決定には限定されず、Tmを含む一連の温度も含む。特定の温度A℃でのd蛍光/d温度値は、(A-N)℃および(A+N)℃にわたる蛍光レベルの勾配に相当する。数学的には、それは、以下の式で表すことができる。
f(温度)=蛍光である場合、
上記の式に見られるように、A℃でのd蛍光/d温度値の計算は、(A-N)℃および(A+N)℃の温度での蛍光の2回の測定を必要とする。三重の場合、3つのd蛍光/d温度値が必要であるため、6回の増幅後の蛍光測定が必要である。LOCS-Xの切断された種の存在下では、温度TXdでのd蛍光/d温度値は、閾値FXdよりも大きいが、LOCS-Xの切断された種の不在下では、温度TXdでのd蛍光/d温度値は、閾値FXd未満である。LOCS-Yの切断された種の存在下では、温度TYdでのd蛍光/d温度値は、閾値FYdよりも大きいが、LOCS-Yの切断された種の不在下では、温度TYdでのd蛍光/d温度値は、閾値FYd未満である。LOCS-Zの切断された種の存在下では、温度TZdでのd蛍光/d温度値は、閾値FZdよりも大きいが、LOCS-Zの切断された種の不在下では、温度TZdでのd蛍光/d温度値は、閾値FZd未満である。切断された各LOCSレポーターの検出は、試料中の対応する標的遺伝子の存在を示す。
閾値を使用する代わりに、アルゴリズムを使用して、試料中の1つ以上のLOCS種が切断された場合に、3つの検出温度TXd、TYd、およびTZdでのd蛍光/d温度値の比を使用して、切断されたLOCS種を決定することができる。上記の3つの温度でのd蛍光/d温度値の比は、切断されたLOCS種の可能な組み合わせの各々に固有であり、試料中の対応する標的(複数可)の存在を示すフィンガープリントとして機能する。このアルゴリズムは、一連の8つの論理試験を含み、1つの論理試験は、1つ以上の切断されたLOCS種の存在を決定するために、切断されたLOCSおよび切断されていないL
OCSの可能な各組み合わせに割り当てられる。可能な組み合わせは、(標的なし)、(Xのみ)、(Yのみ)、(Zのみ)、(XおよびYのみ)、(XおよびZのみ)、(YおよびZのみ)、または(X、Y、およびZ)である。試料が、標的の特定の組み合わせに対して陽性であると決定されるためには、それは、論理試験についてTRUEと決定される必要がある。論理試験は、上記の3つの温度でのd蛍光/d温度値の比が、事前に定義された値の範囲内にあるかどうかを決定する。試料は、最大1つの論理試験についてTRUEであると決定することができ、これが、LOCS-X、LOCS-Y、およびLOCS-Zの切断された種の特定の組み合わせ、ならびにしたがって対応する標的(複数可)を示すか、または(標的なし)論理試験についてTRUEと決定された場合、いかなる標的も含有しない。
この実験に特異的なオリゴヌクレオチドには、LOCS-22(配列番号89)、LOCS-21(配列番号88)、LOCS-23(配列番号90)、パートザイムA22(配列番号124)、パートザイムB22(配列番号125)、パートザイムA23(配列番号126)、パートザイムB23(配列番号127)、パートザイムA24(配列番号130)、パートザイムB24(配列番号131)、順方向プライマー10(配列番号72)、逆方向プライマー10(配列番号73)、順方向プライマー6(配列番号25)、逆方向プライマー6(配列番号26)、順方向プライマー17(配列番号128)、および逆方向プライマー17(配列番号129)が含まれる。配列は、配列表に列挙する。TFRC遺伝子の増幅および検出に特異的なオリゴヌクレオチドは、LOCS-22、パートザイムA22、パートザイムB22、順方向プライマー10、および逆方向プライマー10である。rpoB遺伝子の増幅および検出に特異的なオリゴヌクレオチドは、LOCS-21、パートザイムA23、パートザイムB23、順方向プライマー6、および逆方向プライマー6である。pss遺伝子の増幅および検出に特異的なオリゴヌクレオチドは、LOCS-23、パートザイムA24、パートザイムB24、順方向プライマー17、および逆方向プライマー17である。
BioRad(登録商標)CFX96熱サイクラーを使用して、20μLの合計反応体積で標的配列のリアルタイム検出を実行した。サイクルパラメータは、データ取得ありで39.5℃で30秒間、データ取得ありで56.5℃で30秒間、データ取得ありで65.5℃で30秒間、95℃で2分間、95℃で5秒間および61℃で30秒間のタッチダウンサイクルを10回(1サイクルあたり0.5℃の減衰)、ならびに95℃で5秒間および52℃で40秒間のサイクルを40回(データは52℃のステップで収集)、その後データ取得ありで39.5℃で30秒間、データ取得ありで40.5℃で30秒間、データ取得ありで50.5℃で30秒間、データ取得ありで51.5℃で30秒間、データ取得ありで56.5℃で30秒間、データ取得ありで64.5℃で30秒間、データ取得ありで65.5℃で30秒間、およびデータ取得ありで78.5℃で30秒間であった。各反応は、40nMの各順方向プライマー、200nMの各逆方向プライマー、200nMの各パートザイム、80nMのLOCS-22レポーター、210nMのLOCS-21レポーター、300nMのLOCS-23レポーター、2mMのMgCl2(Bioline)、および1×SensiFASTプローブNo-ROX混合物(Bioline)を含有した。反応は、ゲノムDNAもしくは標的遺伝子の合成Gブロック鋳型(NF H2O中の1標的遺伝子あたり10,000コピー)を含有するか、または標的なし(NF
H2O)のいずれかであった。
PCR中、3つのMNAザイム(MNAザイム22、MNAザイム23、およびMNAザイム24)を使用して、それらの対応するLOCSレポーター(それぞれLOCS-2
2、LOCS-21、およびLOCS-23)の切断を介して標的核酸の増幅をリアルタイムで監視する。MNAザイム22は、TFRC遺伝子(Homo sapiens)配列を検出し、LOCS-22を切断するように設計されている。MNAザイム23は、rpoB遺伝子(Klebsiella pneumoniae)配列を検出し、LOCS-21を切断するように設計されている。MNAザイム24は、pss遺伝子(Streptococcus pneumoniae)配列を検出し、LOCS-23を切断するように設計されている。標的遺伝子TFRC、rpoB、またはpssのいずれかの存在は、PCRサイクルの増幅前または増幅後の段階でいくつかの温度で測定した、JOEチャネルの蛍光シグナルによって検出した。
Claims (20)
- 試料中の第1および第2の標的の存在または不在を決定するための方法であって、前記方法が、
(a)前記第1および/もしくは第2の標的またはそれらのアンプリコンを含むと推定される前記試料またはその誘導体を、
第1および第2の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドであって、前記閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの各々が、ハイブリダイズしていないヌクレオチドの閉鎖一本鎖ループ部分に接続された、ハイブリダイズしたヌクレオチドの二本鎖ステム部分を含み、
前記第1および第2の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分における、ハイブリダイズしたヌクレオチドの数および/またはハイブリダイズしたヌクレオチドの配列が、異なる、第1および第2の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチド、ならびに
前記標的またはそのアンプリコンと接触した場合にのみ、前記第1および第2の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記一本鎖ループ部分を切断または分解することができる酵素と接触させることによって、反応混合物を調製することと、
(b)前記反応混合物を、
-前記酵素が、前記第1および第2の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記ループ部分の切断または分解を誘導して、それにより、第1および第2の開放ステムループオリゴヌクレオチドを生成するのに好適な条件下、
-第1の温度であって、その温度以上で、前記第1の開放ステムループオリゴヌクレオチドの前記二本鎖ステム部分の鎖が解離して、それにより、前記第1の開放ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のフルオロフォアおよびクエンチャー分子の空間的分離を促進し、第1の検出可能な蛍光シグナルを提供する、第1の温度で、ならびに
-第2の温度であって、その温度以上で、前記第2の開放ステムループオリゴヌクレオチドの前記二本鎖ステム部分の鎖が解離して、それにより、前記第2の開放ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のフルオロフォアおよびクエンチャー分子の空間的分離を促進し、第2の検出可能な蛍光シグナルを提供する、第2の温度で、処理することであって、
前記第1の温度が、前記第2の温度よりも低く、
前記第1の開放ステムループオリゴヌクレオチドの前記フルオロフォアおよび前記第2の開放ステムループオリゴヌクレオチドの前記フルオロフォアが、同じ可視スペクトルの色領域で発光する、処理することと、
(c)前記第2の温度以上の温度を含むか、またはそれからなる1つ以上の温度で、前記第1および第2の蛍光シグナルのレベルを検出して、それにより、前記試料中の前記標的の存在または不在を決定することと、を含む、方法。 - 前記酵素が、多成分核酸酵素(MNAザイム)を含み、前記反応混合物の前記処理が、前記反応混合物を、
第1の多成分核酸酵素(MNAザイム)を前記第1の標的またはそのアンプリコンに結合させ、前記第1のMNAザイムの基質アームを前記第1の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記ループ部分にハイブリダイズして、それにより、前記第1のMNAザイムが、前記第1の開放ステムループオリゴヌクレオチドを形成することによって、前記第1の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記ループ部分の前記切断を促進するのに好適な条件下で処理することを含み、
前記第1の標的が、前記第1のMNAザイムのセンサーアームにハイブリダイズして、それにより、前記第1のMNAザイムの集合を促進することができる核酸配列またはそのアンプリコンである、請求項1に記載の方法。 - 前記酵素が、制限エンドヌクレアーゼを含み、前記反応混合物の前記処理が、
前記反応混合物を、前記第1の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記ループ部分への第1の標的またはそのアンプリコンのハイブリダイゼーションに好適な条件下で処理して、第1の制限エンドヌクレアーゼが会合する二本鎖配列を形成し、それにより、前記第1の開放ステムループオリゴヌクレオチドを形成する前記第1の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記ループ部分の前記切断を促進することを含む、請求項1に記載の方法。 - 前記酵素が、エキソヌクレアーゼ活性を含み、前記反応混合物の前記処理が、
-第1の標的またはそのアンプリコンを、前記第1の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記ループ部分にハイブリダイズして、前記第1の標的またはそのアンプリコンを含む第1の二本鎖配列を形成すること、
-第1のプライマーオリゴヌクレオチドを、前記第1の標的またはそのアンプリコンにハイブリダイズして、前記第1の標的またはそのアンプリコンを含む前記第1の二本鎖配列に対して上流(5’)に位置する第2の二本鎖配列を形成すること、
-エキソヌクレアーゼ活性を含む第1の酵素を、前記第1のプライマーオリゴヌクレオチドの末端にあるか、またはそれに隣接する前記第1の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分と会合させること、および
-エキソヌクレアーゼ活性を含む前記第1の酵素の触媒活性により、第1の標的またはアンプリコンを含む前記第1の二本鎖配列の前記ループ部分の分解を促進し、前記第1の開放ステムループオリゴヌクレオチドを形成すること
に好適な条件下で前記反応混合物を処理することを含む、請求項1に記載の方法。 - 前記酵素がポリメラーゼ酵素またはエキソヌクレアーゼである、請求項1に記載の方法。
- 前記酵素が、エキソヌクレアーゼ活性を含み、前記反応混合物の前記処理が、
-第1の標的またはそのアンプリコンを、前記第1の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記ループ部分にハイブリダイズして、前記第1の標的またはそのアンプリコンを含む第1の二本鎖配列を形成すること、
-エキソヌクレアーゼ活性を含む第1の酵素を、前記第1の標的またはそのアンプリコンを含む前記第1の二本鎖配列と会合させること、および
-エキソヌクレアーゼ活性を含む前記第1の酵素の触媒活性により、前記第1の標的またはアンプリコンを含む前記第1の二本鎖配列の前記ループ部分の分解を促進し、前記第
1の開放ステムループオリゴヌクレオチドを形成すること
に好適な条件下で前記反応混合物を処理することを含む、請求項1に記載の方法。 - 前記酵素が、触媒活性に第1の補因子を必要とするDNAザイムおよび/またはリボザイムを含み、前記反応混合物の前記処理が、
-前記第1の補因子を前記DNAザイムに結合させ、かつ/または前記第1の補因子を前記リボザイムに結合させて、前記DNAザイムおよび/またはリボザイムを触媒活性にすること、
-DNAザイムおよび/またはリボザイムを、第1の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記ループ部分にハイブリダイズすること、
-前記DNAザイムおよび/またはリボザイムの触媒活性により、前記第1の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記ループ部分の切断を促進し、前記第1の開放ステムループオリゴヌクレオチドを形成すること
に好適な条件下で前記反応混合物を処理することを含み、
前記第1の標的が、前記第1の補因子である、請求項1に記載の方法。 - 前記反応混合物の前記処理が、
-第2のMNAザイムを前記第2の標的またはそのアンプリコンに結合させ、前記第2のMNAザイムの基質アームを前記第2の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記ループ部分にハイブリダイズして、それにより、前記第2のMNAザイムが、前記第2の開放ステムループオリゴヌクレオチドを形成することによって、前記第2の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記ループ部分の前記切断を促進すること、
-第2の標的またはそのアンプリコンを前記第2の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記ループ部分にハイブリダイズして、第2の制限エンドヌクレアーゼが前記二本鎖配列と会合する二本鎖配列を形成し、それにより、前記第2の開放ステムループオリゴヌクレオチドを形成する前記第2の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記ループ部分の前記切断を促進すること、
-第2の標的またはそのアンプリコンを、前記第2の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記ループ部分にハイブリダイズして、前記第2の標的またはそのアンプリコンを含む第2の二本鎖配列を形成し、
第2のプライマーオリゴヌクレオチドを、前記第2の標的またはそのアンプリコンにハイブリダイズして、前記第2の標的またはそのアンプリコンを含む前記第2の二本鎖配列に対して上流(5’)に位置する第2の二本鎖配列を形成し、
エキソヌクレアーゼ活性を含む第2の酵素を、前記第2のプライマーオリゴヌクレオチドの末端にあるか、またはそれに隣接する前記第2の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分と会合させ、
エキソヌクレアーゼ活性を含む前記第2の酵素の触媒活性により、前記第2の標的またはアンプリコンを含む前記第2の二本鎖配列の前記ループ部分の分解を促進し、前記第2の開放ステムループオリゴヌクレオチドを形成すること、
-第2の標的またはそのアンプリコンを、前記第2の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記ループ部分にハイブリダイズして、前記第2の標的またはそのアンプリコンを含む第2の二本鎖配列を形成し、
エキソヌクレアーゼ活性を含む第2の酵素を、前記第2の標的またはそのアンプリコンを含む前記第2の二本鎖配列と会合させ、
エキソヌクレアーゼ活性を含む前記第2の酵素の触媒活性により、前記第2の標的またはアンプリコンを含む前記第2の二本鎖配列の前記ループ部分の分解を促進し、前記第2の開放ステムループオリゴヌクレオチドを形成すること、
-第2の補因子をDNAザイムに結合させ、かつ/または第2の補因子をリボザイムに結合させて、前記DNAザイムおよび/またはリボザイムを触媒として活性化させ、
DNAザイムおよび/またはリボザイムを、前記第2の閉鎖ステムループオリゴヌクレ
オチドの前記ループ部分にハイブリダイズし、
前記DNAザイムおよび/またはリボザイムの触媒活性により、前記第2の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記ループ部分の切断を促進し、前記第2の開放ステムループオリゴヌクレオチドを形成すること
のうちのいずれか1つ以上に好適な条件下で前記反応混合物を処理することをさらに含み、
前記第2の標的が、前記第2の補因子である、請求項1~7のいずれか一項に記載の方法。 - 試料中の第3の標的またはそのアンプリコンの存在または不在を決定することであって、
(d)前記試料またはその誘導体を含む前記反応混合物を、
第3の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドであって、前記第3の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドが、ハイブリダイズしていないヌクレオチドの閉鎖一本鎖ループ部分に接続されたハイブリダイズしたヌクレオチドの二本鎖ステム部分を含み、
前記第3の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分における、ハイブリダイズしたヌクレオチドの数および/またはハイブリダイズしたヌクレオチドの配列が、前記第1および第2の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のものとは異なり、
前記二本鎖ステム部分が、一方の鎖に接続されたフルオロフォア分子、および反対の鎖に接続されたクエンチャー分子を含む、第3の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチド、ならびに
前記標的またはそのアンプリコンと接触した場合にのみ、前記第3の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記一本鎖ループ部分を切断または分解することができる酵素と接触させることと、
(e)前記反応混合物を、
-前記酵素が、前記第3の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記ループ部分の切断または分解を誘導して、それにより、第3の開放ステムループオリゴヌクレオチドを生成するのに好適な条件下、
-第3の温度であって、その温度以上で、前記第3の開放ステムループオリゴヌクレオチドの前記二本鎖ステム部分の鎖が解離して、それにより、前記第3の開放ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分の前記フルオロフォアおよびクエンチャー分子の空間的分離を促進し、第3の検出可能な蛍光シグナルを提供する、第3の温度で、処理することであって、
前記第3の温度が、前記第1および第2の温度よりも高い、処理することと、
(f)前記第3の温度以上の温度を含むか、またはそれからなる1つ以上の温度で、前記第1、第2、および第3の蛍光シグナルのレベルを検出して、それにより、前記試料中の前記標的の存在または不在を決定すること
とによって、決定することをさらに含む、請求項1~8のいずれか一項に記載の方法。 - 試料中の第3の標的またはそのアンプリコンの存在または不在を決定することであって、
(d)前記試料またはその誘導体を含む前記反応混合物を、
第3の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドであって、前記第3の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドが、ハイブリダイズしていないヌクレオチドの閉鎖一本鎖ループ部分に接続されたハイブリダイズしたヌクレオチドの二本鎖ステム部分を含み、
前記第3の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分における、ハイブリダイズしたヌクレオチドの数および/またはハイブリダイズしたヌクレオチドの配列が、前記第1または第2の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分の配列と同じであり、
前記二本鎖ステム部分が、一方の鎖に接続されたフルオロフォア分子、および反対の鎖に接続されたクエンチャー分子を含み、前記第3の開放ステムループオリゴヌクレオチドに接続された前記フルオロフォア分子が、前記第1および/または第2の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記フルオロフォアとは異なる可視スペクトルの色領域で発光する、第3の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチド、ならびに
前記標的またはそのアンプリコンと接触した場合にのみ、前記第3の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記一本鎖ループ部分を切断または分解することができる酵素と接触させることと、
(e)前記反応混合物を、
-前記酵素が、前記第3の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記ループ部分の切断または分解を誘導して、それにより、第3の開放ステムループオリゴヌクレオチドを生成するのに好適な条件下、
-第3の温度であって、その温度で、前記第3の開放ステムループオリゴヌクレオチドの前記二本鎖ステム部分の鎖が解離して、それにより、前記第3の開放ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分の前記フルオロフォアおよびクエンチャー分子の空間的分離を促進し、第3の検出可能な蛍光シグナルを提供する、第3の温度で、処理することと、
(f)前記第3の温度以上の温度を含むか、またはそれからなる1つ以上の温度で、前記第1、第2、および第3の蛍光シグナルのレベルを検出して、それにより、前記試料中の前記標的の存在または不在を決定すること
とによって、決定することをさらに含む、請求項1~8のいずれか一項に記載の方法。 - 前記方法が、前記反応混合物を、
-第3のMNAザイムを前記第3の標的またはそのアンプリコンに結合させ、前記第3のMNAザイムの基質アームを前記第3の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記ループ部分にハイブリダイズして、それにより、前記第3のMNAザイムが、前記第3の開放ステムループオリゴヌクレオチドを形成することによって、前記第3の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記ループ部分の前記切断を促進すること、
-前記第3の標的またはそのアンプリコンを前記第3の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記ループ部分にハイブリダイズして、第3の制限エンドヌクレアーゼが前記二本鎖配列と会合する二本鎖配列を形成し、それにより、前記第3の開放ステムループオリゴヌクレオチドを形成する前記第3の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記ループ部分の前記切断を促進すること、
-第3の標的またはそのアンプリコンを、前記第3の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記ループ部分にハイブリダイズして、前記第3の標的またはそのアンプリコンを含む第3の二本鎖配列を形成し、
第3のプライマーオリゴヌクレオチドを、前記第3の標的またはそのアンプリコンにハイブリダイズして、前記第3の標的またはそのアンプリコンを含む前記第3の二本鎖配列に対して上流(5’)に位置する第3の二本鎖配列を形成し、エキソヌクレアーゼ活性を含む第3の酵素を、前記第3のプライマーオリゴヌクレオチドの末端にあるか、またはそれに隣接する前記第3の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分と会合させ、
エキソヌクレアーゼ活性を含む前記第3の酵素の触媒活性により、前記第3の標的またはアンプリコンを含む前記第3の二本鎖配列の前記ループ部分の分解を促進し、前記第3の開放ステムループオリゴヌクレオチドを形成すること、
-第3の標的またはそのアンプリコンを、前記第3の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記ループ部分にハイブリダイズして、前記第3の標的またはそのアンプリコンを含む第3の二本鎖配列を形成し、
エキソヌクレアーゼ活性を含む第3の酵素を、前記第3の標的またはそのアンプリコンを含む前記第3の二本鎖配列と会合させ、
エキソヌクレアーゼ活性を含む前記第3の酵素の触媒活性により、前記第3の標的また
はアンプリコンを含む前記第3の二本鎖配列の前記ループ部分の分解を促進し、前記第3の開放ステムループオリゴヌクレオチドを形成すること、
-第3の補因子をDNAザイムに結合させ、かつ/または第3の補因子をリボザイムに結合させて、前記DNAザイムおよび/またはリボザイムを触媒として活性化させ、
DNAザイムおよび/またはリボザイムを、第3の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記ループ部分にハイブリダイズし、
前記DNAザイムおよび/またはリボザイムの触媒活性により、前記第3の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記ループ部分の切断を促進し、前記第3の開放ステムループオリゴヌクレオチドを形成すること
のうちのいずれか1つ以上に好適な条件下で処理することを含み、
前記第3の標的が、前記第3の補因子である、請求項9または10に記載の方法。 - (a)
-前記第3の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分における、ハイブリダイズしたヌクレオチドの数および/またはハイブリダイズしたヌクレオチドの配列が、前記第1および第2の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のものとは異なり、
-前記第3の温度が、前記第1および第2の温度とは異なり、
-前記第3の閉鎖および開放ステムループオリゴヌクレオチドの前記フルオロフォアが、前記第1および第2の閉鎖および開放ステムループオリゴヌクレオチドの前記フルオロフォアと同じ可視スペクトルの色領域で発光する;または
(b)
-前記第1の閉鎖および開放ステムループオリゴヌクレオチドの前記フルオロフォアが、前記第2の閉鎖および開放ステムループオリゴヌクレオチドの前記フルオロフォアと同じ可視スペクトルの色領域で発光し、
-前記第3の閉鎖および開放ステムループオリゴヌクレオチドの前記フルオロフォアが、前記第1および第2の閉鎖および開放ステムループオリゴヌクレオチドの前記フルオロフォアとは異なる可視スペクトルの色領域で発光する、
請求項9または11に記載の方法。 - 前記第1および第2の標的の存在または不在を決定することが、前記第1および第2の蛍光シグナルを使用する融解曲線分析を含む、請求項1~12のいずれか一項に記載の方法。
- (c)部が、前記第1および第2の蛍光シグナルのレベルを、
-前記第2の温度以上の温度、および
-前記第1の温度以上かつ前記第2の温度未満の温度で検出することを含む、請求項1~12のいずれか一項に記載の方法。 - (c)部が、核酸増幅反応中および/または完了時に、前記第1および第2の蛍光シグナルのレベルを検出することを含む、請求項14に記載の方法。
- -前記第1の標的を含む別個の対照試料上で反復することによって、既知の濃度の前記第1の標的および既知の濃度の前記第1の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドを使用して、第1の標的陽性対照蛍光シグナル;および/または
-前記第2の標的を含む別個の対照試料上で反復することによって、第2の標的陽性対照蛍光シグナルであって、前記対照試料が、既知の濃度の前記第2の標的を含む、第2の標的陽性対照蛍光シグナル;および/または
-前記第1および前記第2の標的を含む別個の対照試料上で反復することによって、組み合わされた陽性対照蛍光シグナルであって、前記組み合わされた対照試料が、既知の濃
度の前記第1の標的および/または既知の濃度の前記第2の標的を含む、組み合わされた陽性対照蛍光シグナル
を生成することをさらに含む、請求項14または15に記載の方法。 - 任意の前記陽性対照蛍光シグナルを使用して、前記第1の蛍光シグナルおよび前記第2の蛍光シグナルを正規化することをさらに含む、請求項16に記載の方法。
- 請求項1または2に記載の方法を、
(i)前記第1の標的、または
(ii)前記第2の標的、または
(iii)前記第1の標的もしくは前記第2の標的を含有しない別個の陰性対照試料上で反復することによって、陰性対照蛍光シグナルを生成することをさらに含み、
前記陰性対照蛍光シグナルを使用して、前記第1の蛍光シグナルおよび/または前記第2の蛍光シグナルを正規化することをさらに含む、請求項13~17のいずれか一項に記載の方法。 - 前記第1および/または第2の蛍光シグナルを閾値と比較することをさらに含み、
-前記閾値が、請求項1または2に記載の方法に従って試験された一連の試料に由来する蛍光シグナルを使用して生成され、
(i)無鋳型対照および前記第1の標的
(ii)無鋳型対照および前記第2の標的
(iii)無鋳型対照、前記第1の標的、および前記第2の標的
のうちのいずれか1つ以上を含み、それにより、前記試料中の前記第1および第2の標的の前記存在または不在を決定する、請求項13~18のいずれか一項に記載の方法。 - 組成物であって、
第1および第2の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドであって、前記閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの各々が、ハイブリダイズしていないヌクレオチドの一本鎖ループ部分に接続されたハイブリダイズしたヌクレオチドの二本鎖ステム部分を含み、
前記第1および第2の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分における、ハイブリダイズしたヌクレオチドの数および/またはハイブリダイズしたヌクレオチドの配列が、異なり、ならびに
前記二本鎖ステム部分の各々が、一方の鎖に接続されたフルオロフォア分子、および反対の鎖に接続されたクエンチャー分子を含む、第1および第2の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドを含み、
前記フルオロフォア分子が、同じ可視スペクトルの色領域で発光し、前記第1の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記二本鎖ステム部分の融解温度(Tm)が、前記第2の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記二本鎖ステム部分のTmとは異なり;
前記第1の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記一本鎖ループ部分が、前記第2の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記一本鎖ループ部分の配列とは異なり;
前記第1の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記閉鎖一本鎖ループ部分にハイブリダイズすることができる基質アームを含む、第1のMNAザイム、および
前記第2の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記一本鎖ループ部分にハイブリダイズすることができる基質アームを含む、第2のMNAザイムをさらに含む、組成物。
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