JP7423603B2 - 核酸の多重検出 - Google Patents

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Description

本発明は一般に、分子生物学の分野に関する。より具体的には、本発明は、標的核酸の検出および／または鑑別におけるオリゴヌクレオチドおよびそれらを使用するための方法を提供する。本オリゴヌクレオチドおよび方法は、複数の標的を同時に増幅、検出、および／または識別する上で特定の用途を見出す。
相互参照による組み込み
本出願は、２０１８年８月９日出願の豪州仮出願番号２０１８９０２９１５からの優先権を主張し、その内容全体が、相互参照により本明細書に組み込まれる。
遺伝子分析は、疾患リスクの評価、疾患の診断、患者の予後または治療への応答の予測、および患者の進行の監視のために、診療所において日常的になりつつある。そのような遺伝子検査の導入は、遺伝的変異を識別するための簡便で安価かつ迅速なアッセイの開発に依存する。
インビトロ核酸増幅の方法は、遺伝学および疾患診断において広く適用されている。そのような方法には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、ヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ）、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）、ループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、自家持続配列複製（３ＳＲ）、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）、または逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）が含まれる。これらの標的増幅戦略の各々は、オリゴヌクレオチドプライマーの使用を必要とする。増幅のプロセスは、５’末端にオリゴヌクレオチドプライマーを組み込み、プライマー間に位置する配列の新たに合成されたコピーを含有する、アンプリコンの指数関数的増幅をもたらす。
アンプリコンの蓄積をリアルタイムで、または増幅の終了時に監視するために一般的に使用される方法には、ユニバーサル基質プローブを有するＭＮＡザイムを使用する検出、標的特異的分子ビーコンであるＴａｑＭａｎプローブもしくは加水分解プローブの使用、Ｓｃｏｒｐｉｏｎプライマー／プローブ、および／またはＳｙｂＧｒｅｅｎなどの挿入色素の使用が含まれる。異なる配列を有するアンプリコンは、融解温度またはＴｍとして知られている異なる温度で変性するため、これらのプロトコルのいくつかの最中または終了時に高分解能融解曲線分析を実行して、追加の情報を得ることができる。そのようなプロトコルは、ａ）挿入色素の存在下での二本鎖アンプリコンの２本の鎖の分離、またはｂ）アンプリコンの１本の鎖ならびにフルオロフォアおよびクエンチャーで標識された相補的な標的特異的プローブの分離のいずれかから生じる融解曲線を測定する。融解曲線分析は、加熱中の２本のＤＮＡ鎖の解離速度に関する情報を提供する。融解温度（Ｔｍ）は、ＤＮＡの５０％が解離する温度である。Ｔｍは、対合したヌクレオチドの長さ、配列組成、およびＧ－Ｃ含有量に依存する。融解曲線分析からの標的ＤＮＡに関する情報の解明は従来、典型的には広い温度範囲にわたって小さな間隔で取得される一連の蛍光測定を伴う。融解温度は、塩基配列のみに依存するわけではない。融解温度は、オリゴヌクレオチドの濃度、緩衝液中のカチオン（一価（Ｎａ＋）および二価（Ｍｇ２＋）塩の両方）、ならびに尿素またはホルムアミドなどの不安定化剤の存在または不在によって影響を受ける可能性がある。
一般に、目立たない波長を監視することができる利用可能な蛍光チャネルの数は、リアルタイム機器で単一の反応で検出および特異的に特定することができる標的の数を制限す
る。近年、「オリゴヌクレオチド切断および伸長のタグ付け」（ＴＯＣＥ）として知られているプロトコルがこの能力を拡張し、単一の波長での複数の標的の分析を可能にしている。ＴＯＣＥ技術は、ピッチャーおよびキャッチャーオリゴヌクレオチドを使用する。ピッチャーは、標的に相補的である標的化部分、および相補的ではなく５’端に位置するタグ付け部分の、２つの領域を有する。捕捉オリゴヌクレオチドは、二重標識されており、その３’末端にピッチャーのタグ付け部分に相補的である領域を有する。増幅中、ピッチャーは、アンプリコンに結合し、プライマーの伸長時に、ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性が、ピッチャーからタグ付け部分を切断することができる。その後、放出されたタグ付け部分は、キャッチャーオリゴヌクレオチドに結合し、相補鎖を合成するためのプライマーとして機能する。その後、二本鎖キャッチャー分子の溶融温度（キャッチャー－Ｔｍ）は、元の鋳型の代替マーカーとして作用する。異なる配列および長さを有する複数のキャッチャーを組み込むことが可能であり、それらは全て異なる温度で融解するため、依然として単一の波長で測定しながら、一連の標的を示す一連のキャッチャー－Ｔｍ値を得ることが可能である。このアプローチの制限には、固有の複雑さが含まれるが、これは、放出される断片が、人工標的に対する第２の伸長を開始および完了することを必要とするためである。
ヘアピンプローブまたはステムループプローブもまた、核酸の検出および／または標的増幅の監視に有用なツールであることが証明されている。フルオロフォアおよびクエンチャー色素対で二重標識されているヘアピンプローブは、当該技術分野では一般に分子ビーコンとして知られている。一般に、これらの分子は、１）オリゴヌクレオチドの相補的な５’および３’端のハイブリダイゼーションによって形成されるステム構造、２）検出される標的または標的アンプリコンに相補的なループ領域、ならびに３）分子ビーコンの末端に結合したフルオロフォアクエンチャー色素対の、３つの特徴を有する。ＰＣＲ中、ループ領域は、相補性のためにアンプリコンに結合し、これが、ステムの開放、および故にフルオロフォアクエンチャー色素対の分離を引き起こす。無傷の開放分子ビーコンの末端に結合した色素対の分離は、標的の存在を示す蛍光の変化を引き起こす。本方法は、単一のＰＣＲ検査における複数の標的の多重分析のために一般的に使用される。多重反応では、各分子ビーコンは、異なる標的特異的ループ領域および固有のフルオロフォアを有するため、各アンプリコン種への各異なる分子ビーコンのハイブリダイゼーションを、別個のチャネルで、すなわち、別個の波長で監視することができる。
分子ビーコンの概念は、スロッピービーコンとして知られている戦略で拡張されている。このプロトコルでは、単一のビーコンのループ領域は、十分に長いため、不一致の塩基を許容し、それ故に１つ以上のヌクレオチドが異なるいくつかの密接に関連する標的に結合することができる。増幅後、融解曲線分析を実行し、標的種およびビーコンのループ領域が分離（融解）する温度に基づいて、異なる標的種を鑑別することができる。このようにして、複数の密接に関連する種を、単一の波長で検出し、単一のスロッピービーコンで特定の標的の融解プロファイルを特徴付けることによって同時に識別することができる。標準的な分子ビーコンおよびスロッピービーコンは、増幅中の分解または切断が意図されないという点で、ＴａｑＭａｎおよび加水分解プローブとは異なる。スロッピービーコンおよびＴＯＣＥなどのＤＮＡハイブリダイゼーションベースの技術の欠点は、プローブと非標的核酸配列との間の非特異的ハイブリダイゼーションのために、偽陽性の結果を生成し得ることである。
多くの核酸検出アッセイは、融解曲線分析を利用して、所与の試料中の特定の標的配列の存在を特定する。融解曲線分析プロトコルは、徐々に増加する温度範囲にわたって様々な温度で蛍光を測定することを伴う。その後、この曲線の勾配の変化を温度の関数としてプロットして、融解曲線を得る。このプロセスは、しばしば緩徐であり、典型的には完了に３０～６０分かかる。さらに、融解曲線分析は、結果の解釈のために熟練した担当者に
よる解釈および／または専用ソフトウェアの使用を必要とする可能性がある。したがって、融解曲線分析のより高速および／またはより簡便な代替手段に対する高い需要が存在する。
ＰＣＲによって、または代替的な標的増幅プロトコルによって生成された複数の無関係なアンプリコンの同時検出、鑑別、および／または定量化のための改善された組成物および方法に対する必要性が存在する。
本発明は、現在の多重検出アッセイに存在する１つ以上の欠陥に対処する。
本明細書でＬＯＣＳ（ステムに接続されたループ）と称されるオリゴヌクレオチド構造を使用することによって、増幅プロトコル中に多重化する能力を拡張する方法および組成物が、本明細書で提供される。単一のフルオロフォアおよびクエンチャー対で標識された一連のＬＯＣＳは、標的の存在に応答した切断または分解によるＬＯＣＳの開放後にステム部分が融解する温度によって、単一の反応において個別に識別することができる。したがって、ステム領域の融解温度は、ＬＯＣＳを開放した特定の標的の代替マーカーとして作用する。ステム－ループ構造を組み込む他の方法は、ａ）色素対間の距離を増加させる標的アンプリコン（分子ビーコンおよびスロッピービーコン）へのループ領域のハイブリダイゼーション、またはｂ）色素（切断可能な分子ビーコン）の物理的分離を可能にする切断によることのいずれかの後の蛍光の変化を利用しているが、本発明は、既存の多重検出アッセイに対する改善を提供する。これらの改善は、少なくとも部分的には、各ステムが異なる温度で融解するようにステムの長さおよび／または配列組成を変化させることによって、ステム－ループオリゴヌクレオチドのステム部分の融解温度を操作することを通して生じる。
本明細書に記載されるように、同じフルオロフォアで標識された複数のＬＯＣＳは、ａ）複数の標的の直接的または間接的な同時検出を可能にする異なるループ配列、およびｂ）目立たない温度で融解し、調査される複数の標的において存在する特定の標的（複数可）の特定に使用することができる異なるステム配列を含有し得る。本発明の方法は、例えば、別個のキャッチャー分子が必要とされず、故に反応混合物中の構成成分の数を低減し、費用を低減するという点で、例えば、ＴＯＣＥプロトコルなどの当該技術分野で既の方法に対する１つ以上の利点を提供する。さらに、ＴＯＣＥ法は、放出された断片が合成標的に対する第２の伸長を開始および完了することを必要とするため、本発明の方法よりも本質的に複雑である。さらに、いくつかの実施形態では、ＬＯＣＳプローブは、（標的配列とは独立して）ユニバーサルであることができ、かつ／または一連の検出技術と組み合わせることができ、故に分子診断の分野で広い適用性を送達する。加えて、従来の増幅および検出技術で使用される融解温度は、ハイブリダイゼーションおよび標的核酸によるプローブの融解に基づいている。これは、プローブと非標的核酸配列との間の非特異的ハイブリダイゼーションのために偽陽性が増加するという欠点に悩まされる。ユニバーサル基質を含有するＬＯＣＳレポータープローブは、標的配列と結合しないため、本発明の方法は、この制限を克服する。最後に、分子内結合が分子間結合よりも強いことは、当該技術分野で周知であり、故にこれらの切断されていない（閉鎖）ＬＯＣＳが非特異的標的とハイブリダイズし、偽陽性シグナルを生成する確率は、著しく低い。
分子内結合が分子間結合よりも強い結果として、二重標識ＬＯＣＳは、無傷（閉鎖）の場合は１つの温度で融解するが、標的依存切断または分解によるループ領域の開放後はより低い温度で融解する。本発明では、核酸のこの特性を利用して、機器が１つの蛍光チャネルなどの単一の種類の検出器を使用して複数の標的を鑑別する能力を拡張する。
本発明のＬＯＣＳレポーターによって生成される温度依存蛍光シグナルは、明確に定義されており、標的ＤＮＡとは独立している。したがって、完全な温度勾配ではなく、選択された温度で生成される蛍光シグナルの測定から標的ＤＮＡに関する情報を解明することが可能であり、熱サイクリングデバイス（例えば、ＰＣＲデバイス）での実行時間を低減する上で利点を提供する。非限定的な例として、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＣＦＸ９６ＰＣＲシステムで、０．５℃の増分での２０℃～９０℃の温度および５秒間の保持時間の設定で従来の融解分析を行うには、１４１回の蛍光測定サイクルを必要とし、５０分間の実行時間を必要とする。ＬＯＣＳプローブを使用すると、標的ＤＮＡに関する情報を、同じデバイスから２～６回の蛍光測定で得ることができ、約２～５分間の実行時間を必要とする。いかなる特定の制限もなければ、実行時間の低減は、例えば、診断を含む多くの用途において有利である可能性がある。
本発明のＬＯＣＳプローブを使用して、単一の蛍光チャネルにおける複数の標的を同時に検出、鑑別、および／または定量化することもできる。従来のｑＰＣＲでは、標的ＤＮＡの定量化は、各増幅サイクルで単一温度で蛍光を測定することによって得た増幅曲線からのサイクル定量化（Ｃｑ）値を使用して決定される。Ｃｑ値は、標的ＤＮＡの濃度の負の対数値に比例するため、実験的に決定されたＣｑ値から濃度を決定することが可能である。しかしながら、シグナルが特定のプローブに起源を持つかどうかを特定することは困難であるため、単一のチャネルに２つ以上の標的特異的プローブが存在する場合、各標的を正確かつ特異的に定量化することは困難である。この問題に対処するために、ＬＯＣＳは、増幅中に２つ以上の温度で蛍光を測定することによって増幅曲線を得ることを条件として、単一のチャネルにおける２つ以上の標的の正確かつ特異的な定量化を可能にする。これが可能なのは、異なるＬＯＣＳが、異なる温度で有意に異なる量の蛍光を生成し得るためである。
分析が、ＰＣＲ内の限定された数の時点、例えば、ＰＣＲ後の蛍光取得のみを必要とするいくつかの実施形態では、ＬＯＣＳ構造の使用は、各サイクルでの取得の必要性を排除する。したがって、これらの実施形態は、結果が得られるまでの時間を低減することができる非常に迅速なサイクリングプロトコルに非常に適している。
上記のように、融解曲線分析プロトコルは、徐々に増加する温度範囲（例えば、３０℃～９０℃）にわたって様々な温度で蛍光を測定することを伴う。その後、この曲線の勾配の変化を温度の関数としてプロットして、融解曲線を得る。このプロセスは、しばしば緩徐であり、例えば、完了に３０～６０分かかる可能性がある。融解曲線分析の速度を増加させるには、高度に専門化された機器へのアクセスが必要であり、標準的なＰＣＲデバイスを使用して達成することはできない。したがって、標準的な機器を使用して、単一の蛍光チャネルにおける複数の標的の同時検出を提供することができる融解曲線分析のより高速な代替手段に対する高い需要が存在する。本発明のＬＯＣＳ構造の融解温度（Ｔｍ）は、事前に決定され、一定である（すなわち、標的配列または濃度によって影響されない）ため、温度勾配全体を通した傾斜を必要としない。各ＬＯＣＳ構造は、その特定のＴｍでの単一の蛍光測定のみを必要とし、完全な温度勾配を実行する必要性がないため、より高速な結果が得られるまでの時間を促進するため、上記の制限を克服する。
さらに、融解曲線分析は、典型的には結果の解釈のために熟練した担当者による解釈または専用ソフトウェアの使用を必要とする。
本発明のいくつかの実施形態では、ＰＣＲの完了後の単一温度の蛍光測定の使用は、融解曲線の主観的な解釈の必要性を排除し、標的の存在または不在の客観的な決定を促進する。
本発明の他の実施形態では、分析は、ＰＣＲ内の限定された数の点、例えば、ＰＣＲ後の蛍光取得のみを必要としてもよく、これは、各サイクルでの取得の必要性を排除する。したがって、これらの実施形態は、結果が得られるまでの時間を低減することができる非常に迅速なサイクリングプロトコルに非常に適している。
完全に一致したプローブと不一致のプローブとの区別を促進するための２つの温度取得を含む、ＰＣＲ中の複数の温度での蛍光取得を伴ういくつかの方法が、説明されている。加えて、２つの標的が存在し、単一のチャネルから検出される場合、いくつかのプロトコルは、各ＰＣＲサイクル後に複数の取得温度を使用して、各標的の濃度を定量化する。２つの標的を同時に定量化する他の方法は、各ＰＣＲサイクルの終了時に完全な融解曲線を実行することによって達成される。
本発明のＬＯＣＳ構造は、これらの既存の分析方法のほとんどおよび潜在的には全てと互換性があり得る。
本発明は、少なくとも部分的には、以下の実施形態１～５９に関連する。
実施形態１．試料中の第１および第２の標的の存在または不在を決定するための方法であって、
－第１および／もしくは第２の標的またはそれらのアンプリコンを含むと推定される試料またはその誘導体を、
第１および第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドであって、閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの各々が、ハイブリダイズしていないヌクレオチドの閉鎖一本鎖ループ部分に接続されたハイブリダイズしたヌクレオチドの二本鎖ステム部分を含み、
第１および第２の閉ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分における、ハイブリダイズしたヌクレオチドの数および／またはハイブリダイズしたヌクレオチドの配列が、異なり、
二本鎖ステム部分の各々が、一方の鎖に接続されたフルオロフォア分子、および反対の鎖に接続されたクエンチャー分子を含む、第１および第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチド、ならびに
標的またはそのアンプリコンと接触した場合にのみ、第１および第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの一本鎖ループ部分を切断または分解することができる酵素と接触させることによって、反応混合物を調製することと、
－反応混合物を、
酵素が、第１および第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分の切断または分解を誘導して、それにより、第１および第２の開放ステムループオリゴヌクレオチドを生成するのに好適な条件下で処理することと、
－反応混合物またはその誘導体を、第１の温度であって、その温度で、第１の開放ステムループオリゴヌクレオチドの二本鎖ステム部分の鎖が解離して、それにより、第１の開放ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のフルオロフォアおよびクエンチャー分子の空間的分離を促進し、第１の検出可能なシグナルを提供する、第１の温度で、ならびに
第２の温度であって、その温度で、第２の開放ステムループオリゴヌクレオチドの二本鎖ステム部分の鎖が解離して、それにより、第２の開放ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のフルオロフォアおよびクエンチャー分子の空間的分離を促進し、第２の検出可能な蛍光シグナルを提供する、第２の温度で、処理することであって、
第１の温度が、第２の温度とは異なり、
第１の開放ステムループオリゴヌクレオチドのフルオロフォアおよび第２の開放ステムループオリゴヌクレオチドのフルオロフォアが、同じ可視スペクトルの色領域で発光する、処理することによって、該第１および第２の開放オリゴヌクレオチドの存在または不在を検出することとを含み、
第１の温度でのシグナルの検出が、試料中の第１の標的の存在を示し、第１の温度でのシグナルの検出の失敗が、試料中の第１の標的の不在を示し、
第２の温度でのシグナルの検出が、試料中の第２の標的の存在を示し、第２の温度でのシグナルの検出の失敗が、試料中の第２の標的の不在を示す、方法。
実施形態２．酵素が、多成分核酸酵素（ＭＮＡザイム）を含み、反応混合物の該処理が、反応混合物を、
第１の多成分核酸酵素（ＭＮＡザイム）を第１の標的またはそのアンプリコンに結合させ、該第１のＭＮＡザイムの基質アームを第１の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分にハイブリダイズして、それにより、第１のＭＮＡザイムが、第１の開放ステムループオリゴヌクレオチドを形成することによって、第１の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分の該切断を促進するのに好適な条件下で処理することを含む、実施形態１に記載の方法。
実施形態３．標的が、第１のＭＮＡザイムのセンサーアームにハイブリダイズして、それにより、第１のＭＮＡザイムの集合を促進することができる核酸配列またはそのアンプリコンである、実施形態２に記載の方法。
実施形態４．
－標的が、分析物、タンパク質、化合物、または分子であり、
－酵素が、第１の標的に結合することができるアプタマーを有する酵素を含み、
－アプタマーへの第１の標的の結合が、アプタマーを有する酵素を触媒活性にすることができる、実施形態１に記載の方法。
実施形態５．アプタマーを有する酵素が、アプタ－ＤＮＡザイム、アプタ－リボザイム、アプタ－ＭＮＡザイムのうちのいずれか１つ以上を含む、実施形態４に記載の方法。
実施形態６．
－標的が、分析物、タンパク質、化合物、または分子であり、
－反応混合物が、第１のＭＮＡザイムのセンサーアームにハイブリダイズして、それにより、第１のＭＮＡザイムの集合を促進することができるオリゴヌクレオチド配列をさらに含み、
－第１のＭＮＡザイムが、第１の標的に結合することができるアプタマー配列を含み、
－アプタマーへの標的の結合が、第１のＭＮＡザイムを触媒活性にすることができる、実施形態２、４、または５のいずれか一項に記載の方法。
実施形態７．酵素が、制限エンドヌクレアーゼを含み、反応混合物の該処理が、
反応混合物を、第１の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分への第１の標的またはそのアンプリコンのハイブリダイゼーションに好適な条件下で処理して、第１の制限エンドヌクレアーゼが会合する二本鎖配列を形成し、それにより、第１の開放ステムループオリゴヌクレオチドを形成する第１の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分の該切断を促進する、実施形態１～６のいずれか一項に記載の方法。
実施形態８．制限エンドヌクレアーゼが、第１の制限エンドヌクレアーゼの該二本鎖配列のループ鎖と会合し、それを切断することができるニッキングエンドヌクレアーゼである、実施形態７に記載の方法。
実施形態９．酵素が、エキソヌクレアーゼ活性（例えば、ポリメラーゼ酵素、エキソヌクレアーゼ）を含み、反応混合物の該処理が、
反応混合物を、
－第１の標的またはそのアンプリコンを、第１の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分にハイブリダイズして、第１の標的またはそのアンプリコンを含む第１の二本鎖配列を形成すること、
－第１のプライマーオリゴヌクレオチドを、第１の標的またはそのアンプリコンにハイブリダイズして、第１の標的またはそのアンプリコンを含む第１の二本鎖配列に対して上流（５’）に位置する第２の二本鎖配列を形成すること、
－エキソヌクレアーゼ活性を含む第１の酵素を、第１のプライマーオリゴヌクレオチドの末端にあるか、またはそれに隣接する第１の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分と会合させること、および
－エキソヌクレアーゼ活性を含む第１の酵素を触媒活性させ、それにより、第１の標的またはアンプリコンを含む第１の二本鎖配列のループ部分の分解を促進し、第１の開放ステムループオリゴヌクレオチドを形成することに好適な条件下で処理することを含む、実施形態１～８のいずれか一項に記載の方法。
実施形態１０．酵素が、エキソヌクレアーゼ活性を含み、反応混合物の該処理が、
反応混合物を、
－第１の標的またはそのアンプリコンを、第１の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分にハイブリダイズして、第１の標的またはそのアンプリコンを含む第１の二本鎖配列を形成すること、
－エキソヌクレアーゼ活性を含む第１の酵素を、第１の標的またはそのアンプリコンを含む第１の二本鎖配列と会合させること、および
－エキソヌクレアーゼ活性を含む第１の酵素を触媒活性させ、それにより、第１の標的またはアンプリコンを含む第１の二本鎖配列のループ部分の分解を促進し、第１の開放ステムループオリゴヌクレオチドを形成することに好適な条件下で処理することを含む、実施形態１～９のいずれか一項に記載の方法。
実施形態１１．酵素が、触媒活性に第１の補因子を必要とするＤＮＡザイムおよび／またはリボザイムを含み、反応混合物の該処理が、反応混合物を、
－該第１の補因子をＤＮＡザイムに結合させ、かつ／または該第１の補因子をリボザイムに結合させて、ＤＮＡザイムおよび／またはリボザイムを触媒活性にすること、
－ＤＮＡザイムおよび／またはリボザイムを、第１の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分にハイブリダイズすること、
－ＤＮＡザイムおよび／またはリボザイムを触媒活性させ、それにより、第１の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分の切断を促進し、第１の開放ステムループオリゴヌクレオチドを形成することに好適な条件下で処理することを含み、
第１の標的が、第１の補因子である、実施形態１～１０のいずれか一項に記載の方法。
実施形態１２．第１の補因子が、金属イオン（例えば、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃａ２＋、Ｐｂ２＋）である、実施形態１１に記載の方法。
実施形態１３．該処理が、反応混合物を、
－第２のＭＮＡザイムを第２の標的またはそのアンプリコンに結合させ、該第２のＭＮＡザイムの基質アームを第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分にハイブリダイズして、それにより、第２のＭＮＡザイムが、第２の開放ステムループオリゴヌクレオチドを形成することによって、第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分の該切断を促進すること、
－第２の標的またはそのアンプリコンを第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分にハイブリダイズして、第２の制限エンドヌクレアーゼが二本鎖配列と会合する二本鎖配列を形成し、それにより、第２の開放ステムループオリゴヌクレオチドを形成する第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分の該切断を促進すること、
－第２の標的またはそのアンプリコンを、第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分にハイブリダイズして、第２の標的またはそのアンプリコンを含む第２の二本鎖配列を形成し、
第２のプライマーオリゴヌクレオチドを、第２の標的またはそのアンプリコンにハイブリダイズして、第２の標的またはそのアンプリコンを含む第２の二本鎖配列に対して上流（５’）に位置する第２の二本鎖配列を形成し、
エキソヌクレアーゼ活性を含む第２の酵素を、第２のプライマーオリゴヌクレオチドの末端にあるか、またはそれに隣接する第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分と会合させ、
エキソヌクレアーゼ活性を含む第２の酵素を触媒活性させ、それにより、第２の標的またはアンプリコンを含む第２の二本鎖配列のループ部分の分解を促進し、第２の開放ステムループオリゴヌクレオチドを形成すること、
－第２の標的またはそのアンプリコンを、第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分にハイブリダイズして、第２の標的またはそのアンプリコンを含む第２の二本鎖配列を形成し、
エキソヌクレアーゼ活性を含む第２の酵素を、第２の標的またはそのアンプリコンを含む第２の二本鎖配列と会合させ、
エキソヌクレアーゼ活性を含む第２の酵素を触媒活性させ、それにより、第２の標的またはアンプリコンを含む第２の二本鎖配列のループ部分の分解を促進し、第２の開放ステムループオリゴヌクレオチドを形成すること、
－第２の補因子をＤＮＡザイムに結合させ、かつ／または第２の補因子をリボザイムに結合させて、ＤＮＡザイムおよび／またはリボザイムを触媒活性にし、
ＤＮＡザイムおよび／またはリボザイムを、第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分にハイブリダイズし、
ＤＮＡザイムおよび／またはリボザイムを触媒活性させ、それにより、第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分の切断を促進し、第２の開放ステムループオリゴヌクレオチドを形成することのうちのいずれか１つ以上に好適な条件下で処理することをさらに含み、
第２の標的が、第２の補因子である、実施形態１～１２のいずれか一項に記載の方法。
実施形態１４．第２の補因子が、金属イオン（例えば、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃａ２＋、Ｐｂ２＋）である、実施形態１３に記載の方法。
実施形態１５．第２の制限エンドヌクレアーゼが、第２の標的またはそのアンプリコンを含む該二本鎖配列のループ鎖と会合し、それを切断することができるニッキングエンドヌクレアーゼである、実施形態１３に記載の方法。
実施形態１６．第１および第２の制限エンドヌクレアーゼが、異なる種類の制限エンドヌクレアーゼである、実施形態１５に記載の方法。
実施形態１７．第１および第２の制限エンドヌクレアーゼが、同じ種類の制限エンドヌクレアーゼである、実施形態１５に記載の方法。
実施形態１８．第２の標的が、第２のＭＮＡザイムのセンサーアームにハイブリダイズして、それにより、第２のＭＮＡザイムの集合を促進することができる核酸配列またはそのアンプリコンである、実施形態１３に記載の方法。
実施形態１９．
－第２の標的が、分析物、タンパク質、化合物、または分子であり、
－酵素が、第２の標的に結合することができるアプタマーを有する酵素を含み、
－アプタマーへの第２の標的の結合が、アプタマーを有する酵素を触媒活性にすることができる、実施形態１３に記載の方法。
実施形態２０．アプタマーを有する酵素が、アプタ－ＤＮＡザイム、アプタ－リボザイム、アプタ－ＭＮＡザイムのうちのいずれか１つ以上を含む、実施形態１９に記載の方法。
実施形態２１．
－第２の標的が、分析物、タンパク質、化合物、または分子であり、
－反応混合物が、第２のＭＮＡザイムのセンサーアームにハイブリダイズして、それにより、第２のＭＮＡザイムの集合を促進することができるオリゴヌクレオチド配列をさらに含み、
－第２のＭＮＡザイムが、第２の標的に結合することができるアプタマー配列を含み、
－第２のＭＮＡザイムのアプタマー配列への第２の標的の結合が、第２のＭＮＡザイムのアプタマーに結合した阻害分子の除去を促進することによって、第２のＭＮＡザイムを触媒活性にすることができる、実施形態１３、１９、または２０に記載の方法。
実施形態２２．第１の閉鎖および開放ステムループオリゴヌクレオチドのフルオロフォアが、第２の閉鎖および開放ステムループオリゴヌクレオチドのフルオロフォアと同じである、実施形態１～２１のいずれか一項に記載の方法。
実施形態２３．
－反応混合物が、該第１および第２のＭＮＡザイムを含み、
－第１のＭＮＡザイムの基質アームにハイブリダイズすることができる第１の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分の配列が、第２のＭＮＡザイムの基質アームにハイブリダイズすることができる第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分の配列とは異なる、実施形態１３～２２のいずれか一項に記載の方法。
実施形態２４．第１の閉鎖および開放ステムループオリゴヌクレオチドのフルオロフォアならびに第２の閉鎖および開放ステムループオリゴヌクレオチドのフルオロフォアが、デバイスの単一の蛍光発光チャネルにおいて検出可能である、実施形態１～２３のいずれか一項に記載の方法。
実施形態２５．試料中の第３の標的またはそのアンプリコンの存在または不在を決定することであって、
－試料またはその誘導体を含む反応混合物を、
第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドであって、第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドが、ハイブリダイズしていないヌクレオチドの閉鎖一本鎖ループ部分に接続されたハイブリダイズしたヌクレオチドの二本鎖ステム部分を含み、
第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分における、ハイブリダイズしたヌクレオチドの数および／またはハイブリダイズしたヌクレオチドの配列が、第１および第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のものとは異なり、
二本鎖ステム部分が、一方の鎖に接続されたフルオロフォア分子、および反対の鎖に接続されたクエンチャー分子を含む、第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチド、ならびに
標的またはそのアンプリコンと接触した場合にのみ、第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの一本鎖ループ部分を切断または分解することができる酵素と接触させることと、
－反応混合物を、酵素が、第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分の切断または分解を誘導して、それにより、第３の開放ステムループオリゴヌクレオチドを
生成するのに好適な条件下で処理することと、
－反応混合物またはその誘導体を、
第３の温度であって、その温度で、第３の開放ステムループオリゴヌクレオチドの二本鎖ステム部分の鎖が解離して、それにより、第３の開放ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のフルオロフォアおよびクエンチャー分子の空間的分離を促進し、第３の検出可能なシグナルを提供する、第３の温度で、処理することによって、第３のオリゴヌクレオチドの存在または不在を検出することとを含み、
第３の温度が、第１および第２の温度とは異なり、
第３の温度でのシグナルの検出が、試料中の第３の標的の存在を示し、第３の温度でのシグナルの検出の失敗が、試料中の第３の標的の不在を示す、実施形態１～２４のいずれか一項に記載の方法。
実施形態２６．試料中の第３の標的またはそのアンプリコンの存在または不在を決定することであって、
－試料またはその誘導体を含む反応混合物を、
第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドであって、第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドが、ハイブリダイズしていないヌクレオチドの閉鎖一本鎖ループ部分に接続されたハイブリダイズしたヌクレオチドの二本鎖ステム部分を含み、
第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分における、ハイブリダイズしたヌクレオチドの数および／またはハイブリダイズしたヌクレオチドの配列が、第１または第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のものと同じであり、
二本鎖ステム部分が、一方の鎖に接続されたフルオロフォア分子、および反対の鎖に接続されたクエンチャー分子を含み、第３の開放ステムループオリゴヌクレオチドに接続されたフルオロフォア分子が、第１および／または第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのフルオロフォアとは異なる可視スペクトルの色領域で発光する、第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチド、ならびに
標的またはそのアンプリコンと接触した場合にのみ、第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの一本鎖ループ部分を切断または分解することができる酵素と接触させることと、
－反応混合物を、酵素が、第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分の切断または分解を誘導して、それにより、第３の開放ステムループオリゴヌクレオチドを生成するのに好適な条件下で処理することと、
－反応混合物またはその誘導体を、
第３の温度であって、その温度で、第３の開放ステムループオリゴヌクレオチドの二本鎖ステム部分の鎖が解離して、それにより、第３の開放ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のフルオロフォアおよびクエンチャー分子の空間的分離を促進し、第３の検出可能なシグナルを提供する、第３の温度で、処理することによって、第３のオリゴヌクレオチドの存在または不在を検出することとを含み、
第３の温度でのシグナルの検出が、試料中の第３の標的の存在を示し、第３の温度でのシグナルの検出の失敗が、試料中の第３の標的の不在を示す、実施形態１～２４のいずれか一項に記載の方法。
実施形態２７．第３の温度が、第１および／または第２の温度とは異なる、実施形態２６に記載の方法。
実施形態２８．方法が、反応混合物を、
－第３のＭＮＡザイムを第３の標的またはそのアンプリコンに結合させ、該第３のＭＮＡザイムの基質アームを第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分にハイブリダイズして、それにより、第３のＭＮＡザイムが、第３の開放ステムループオリゴヌクレオチドを形成することによって、第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのルー
プ部分の該切断を促進すること、
－第３の標的またはそのアンプリコンを第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分にハイブリダイズして、第３の制限エンドヌクレアーゼが二本鎖配列と会合する二本鎖配列を形成し、それにより、第３の開放ステムループオリゴヌクレオチドを形成する第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分の該切断を促進すること、
－第３の標的またはそのアンプリコンを、第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分にハイブリダイズして、第３の標的またはそのアンプリコンを含む第３の二本鎖配列を形成し、
第３のプライマーオリゴヌクレオチドを、第３の標的またはそのアンプリコンにハイブリダイズして、第３の標的またはそのアンプリコンを含む第３の二本鎖配列に対して上流（５’）に位置する第３の二本鎖配列を形成し、エキソヌクレアーゼ活性を含む第３の酵素を、第３のプライマーオリゴヌクレオチドの末端にあるか、またはそれに隣接する第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分と会合させ、
エキソヌクレアーゼ活性を含む第３の酵素を触媒活性させ、それにより、第３の標的またはアンプリコンを含む第３の二本鎖配列のループ部分の分解を促進し、第３の開放ステムループオリゴヌクレオチドを形成すること、
－第３の標的またはそのアンプリコンを、第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分にハイブリダイズして、第３の標的またはそのアンプリコンを含む第３の二本鎖配列を形成し、
エキソヌクレアーゼ活性を含む第３の酵素を、第３の標的またはそのアンプリコンを含む第３の二本鎖配列と会合させ、
エキソヌクレアーゼ活性を含む第３の酵素を触媒活性させ、それにより、第３の標的またはアンプリコンを含む第３の二本鎖配列のループ部分の分解を促進し、第３の開放ステムループオリゴヌクレオチドを形成すること、
－第３の補因子をＤＮＡザイムに結合させ、かつ／または第３の補因子をリボザイムに結合させて、ＤＮＡザイムおよび／またはリボザイムを触媒活性にし、
ＤＮＡザイムおよび／またはリボザイムを、第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分にハイブリダイズし、
ＤＮＡザイムおよび／またはリボザイムを触媒活性させ、それにより、第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分の切断を促進し、第３の開放ステムループオリゴヌクレオチドを形成することのうちのいずれか１つ以上に好適な条件下で処理することを含み、
第３の標的が、第３の補因子である、実施形態２５～２７のいずれか一項に記載の方法。
実施形態２９．補因子が、金属イオン（例えば、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃａ２＋、Ｐｂ２＋）である、実施形態２８に記載の方法。
実施形態３０．制限エンドヌクレアーゼが、第３の標的またはそのアンプリコンを含む該二本鎖配列のループ鎖と会合し、それを切断することができるニッキングエンドヌクレアーゼである、実施形態２８の方法。
実施形態３１．第３の標的が、第３のＭＮＡザイムのセンサーアームにハイブリダイズして、それにより第３のＭＮＡザイムの集合を促進することができる核酸配列またはそのアンプリコンである、実施形態２８に記載の方法。
実施形態３２．
－標的が、分析物、タンパク質、化合物、または分子であり、
－酵素が、第３の標的に結合することができるアプタマーを有する酵素を含み、
－アプタマーへの第３の標的の結合が、アプタマーを有する酵素を触媒活性にすること
ができる、実施形態２８に記載の方法。
実施形態３３．アプタマーを有する酵素が、アプタ－ＤＮＡザイム、アプタ－リボザイム、アプタ－ＭＮＡザイムのうちのいずれか１つ以上を含む、実施形態３２に記載の方法。
実施形態３４．
－第３の標的が、分析物、タンパク質、化合物、または分子であり、
－反応混合物が、第３のＭＮＡザイムのセンサーアームにハイブリダイズして、それにより、第３のＭＮＡザイムの集合を促進することができるオリゴヌクレオチド配列をさらに含み、
－第３のＭＮＡザイムが、第３の標的に結合することができるアプタマー配列を含み、
－第３のＭＮＡザイムのアプタマー配列への第３の標的の結合が、第３のＭＮＡザイムのアプタマーに結合した阻害分子の除去を促進することによって、第３のＭＮＡザイムを触媒活性にすることができる、実施形態２８に記載の方法。
実施形態３５．
－反応混合物が、該第３のＭＮＡザイム、ならびに該第１および第２のＭＮＡザイムのいずれかまたは両方を含み、
－第３のＭＮＡザイムの基質アームにハイブリダイズすることができる第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分の配列が、
第１のＭＮＡザイムの基質アームにハイブリダイズすることができる第１の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分の配列、および／または
第１のＭＮＡザイムの基質アームにハイブリダイズすることができる第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分の配列とは異なる、実施形態２８、または３０～３４のいずれか一項に記載の方法。
実施形態３６．
第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分における、ハイブリダイズしたヌクレオチドの数および／またはハイブリダイズしたヌクレオチドの配列が、第１および第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のものとは異なり、
－第３の温度が、第１および第２の温度とは異なり、
－第３の閉鎖および開放ステムループオリゴヌクレオチドのフルオロフォアが、第１および第２の閉鎖および開放ステムループオリゴヌクレオチドのフルオロフォアと同じ可視スペクトルの色領域で発光する、実施形態２５、または実施形態２８～３５のいずれか一項に記載の方法。
実施形態３７．第３の閉鎖および開放ステムループオリゴヌクレオチドのフルオロフォアが、第１および／または第２の閉鎖および開放ステムループオリゴヌクレオチドのフルオロフォアと同じである、実施形態２５、または実施形態２８～３６のいずれか一項に記載の方法。
実施形態３８．第３の閉鎖および開放ステムループオリゴヌクレオチドのフルオロフォア、ならびに第１の閉鎖および開放ステムループオリゴヌクレオチドのフルオロフォアおよび／または第２の閉鎖および開放オリゴヌクレオチドのフルオロフォアが、デバイスの同じ蛍光発光チャネルを使用して検出可能である、実施形態３７に記載の方法。
実施形態３９．
－第１の閉鎖および開放ステムループオリゴヌクレオチドのフルオロフォアが、第２の閉鎖および開放ステムループオリゴヌクレオチドのフルオロフォアと同じ可視スペクトルの色領域で発光し、
－第３の閉鎖および開放ステムループオリゴヌクレオチドのフルオロフォアが、第１お
よび第２の閉鎖および開放ステムループオリゴヌクレオチドのフルオロフォアとは異なる可視スペクトルの色領域で発光する、実施形態２５～３５、または３６のいずれか一項に記載の方法。
実施形態４０．第３の温度が、第１の温度および／または第２の温度と１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、２０℃、２５℃、３０℃、３５℃、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃、７０℃、７５℃、８０℃超だけ異なる、実施形態２５～３９のいずれか一項に記載の方法。
実施形態４１．融解曲線分析が、シグナルの任意の該検出またはシグナルの任意の該検出の失敗に使用される、実施形態１～４０のいずれか一項に記載の方法。
実施形態４２．第１の温度が、第２の温度と１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、２０℃、２５℃、３０℃、３５℃、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃、７０℃、７５℃、８０℃超だけ異なる、実施形態１～４１のいずれか一項に記載の方法。
実施形態４３．任意のその該アンプリコンが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、ヘリカーゼ依存増幅（ＨＤＡ）、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）、ループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、自家持続配列複製（３ＳＲ）、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）、および／または逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）のうちのいずれか１つ以上によって生成される、実施形態１～４２のいずれか一項に記載の方法。
実施形態４４．試料が、対象から得られた生物学的試料である、実施形態１～４３のいずれか一項に記載の方法。
実施形態４５．方法が、インビトロで実行される、実施形態１～４３のいずれか一項に記載の方法。
実施形態４６．方法が、エクスビボで実行される、実施形態１～４３のいずれか一項に記載の方法。
実施形態４７．組成物であって、
第１および第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドであって、閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの各々が、ハイブリダイズしていないヌクレオチドの一本鎖ループ部分に接続されたハイブリダイズしたヌクレオチドの二本鎖ステム部分を含み、
第１および第２の閉ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分における、ハイブリダイズしたヌクレオチドの数および／またはハイブリダイズしたヌクレオチドの配列が、異なり、
二本鎖ステム部分の各々が、一方の鎖に接続されたフルオロフォア分子、および反対の鎖に接続されたクエンチャー分子を含む、第１および第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドを含み、
フルオロフォア分子が、同じ可視スペクトルの色領域で発光し、第１の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの二本鎖ステム部分の融解温度（Ｔｍ）が、第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの二本鎖ステム部分のＴｍとは異なる、組成物。
実施形態４８．第１の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの一本鎖ループ部分が、第２
の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの一本鎖ループ部分の配列とは異なる、実施形態４７に記載の組成物。
実施形態４９．
第１の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの閉鎖一本鎖ループ部分にハイブリダイズすることができる基質アームを含む、第１のＭＮＡザイム、および
第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの一本鎖ループ部分にハイブリダイズすることができる基質アームを含む、第２のＭＮＡザイムをさらに含む、実施形態４７または実施形態４８に記載の組成物。
実施形態５０．
第１のＭＮＡザイムの基質アームが、第１の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの一本鎖ループ部分にハイブリダイズし、
第２のＭＮＡザイムの基質アームが、第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの一本鎖ループ部分にハイブリダイズする、実施形態４９に記載の組成物。
実施形態５１．
第１および／または第２のＭＮＡザイムが、標的分析物、タンパク質、化合物、または分子に結合したアプタマー配列、およびオリゴヌクレオチド配列にハイブリダイズしたセンサーアームを含み、
第１のＭＮＡザイムが、第２のＭＮＡザイムとは異なる標的を検出するように設計されている、実施形態５０に記載の組成物。
実施形態５２．
第１および／または第２のＭＮＡザイムが、標的配列にハイブリダイズしたセンサーアームを含み、第１のＭＮＡザイムが、第２のＭＮＡザイムとは異なる標的を検出するように設計されている、実施形態５０に記載の組成物。
実施形態５３．
第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの一本鎖ループ部分の配列とは異なる、第１の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの該一本鎖ループ部分にハイブリダイズし、それにより、該第１のオリゴヌクレオチドを含む二本鎖配列を形成する、第１のオリゴヌクレオチド配列、
第１の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの一本鎖ループ部分の配列とは異なる、第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの該一本鎖ループ部分にハイブリダイズし、それにより、該第２のオリゴヌクレオチドを含む二本鎖配列を形成する、第２のオリゴヌクレオチド配列、
該第１のオリゴヌクレオチドを含む二本鎖配列に関連し、それを切断することができる、制限エンドヌクレアーゼ、および／または
該第２のオリゴヌクレオチドを含む二本鎖配列に関連し、それを切断することができる、制限エンドヌクレアーゼをさらに含む、実施形態４７～５２のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態５４．
第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの一本鎖ループ部分の配列とは異なる、第１の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの該一本鎖ループ部分にハイブリダイズし、それにより、該第１の標的オリゴヌクレオチドを含む第１の二本鎖配列を形成する、第１の標的オリゴヌクレオチド配列を含む、第１の二本鎖配列、
第１の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの一本鎖ループ部分の配列とは異なる、第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの該一本鎖ループ部分にハイブリダイズし、そ
れにより、該第２の標的オリゴヌクレオチドを含む二本鎖配列を形成する、第２の標的オリゴヌクレオチド配列を含む、第２の二本鎖配列、
該第１の二本鎖配列に対して上流（５’）の第１の標的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズした第１のプライマーオリゴヌクレオチド、および第１のプライマーオリゴヌクレオチドの末端にあるか、もしくはそれに隣接する第１の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分に関連するエキソヌクレアーゼ活性（例えば、ポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼ）を含む第１の酵素、ならびに／または
該第２の二本鎖配列第２のに対して上流（５’）の第２の標的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズした第２のプライマーオリゴヌクレオチド、および第２のプライマーオリゴヌクレオチドの末端にあるか、もしくはそれに隣接する第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分に関連するエキソヌクレアーゼ活性（例えば、ポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼ）を含む第２の酵素をさらに含む、実施形態４７～５３のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態５５．
第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの一本鎖ループ部分の配列とは異なる、閉鎖第１のステムループオリゴヌクレオチドの該一本鎖ループ部分にハイブリダイズし、それにより、該第１の標的オリゴヌクレオチドを含む第１の二本鎖配列を形成する、第１の標的オリゴヌクレオチド配列を含む、第１の二本鎖配列、
第１の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの一本鎖ループ部分の配列とは異なる、第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの該一本鎖ループ部分にハイブリダイズし、それにより、該第２の標的オリゴヌクレオチドを含む第２の二本鎖配列を形成する、第２の標的オリゴヌクレオチド配列を含む、第２の二本鎖配列をさらに含み、
エキソヌクレアーゼ活性を含む第１の酵素が、第１の二本鎖配列に関連し、エキソヌクレアーゼ活性を含む第２の酵素が、第２の二本鎖配列に関連する、実施形態４７～５４のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態５６．
第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの一本鎖ループ部分の配列とは異なる、第１の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分にハイブリダイズした第１のＤＮＡザイムおよび／または第１のリボザイム、
第１の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの一本鎖ループ部分の配列とは異なる、第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分にハイブリダイズした第２のＤＮＡザイムおよび／または第２のリボザイム、
各該ＤＮＡザイムを触媒活性にすることができ、故にループ部分にハイブリダイズした任意の該ＤＮＡザイムの切断活性を誘導する、各該ＤＮＡザイムの補因子、
各該リボザイムを触媒活性にすることができ、故にループ部分にハイブリダイズした任意の該リボザイムの切断活性を誘導する、各該リボザイムの補因子をさらに含む、実施形態４７～５５のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態５７．
第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドであって、第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドが、ハイブリダイズしていないヌクレオチドの一本鎖ループ部分に接続されたハイブリダイズしたヌクレオチドの二本鎖ステム部分を含み、
第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分における、ハイブリダイズしたヌクレオチドの数および／またはハイブリダイズしたヌクレオチドの配列が、第１および第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのものとは異なり、
第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの二本鎖ステム部分が、一方の鎖に接続されたフルオロフォア分子、および反対の鎖に接続されたクエンチャー分子を含み、第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのフルオロフォア分子が、第１および第２の閉鎖ス
テムループオリゴヌクレオチドのフルオロフォア分子と比較して、異なる可視スペクトルの色領域で発光する、第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドをさらに含む、実施形態４７～５６のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態５８．
第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドであって、第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドが、ハイブリダイズしていないヌクレオチドの一本鎖ループ部分に接続されたハイブリダイズしたヌクレオチドの二本鎖ステム部分を含み、
第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分における、ハイブリダイズしたヌクレオチドの数および／またはハイブリダイズしたヌクレオチドの配列が、第１および第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのものとは異なり、
第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの二本鎖ステム部分が、一方の鎖に接続されたフルオロフォア分子、および反対の鎖に接続されたクエンチャー分子を含み、第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのフルオロフォア分子が、第１および第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのフルオロフォア分子と比較して、同じ可視スペクトルの色領域で発光する、第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドをさらに含む、実施形態４７～５６のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態５９．
第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドであって、第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドが、ハイブリダイズしていないヌクレオチドの一本鎖ループ部分に接続されたハイブリダイズしたヌクレオチドの二本鎖ステム部分を含み、
第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分における、ハイブリダイズしたヌクレオチドの数および／またはハイブリダイズしたヌクレオチドの配列が、第１または第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのものと同じであり、
第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの二本鎖ステム部分が、一方の鎖に接続されたフルオロフォア分子、および反対の鎖に接続されたクエンチャー分子を含み、第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのフルオロフォア分子が、第１および第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのフルオロフォア分子と比較して、異なる可視スペクトルの色領域で発光する、第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドをさらに含む、実施形態４７～５６のいずれか一項に記載の組成物。
本発明はまた、以下に列挙される実施形態１～８１にも関連する。
実施形態１．試料中の第１および第２の標的の存在または不在を決定するための方法であって、
（ａ）第１および／もしくは第２の標的またはそれらのアンプリコンを含むと推定される試料またはその誘導体を、
第１および第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドであって、閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの各々が、ハイブリダイズしていないヌクレオチドの閉鎖一本鎖ループ部分に接続されたハイブリダイズしたヌクレオチドの二本鎖ステム部分を含み、
第１および第２の閉ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分における、ハイブリダイズしたヌクレオチドの数および／またはハイブリダイズしたヌクレオチドの配列が、異なる、第１および第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチド、ならびに
標的またはそのアンプリコンと接触した場合にのみ、第１および第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの一本鎖ループ部分を切断または分解することができる酵素と接触させることによって、反応混合物を調製することと、
（ｂ）反応混合物を、
－酵素が、第１および第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分の切断または分解を誘導して、それにより、第１および第２の開放ステムループオリゴヌクレオチドを生成するのに好適な条件下、
－第１の温度であって、その温度以上で、第１の開放ステムループオリゴヌクレオチドの二本鎖ステム部分の鎖が解離して、それにより、第１の開放ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のフルオロフォアおよびクエンチャー分子の空間的分離を促進し、第１の検出可能な蛍光シグナルを提供する、第１の温度で、ならびに
－第２の温度であって、その温度以上で、第２の開放ステムループオリゴヌクレオチドの二本鎖ステム部分の鎖が解離して、それにより、第２の開放ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のフルオロフォアおよびクエンチャー分子の空間的分離を促進し、第２の検出可能な蛍光シグナルを提供する、第２の温度で、処理することであって、
第１の温度が、第２の温度よりも低く、
第１の開放ステムループオリゴヌクレオチドのフルオロフォアおよび第２の開放ステムループオリゴヌクレオチドのフルオロフォアが、同じ可視スペクトルの色領域で発光する、処理することと、
（ｃ）第２の温度以上の温度を含むか、またはそれからなる１つ以上の温度で、該第１および第２の蛍光シグナルのレベルを検出して、それにより、試料中の該標的の存在または不在を決定することとを含む、方法。
実施形態２．酵素が、多成分核酸酵素（ＭＮＡザイム）を含み、反応混合物の該処理が、反応混合物を、
第１の多成分核酸酵素（ＭＮＡザイム）を第１の標的またはそのアンプリコンに結合させ、該第１のＭＮＡザイムの基質アームを第１の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分にハイブリダイズして、それにより、第１のＭＮＡザイムが、第１の開放ステムループオリゴヌクレオチドを形成することによって、第１の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分の該切断を促進するのに好適な条件下で処理することを含む、実施形態１に記載の方法。
実施形態３．第１の標的が、第１のＭＮＡザイムのセンサーアームにハイブリダイズして、それにより、第１のＭＮＡザイムの集合を促進することができる核酸配列またはそのアンプリコンである、実施形態２に記載の方法。
実施形態４．
－第１の標的が、分析物、タンパク質、化合物、または分子であり、
－酵素が、第１の標的に結合することができるアプタマーを有する酵素を含み、
－アプタマーへの第１の標的の結合が、アプタマーを有する酵素を触媒活性にすることができる、実施形態１に記載の方法。
実施形態５．アプタマーを有する酵素が、アプタ－ＤＮＡザイム、アプタ－リボザイム、アプタ－ＭＮＡザイムのうちのいずれか１つ以上を含む、実施形態４に記載の方法。
実施形態６．
－第１の標的が、分析物、タンパク質、化合物、または分子であり、
－反応混合物が、第１のＭＮＡザイムのセンサーアームにハイブリダイズして、それにより、第１のＭＮＡザイムの集合を促進することができるオリゴヌクレオチド配列をさらに含み、
－第１のＭＮＡザイムが、第１の標的に結合することができるアプタマー配列を含み、
－アプタマーへの標的の結合が、第１のＭＮＡザイムを触媒活性にすることができる、実施形態２、４、または５のいずれか一項に記載の方法。
実施形態７．該閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドが、酵素による該切断または分解中に該標的またはそのアンプリコンにハイブリダイズしていない、実施形態１～６のいずれか一項に記載の方法。
実施形態８．酵素が、制限エンドヌクレアーゼを含み、反応混合物の該処理が、
反応混合物を、第１の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分への第１の標的またはそのアンプリコンのハイブリダイゼーションに好適な条件下で処理して、第１の制限エンドヌクレアーゼが会合する二本鎖配列を形成し、それにより、第１の開放ステムループオリゴヌクレオチドを形成する第１の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分の該切断を促進することを含む、実施形態１～６のいずれか一項に記載の方法。
実施形態９．制限エンドヌクレアーゼが、第１の制限エンドヌクレアーゼの該二本鎖配列のループ鎖と会合し、それを切断することができるニッキングエンドヌクレアーゼである、実施形態８に記載の方法。
実施形態１０．酵素が、エキソヌクレアーゼ活性（例えば、ポリメラーゼ酵素、エキソヌクレアーゼ）を含み、反応混合物の該処理が、
反応混合物を、
－第１の標的またはそのアンプリコンを、第１の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分にハイブリダイズして、第１の標的またはそのアンプリコンを含む第１の二本鎖配列を形成すること、
－第１のプライマーオリゴヌクレオチドを、第１の標的またはそのアンプリコンにハイブリダイズして、第１の標的またはそのアンプリコンを含む第１の二本鎖配列に対して上流（５’）に位置する第２の二本鎖配列を形成すること、
－エキソヌクレアーゼ活性を含む第１の酵素を、第１のプライマーオリゴヌクレオチドの末端にあるか、またはそれに隣接する第１の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分と会合させること、および
－エキソヌクレアーゼ活性を含む第１の酵素を触媒活性させ、それにより、第１の標的またはアンプリコンを含む第１の二本鎖配列のループ部分の分解を促進し、第１の開放ステムループオリゴヌクレオチドを形成することに好適な条件下で処理することを含む、実施形態１～６のいずれか一項に記載の方法。
実施形態１１．酵素が、エキソヌクレアーゼ活性を含み、反応混合物の該処理が、
反応混合物を、
－第１の標的またはそのアンプリコンを、第１の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分にハイブリダイズして、第１の標的またはそのアンプリコンを含む第１の二本鎖配列を形成すること、
－エキソヌクレアーゼ活性を含む第１の酵素を、第１の標的またはそのアンプリコンを含む第１の二本鎖配列と会合させること、および
－エキソヌクレアーゼ活性を含む第１の酵素を触媒活性させ、それにより、第１の標的またはアンプリコンを含む第１の二本鎖配列のループ部分の分解を促進し、第１の開放ステムループオリゴヌクレオチドを形成することに好適な条件下で処理することを含む、実施形態１～６のいずれか一項に記載の方法。
実施形態１２．酵素が、触媒活性に第１の補因子を必要とするＤＮＡザイムおよび／またはリボザイムを含み、反応混合物の該処理が、反応混合物を、
－該第１の補因子をＤＮＡザイムに結合させ、かつ／または該第１の補因子をリボザイムに結合させて、ＤＮＡザイムおよび／またはリボザイムを触媒活性にすること、
－ＤＮＡザイムおよび／またはリボザイムを、第１の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分にハイブリダイズすること、
－ＤＮＡザイムおよび／またはリボザイムを触媒活性させ、それにより、第１の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分の切断を促進し、第１の開放ステムループオリゴヌクレオチドを形成することに好適な条件下で処理することを含み、
第１の標的が、第１の補因子である、実施形態１～１１のいずれか一項に記載の方法。
実施形態１３．第１の補因子が、金属イオン（例えば、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃａ２＋、Ｐｂ２＋）である、実施形態１２に記載の方法。
実施形態１４．該処理が、反応混合物を、
－第２のＭＮＡザイムを第２の標的またはそのアンプリコンに結合させ、該第２のＭＮＡザイムの基質アームを第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分にハイブリダイズして、それにより、第２のＭＮＡザイムが、第２の開放ステムループオリゴヌクレオチドを形成することによって、第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分の該切断を促進すること、
－第２の標的またはそのアンプリコンを第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分にハイブリダイズして、第２の制限エンドヌクレアーゼが二本鎖配列と会合する二本鎖配列を形成し、それにより、第２の開放ステムループオリゴヌクレオチドを形成する第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分の該切断を促進すること、
－第２の標的またはそのアンプリコンを、第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分にハイブリダイズして、第２の標的またはそのアンプリコンを含む第２の二本鎖配列を形成し、
第２のプライマーオリゴヌクレオチドを、第２の標的またはそのアンプリコンにハイブリダイズして、第２の標的またはそのアンプリコンを含む第２の二本鎖配列に対して上流（５’）に位置する第２の二本鎖配列を形成し、
エキソヌクレアーゼ活性を含む第２の酵素を、第２のプライマーオリゴヌクレオチドの末端にあるか、またはそれに隣接する第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分と会合させ、
エキソヌクレアーゼ活性を含む第２の酵素を触媒活性させ、それにより、第２の標的またはアンプリコンを含む第２の二本鎖配列のループ部分の分解を促進し、第２の開放ステムループオリゴヌクレオチドを形成すること、
－第２の標的またはそのアンプリコンを、第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分にハイブリダイズして、第２の標的またはそのアンプリコンを含む第２の二本鎖配列を形成し、
エキソヌクレアーゼ活性を含む第２の酵素を、第２の標的またはそのアンプリコンを含む第２の二本鎖配列と会合させ、
エキソヌクレアーゼ活性を含む第２の酵素を触媒活性させ、それにより、第２の標的またはアンプリコンを含む第２の二本鎖配列のループ部分の分解を促進し、第２の開放ステムループオリゴヌクレオチドを形成すること、
－第２の補因子をＤＮＡザイムに結合させ、かつ／または第２の補因子をリボザイムに結合させて、ＤＮＡザイムおよび／またはリボザイムを触媒活性にし、
ＤＮＡザイムおよび／またはリボザイムを、第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分にハイブリダイズし、
ＤＮＡザイムおよび／またはリボザイムを触媒活性させ、それにより、第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分の切断を促進し、第２の開放ステムループオリゴヌクレオチドを形成することのうちのいずれか１つ以上に好適な条件下で処理することをさらに含み、
第２の標的が、第２の補因子である、実施形態１～１３のいずれか一項に記載の方法。
実施形態１５．第２の補因子が、金属イオン（例えば、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃａ２＋、Ｐｂ２＋）である、実施形態１４に記載の方法。
実施形態１６．第２の制限エンドヌクレアーゼが、第２の標的またはそのアンプリコンを含む該二本鎖配列のループ鎖と会合し、それを切断することができるニッキングエンドヌ
クレアーゼである、実施形態１４に記載の方法。
実施形態１７．第１および第２の制限エンドヌクレアーゼが、異なる種類の制限エンドヌクレアーゼである、実施形態１６に記載の方法。
実施形態１８．第１および第２の制限エンドヌクレアーゼが、同じ種類の制限エンドヌクレアーゼである、実施形態１６に記載の方法。
実施形態１９．第２の標的が、第２のＭＮＡザイムのセンサーアームにハイブリダイズして、それにより、第２のＭＮＡザイムの集合を促進することができる核酸配列またはそのアンプリコンである、実施形態１４に記載の方法。
実施形態２０．
－第２の標的が、分析物、タンパク質、化合物、または分子であり、
－酵素が、第２の標的に結合することができるアプタマーを有する酵素を含み、
－アプタマーへの第２の標的の結合が、アプタマーを有する酵素を触媒活性にすることができる、実施形態１４に記載の方法。
実施形態２１．アプタマーを有する酵素が、アプタ－ＤＮＡザイム、アプタ－リボザイム、アプタ－ＭＮＡザイムのうちのいずれか１つ以上を含む、実施形態２０に記載の方法。
実施形態２２．
－第２の標的が、分析物、タンパク質、化合物、または分子であり、
－反応混合物が、第２のＭＮＡザイムのセンサーアームにハイブリダイズして、それにより、第２のＭＮＡザイムの集合を促進することができるオリゴヌクレオチド配列をさらに含み、
－第２のＭＮＡザイムが、第２の標的に結合することができるアプタマー配列を含み、
－第２のＭＮＡザイムのアプタマー配列への第２の標的の結合が、第２のＭＮＡザイムのアプタマーに結合した阻害分子の除去を促進することによって、第２のＭＮＡザイムを触媒活性にすることができる、実施形態１４、２０、または２１に記載の方法。
実施形態２３．第１の閉鎖および開放ステムループオリゴヌクレオチドのフルオロフォアが、第２の閉鎖および開放ステムループオリゴヌクレオチドのフルオロフォアと同じである、実施形態１～２２のいずれか一項に記載の方法。
実施形態２４．
－反応混合物が、該第１および第２のＭＮＡザイムを含み、
－第１のＭＮＡザイムの基質アームにハイブリダイズすることができる第１の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分の配列が、第２のＭＮＡザイムの基質アームにハイブリダイズすることができる第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分の配列とは異なる、実施形態１４～２３のいずれか一項に記載の方法。
実施形態２５．第１の閉鎖および開放ステムループオリゴヌクレオチドのフルオロフォアならびに第２の閉鎖および開放ステムループオリゴヌクレオチドのフルオロフォアが、デバイスの単一の蛍光発光チャネルにおいて検出可能である、実施形態１～２４のいずれか一項に記載の方法。
実施形態２６．該酵素が、該標的またはそのアンプリコンのいずれの切断または分解も誘導しない、実施形態１～２５のいずれか一項に記載の方法。
実施形態２７．第１および第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドが各々、該二本鎖ステム部分および該一本鎖ループ部分からなる、実施形態１～２６のいずれか一項に記載の方法。
実施形態２８．試料中の第３の標的またはそのアンプリコンの存在または不在を決定することであって、
（ｄ）試料またはその誘導体を含む反応混合物を、
第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドであって、第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドが、ハイブリダイズしていないヌクレオチドの閉鎖一本鎖ループ部分に接続されたハイブリダイズしたヌクレオチドの二本鎖ステム部分を含み、
第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分における、ハイブリダイズしたヌクレオチドの数および／またはハイブリダイズしたヌクレオチドの配列が、第１および第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のものとは異なり、
二本鎖ステム部分が、一方の鎖に接続されたフルオロフォア分子、および反対の鎖に接続されたクエンチャー分子を含む、第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチド、ならびに
標的またはそのアンプリコンと接触した場合にのみ、第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの一本鎖ループ部分を切断または分解することができる酵素と接触させることと、
（ｅ）反応混合物を、
－酵素が、第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分の切断または分解を誘導して、それにより、第３の開放ステムループオリゴヌクレオチドを生成するのに好適な条件下、
－第３の温度であって、その温度以上で、第３の開放ステムループオリゴヌクレオチドの二本鎖ステム部分の鎖が解離して、それにより、第３の開放ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のフルオロフォアおよびクエンチャー分子の空間的分離を促進し、第３の検出可能な蛍光シグナルを提供する、第３の温度で、処理することであって、
第３の温度が、第１および第２の温度よりも高い、処理することと、
（ｆ）第３の温度以上の温度を含むか、またはそれからなる１つ以上の温度で、該第１、第２、および第３の蛍光シグナルのレベルを検出して、それにより、試料中の該標的の存在または不在を決定することとによって、決定することをさらに含む、実施形態１～２７のいずれか一項に記載の方法。
実施形態２９．試料中の第３の標的またはそのアンプリコンの存在または不在を決定することであって、
（ｄ）試料またはその誘導体を含む反応混合物を、
第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドであって、第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドが、ハイブリダイズしていないヌクレオチドの閉鎖一本鎖ループ部分に接続されたハイブリダイズしたヌクレオチドの二本鎖ステム部分を含み、
第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分における、ハイブリダイズしたヌクレオチドの数および／またはハイブリダイズしたヌクレオチドの配列が、第１または第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のものと同じであり、
二本鎖ステム部分が、一方の鎖に接続されたフルオロフォア分子、および反対の鎖に接続されたクエンチャー分子を含み、第３の開放ステムループオリゴヌクレオチドに接続されたフルオロフォア分子が、第１および／または第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのフルオロフォアとは異なる可視スペクトルの色領域で発光する、第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチド、ならびに
標的またはそのアンプリコンと接触した場合にのみ、第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの一本鎖ループ部分を切断または分解することができる酵素と接触させることと、
（ｅ）反応混合物を、
－酵素が、第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分の切断または分解を誘導して、それにより、第３の開放ステムループオリゴヌクレオチドを生成するのに好適な条件下、
－第３の温度であって、その温度で、第３の開放ステムループオリゴヌクレオチドの二本鎖ステム部分の鎖が解離して、それにより、第３の開放ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のフルオロフォアおよびクエンチャー分子の空間的分離を促進し、第３の検出可能な蛍光シグナルを提供する、第３の温度で、処理することと、
（ｆ）第３の温度以上の温度を含むか、またはそれからなる１つ以上の温度で、該第１、第２、および第３の蛍光シグナルのレベルを検出して、それにより、試料中の該標的の存在または不在を決定することとによって、決定することをさらに含む、実施形態１～２７のいずれか一項に記載の方法。
実施形態３０．第３の温度が、第１および／または第２の温度とは異なる、実施形態２９に記載の方法。
実施形態３１．方法が、反応混合物を、
－第３のＭＮＡザイムを第３の標的またはそのアンプリコンに結合させ、該第３のＭＮＡザイムの基質アームを第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分にハイブリダイズして、それにより、第３のＭＮＡザイムが、第３の開放ステムループオリゴヌクレオチドを形成することによって、第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分の該切断を促進すること、
－第３の標的またはそのアンプリコンを第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分にハイブリダイズして、第３の制限エンドヌクレアーゼが二本鎖配列と会合する二本鎖配列を形成し、それにより、第３の開放ステムループオリゴヌクレオチドを形成する第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分の該切断を促進すること、
－第３の標的またはそのアンプリコンを、第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分にハイブリダイズして、第３の標的またはそのアンプリコンを含む第３の二本鎖配列を形成し、
第３のプライマーオリゴヌクレオチドを、第３の標的またはそのアンプリコンにハイブリダイズして、第３の標的またはそのアンプリコンを含む第３の二本鎖配列に対して上流（５’）に位置する第３の二本鎖配列を形成し、エキソヌクレアーゼ活性を含む第３の酵素を、第３のプライマーオリゴヌクレオチドの末端にあるか、またはそれに隣接する第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分と会合させ、
エキソヌクレアーゼ活性を含む第３の酵素を触媒活性させ、それにより、第３の標的またはアンプリコンを含む第３の二本鎖配列のループ部分の分解を促進し、第３の開放ステムループオリゴヌクレオチドを形成すること、
－第３の標的またはそのアンプリコンを、第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分にハイブリダイズして、第３の標的またはそのアンプリコンを含む第３の二本鎖配列を形成し、
エキソヌクレアーゼ活性を含む第３の酵素を、第３の標的またはそのアンプリコンを含む第３の二本鎖配列と会合させ、
エキソヌクレアーゼ活性を含む第３の酵素を触媒活性させ、それにより、第３の標的またはアンプリコンを含む第３の二本鎖配列のループ部分の分解を促進し、第３の開放ステムループオリゴヌクレオチドを形成すること、
－第３の補因子をＤＮＡザイムに結合させ、かつ／または第３の補因子をリボザイムに結合させて、ＤＮＡザイムおよび／またはリボザイムを触媒活性にし、
ＤＮＡザイムおよび／またはリボザイムを、第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分にハイブリダイズし、
ＤＮＡザイムおよび／またはリボザイムを触媒活性させ、それにより、第３の閉鎖ステ
ムループオリゴヌクレオチドのループ部分の切断を促進し、第３の開放ステムループオリゴヌクレオチドを形成することのうちのいずれか１つ以上に好適な条件下で処理することを含み、
第３の標的が、第３の補因子である、実施形態２８～３０のいずれか一項に記載の方法。
実施形態３２．補因子が、金属イオン（例えば、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃａ２＋、Ｐｂ２＋）である、実施形態３１に記載の方法。
実施形態３３．制限エンドヌクレアーゼが、第３の標的またはそのアンプリコンを含む該二本鎖配列のループ鎖と会合し、それを切断することができるニッキングエンドヌクレアーゼである、実施形態３１の方法。
実施形態３４．第３の標的が、第３のＭＮＡザイムのセンサーアームにハイブリダイズして、それにより第３のＭＮＡザイムの集合を促進することができる核酸配列またはそのアンプリコンである、実施形態３１に記載の方法。
実施形態３５．
－標的が、分析物、タンパク質、化合物、または分子であり、
－酵素が、第３の標的に結合することができるアプタマーを有する酵素を含み、
－アプタマーへの第３の標的の結合が、アプタマーを有する酵素を触媒活性にすることができる、実施形態３１に記載の方法。
実施形態３６．アプタマーを有する酵素が、アプタ－ＤＮＡザイム、アプタ－リボザイム、アプタ－ＭＮＡザイムのうちのいずれか１つ以上を含む、実施形態３５に記載の方法。
実施形態３７．
－第３の標的が、分析物、タンパク質、化合物、または分子であり、
－反応混合物が、第３のＭＮＡザイムのセンサーアームにハイブリダイズして、それにより、第３のＭＮＡザイムの集合を促進することができるオリゴヌクレオチド配列をさらに含み、
－第３のＭＮＡザイムが、第３の標的に結合することができるアプタマー配列を含み、
－第３のＭＮＡザイムのアプタマー配列への第３の標的の結合が、第３のＭＮＡザイムのアプタマーに結合した阻害分子の除去を促進することによって、第３のＭＮＡザイムを触媒活性にすることができる、実施形態３１に記載の方法。
実施形態３８．
－反応混合物が、該第３のＭＮＡザイム、ならびに該第１および第２のＭＮＡザイムのいずれかまたは両方を含み、
－第３のＭＮＡザイムの基質アームにハイブリダイズすることができる第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分の配列が、
第１のＭＮＡザイムの基質アームにハイブリダイズすることができる第１の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分の配列、および／または
第１のＭＮＡザイムの基質アームにハイブリダイズすることができる第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分の配列とは異なる、実施形態３１、または実施形態３３～３７のいずれか一項に記載の方法。
実施形態３９．
第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分における、ハイブリダイズしたヌクレオチドの数および／またはハイブリダイズしたヌクレオチドの配列が、第１およ
び第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のものとは異なり、
－第３の温度が、第１および第２の温度とは異なり、
－第３の閉鎖および開放ステムループオリゴヌクレオチドのフルオロフォアが、第１および第２の閉鎖および開放ステムループオリゴヌクレオチドのフルオロフォアと同じ可視スペクトルの色領域で発光する、実施形態２８、または実施形態３１～３８のいずれか一項に記載の方法。
実施形態４０．第３の閉鎖および開放ステムループオリゴヌクレオチドのフルオロフォアが、第１および／または第２の閉鎖および開放ステムループオリゴヌクレオチドのフルオロフォアと同じである、実施形態２８、または実施形態３１～３９のいずれか一項に記載の方法。
実施形態４１．第３の閉鎖および開放ステムループオリゴヌクレオチドのフルオロフォア、ならびに第１の閉鎖および開放ステムループオリゴヌクレオチドのフルオロフォアおよび／または第２の閉鎖および開放ステムループオリゴヌクレオチドのフルオロフォアが、デバイスの同じ蛍光発光チャネルを使用して検出可能である、実施形態４０に記載の方法。
実施形態４２．
－第１の閉鎖および開放ステムループオリゴヌクレオチドのフルオロフォアが、第２の閉鎖および開放ステムループオリゴヌクレオチドのフルオロフォアと同じ可視スペクトルの色領域で発光し、
－第３の閉鎖および開放ステムループオリゴヌクレオチドのフルオロフォアが、第１および第２の閉鎖および開放ステムループオリゴヌクレオチドのフルオロフォアとは異なる可視スペクトルの色領域で発光する、実施形態２８～３８、または実施形態３９のいずれか一項に記載の方法。
実施形態４３．第３の温度が、第１の温度および／または第２の温度と１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、２０℃、２５℃、３０℃、３５℃、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃、７０℃、７５℃、８０℃超だけ異なる、実施形態２８～４２のいずれか一項に記載の方法。
実施形態４４．第３の温度での第３の蛍光シグナルの検出が、試料中の第３の標的の存在を示し、第３の温度での第３の蛍光シグナルの検出の失敗が、試料中の第３の標的の不在を示す、実施形態２８～４３のいずれか一項に記載の方法。
実施形態４５．
（ｉ）第１の温度で第１の蛍光シグナルの存在を決定することが、試料中の第１の標的の存在を示し、第１の蛍光シグナルの不在を決定することが、試料中の第１の標的の不在を示し、
（ｉｉ）第２の温度で第２の蛍光シグナルの存在を決定することが、試料中の第２の標的の存在を示し、第２の蛍光シグナルの不在を決定することが、試料中の第２の標的の不在を示す、実施形態１～４４のいずれか一項に記載の方法。
実施形態４６．第１および第２の標的の存在または不在を該決定することが、該第１および第２の蛍光シグナルを使用する融解曲線分析を含む、実施形態１～４４のいずれか一項に記載の方法。
実施形態４７．（ｃ）部が、該第１および第２の蛍光シグナルのレベルを、
－第２の温度以上の温度、および
－第１の温度以上かつ第２の温度未満の温度で検出することを含む、実施形態１～４４のいずれか一項に記載の方法。
実施形態４８．（ｃ）部が、該第１および第２の蛍光シグナルのレベルを、第２の温度未満の温度で検出することをさらに含む、実施形態４７に記載の方法。
実施形態４９．（ｃ）部が、核酸増幅反応中および／または完了時に、該第１および第２の蛍光シグナルのレベルを検出することを含む、実施形態４７または実施形態４８に記載の方法。
実施形態５０．既知の濃度の第１の標的および／または既知の濃度の第１の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドを使用して、第１の標的陽性対照蛍光シグナルを生成することをさらに含む、実施形態４７～４９のいずれか一項に記載の方法。
実施形態５１．該方法を、該第１の標的を含む別個の対照試料上で反復することによって、第１の標的陽性対照蛍光シグナルを生成することをさらに含む、実施形態４７～５０のいずれか一項に記載の方法。
実施形態５２．第１の標的を含む対照試料が、既知の濃度の第１の標的を含む、実施形態５１に記載の方法。
実施形態５３．第１の標的を含む対照試料が、該第２の標的をさらに含む、実施形態５１または実施形態５２に記載の方法。
実施形態５４．該方法を、該第２の標的を含む別個の対照試料上で反復することによって、第２の標的陽性対照蛍光シグナルを生成することをさらに含む、実施形態４６～５３のいずれか一項に記載の方法。
実施形態５５．第２の標的を含む対照試料が、既知の濃度の第２の標的を含む、実施形態５４に記載の方法。
実施形態５６．該対照試料が、該第１の標的をさらに含む、実施形態５４または実施形態５５に記載の方法。
実施形態５７．該方法を、該第１および該第２の標的を含む別個の対照試料上で反復することによって、組み合わされた陽性対照蛍光シグナルを生成することをさらに含む、実施形態４６～５３のいずれか一項に記載の方法。
実施形態５８．組み合わされた対照試料が、既知の濃度の第１の標的および／または既知の濃度の第２の標的を含む、実施形態５７に記載の方法。
実施形態５９．任意の該陽性対照蛍光シグナルを使用して、該第１の蛍光シグナルおよび／または該第２の蛍光シグナルを正規化することをさらに含む、実施形態５０～５８のいずれか一項に記載の方法。
実施形態６０．実施形態１～３のいずれか一項に記載の方法を、
（ｉ）該第１の標的、または
（ｉｉ）該第２の標的、または
（ｉｉｉ）該第１の標的もしくは該第２の標的を含有しない別個の陰性対照試料上で反
復することによって、陰性対照蛍光シグナルを生成することをさらに含む、実施形態４６～５９のいずれか一項に記載の方法。
実施形態６１．該陰性対照蛍光シグナルを使用して、該第１の蛍光シグナルおよび／または該第２の蛍光シグナルを正規化することをさらに含む、実施形態６０に記載の方法。
実施形態６２．該第１および／または第２の蛍光シグナルを閾値と比較することをさらに含み、
－閾値が、実施形態１～３のいずれか一項に記載の方法に従って試験された一連の試料に由来する蛍光シグナルを使用して生成され、
（ｉ）無鋳型対照および第１の標的
（ｉｉ）無鋳型対照および第２の標的
（ｉｉｉ）無鋳型対照、第１の標的、および第２の標的
のうちのいずれか１つ以上を含むことで、それにより、試料中の第１および第２の標的の該存在または不在を決定する、実施形態４６～６１のいずれか一項に記載の方法。
実施形態６３．一連の試料が、既知の濃度の該第１の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドおよび／または既知の濃度の該第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドを使用して試験される、実施形態６２に記載の方法。
実施形態６４．第１の温度が、第２の温度と１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、２０℃、２５℃、３０℃、３５℃、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃、７０℃、７５℃、８０℃超だけ異なる、実施形態１～６３のいずれか一項に記載の方法。
実施形態６５．任意のその該アンプリコンが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、ヘリカーゼ依存増幅（ＨＤＡ）、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）、ループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、自家持続配列複製（３ＳＲ）、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）、および／または逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）のうちのいずれか１つ以上によって生成される、実施形態１～６４のいずれか一項に記載の方法。
実施形態６６．試料が、対象から得られた生物学的試料である、実施形態１～６５のいずれか一項に記載の方法。
実施形態６７．方法が、インビトロで実行される、実施形態１～６５のいずれか一項に記載の方法。
実施形態６８．方法が、エクスビボで実行される、実施形態１～６５のいずれか一項に記載の方法。
実施形態６９．組成物であって、
第１および第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドであって、閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの各々が、ハイブリダイズしていないヌクレオチドの一本鎖ループ部分に接続されたハイブリダイズしたヌクレオチドの二本鎖ステム部分を含み、
第１および第２の閉ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分における、ハイブリダイズしたヌクレオチドの数および／またはハイブリダイズしたヌクレオチドの配列が、異なり、
二本鎖ステム部分の各々が、一方の鎖に接続されたフルオロフォア分子、および反対の
鎖に接続されたクエンチャー分子を含む、第１および第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドを含み、
フルオロフォア分子が、同じ可視スペクトルの色領域で発光し、第１の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの二本鎖ステム部分の融解温度（Ｔｍ）が、第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの二本鎖ステム部分のＴｍとは異なる、組成物。
実施形態７０．第１の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの一本鎖ループ部分が、第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの一本鎖ループ部分の配列とは異なる、実施形態６９に記載の組成物。
実施形態７１．
第１の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの閉鎖一本鎖ループ部分にハイブリダイズすることができる基質アームを含む、第１のＭＮＡザイム、および
第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの一本鎖ループ部分にハイブリダイズすることができる基質アームを含む、第２のＭＮＡザイムをさらに含む、実施形態６９または実施形態７０に記載の組成物。
実施形態７２．
第１のＭＮＡザイムの基質アームが、第１の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの一本鎖ループ部分にハイブリダイズし、
第２のＭＮＡザイムの基質アームが、第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの一本鎖ループ部分にハイブリダイズする、実施形態７１に記載の組成物。
実施形態７３．
第１および／または第２のＭＮＡザイムが、標的分析物、タンパク質、化合物、または分子に結合したアプタマー配列、およびオリゴヌクレオチド配列にハイブリダイズしたセンサーアームを含み、
第１のＭＮＡザイムが、第２のＭＮＡザイムとは異なる標的を検出するように設計されている、実施形態７２に記載の組成物。
実施形態７４．
第１および／または第２のＭＮＡザイムが、標的配列にハイブリダイズしたセンサーアームを含み、第１のＭＮＡザイムが、第２のＭＮＡザイムとは異なる標的を検出するように設計されている、実施形態７２に記載の組成物。
実施形態７５．
第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの一本鎖ループ部分の配列とは異なる、第１の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの該一本鎖ループ部分にハイブリダイズし、それにより、該第１のオリゴヌクレオチドを含む二本鎖配列を形成する、第１のオリゴヌクレオチド配列、
第１の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの一本鎖ループ部分の配列とは異なる、第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの該一本鎖ループ部分にハイブリダイズし、それにより、該第２のオリゴヌクレオチドを含む二本鎖配列を形成する、第２のオリゴヌクレオチド配列、
該第１のオリゴヌクレオチドを含む二本鎖配列に関連し、それを切断することができる、制限エンドヌクレアーゼ、および／または
該第２のオリゴヌクレオチドを含む二本鎖配列に関連し、それを切断することができる、制限エンドヌクレアーゼをさらに含む、実施形態６９～７４のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態７６．
第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの一本鎖ループ部分の配列とは異なる、第１の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの該一本鎖ループ部分にハイブリダイズし、それにより、該第１の標的オリゴヌクレオチドを含む第１の二本鎖配列を形成する、第１の標的オリゴヌクレオチド配列を含む、第１の二本鎖配列、
第１の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの一本鎖ループ部分の配列とは異なる、第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの該一本鎖ループ部分にハイブリダイズし、それにより、該第２の標的オリゴヌクレオチドを含む二本鎖配列を形成する、第２の標的オリゴヌクレオチド配列を含む、第２の二本鎖配列、
該第１の二本鎖配列に対して上流（５’）の第１の標的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズした第１のプライマーオリゴヌクレオチド、および第１のプライマーオリゴヌクレオチドの末端にあるか、もしくはそれに隣接する第１の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分に関連するエキソヌクレアーゼ活性（例えば、ポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼ）を含む第１の酵素、ならびに／または
該第２の二本鎖配列第２のおよび第２の酵素に対して上流（５’）の第２の標的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズした第２のプライマーオリゴヌクレオチド、および第２のプライマーオリゴヌクレオチドの末端にあるか、もしくはそれに隣接する第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分に関連するエキソヌクレアーゼ活性（例えば、ポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼ）を含む第２の酵素をさらに含む、実施形態６９～７５のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態７７．
第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの一本鎖ループ部分の配列とは異なる、閉鎖第１のステムループオリゴヌクレオチドの該一本鎖ループ部分にハイブリダイズし、それにより、該第１の標的オリゴヌクレオチドを含む第１の二本鎖配列を形成する、第１の標的オリゴヌクレオチド配列を含む、第１の二本鎖配列、
第１の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの一本鎖ループ部分の配列とは異なる、第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの該一本鎖ループ部分にハイブリダイズし、それにより、該第２の標的オリゴヌクレオチドを含む第２の二本鎖配列を形成する、第２の標的オリゴヌクレオチド配列を含む、第２の二本鎖配列をさらに含み、
エキソヌクレアーゼ活性を含む第１の酵素が、第１の二本鎖配列に関連し、エキソヌクレアーゼ活性を含む第２の酵素が、第２の二本鎖配列に関連する、実施形態６９～７６のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態７８．
第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの一本鎖ループ部分の配列とは異なる、第１の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分にハイブリダイズした第１のＤＮＡザイムおよび／または第１のリボザイム、
第１の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの一本鎖ループ部分の配列とは異なる、第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分にハイブリダイズした第２のＤＮＡザイムおよび／または第２のリボザイム、
各該ＤＮＡザイムを触媒活性にすることができ、故にループ部分にハイブリダイズした任意の該ＤＮＡザイムの切断活性を誘導する、各該ＤＮＡザイムの補因子、
各該リボザイムを触媒活性にすることができ、故にループ部分にハイブリダイズした任意の該リボザイムの切断活性を誘導する、各該リボザイムの補因子をさらに含む、実施形態６９～７７のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態７９．
第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドであって、第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドが、ハイブリダイズしていないヌクレオチドの一本鎖ループ部分に接続され
たハイブリダイズしたヌクレオチドの二本鎖ステム部分を含み、
第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分における、ハイブリダイズしたヌクレオチドの数および／またはハイブリダイズしたヌクレオチドの配列が、第１および第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのものとは異なり、
第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの二本鎖ステム部分が、一方の鎖に接続されたフルオロフォア分子、および反対の鎖に接続されたクエンチャー分子を含み、第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのフルオロフォア分子が、第１および第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのフルオロフォア分子と比較して、異なる可視スペクトルの色領域で発光する、第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドをさらに含む、実施形態６９～７８のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態８０．
第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドであって、第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドが、ハイブリダイズしていないヌクレオチドの一本鎖ループ部分に接続されたハイブリダイズしたヌクレオチドの二本鎖ステム部分を含み、
第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分における、ハイブリダイズしたヌクレオチドの数および／またはハイブリダイズしたヌクレオチドの配列が、第１および第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのものとは異なり、
第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの二本鎖ステム部分が、一方の鎖に接続されたフルオロフォア分子、および反対の鎖に接続されたクエンチャー分子を含み、第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのフルオロフォア分子が、第１および第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのフルオロフォア分子と比較して、同じ可視スペクトルの色領域で発光する、第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドをさらに含む、実施形態６９～７８のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態８１．
第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドであって、第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドが、ハイブリダイズしていないヌクレオチドの一本鎖ループ部分に接続されたハイブリダイズしたヌクレオチドの二本鎖ステム部分を含み、
第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分における、ハイブリダイズしたヌクレオチドの数および／またはハイブリダイズしたヌクレオチドの配列が、第１または第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのものと同じであり、
第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの二本鎖ステム部分が、一方の鎖に接続されたフルオロフォア分子、および反対の鎖に接続されたクエンチャー分子を含み、第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのフルオロフォア分子が、第１および第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのフルオロフォア分子と比較して、異なる可視スペクトルの色領域で発光する、第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドをさらに含む、実施形態６９～７８のいずれか一項に記載の組成物。
これより、本発明の好ましい実施形態を、例としてのみ、以下に明記される添付の図１～８を参照して説明する。
無傷の閉鎖されロックされた形態、および切断または分解された開放形態の、例示的なＬＯＣＳレポーターおよびそれらの融解温度（Ｔｍ）を示す。例示的な無傷（閉鎖）のＬＯＣＳ（図１Ａ、ＬＨＳ）は、ループ領域、ステム領域、およびフルオロフォア（Ｆ）クエンチャー（Ｑ）色素対を有する。ループ領域の切断または分解は、開放ＬＯＣＳレポーター構造を生成することができる（図１Ａ、ＲＨＳ）。無傷のＬＯＣＳのステム領域の融解温度（Ｔｍ）は、開放ＬＯＣＳ構造のステム領域のＴｍよりも高い。したがって、ＬＯＣＳ ＡのステムＡは、Ｔｍ１で分離または融解する。これは、開放ＬＯＣＳステムＡ’が融解する温度であるＴｍ２よりも高い（図１Ｂ）。同様に、無傷のＬＯＣＳ ＢのステムＢのＴｍは、Ｔｍ３で融解する。これは、開放ＬＯＣＳステムＢ’が融解する温度であるＴｍ４よりも高い（図１Ｂ）。開放ＬＯＣＳ構造のＴｍに対応する温度での負のピークの存在は、特定のＬＯＣＳの開放を誘導する標的の存在を示す。特定の各開放ＬＯＣＳ内の各ステムは、異なる温度で融解するため、同じフルオロフォアで標識された複数のＬＯＣＳを、単一の反応で同時に分析することができる。 ユニバーサルであり、任意の標的の検出に使用することができるＬＯＣＳオリゴヌクレオチドを使用して標的を検出するための例示的な戦略を示す。このスキームでは、ＬＯＣＳオリゴヌクレオチドは、ステム領域、フルオロフォアクエンチャー色素対、およびループ領域を含有する。ループ領域は、当該技術分野でＰｌｅｘＺｙｍｅとしても知られているＭＮＡザイムなどの触媒核酸のユニバーサルな基質を含む。ＭＮＡザイムは、構成成分パートザイムの標的センサーアームが標的上で隣接して整列するときに形成される。ＬＯＣＳオリゴヌクレオチドのループ領域は、ＭＮＡザイムの基質結合アームに結合し、ループ内の基質は、ＭＮＡザイムによって切断され、蛍光シグナルが生成される。反応を冷却して、開放ＬＯＣＳのステム領域を再アニーリングさせ、その後反応を融解曲線分析に供してもよく、それにより、反応が加熱される際の蛍光を監視する。開放ＬＯＣＳのＴｍに対応する融解ピークの存在は、ＭＮＡザイムを集合させた標的の存在を示す。標的を直接的に検出しても、標的増幅プロトコルによって生成される標的アンプリコンを検出してもよい。 標的に特異的なＬＯＣＳオリゴヌクレオチドを使用して標的を検出するための例示的な戦略を示す。ＬＯＣＳオリゴヌクレオチドは、ステム領域、フルオロフォアクエンチャー色素対、および標的アンプリコンに相補的な領域を含むループ領域を含有する。図３Ａに示されるスキームでは、ＬＯＣＳオリゴヌクレオチドのループ領域は、増幅中に標的アンプリコンに結合する。プライマーの伸長中、ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性は、ループ領域を分解し、リアルタイムで蛍光シグナルを生成するが、ステム領域は無傷のまま残す。ステム領域は、互いに相補的であるが、それらの標的には相補的ではない。増幅後、分解された開放ＬＯＣＳ構造のステムが再アニーリングされるように、反応を冷却してもよい。その後の融解曲線分析を実行して、開放ＬＯＣＳに由来するステム領域が融解し、蛍光を生成する温度を測定することができる。図３Ｂに示されるスキームでは、ＬＯＣＳオリゴヌクレオチドのループ領域は、標的アンプリコンに相補的な領域を含み、制限酵素、例えば、ニッキング酵素の認識部位をさらに含有する。ＬＯＣＳオリゴヌクレオチドのループ領域は、標的に結合し、ニッキング酵素は、ループ領域を切断し、標的分子を無傷のまま残す。これにより、ＬＯＣＳが開放され、蛍光シグナルが生成される。その後、切断された開放ＬＯＣＳ構造のステムが再アニーリングされ得るように、反応を冷却してもよく、その後融解曲線分析を実行して、開放ＬＯＣＳに由来するステム領域が融解する温度を測定することができる。この戦略を使用して、標的配列を直接的に検出しても、標的増幅法と組み合わせた場合に標的アンプリコンを検出してもよい。 １０，０００コピー（黒線）、４０コピー（灰色線）、または０コピー（点線）の標的ＭｇＰａ（図４Ａ）もしくはＴＶ－Ｂｔｕｂ（図４Ｃ）、またはＭｇＰａおよびＴＶ－Ｂｔｕｂの両方（図４Ｅ）を含有する反応から得られたＰＣＲ増幅プロットを示す。１０，０００コピー（黒線）および４０コピー（灰色線）を含有する反応から増幅後に得られた融解曲線特性を、標的ＭｇＰａ（図４Ｂ）、ＴＶ－Ｂｔｕｂ（図４Ｄ）、またはＭｇＰａおよびＴＶ－Ｂｔｕｂの両方（図４Ｆ）について示す。ＭｇＰａ遺伝子標的の存在下でＬＯＣＳ－１を開放することによって生成される融解特性は、３５℃および４１℃の融解温度でのピークを含み、ＴＶ－Ｂｔｕｂ遺伝子標的の存在下でＬＯＣＳ－２を開放することによって生成される融解特性は、５０℃の融解温度に対応するピークを含んだ一方、ＭｇＰａおよびＴＶ－Ｂｔｕｂ遺伝子標的の両方の存在下でＬＯＣＳ－１およびＬＯＣＳ－２の両方を開放することによって生成される融解特性は、３５℃、４１℃、および５０℃の融解温度での３つのピークを含んだ。ＭｇＰａの存在下でのＬＯＣＳ融解特性（Ｔｍ＝３５℃および４１℃）は、ＴＶ－Ｂｔｕｂ遺伝子標的の存在下で生成されるＬＯＣＳ融解特性（Ｔｍ＝５０℃）とは異なる。さらに、ＭｇＰａおよびＴＶ－Ｂｔｕｂの両方の遺伝子標的の存在下でのＬＯＣＳ融解特性（Ｔｍ＝３５℃、４１℃、および５０℃）は、単一の遺伝子標的のみが存在する前述の融解特性とは異なり、これは、両方の標的が検出されたことを示す。 （上部パネル）１０，０００コピー（黒線）、４０コピー（灰色線）、または０コピー（点線）のＭｇＰａ（図５Ａ１）、ＨＭＰＶ（図５Ｂ１）、およびＣＴ－ｏｍｐＡ（図５Ｃ１）遺伝子標的を含有する反応から得られたＰＣＲ増幅プロットを示す。下部パネルに示される結果は、１０，０００コピー（黒線）および４０コピー（灰色線）のＭｇＰａ（図５Ａ２）、ＨＭＰＶ（図５Ｂ２）、およびＣＴ－ｏｍｐＡ（図５Ｃ２）遺伝子標的を含有する反応から得られた融解曲線特性である。３つの標的は、３つの異なるＭＮＡザイムを使用して特異的に検出され、これらの各々が、同一の基質結合アームを有し、標的結合アームのみが異なっていた。各ＭＮＡザイムは、ユニバーサル基質およびユニバーサルステムを含む同じユニバーサルＬＯＣＳ－１オリゴヌクレオチドを開放した。各標的は、ユニバーサルステムのＴｍに対応する４０℃にピークを有する融解曲線特性を生成した。 （上部パネル）１０，０００コピー（黒線）、４０コピー（灰色線）、または０コピー（点線）のＴＶ－Ｂｔｕｂ（図６Ａ１）、ＶＺＶ（図６Ｂ１）、およびｒｐｏＢ（図６Ｃ１）標的を含有する反応から得られたＰＣＲ増幅プロットを示す。下部パネルに示される結果は、１０，０００コピー（黒線）または４０コピー（灰色線）のＴＶ－Ｂｔｕｂ（図６Ａ２）、ＶＺＶ（図６Ｂ２）、およびｒｐｏＢ（図６Ｃ２）標的を含有する反応から得られた融解曲線特性である。３つの標的は、３つの異なるＭＮＡザイムによって特異的に検出され、これらの各々が、同一の基質結合アームを有し、標的結合アームのみが異なっていた。各ＭＮＡザイムは、ユニバーサル基質およびユニバーサルステムを含む同じユニバーサルＬＯＣＳ－２を開放した。各標的は、ＬＯＣＳ－２内のユニバーサルステムのＴｍに対応する５０℃にピークを有する融解曲線特性を生成した。 ＬＯＣＳ－１（図７Ａ）、ＬＯＣＳ－２（図７Ｂ）、ＬＯＣＳ－３（図７Ｃ）、およびＬＯＣＳ－４（図７Ｄ）を使用して標的ＣＴ－Ｃｄｓ（図７Ａおよび７Ｃ）またはＴＦＲＣ（図７Ｂおよび７Ｄ）の増幅を監視した場合に得られた融解曲線特性を示す。標的の不在下で得られた融解曲線特性（点線）は、それぞれ無傷の閉鎖ＬＯＣＳ－１、ＬＯＣＳ－２、ＬＯＣＳ－３、およびＬＯＣＳ－４の融解温度に対応する６５℃、７７℃、６６℃、および６７℃のＴｍにピークを有した。ＣＴ－Ｃｄｓ標的（黒線、図７Ａおよび７Ｃ）の存在下では、開放ＬＯＣＳ－１およびＬＯＣ－３構造は、それぞれ３０℃および３６℃の融解温度をもたらした。ＴＦＲＣ標的（黒線、図７Ｂおよび７Ｄ）の存在下では、開放ＬＯＣＳ－２およびＬＯＣ－４構造は、それぞれ５０℃および３２℃の融解温度をもたらした。 ＢｉｏＲａｄ（登録商標）ＣＦＸ９６熱サイクラー（図８Ａ）、ＡＢＩ７５００（図８Ｂ）、もしくはＬｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ４８０（パネルＣ）、またはＸＸｐｒｅｓｓ ＰＣＲ（図８Ｄ）でのＭｇＰａ標的の増幅について得られた融解曲線を示す。両方の標的は、全ての機械のＦＡＭチャネルで監視した。 ＢｉｏＲａｄ（登録商標）ＣＦＸ９６熱サイクラー（図９Ａ）もしくはＡＢＩ７５００（図９Ｂ）、Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ４８０（図９Ｃ）、またはＸＸｐｒｅｓｓ ＰＣＲ（図９Ｄ）で実行した場合のＴＶ－Ｂｔｕｂ標的の増幅について得られた融解曲線を示す。両方の標的は、全ての機械のＦＡＭチャネルで監視した。 標的ＭｇＰａ（黒色曲線）およびＴＶ－Ｂｔｕｂ（灰色曲線）を同時増幅し、単一のチャネルで読み取った二重ＰＣＲ反応から得られた融解曲線特性を示す。実線および点線は、それぞれ１０，０００コピーおよび４０コピーの目標濃度を示す。図１０Ａは、ＦＡＭチャネルで読み取ったＬＯＣＳ－１およびＬＯＣＳ－２を使用して得られた融解曲線を示し、図１０Ｂは、ＨＥＸチャネルで読み取ったＬＯＣ－５およびＬＯＣＳ－６を使用する結果を示し、図１０Ｃは、テキサスレッドチャネルで読み取ったＬＯＣＳ－７およびＬＯＣＳ－８を使用する結果を示し、図１０Ｄは、Ｃｙ５チャネルで読み取ったＬＯＣＳ－９およびＬＯＣＳ－１０を使用する結果を示す。 １０，０００コピーのＭｇＰａ（図１１Ａ）、ＴＶ－Ｂｔｕｂ（図１１Ｂ）、ＣＴｃｒｙ（図１１Ｃ）、ＭｇＰａおよびＴＶ－Ｂｔｕｂの両方（図１１Ｄ）、ＭｇＰａおよびＣＴｃｒｙの両方（図１１Ｅ）、またはＴＶ－ＢｔｕｂおよびＣＴｃｒｙの両方（図１１Ｆ）の遺伝子標的を含有する反応からＰＣＲ増幅後に得られた融解曲線特性を示す。ＬＯＣＳ－１および／またはＬＯＣＳ－２および／またはＬＯＣＳ－１１を開放することによって生成される融解特性は、これらの構造が３０℃～５０℃の範囲内のＴｍで融解したことを示すピークを生成した一方、無傷の閉鎖ＬＯＣＳは、６４℃～７４℃の範囲のＴｍで融解した。各シナリオでは、ＬＯＣＳ融解特性は、固有であり、他のＬＯＣＳ融解特性とは異なる。 各々１０，０００コピーのＭｇＰａ、ＴＶ－Ｂｔｕｂ、およびＣＴｃｒｙ遺伝子標的を含有する反応からＰＣＲ増幅後に得られた融解曲線特性を示す。ＭｇＰａ、ＴＶ－Ｂｔｕｂ、およびＣＴｃｒｙ遺伝子標的の存在下でＬＯＣＳ－１、ＬＯＣＳ－２、およびＬＯＣＳ－１１を開放することによって生成される融解特性は、３０℃、４１℃、および４９℃の融解温度での３つのピークを含んだ。３つ全ての遺伝子標的を含有する反応は、単一の遺伝子標的のみを含有する反応（図１１Ａ～１１Ｃ）および３つの遺伝子標的のうちの２つを含有する反応（図１１Ｄ～１１Ｅ）とは区別することができる。例えば、３つ全ての遺伝子標的を含有する反応は、開放ＬＯＣＳ１のＴｍのピーク（約６４℃）の消失によって、ＴＶ－ＢｔｕｂおよびＣＴｃｒｙのみを含有する反応（図１１Ｆ）から区別することができる。 １０，０００コピーのＭｇＰａ、ＴＶ－Ｂｔｕｂ、ＮＧｏｐａ、またはｇｐｄ遺伝子標的のいずれかを含有する四重反応からＰＣＲ増幅後に得られた融解曲線特性を示す。４つの標的は、４つの異なるＭＮＡザイムを使用して特異的に検出され、転じて、これらのＭＮＡザイムは、２つの蛍光チャネルで監視される４つの異なるＬＯＣＳレポーターを切断および開放した。各ＬＯＣＳレポーターは、異なるユニバーサル基質を含有するが、ＦＡＭチャネルおよびテキサスレッドチャネルの両方において、同じユニバーサルステム（ステム１およびステム２）を使用した。ＭｇＰａまたはＴＶ－Ｂｔｕｂ遺伝子の存在は、テキサスレッドチャネルのシグナルの増加によって検出し、ＮＧｏｐａまたはｇｐｄ遺伝子の存在は、ＦＡＭチャネルのシグナルの増加によって検出した。テキサスレッドチャネルでのＭｇＰａまたはＴＶ－Ｂｔｕｂの特異的な検出、およびＦＡＭチャネルでのＮＧｏｐａまたはｇｐｄの特異的な検出は、固有の融解曲線特性の存在に基づいて決定した。ＭｇＰａの存在下でＬＯＣＳ－７を開放し、ＴＶ－Ｂｔｕｂの存在下でＬＯＣＳ－８を開放することによって、テキサスレッドチャネルで生成される融解特性は、それぞれ４３℃および５３℃の融解温度でのピークを含んだ。ＮＧｏｐａの存在下でＬＯＣＳ－１２を開放し、ｇｐｄの存在下でＬＯＣＳ－１３を開放することによって、ＦＡＭチャネルで生成される融解特性は、それぞれ２６℃および４２℃、ならびに５３℃の融解温度でのピークを含んだ。 ３つのＬＯＣＳレポーターのループ領域の各々が異なるＭＮＡザイムの異なる基質を含有するが、３つ全てが同じステム配列を含有する、一重ＰＣＲ反応から得られた融解曲線特性を示す。標的の不在下で得られた融解特性（灰色線）は、それぞれ無傷の閉鎖ＬＯＣＳ－２、ＬＯＣＳ－１４、およびＬＯＣＳ－１５の融解温度に対応する７４℃（図１４Ａ）、７５℃（図１４Ｂ）、および７５℃（図１４Ｃ）に融解ピークを示す。ＴＦＲＣ標的（黒線、図１４Ａ、１４Ｂ、および１４Ｃ）の存在下で、開放ＬＯＣＳ－２、ＬＯＣＳ－１４、およびＬＯＣ－１５構造は、それぞれ４９℃、４８℃、および４９℃の融解温度をもたらした。 ＬＯＣＳ－１６（図１５Ａ）およびＬＯＣＳ－１７（図１５Ｂ）を使用して、ＭＮＡザイム切断の代替的な方法としてニッキングエンドヌクレアーゼ（Ｎｔ．を使用して２つの異なる標的（ＡＦ－ＮＥ－ＴＶ１およびＡＦ－ＮＥ－Ｒ５ｂ）を検出および特定した場合に得られた融解曲線特性を示す。標的の不在下で得られた融解曲線特性（灰色線）は、それぞれ無傷の閉鎖ＬＯＣＳ－１６およびＬＯＣＳ－１７の融解温度に対応する６５℃および７６℃のＴｍにピークを有した。標的の存在下で得られた融解曲線特性（黒線、それぞれＡＦ－ＮＥ－ＴＶ１およびＡＦ－ＮＥ－Ｒ５ｂ）は、それぞれ切断された開放ＬＯＣＳ－１６およびＬＯＣＳ－１７との融解温度に対応する２９℃および４８℃のＴｍにピークを有した。この実施例のデータは、ＬＯＣＳレポーターが、ニッキングエンドヌクレアーゼ酵素を使用する方法などの代替的な標的検出方法とともに使用することができることを実証する。 ＴａｑＭａｎ／加水分解シグナル生成を媒介するもの、つまりプローブの標的特異的領域（ループ）がＰＣＲ中にポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性によって分解されるものと同様の戦略を使用して、ＬＯＣＳプローブを開放する場合に得られた増幅曲線（図１６Ａ）および融解曲線特性（図１６Ｂ）を示す。ＰＣＲプロットは、１０，０００コピー（黒線）または０コピー（灰色線）のＴＶ－ｂｔｕｂ遺伝子標的を含有する反応から得た（図１６Ａ）。標的の不在下で得られた融解曲線特性（灰色線）は、無傷の閉鎖ＬＯＣＳ－１８の融解温度に対応する６１℃のＴｍに融解ピークを有した（図１６Ｂ）。標的の存在下で得られた融解曲線特性（黒線）は、切断された開放ＬＯＣＳ－１８の融解温度に対応する４０℃のＴｍに融解ピークを有した（図１６Ｂ）。この実施例のデータは、ＬＯＣＳレポーターが、エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を使用して、アンプリコンにハイブリダイズするプローブを切断するＴａｑＭａｎなどの代替的な標的検出方法とともに使用することができることを実証する。 ３９℃（図１７Ａ）および７２℃（図１７Ｂ）での、２０，０００コピーの標的Ｘ／ＣＴｃｒｙ（黒実線）、２０，０００コピーの標的Ｙ／ＮＧｏｐａ（黒点線）、または２０，０００コピーの両方の標的（灰色線）を含有する反応から得られたＰＣＲ増幅プロットを示す。閾値ＴＸおよびＴＹを、それぞれ３９℃および７２℃で得られた増幅プロットについて示す。ＥＸ１、ＥＸ２、ＥＹ１、およびＥＹ２と指定された終点蛍光値を示す。 ３９℃で２０，０００コピーの標的Ｙ／ＮＧｏｐａ（図１８Ａ）、７２℃で２０，０００コピーの標的Ｙ／ＮＧｏｐａ（図１８Ｂ）、ＦＡＦで正規化した後の７２℃で２０，０００コピーの標的Ｙ／ＮＧｏｐａ（図１８Ｃ）、３９℃で３２コピーの標的Ｙ／ＮＧｏｐａ（図１８Ｄ）、７２℃で３２コピーの標的Ｙ／ＮＧｏｐａ（図１８Ｅ）、ＦＡＦで正規化した後の７２℃で３２コピーの標的Ｙ／ＮＧｏｐａ（図１８Ｆ）、３９℃で０コピーの標的Ｙ／ＮＧｏｐａ（図１８Ｇ）、７２℃で０コピーの標的Ｙ／ＮＧｏｐａ（図１８Ｈ）、ＦＡＦで正規化した後の７２℃で０コピーの標的Ｙ／ＮＧｏｐａ（図１８Ｉ）での、０コピーの標的Ｘ／ＣＴｃｒｙ（黒実線）、３２コピーの標的Ｘ／ＣＴｃｒｙ（灰色線）、または２０，０００コピーの両方の標的ＸＣＴｃｒｙ（黒点線）を含有する反応から得られたＰＣＲ増幅プロットを示す。 標的Ｙのｌｎコピー数（ＮＧｏｐａ）－標的Ｘのｌｎコピー数（ＣＴｃｒｙ）に対してプロットしたＣｑ値の相対シフトの非線形ロジスティック回帰を示す。 １０，０００コピーのｇｐｄ、ｇｐｄ３、またはｐｏｒＡ遺伝子標的のいずれかを含有する単一ウェル六重反応からＨＥＸチャネルで得られた融解曲線特性を示す。単一ウェルを使用して、６つの標的を、２つの蛍光チャネル（１チャネルあたり３つの標的）を使用して特異的に検出および鑑別した。これらの標的は、６つの異なるＭＮＡザイムを使用して検出し、転じて、これらは、６つの異なるＬＯＣＳレポーターを切断および開放した。図２０Ａ：ｇｐｄ（５３℃、６８℃、および８５℃）の存在下でのＬＯＣＳ－２１、図２０Ｂ：ｇｐｄ３（３０℃、４３℃、７７℃、および８５℃）の存在下でのＬＯＣＳ－２２、図２０Ｃ：ｐｏｒＡ（６８℃および７７℃）の存在下でのＬＯＣＳ－２３、図２０Ｄ：ｇｐｄおよびｇｐｄ３（３０℃、４３℃、５３℃、および８５℃）の存在下でのＬＯＣＳ－２１およびＬＯＣＳ－２２、図２０Ｅ：ｇｐｄおよびｐｏｒＡ（５３℃および６８℃）の存在下でのＬＯＣＳ－２１およびＬＯＣＳ－２３、図２０Ｆ：ｇｐｄ３およびｐｏｒＡ（３０℃、４３℃、６８℃、および７７℃）の存在下でのＬＯＣＳ－２２およびＬＯＣＳ－２３。 １０，０００コピーのＴＶ－Ｂｔｕｂ、ＭｇＰａ、またはＬＧＶ遺伝子標的のいずれかを含有する、図２０の同じ単一ウェル六重反応からテキサスレッドチャネルで得られた融解曲線特性を示す。これらの反応では、６つの標的を、２つの蛍光チャネル（１チャネルあたり３つの標的）を使用して特異的に検出および鑑別した。これらの標的は、６つの異なるＭＮＡザイムを使用して検出し、転じて、これらは、ＨＥＸおよびテキサスレッドチャネルで監視される６つの異なるＬＯＣＳレポーターを切断および開放した。図２１Ａ：ＴＶ－Ｂｔｕｂ（３０℃、４２℃、６６℃、および８２℃）の存在下でＬＯＣＳ－２４によって生成された融解曲線特性、図２１Ｂ：ＭｇＰａ（５３℃、６６℃、および８２℃）の存在下でのＬＯＣＳ－２５、図２１Ｃ：ＬＧＶ（６８℃）の存在下でのＬＯＣＳ－２６、図２１Ｄ：ＴＶ－ＢｔｕｂおよびＭｇＰａ（３０℃、４２℃、５３℃、および８２℃）の存在下でのＬＯＣＳ－２４およびＬＯＣＳ－２５、図２１Ｅ：ＴＶ－ＢｔｕｂおよびＬＧＶ（３０℃、４２℃、および６８℃）の存在下でのＬＯＣＳ－２４およびＬＯＣＳ－２６、図２１Ｆ：ＭｇＰａおよびＬＧＶの存在下でのＬＯＣＳ－２５およびＬＯＣＳ－２６（３０℃、４３℃、５３℃、および６８℃）。 各々１０，０００コピーのｇｐｄ、ｇｐｄ３、およびｐｏｒＡ（図２２Ａ）、または各々１０，０００コピーのＴＶ－Ｂｔｕｂ、ＭｇＰａ、およびＬＧＶ遺伝子標的（図２２Ｂ）を含有する、図２０および２１と同じ六重反応からＰＣＲ増幅後に得られた融解曲線特性を示す。これらの標的は、６つのＭＮＡザイムを使用して検出し、転じて、これらは、２つの蛍光チャネルで監視される６つのＬＯＣＳレポーターを切断および開放した。図２２Ａ：ｇｐｄ、ｇｐｄ３、およびｐｏｒＡ遺伝子標的（３０℃、４３℃、５３℃、および６８℃）の存在下でＬＯＣＳ－２１、ＬＯＣＳ－２２、およびＬＯＣＳ－２３によってＨＥＸチャネルで生成される融解特性。図２２Ｂ：ＴＶ－Ｂｔｕｂ、ＭｇＰａ、およびＬＧＶ（３０℃、４２℃、５３℃、および６８℃）の存在下でＬＯＣＳ－２４、ＬＯＣＳ－２５、およびＬＯＣＳ－２６によってテキサスレッドチャネルで生成される融解特性。 １０，０００コピーのＮＧｏｐａ、ｐｏｒＡ、ｇｐｄ、ｇｐｄ３、ＴＶ－Ｂｔｕｂ、ＭｇＰａ、ＣＴｃｒｙ、ＬＧＶ、ｐｏｌＡ、またはＴＦＲＣ遺伝子標的のいずれかを含有する十重反応からＰＣＲ増幅後に得られた融解曲線特性を示す。１０個の遺伝子標的は、１０個の異なるＭＮＡザイムを使用して特異的に検出され、転じて、これらのＭＮＡザイムは、５つの蛍光チャネル（ＦＡＭ、ＨＥＸ、テキサスレッド、Ｃｙ５、およびＣｙ５．５）で監視される１０個の異なるＬＯＣＳレポーターを切断および開放した。ＦＡＭチャネル内の標的の鑑別は、図２３Ａ：ＮＧｏｐａの存在下でのＬＯＣＳ－１５（５３℃）、図２３Ｂ：ｐｏｒＡの存在下でのＬＯＣＳ－２７（３０℃および７６℃）、ならびに図２３Ｃ：ＮＧｏｐａおよびｐｏｒＡの両方の存在下でのＬＯＣＳ－１５およびＬＯＣＳ－２７（３０℃および５３℃）によって示す。ＨＥＸチャネル内の標的の鑑別は、図２３Ｄ：ｇｐｄの存在下でのＬＯＣＳ－２１（５３℃および７０℃）、図２３Ｅ：ｇｐｄ３の存在下でのＬＯＣＳ－２２（３０℃、４３℃、および７６℃）、ならびに図２３Ｆ：ｇｐｄおよびｇｐｄ３遺伝子標的の両方の存在下でのＬＯＣＳ－２１およびＬＯＣＳ－２２（３０℃、４３℃、および５３℃）によって示す。テキサスレッドチャネル内の標的の鑑別は、図２３Ｇ：ＴＶ－Ｂｔｕｂの存在下でのＬＯＣＳ－２４（３１℃、４１℃、５９℃、および８３℃）、図２３Ｈ：ＭｇＰａの存在下でのＬＯＣＳ－２８（６３℃）、ならびに図２３Ｉ：ＴＶ－ＢｔｕｂおよびＭｇＰａの両方の存在下でのＬＯＣＳ－２４およびＬＯＣＳ－２８（３１℃、４１℃、および６３℃）によって示す。Ｃｙ５チャネル内の標的の鑑別は、図２３Ｊ：ＣＴｃｒｙの存在下でのＬＯＣＳ－２９（６１℃および７９℃）、図２３Ｋ：ＬＧＶの存在下でのＬＯＣＳ－１０（４７℃および８０℃）、ならびに図２３Ｌ：ＣＴｃｒｙおよびＬＶＧの両方の存在下でのＬＯＣＳ－２９およびＬＯＣＳ－１０（４７℃および６１℃）によって示す。Ｃｙ５．５チャネル内の標的の鑑別は、図２３Ｍ：ｐｏｌＡおよびＴＦＲＣ遺伝子標的の両方の存在下でのＬＯＣＳ－３０およびＬＯＣＳ－３１（３９℃および５９℃）、ならびに図２３Ｎ：ＴＦＲＣ遺伝子の存在下でのＬＯＣＳ－３１（３９℃および８０℃）によって示す。 （図２３続き） ３連の反応からの蛍光レベルの平均から無鋳型対照の３連の反応からの平均を減算したものとして表した、４０．５℃、５６．５℃、および７８．５℃で測定した、１０，０００コピーのＴＦＲＣ、ｒｐｏＢ、ｐｓｓ、または２つ以上の遺伝子標的の全ての組み合わせを含有する反応からＪＯＥチャネルで得られた、増幅前および増幅後の差次的な蛍光レベルの比較分析を示す。誤差バーは、各３連の標準偏差である。 ３２℃、４０．５℃、５６．５℃、および６５．５℃で測定した、１０，０００コピーのＴＦＲＣ、ｒｐｏＢ、ｐｓｓ、または２つ以上の遺伝子標的の全ての組み合わせを含有する反応からＪＯＥチャネルで得られた増幅後の差次的な比較蛍光レベルを示す。値は、３連の反応を平均した、（ａ）３２℃と４０．５℃、（ｂ）４０．５℃と５６．５℃、（ｃ）５６．５℃と６５℃との間の差次的な蛍光レベルとして表した。誤差バーは、各３連の標準偏差である。 ３９．５℃、５６．５℃、および６５．５℃で測定した、１０，０００コピーのＴＦＲＣ、ｒｐｏＢ、ｐｓｓ、または２つ以上の遺伝子標的の全ての組み合わせを含有する反応からＪＯＥチャネルで得られた増幅前および増幅後の差次的な蛍光レベルの比較分析を示す。値は、３連の反応を平均した、（ｉ）３９．５℃での増幅前および増幅後の蛍光レベル間の差、（ｉｉ）３９．５℃での増幅前および増幅後の蛍光レベル間の差および５６．５℃での増幅前および増幅後の蛍光レベル間の差、ならびに（ｉｉｉ）５６．５℃での増幅前および増幅後の蛍光レベル間の差および６５．５℃での増幅前および増幅後の蛍光レベル間の差として表した。誤差バーは、各３連の標準偏差である。 ３連の反応を平均した、１０，０００コピーのＴＦＲＣ、ｒｐｏＢ、ｐｓｓ、または２つ以上の遺伝子標的の全ての組み合わせを含有する反応からＪＯＥチャネルで得られた４０℃、５１℃、および６５℃での比較融解ピーク高さを示す。誤差バーは、各３連の標準偏差である。
定義
この出願で使用される場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」には、別段文脈が明確に指示しない限り、複数の参照対象が含まれる。例えば、「ポリヌクレオチド」という語句はまた、複数のポリヌクレオチドも含む。
本明細書で使用される場合、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含む）」という用語は、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ（含む）」を意味する。「ｃｏｍｐｒｉｓｅ（含む）」および「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ（含む）」などの「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含む）」という単語の変化形は、それに応じて様々な意味を有する。したがって、例えば、ヌクレオチドの配列を「含む」ポリヌクレオチドは、そのヌクレオチドの配列のみからなっても、１つ以上の追加のヌクレオチドを含んでもよい。
本明細書で使用される場合、「複数」という用語は、２つ以上を意味する。特定の具体的な態様または実施形態では、複数は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、またはそれ以上、およびその中で誘導可能な任意の整数、およびその中で導出可能な任意の範囲を意味し得る。
本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、ウシ、ウマ、ヒツジ、霊長類、鳥類、およびげっ歯類種を含む、経済的、社会的、または研究的に重要な任意の動物を含む。したがって、「対象」は、例えば、ヒトまたは非ヒト哺乳動物などの哺乳動物であり得る。細菌、ウイルス、真菌／酵母、原生生物、および線虫を含むがこれらに限定されない、微生物対象もまた包含される。本発明による「対象」には、プリオンなどの感染性病原体も含まれる。
本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」および「核酸」という用語は、互換的に使用することができ、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド塩基、またはそれらの類似体、誘導体、変異体、断片、または組み合わせの一本鎖または二本鎖ポリマーを指し、ＤＮＡ、メチル化ＤＮＡ、アルキル化ＤＮＡ、ＲＮＡ、メチル化ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｔＲＮＡ、ｓｍＲＮＡ、プレおよびプリマイクロＲＮＡ、他の非コードＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、それらの誘導体、それらのアンプリコン、またはそれらの任意の組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。非限定的な例として、核酸の供給源は、合成、哺乳動物、ヒト、動物、植物、真菌、細菌、ウイルス、古細菌、またはそれらの任意の組み合わせを含む群から選択され得る。「ポリヌクレオチド」および「核酸」「オリゴヌクレオチド」という用語は、別段示されない限り、任意の特定の配列およびそれに相補的な配列への言及を含む。
本明細書で使用される場合、「標的」という用語は、本発明の方法を使用して検出することができる、試料中に存在する任意の分子または分析物を指す。「標的」という用語は、核酸標的、ならびに例えば、タンパク質、ペプチド、分析物、リガンド、およびイオン（例えば、金属イオン）などの非核酸標的を含むことが理解される。
本明細書で使用される場合、「オリゴヌクレオチド」という用語は、ＤＮＡのセグメントもしくはＤＮＡ含有核酸分子、またはＲＮＡもしくはＲＮＡ含有分子、またはそれらの組み合わせを指す。オリゴヌクレオチドの例には、核酸標的；基質、例えば、ＭＮＡザイムによって修飾され得るもの；ＰＣＲなどの方法によるインビトロ標的増幅に使用されるものなどのプライマー；およびＭＮＡザイムの構成成分が含まれる。「オリゴヌクレオチド」という用語は、別段示されない限り、任意の特定の配列およびそれに相補的な配列への言及を含む。オリゴヌクレオチドは、４－アセチルシチジン、５－（カルボキシヒドロキシルメチル）ウリジン、２’－Ｏ－メチルシチジン、５－カルボキシメチルアミノメチルチオウリジン、ジヒドロウリジン、２’－Ｏ－メチルシュードウリジン、ベータＤ－ガラクトシルケオシン、２’－Ｏ－メチルグアノシン、イノシン、Ｎ６－イソペンテニルアデノシン、１－メチルアデノシン、１－メチルシュードウリジン、１－メチルグアノシン、１－メチルイノシン、２，２－ジメチルグアノシン、２－メチルアデノシン、２－メチルグアノシン、３－メチルシチジン、５－メチルシチジン、Ｎ６－メチルアデノシン、７－メチルグアノシン、５－メチルアミノメチルウリジン、５－メトキシアミノメチル－２－チオウリジン、ベータＤ－マンノシルメチルウリジン、５－メトキシカルボニルメチルウリジン、５－メトキシウリジン、２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニルアデノシン、Ｎ－（（９－ベータ－リボフラノシル－２－メチルチオプリン－６－イル）カルバモイル）スレオニン、Ｎ－（（９－ベータ－リボフラノシルプリン－６－イル）Ｎ－メチル－カルバモイル）スレオニン、ウリジン－５－オキシ酢酸メチルエステル、ウリジン－５－オキシ酢酸（ｖ）、ウィブトキソシン、シュードウリジン、クエオシン、２－チオシチジン、５－メチル－２－チオウリジン、２－チオウリジン、４－チオウリジン、５－メチルウリジン、Ｎ－（（９－ベータ－Ｄ－リボフラノシルプリン－６－イル）カルバモイル）スレオニン、２’－Ｏ－メチル－５－メチルウリジン、２’－Ｏ－メチルウリジン、ウィブトシン、３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）ウリジン、ベータＤ－アラビノシルウリジン、ベータＤ－アラビノシルチミジンを含む群を含むがこれらに限定されない、少なくとも１つの付加または置換を含み得る。
本明細書で使用される場合、「相補的」、「相補性」、「一致する」、および「一致した」という用語は、ヌクレオチド（例えば、エグデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、またはそれらの組み合わせ）が、ワトソン－クリック塩基対合またはゆらぎ塩基対合のいずれかを介して互いにハイブリダイズする能力を指す。結合は、アデニン（Ａ）
塩基とウラシル（Ｕ）塩基との間、アデニン（Ａ）塩基とチミン（Ｔ）塩基との間、シトシン（Ｃ）塩基とグアニン（Ｇ）塩基との間のワトソン－クリック塩基対合を介して形成され得る。ゆらぎ塩基対は、ポリヌクレオチド二重鎖（例えば、グアニン－ウラシル、イノシン－ウラシル、イノシン－アデニン、およびイノシン－シトシン）の２つのヌクレオチド間の非ワトソン－クリック塩基対合である。「相補的」と称されるヌクレオチドまたは互いの「相補体」であるヌクレオチドは、それらのそれぞれの塩基間のワトソン－クリック塩基対合またはゆらぎ塩基対合のいずれかによって一緒にハイブリダイズする能力を有するヌクレオチドである。
本明細書で使用される場合、「非相補的」、「相補的ではない」、「不一致」、および「不一致の」という用語は、それらのそれぞれの塩基間のワトソン－クリック塩基対合またはゆらぎ塩基対合のいずれかによって一緒にハイブリダイズする能力を欠如するヌクレオチド（例えば、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、およびそれらの組み合わせ）を指す。
本明細書で使用される場合、「酵素」は、化学反応（例えば、ポリヌクレオチドの増幅、ポリヌクレオチドの切断など）を触媒することができる任意の分子を指す。本発明での使用に好適な酵素の非限定的な例には、核酸酵素およびタンパク質酵素が含まれる。好適な核酸酵素の非限定的な例には、ＲＮＡザイム、ＭＮＡザイム、およびＤＮＡザイムが含まれる。好適なタンパク質酵素の非限定的な例には、エキソヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼが含まれる。酵素は一般に、本明細書に記載の方法のうちの１つ以上の実行を助ける触媒活性を提供する。非限定的な例として、エキソヌクレアーゼ活性は、例えば、ポリメラーゼの固有の触媒活性であり得る。非限定的な例として、エンドヌクレアーゼ活性は、例えば、ニッキングエンドヌクレアーゼ、リボエンドヌクレアーゼ、または二重特異性ヌクレアーゼ（ＤＳＮ）を含む制限酵素の固有の触媒活性であり得る。
本明細書で使用される場合、「アンプリコン」は、ＰＣＲ、ＲＴ－ＰＣＲ、ＳＤＡ、ＨＤＡ、ＲＰＡ、ＬＡＭＰ、ＲＣＡ、ＴＭＡ、３ＳＲ、またはＮＡＳＢＡを含むがこれらに限定されない、天然または人工の核酸増幅または複製事象の生成物である核酸（例えば、ＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはそれらの組み合わせ）を指す。
本明細書で使用される場合、「ステムループオリゴヌクレオチド」という用語は、一本鎖ループ構成成分に接合した二本鎖ステム構成成分を含むか、またはそれからなる、ＤＮＡもしくはＤＮＡ含有分子、またはＲＮＡもしくはＲＮＡ含有分子、またはそれらの組み合わせ（すなわち、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド分子もしくは複合体）を意味することが理解される。二本鎖ステム構成成分は、相補的塩基対合によって相補的逆方向鎖にハイブリダイズした順方向鎖を含み、順方向鎖の３’ヌクレオチドは、一本鎖ループ構成成分の５’ヌクレオチドに接合し、逆方向鎖の５’ヌクレオチドは、一本鎖ループ構成成分の３’ヌクレオチドに接合する。二本鎖ステム構成成分は、一方の鎖（例えば、順方向鎖）上に１つ以上のフルオロフォア、および反対の鎖（例えば、逆方向鎖）上に１つ以上のクエンチャーをさらに含み得る。
本明細書で使用される場合、本明細書では「ＬＯＣＳオリゴヌクレオチド」、「ＬＯＣＳ構造」、「ＬＯＣＳレポーター」、「無傷のＬＯＣＳ」、「閉鎖ＬＯＣＳ」、および「ＬＯＣＳプローブ」とも称される、「ステムループオリゴヌクレオチド」および「ＬＯＣＳ」という用語は、本明細書では互換的に使用され、一本鎖ループ構成成分（本明細書では「ループ」、「ループ領域」、および「ループ部分」とも称される）に接合した二本鎖ステム構成成分（本明細書では「ステム」、「ステム領域」、および「ステム部分」とも称される）を含むか、またはそれからなる、ＤＮＡもしくはＤＮＡ含有分子、またはＲＮＡもしくはＲＮＡ含有分子、またはそれらの組み合わせ（すなわち、ＤＮＡ－ＲＮＡハイ
ブリッド分子もしくは複合体）を意味することが理解される。二本鎖ステム構成成分は、相補的塩基対合によって相補的逆方向鎖にハイブリダイズした順方向鎖を含み、順方向鎖の３’ヌクレオチドは、一本鎖ループ構成成分の５’ヌクレオチドに接合し、逆方向鎖の５’ヌクレオチドは、一本鎖ループ構成成分の３’ヌクレオチドに接合する。
二本鎖ステム構成成分は、一方の鎖（例えば、順方向鎖）上に１つ以上のフルオロフォア、および反対の鎖（例えば、逆方向鎖）上に１つ以上のクエンチャーをさらに含み得る。例えば、フルオロフォア（複数可）は、順方向鎖の５’末端もしくはその近くに結合することができ、クエンチャー（複数可）は、逆方向鎖の３’末端もしくはその近くに結合することができるか、またはその逆であってもよい。一本鎖ループ構成成分は、例えば、ＭＮＡザイム、ＤＮＡザイム、リボザイム、アプタ－ＭＮＡザイム、またはアプタザイムなどの触媒核酸の基質として機能することができる領域を含み得る。加えて、またはあるいは、一本鎖ループ構成成分は、標的核酸（例えば、検出、定量化などのための標的）、および／またはそれに由来するアンプリコンに相補的であり、さらにエキソヌクレアーゼ酵素の基質として機能することができる領域を含み得る。非限定的な例として、エキソヌクレアーゼは、ポリメラーゼ酵素の固有の活性であり得る。加えて、またはあるいは、一本鎖ループ構成成分領域は、（ｉ）検出される標的に相補的であり得る領域、（ｉｉ）二本鎖制限酵素認識部位の一本鎖を含み得る領域、および（ｉｉｉ）制限酵素の基質として機能することができる領域を含み得る。
本明細書で使用される場合、「開放ステムループオリゴヌクレオチド」、「開放ＬＯＣＳ」、「開放ＬＯＣＳオリゴヌクレオチド」、「開放ＬＯＣＳ構造」、「開放ＬＯＣＳレポーター」、「開放ＬＯＣＳプローブ」、「開放ＬＯＣＳ」、「切断されたＬＯＣＳ」、および「分解されたＬＯＣＳ」という用語は、本明細書では互換的に使用され、ループ内の隣接するヌクレオチド間の少なくとも１つの結合が除去され、それにより、ループ領域内に開放構造を提供するように、一本鎖ループ構成成分が（例えば、本明細書に記載の酵素によって）切断および／または分解された「ステムループオリゴヌクレオチド」または「ＬＯＣＳ」への言及であることが理解される。開放ＬＯＣＳでは、二本鎖ステム部分の順方向鎖および逆方向鎖は、互いにハイブリダイズして、ステムを形成する能力を保持し得る。
本明細書で使用される場合、「ユニバーサルステム」という用語は、任意のＬＯＣＳ構造に組み込まれ得る二本鎖配列を指す。同じ「ユニバーサルステム」を、触媒核酸基質または対象となる標的に相補的な配列のいずれかを含むループを含有するＬＯＣＳにおいて使用することができる。単一のユニバーサルステムは、特定のＬＯＣＳの開放を促進することができる任意の標的の代替マーカーとして使用することができる。一連のユニバーサルステムは、任意の標的の組を分析するように設計した一連のＬＯＣＳに組み込むことができる。
本明細書で使用される場合、「ユニバーサルＬＯＣＳ」という用語は、「ユニバーサルステム」と、ＭＮＡザイム標的センシングアームの配列にかかわらず、相補的な基質結合アームを有する任意のＭＮＡザイムによって切断され得るユニバーサル触媒核酸基質を含む「ユニバーサルループ」とを含有する、ＬＯＣＳ構造を指す。単一のユニバーサルＬＯＣＳは、特定のＬＯＣＳの開放を促進することができる任意の標的の代替マーカーとして使用することができる。一連のユニバーサルＬＯＣＳは、任意の標的の組を分析するように設計した任意の多重アッセイに組み込むことができる。
本明細書で使用される場合、「核酸酵素」、「触媒核酸」、「触媒活性を有する核酸」、および「触媒核酸酵素」という用語は、本明細書で互換的に使用され、少なくとも１つの基質を認識し、その少なくとも１つの基質の修飾（切断など）を触媒し得る、ＤＮＡも
しくはＤＮＡ含有分子もしくは複合体、またはＲＮＡもしくはＲＮＡ含有分子もしくは複合体、またはそれらの組み合わせ（すなわち、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド分子もしくは複合体）を意味するものとする。触媒核酸のヌクレオチド残基は、塩基Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、およびＵ、ならびにそれらの誘導体および類似体を含み得る。上記の用語は、少なくとも１つの基質を認識し、その少なくとも１つの基質の修飾（切断など）を触媒し得るＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド分子である、単一のＤＮＡもしくはＤＮＡ含有分子（当該技術分野では「ＤＮＡ酵素」、「デオキシリボザイム」、もしくは「ＤＮＡザイム」としても知られている）、またはＲＮＡもしくはＲＮＡ含有分子（当該技術分野では「リボザイム」としても知られている）、またはそれらの組み合わせを含み得る単分子核酸酵素を含む。上記の用語は、少なくとも１つの基質を認識し、その少なくとも１つの基質の修飾（切断など）を触媒し得るＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド複合体である、ＤＮＡもしくはＤＮＡ含有複合体、またはＲＮＡもしくはＲＮＡ含有複合体、またはそれらの組み合わせを含む核酸酵素を含む。「核酸酵素」、「触媒核酸」、「触媒活性を有する核酸」、および「触媒核酸酵素」という用語は、それらの意味の中に、ＭＮＡザイムを含む。
本明細書で使用される場合、本明細書で使用される「ＭＮＡザイム」および「多成分核酸酵素」という用語は、同じ意味を有し、ＭＮＡザイム集合促進剤（例えば、標的）の存在下でのみ基質を触媒的に修飾することができる活性核酸酵素を形成する、２つ以上のオリゴヌクレオチド配列（例えば、パートザイム）を指す。「ＭＮＡザイム」はまた、当該技術分野では「ＰｌｅｘＺｙｍｅ」としても知られている。ＭＮＡザイムは、基質の切断を含む一連の反応、および基質（複数可）の他の酵素修飾を触媒することができる。エンドヌクレアーゼまたは切断活性を有するＭＮＡザイムはまた、「ＭＮＡザイム切断剤」としても知られている。構成成分パートザイムであるパートザイムＡおよびＢは各々、ワトソン－クリック塩基対合を介して集合促進剤（例えば、標的ＤＮＡまたはＲＮＡ配列）に結合する。ＭＮＡザイムは、パートザイムＡおよびＢのセンサーアームが集合促進剤で互いに隣接してハイブリダイズする場合にのみ形成される。ＭＮＡザイムの基質アームは、基質に係合し、その修飾（例えば、切断）は、パートザイムＡおよびＢの触媒ドメインの相互作用によって形成されるＭＮＡザイムの触媒コアによって触媒される。ＭＮＡザイムは、ＤＮＡ／ＲＮＡキメラレポーター基質を切断することができる。フルオロフォアおよびクエンチャー色素対間の基質のＭＮＡザイム切断は、蛍光シグナルを生成し得る。「多成分核酸酵素」および「ＭＮＡザイム」という用語は、２つの分子で構成される二分構造、または３つの核酸分子で構成される三分構造、または例えば４つ以上の核酸分子によって形成されるものなどの他の多分構造を含む。
本明細書で使用される場合、「ＭＮＡザイム」および「多成分核酸酵素」という用語は、ＰＣＴ特許公開番号第ＷＯ／２００７／０４１７７４号、同第ＷＯ／２００８／０４００９５号、同第ＷＯ２００８／１２２０８４号、および関連する米国特許公開番号第２００７－０２３１８１０号、同第２０１０－０１３６５３６号、および同第２０１１－０１４３３３８号（これらの文書の各々の内容の全体が、参照により本明細書に組み込まれる）のいずれか１つ以上に開示されるものを含む、全ての既知のＭＮＡザイムおよび修飾ＭＮＡザイムを包含することが理解される。「ＭＮＡザイム」および「多成分核酸酵素」という用語によって包含されるＭＮＡザイムおよび修飾ＭＮＡザイムの非限定的な例には、（本明細書に例証される）切断触媒活性を有するＭＮＡザイム、１つ以上の集合阻害剤を含む解体または部分的に集合したＭＮＡザイム、１つ以上のアプタマーを含むＭＮＡザイム（「アプタ－ＭＮＡザイム」）、１つ以上の短縮型センサーアームおよび任意で１つ以上の安定化オリゴヌクレオチドを含むＭＮＡザイム、１つ以上の活性阻害剤を含むＭＮＡザイム、多成分核酸不活性プロ酵素（ＭＮＡｉ）が含まれ、これらの各々は、ＷＯ／２００７／０４１７７４、ＷＯ／２００８／０４００９５、ＵＳ２００７－０２３１８１０、ＵＳ２０１０－０１３６５３６、および／またはＵＳ２０１１－０１４３３３８のうちの１つ以上において詳細に説明されている。
本明細書で使用される場合、「パートザイム」、「構成成分パートザイム」、および「パートザイム構成成分」という用語は、ＤＮＡ含有またはＲＮＡ含有またはＤＮＡ－ＲＮＡ含有オリゴヌクレオチドを指し、これらのうちの２つ以上は、本明細書で定義されるＭＮＡザイム集合促進剤の存在下でのみ、一緒に「ＭＮＡザイム」を形成することができる。特定の好ましい実施形態では、１つ以上、および好ましくは少なくとも２つの構成成分パートザイムは、３つの領域またはドメイン、つまり修飾を触媒する触媒コアの一部を形成する「触媒」ドメイン、集合促進剤と会合する、かつ／またはそれに結合することができる「センサーアーム」ドメイン、および基質と会合する、かつ／またはそれに結合することができる「基質アーム」ドメインを含み得る。「センサーアーム」、「標的センサーアーム」、または「標的センシングアーム」、または「標的アーム」という用語は、集合促進剤、例えば、標的に結合するパートザイムのドメインを説明するために互換的に使用され得る。パートザイムは、本明細書で「アプタ－パートザイム」と称されるアプタマーを含むがこれらに限定されない、少なくとも１つの追加の構成成分を含み得る。パートザイムは、短縮型センサーアームを有するパートザイム構成成分、および集合促進剤または基質のいずれかと相互作用することによってＭＮＡザイム構造を安定化する安定化アーム構成成分を含むがこれらに限定されない、複数の構成成分を含み得る。
本明細書で使用される場合、「集合促進剤分子」、「集合促進剤」、「ＭＮＡザイム集合促進剤分子」、および「ＭＮＡザイム集合促進剤」という用語は、ＭＮＡザイムのセンサーアームとの相互作用によって触媒活性ＭＮＡザイムを形成するための構成成分パートザイムの自己集合を促進することができる実体を指す。本明細書で使用される場合、集合促進剤は、切断または他の酵素活性を有するＭＮＡザイムの集合を促進し得る。好ましい実施形態では、集合促進剤は、ＭＮＡザイムの自己集合に必要とされる。集合促進剤は、１つの分子で構成されていても、１つ以上のオリゴヌクレオチド「パートザイム」のセンサーアームと対合するか、またはそれに結合する２つ以上の「集合促進剤構成成分」で構成されていてもよい。集合促進剤は、ＭＮＡザイムのセンサーアーム（複数可）と配列相補性を共有しない１つ以上のヌクレオチド構成成分を含み得る。集合促進剤は、標的であってもよい。標的は、ＤＮＡ、メチル化ＤＮＡ、アルキル化ＤＮＡ、ＲＮＡ、メチル化ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｔＲＮＡ、ｓｍＲＮＡ、プレおよびプリマイクロＲＮＡ、他の非コードＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、それらの誘導体、アンプリコン、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される核酸であり得る。核酸は、増幅され得る。増幅は、ＰＣＲ、ＲＴ－ＰＣＲ、ＳＤＡ、ＨＤＡ、ＲＰＡ、ＬＡＭＰ、ＲＣＡ、ＴＭＡ、３ＳＲ、またはＮＡＳＢＡのうちの１つ以上を含み得る。
本明細書で使用される場合、「検出可能な効果」という用語は、ＬＯＣＳプローブ（複数可）の切断が生じたことを示すものとして検出または定量化することができる効果である。効果の大きさは、集合促進剤（例えば、標的）などの入力の量を示し得る。検出可能な効果は、蛍光分光、表面プラズモン共鳴、質量分光、ＮＭＲ、電子スピン共鳴、偏光蛍光分光、円二色性分光法、免疫測定、クロマトグラフィー、放射測定、測光、シンチグラフィー、電子的方法、電気化学的方法、ＵＶ、可視光もしくは赤外線分光、酵素的方法、またはそれらの任意の組み合わせを含む、様々な方法によって検出することができる。
本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド基質」および「基質」という用語は、触媒核酸酵素を含む酵素によって認識、作用、または修飾され得る、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド塩基、またはそれらの類似体、誘導体、変異体、断片、もしくは組み合わせの任意の一本鎖または二本鎖ポリマーを含む。「ポリヌクレオチド基質」または「基質」は、切断を含むがこれに限定されない、様々な酵素活性によって修飾され得る。「ポリヌクレオチド基質」または「基質」の切断または分解は、酵素の触媒活
性を監視するための「検出可能な効果」を提供し得る。「ポリヌクレオチド基質」または「基質」は、ＭＮＡザイム、アプタＭＮＡザイム、ＤＮＡザイム、アプタザイム、リボザイムなどの触媒核酸酵素、および／またはエキソヌクレアーゼもしくはエンドヌクレアーゼなどのタンパク質酵素を含むがこれらに限定されない、１つ以上の酵素による切断または分解が可能であり得る。
本明細書で使用される場合、「レポーター基質」は、触媒反応に関連して、基質の切断または切断された生成物の出現のいずれかの測定を促進するように特に適合された基質である。レポーター基質は、溶液中に遊離していても、例えば、表面または別の分子に結合（または「繋留」）していてもよい。レポーター基質は、例えば、（クエンチャーなどの１つ以上の追加の構成成分を有するか、もしくは有しない）フルオロフォア、放射性標識、ビオチン（例えば、ビオチン化）、または化学発光標識を含む多種多様な手段のいずれかによって標識することができる。
本明細書で使用される場合、「ユニバーサル基質」は、各々が異なる集合促進剤を認識することができる複数のＭＮＡザイムによって認識され、触媒的に作用される基質、例えば、レポーター基質である。そのような基質の使用は、それらの全てがユニバーサル基質を認識する、構造的に関連するＭＮＡザイムを使用して、様々な集合促進剤を検出、特定、または定量化するための別個のアッセイの開発を促進する。これらのユニバーサル基板は各々、１つ以上の標識で独立して標識することができる。好ましい実施形態では、独立して検出可能な標識を使用して、１つ以上のユニバーサル基質を標識して、ＭＮＡザイムを使用して様々な集合促進剤を独立してまたは同時に検出するための便利なシステムの作製を可能にする。いくつかの実施形態では、基質は、補因子、例えば、鉛または水銀などの金属イオン補因子の存在下で触媒活性であるＤＮＡザイムによる触媒修飾が可能である。
本明細書で使用される場合、「プローブ」という用語は、標的核酸の検出に使用されるオリゴヌクレオチドを指す。プローブの非限定的な例には、ＴａｑＭａｎプローブ、分子ビーコンプローブ、および核酸酵素による触媒切断が可能なループ領域内に核酸酵素基質を含むＬＯＣＳプローブが含まれる。
「生成物」という用語は、基質の酵素修飾の結果として生成される１つ以上の新たな分子（複数可）を指す。本明細書で使用される場合、「切断生成物」という用語は、酵素による切断またはエンドヌクレアーゼ活性の結果として生成される新たな分子を指す。いくつかの実施形態では、無傷の閉鎖ＬＯＣＳ構造の酵素切断または分解の生成物は、ハイブリダイズして、開放ＬＯＣＳ構造を形成することができる、２つのオリゴヌクレオチド断片を含む。
本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチドの文脈における「融解温度」および「Ｔｍ」という用語の使用は、別段具体的に示されない限り、ウォレス規則を使用して計算した融解温度（Ｔｍ）への言及であることが理解され、それにより、Ｔｍ＝２℃（Ａ＋Ｔ）＋４℃（Ｇ＋Ｃ）である（Ｗａｌｌａｃｅ ｅｔ ａｌ．，（１９７９）Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．６，３５４３を参照されたい）。配列組成が融解温度に与える効果は、以下の式、Ｔｍ（℃）＝ΔＨ°／（ΔＳ°＋Ｒ ｌｎ［ｏｌｉｇｏ］）－２７３．１５によって支配される最近傍法を使用して理解することができる。ステムの長さおよび配列組成に加えて、融解温度に影響を与えることが知られている他の因子には、イオン強度およびオリゴヌクレオチド濃度が含まれる。より高いオリゴヌクレオチドおよび／またはイオン濃度は、融解温度の増加につながる二重鎖形成の可能性を増加させる。対照的に、より低いオリゴヌクレオチドおよび／またはイオン濃度は、融解温度の低下につながるステムの解離を支持する。
本明細書で使用される場合、「クエンチャー」という用語は、フルオロフォアへの近接時に、フルオロフォアによって生成される放出エネルギーを吸収し、このエネルギーを熱として放散するか、またはフルオロフォアの放出波長よりも長い波長の光を放出する、任意の分子を含む。クエンチャーの非限定的な例には、ダブシル、ＴＡＭＲＡ、グラフェン、ＦＲＥＴフルオロフォア、ＺＥＮクエンチャー、ＡＴＴＯクエンチャー、Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅクエンチャー（ＢＨＱ）、およびＢｌａｃｋ Ｂｅｒｒｙクエンチャー（ＢＢＱ）が含まれる。
本明細書で使用される場合、核酸の文脈で使用される場合の「塩基」という用語は、「ヌクレオチド」という用語と同じ意味を有することが理解される。
本明細書で使用される場合、「キット」という用語は、材料を送達するための任意の送達システムを指す。そのような送達システムには、反応試薬（例えば、適切な容器内のラベル、参照試料、支持材料など）および／または支持材料（例えば、緩衝液、アッセイを実行するための説明書など）のある場所から別の場所への保管、輸送、または送達を可能にするシステムが含まれる。例えば、キットは、関連する反応試薬および／または支持材料を含有する箱などの１つ以上の同封物を含み得る。「キット」という用語には、断片化されたキットおよび組み合わされたキットの両方が含まれる。
本明細書で使用される場合、「断片化されたキット」という用語は、それぞれがキット全体の構成要素の下位部分を含有する、２つ以上の別個の容器を含む送達システムを指す。容器は、意図されるレシピエントに一緒にまたは別個に送達され得る。各々がキット全体の構成要素の下位部分を含有する、２つ以上の別個の容器を含む任意の送達システムは、「断片化されたキット」という用語の意味に含まれる。
本明細書で使用される場合、「組み合わされたキット」は、単一の容器（例えば、所望の構成要素の各々を収容する単一の箱）内に反応アッセイの構成要素の全てを含有する送達システムを指す。
本明細書において、列挙された数値に関する「約」という用語の使用は、列挙された数値および列挙された値の±１０パーセント以内の数値を含むことが理解される。
本明細書において、一連の数値への言及時の「間」という用語の使用は、その範囲の各終点の数値を包含することが理解される。例えば、１０残基長～２０残基長のポリペプチドは、１０残基長のポリペプチドおよび２０残基長のポリペプチドを含む。
本明細書における先行技術の文書、またはそれらの文書から派生した、もしくはそれらの文書に基づく本明細書の記載のいかなる記載も、これらの文書または派生した記載が関連する当該技術の一般的な知識の一部であることを認めるものではない。
別段記載されない限り、説明の目的で、本明細書に参照される全ての文書の全体が、これにより、参照により本明細書に組み込まれる。
略語
以下の略語が、本明細書および本明細書全体を通して使用される。
ＬＯＣＳ：ステムに接続されたループ
ＭＮＡザイム：多成分核酸酵素、または多成分核酸酵素、
パートザイム：オリゴヌクレオチドを含有する部分酵素、
ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応、
ｇＤＮＡ：ゲノムＤＮＡ
ＮＴＣ：無鋳型対照
ｑＰＣＲ：リアルタイム定量化ＰＣＲ
Ｃｔ：閾値サイクル
Ｒ２：相関係数
ｎＭ：ナノモル
ｍＭ：ミリモル
μＬ：マイクロリットル
ｄＮＴＰ：デオキシリボヌクレオチド三リン酸
ＮＦ－Ｈ２Ｏ：無ヌクレアーゼ水、
ＬＮＡ：ロックされた核酸、
Ｆ：フルオロフォア、
Ｑ：クエンチャー、
Ｎ＝Ａ、Ｃ、Ｔ、Ｇ、またはそれらの類似体、
Ｎ’＝Ｎに相補的であるか、またはＮと塩基対合することができる任意のヌクレオチド。
（Ｎ）ｘ：任意の数のＮ、
（Ｎ’）ｘ：任意の数のＮ’、
Ｗ：ＡまたはＴ、
Ｒ：Ａ、Ｇ、またはＡＡ、
ｒＮ：任意のリボヌクレオチド塩基、
（ｒＮ）ｘ：任意の数のｒＮ、
ｒＲ：ＡまたはＧ、
ｒＹ：ＣまたはＵ、
Ｍ：ＡまたはＣ、
Ｈ：Ａ、Ｃ、またはＴ、
Ｄ：Ｇ、Ａ、またはＴ、
ＪＯＥまたは６－ＪＯＥ：６－カルボキシ－４’，５’－ジクロロ－２’，７’－ジメトキシフルオレセイン、
ＦＡＭまたは６－ＦＡＭ：６－カルボキシフルオレセイン、
ＢＨＱ１：Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅクエンチャー１
ＢＨＱ２：Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅクエンチャー２
ＲＴ－ＰＣＲ：逆転写ポリメラーゼ連鎖反応
ＳＤＡ：鎖変位増幅
ＨＤＡ：ヘリカーゼ依存増幅
ＲＰＡ：リコンビナーゼポリメラーゼ増幅
ＬＡＭＰ：ループ媒介等温増幅
ＲＣＡ：ローリングサークル増幅
ＴＭＡ：転写媒介増幅
３ＳＲ：自家持続配列複製
ＮＡＳＢＡ：核酸配列ベースの増幅
ＩＢ：Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ（登録商標）ＦＱ
ＩＢＲ：Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ（登録商標）ＲＱ
ｓｈＲＮＡ：低分子ヘアピン型ＲＮＡ
ｓｉＲＮＡ：低分子干渉ＲＮＡ
ｍＲＮＡ：メッセンジャーＲＮＡ
ｔＲＮＡ：転移ＲＮＡ
ｓｎｏＲＮＡ：核小体低分子ＲＮＡ
ｓｔＲＮＡ：小分子一過性ＲＮＡ
ｓｍＲＮＡ：小分子調節性調節ＲＮＡ
プレマイクロＲＮＡ：前駆体マイクロＲＮＡ
プリマイクロＲＮＡ：一次マイクロＲＮＡ
ＬＨＳ：左側
ＲＨＳ：右側
ＤＳＯ：二本鎖オリゴヌクレオチド
Ｔｍ：融解温度
ＲＦＵ：相対蛍光単位
以下の詳細な説明は、当業者による本発明の実施を可能にするのに十分詳細に本発明の例示的な実施形態を伝える。記載される様々な実施形態の特徴または制限は、本発明の他の実施形態または本発明全体を必ずしも制限するものではない。したがって、以下の詳細な説明は、特許請求の範囲によってのみ定義される本発明の範囲を制限するものではない。
本発明は、標的（例えば、核酸、タンパク質、分析物、化合物、分子など）の改善された多重化検出のための方法および組成物に関する。本方法および組成物は各々、様々な他の薬剤（複数可）と組み合わせて使用することができるＬＯＣＳオリゴヌクレオチドを用いる。
－ＬＯＣＳオリゴヌクレオチド
本発明の例示的なＬＯＣＳオリゴヌクレオチドを、図１に示す。例示的な無傷の（閉鎖）ＬＯＣＳオリゴヌクレオチド（図１Ａ、ＬＨＳ）は、ループ領域、ステム領域、およびフルオロフォア（Ｆ）／クエンチャー（Ｑ）色素対を有する。図１は、無傷のＬＯＣＳ Ａおよび無傷のＬＯＣＳ Ｂと表される２つの例示的なＬＯＣＳオリゴヌクレオチドを示す。これらのＬＯＣＳオリゴヌクレオチドは、異なるループ配列および異なるステム配列を有する。組み合わせて使用される場合、本発明の２つの所与のＬＯＣＳオリゴヌクレオチドは一般に、ステムの配列および／または長さが異なる。非限定的な例としてのみ、無傷のＬＯＣＳ ＡのステムＡは、Ｔｍ１と表される第１の温度で融解するように設計することができる一方、無傷のＬＯＣＳ ＢのステムＢは、Ｔｍ３と表される異なる温度で融解するように設計することができる。無傷のＬＯＣＳオリゴヌクレオチドのループ領域の切断または分解は、開放ＬＯＣＳ構造をもたらす（図１Ａ、ＲＨＳ）。
分子内結合は分子間結合よりも強いため、無傷のＬＯＣＳ構造のステム領域は一般に、開放、切断、または分解されたＬＯＣＳオリゴヌクレオチド構造のステムよりも高温で融解する。例えば、無傷のＬＯＣＳ ＡのステムＡは、開放ＬＯＣＳステムＡ’が融解する温度であるＴｍ２よりも高いＴｍ１で融解する（図１Ｂ）。同様に、無傷のＬＯＣＳ ＢのステムＢの融解温度は、開放ＬＯＣＳステムＢ’が融解する温度であるＴｍ４よりも高いＴｍ３で融解する（図１Ｂ）。特定の開放ＬＯＣＳ構造に対応する温度での（例えば、関連する蛍光マーカーによって検出される）ピークの存在は、この特定のＬＯＣＳ構造の開放を指向する標的または標的アンプリコンの存在を示す。開放ＬＯＣＳ Ａのステムは、開放ＬＯＣＳ Ｂとは異なる温度で融解するため（図１Ｂ）、同じフルオロフォアで標識された複数の開放ＬＯＣＳ構造を、単一の反応で同時に検出および分析することができる。さらに、異なるフルオロフォアで標識された複数の開放ＬＯＣＳ構造もまた、単一の反応で同時に検出および分析することができる。
これより、図２に示される例示的な実施形態を参照すると、ＬＯＣＳオリゴヌクレオチドのループ領域の配列は、例えば、ＭＮＡザイムまたは他の触媒核酸（複数可）の基質であり得る。図３Ａおよび図３Ｂに示されるさらなる実施形態では、ＬＯＣＳオリゴヌクレオチドのループ領域は、検出される標的に完全にまたは部分的に相補的であり、かつ二本鎖の場合、エキソヌクレアーゼによる、例えば、ポリメラーゼに固有のエキソヌクレアー
ゼ活性による分解のための基質として機能することができる、標的特異的配列であり得る。図３Ｂに示されるさらに別の例示的な実施形態では、ループ内の標的特異的配列は、二本鎖制限酵素認識部位の一本鎖をさらに含み得る。標的配列へのループ配列のハイブリダイゼーションは、機能的で切断可能な制限部位をもたらし得る。好ましい実施形態では、制限酵素は、標的を無傷のまま残しながら、ＬＯＣＳオリゴヌクレオチドのループ鎖を切断することができるニッキング酵素である。
特定の実施形態では、本発明のＬＯＣＳオリゴヌクレオチドを使用して、標的を直接的に検出することができる。他の例示的な実施形態では、ＬＯＣＳを使用して、ＰＣＲ、ＲＴ－ＰＣＲ、ＳＤＡ、ＨＤＡ、ＲＰＡ、ＬＡＭＰ、ＲＣＡ、ＴＭＡ、３ＳＲ、またはＮＡＳＢＡを含むがこれらに限定されない、標的増幅技術によって生成される標的アンプリコンを検出することができる。ＬＯＣＳの開放をもたらす切断または分解は、標的増幅中にリアルタイムで生じても、増幅に続いて、反応の終点で実行されてもよい。ループ領域は、ＭＮＡザイム、ＤＮＡザイム、リボザイムを含むがこれらに限定されない、触媒核酸の酵素活性によって、またはエキソヌクレアーゼもしくはエンドヌクレアーゼを含むタンパク質酵素の酵素活性によって媒介される標的依存切断または分解によって開放することができる。非限定的な例として、エキソヌクレアーゼ活性は、例えば、ポリメラーゼの固有の触媒活性であり得る。非限定的な例として、エンドヌクレアーゼ活性は、例えば、ニッキングエンドヌクレアーゼ、リボエンドヌクレアーゼ、または二重特異性ヌクレアーゼ（ＤＳＮ）を含む制限酵素の固有の触媒活性であり得る。
それにより、ループ領域が触媒核酸の基質を含む例示的な戦略を、図２に示す。この戦略では、ＬＯＣＳオリゴヌクレオチドは、任意の標的の検出に使用することができるユニバーサル基質を含む。ＬＯＣＳオリゴヌクレオチドは、ステム領域、フルオロフォアクエンチャー／色素対、およびＭＮＡザイムなどの触媒核酸のユニバーサル基質を含む介在ループ領域を含有する。ＭＮＡザイムは、標的を直接的に検出しても、標的増幅中に生成されたアンプリコンの検出に使用してもよい。ＭＮＡザイムは、パートザイムの標的センサーアームが標的上または標的アンプリコン上で隣接して整列して、活性触媒コアを形成するときに形成される。ＬＯＣＳオリゴヌクレオチドのループ領域は、ＭＮＡザイムの基質結合アームに結合し、ループ内の基質は、ＭＮＡザイムによって切断され、これにより、ＬＯＣＳが開放され、蛍光シグナルが生成される。その後、開放ＬＯＣＳ構造のステムが再アニーリングされるように、反応を冷却してもよい。その後、反応を加熱し、融解曲線分析を実行して、開放ＬＯＣＳステム領域が融解する温度を測定することができる。当業者は、標的がリアルタイムでまたは反応の終了時に検出され得ることを認識するであろう。
複数の標的を同時に検出するように設計した反応は、各々が、ループ内の異なるユニバーサル基質、および異なるＭＮＡザイムによる基質／ループの切断後に異なる温度で融解することができる異なるステム領域を含む、複数のＬＯＣＳオリゴヌクレオチドを含有し得る。ＬＯＣＳオリゴヌクレオチドは、同じフルオロフォア／クエンチャー色素対をさらに含み得る。例として、ＭＮＡザイム１は、標的１の存在下で形成され、ＬＯＣＳオリゴヌクレオチド１内の基質１を切断することができる。これは、温度１で融解するステム１を含有する切断された二本鎖の開放ＬＯＣＳ構造１をもたらす。同時に、ＭＮＡザイム２は、標的２の存在下で形成され、ＬＯＣＳオリゴヌクレオチド２内の基質２を切断することができ、温度２で融解するステム２を含有する切断された二本鎖の開放ＬＯＣＳ構造２をもたらす。反応の融解プロファイルを分析すると、温度１でのピークの存在は、標的１の存在を示し、温度２でのピークの存在は、標的２の存在を示し、温度１および２での２つのピークの存在は、標的１および標的２の両方の存在を示す。したがって、機器の単一チャネルで読み取った単一波長は、２つの標的の検出および識別を可能にする。
反応混合物は、異なるフルオロフォアおよびクエンチャー対で標識された追加のＬＯＣＳをさらに含有することができる。例として、ＬＯＣＳオリゴヌクレオチド１および２は、フルオロフォアＡで標識することができ、ＬＯＣＳオリゴヌクレオチド３および４は、フルオロフォアＢで標識することができる。ＭＮＡザイム１は、標的１の存在下で形成され、ＬＯＣＳオリゴヌクレオチド１内の基質１を切断することができ、温度１で融解するステム１を含有する切断された二本鎖開放ＬＯＣＳ構造１をもたらす。ＭＮＡザイム２は、標的２の存在下で形成され、ＬＯＣＳオリゴヌクレオチド２内の基質２を切断することができ、温度２で融解するステム２を含有する切断された二本鎖の開放ＬＯＣＳ構造２をもたらす。ＭＮＡザイム３は、標的３の存在下で形成され、ＬＯＣＳオリゴヌクレオチド３内の基質３を切断することができ、温度３で融解するステム３を含有する切断された二本鎖の開放ＬＯＣＳ構造３をもたらす。ＭＮＡザイム４は、標的４の存在下で形成され、ＬＯＣＳオリゴヌクレオチド４内の基質４を切断することができ、温度４で融解するステム４を含有する切断された二本鎖の開放ＬＯＣＳ構造４をもたらす。反応の融解プロファイルをフルオロフォアＡの励起波長で分析すると、温度１でのピークの存在は、標的１の存在を示し、温度２でのピークの存在は、標的２の存在を示し、温度１および２での２つのピークの存在は、標的１および標的２の両方の存在を示す。反応の融解プロファイルをフルオロフォアＢの励起波長で分析すると、温度３でのピークの存在は、標的３の存在を示し、温度４でのピークの存在は、標的４の存在を示し、温度３および４での４つのピークの存在は、標的３および標的２の両方の存在を示す。したがって、機器の２つのチャネルで読み取った２つの波長での分析は、４つの標的の検出および識別を可能にする。当業者は、戦略を拡張して、１つの特定の波長で３つ以上の標的の切断を監視することができ、さらに分析されるフルオロフォアの数を、個々の波長の識別に利用可能な機器の最大容量によって決定される数まで増加させることができることを認識する。
これより、図３に示される例示的な実施形態を参照すると、標的および／またはアンプリコンに特異的かつ相補的なループ領域を有するＬＯＣＳオリゴヌクレオチドを使用して標的を検出するための２つの例示的な戦略が示される。これより、図３Ａに示される実施形態参照すると、ＬＯＣＳオリゴヌクレオチドは、ステム領域、フルオロフォアクエンチャー色素対、および標的アンプリコンに相補的な領域を含むループ領域を含有する。増幅中、ＬＯＣＳオリゴヌクレオチドのループ領域は、標的アンプリコンに結合する。プライマーの伸長中、ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性は、ループ領域を分解し、ステム領域を無傷のまま残し、リアルタイムで蛍光シグナルを生成する。増幅後、分解された開放ＬＯＣＳ構造のステムが再アニーリングされるように、反応を冷却してもよく、その後融解曲線分析を実行して、分解された開放ＬＯＣＳに由来するステム領域が融解する温度を測定することができる。当業者は、標的がリアルタイムでまたは反応の終了時に検出され得ることを認識するであろう。
図３Ｂに示されるさらなる例示的な実施形態では、ＬＯＣＳオリゴヌクレオチドは、ステム領域、フルオロフォア／クエンチャー色素対、および標的に相補的な領域を含み、かつ制限酵素、例えば、ニッキング酵素の認識部位をさらに含む、ループ領域を含有する。ＬＯＣＳオリゴヌクレオチドのループ領域が、標的に結合すると、ニッキング酵素は、ＬＯＣＳのループ鎖を切断し、標的を無傷のまま残し、蛍光シグナルを生成する。切断された開放ＬＯＣＳ構造の無傷のステムが再アニーリングされるように、反応を冷却してもよく、その後融解曲線分析を実行して、切断された開放ＬＯＣＳに由来するステム領域が融解する温度を測定することができる。当業者は、標的が事前に増幅せずに反応で直接的に検出され得ることを容易に認識するであろう。さらに、当業者は、標的増幅によって生成される標的アンプリコンがリアルタイムでまたは反応の終了時に検出され得ることを認識するであろう。好ましい実施形態では、標的増幅と組み合わせて使用される制限酵素は、反応温度（複数可）で活性かつ熱安定性であり得る。
さらなる例示的な実施形態では、ＬＯＣＳオリゴヌクレオチドは、ステム領域、フルオロフォア／クエンチャー色素対、およびＤＮＡザイムまたはリボザイム、例えば、金属イオンの存在下でのみ触媒活性であり得るＤＮＡザイムまたはリボザイムの基質を含み得るループ領域を含有し得る。特定のＤＮＡザイムおよびリボザイムは、触媒活性を可能にするのに金属カチオン補因子を必要とすることが当該技術分野で知られている。例えば、いくつかのＤＮＡザイムおよびリボザイムは、例えば、鉛または水銀の存在下でのみ触媒活性であり得る。そのような金属は、例えば、環境試料中に存在し得る。ＬＯＣＳオリゴヌクレオチドが、例えば、鉛に依存するＤＮＡザイムまたはリボザイムの基質を含むループを含有する場合、試料中の鉛の存在は、ＬＯＣＳの切断および蛍光シグナルの生成をもたらすことができる。切断された開放ＬＯＣＳ構造の無傷のステムが再アニーリングされるように、反応を冷却してもよく、その後融解曲線分析を実行して、切断された開放ＬＯＣＳに由来するステム領域が融解する温度を測定することができる。当業者は、各々が特定の金属補因子に依存する複数のＤＮＡザイムおよび／またはリボザイムを、複数の標的、例えば、鉛および水銀を検出するように設計した単一の反応で組み合わせることができることを容易に認識するであろう。さらに、当業者は、標的がリアルタイムでまたは反応の終了時に検出され得ることを認識するであろう。
本明細書において、ヌクレオチドの別の配列に「実質的に相補的」であるヌクレオチドの配列への言及は、第１の配列が、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００個、またはそれ以上のヌクレオチドの領域にわたって、第２の配列の相補体と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一であることを意味し得る。
本明細書において、ヌクレオチドの別の配列に「相補的」であるヌクレオチドの配列は、第１の配列が、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００個、またはそれ以上の領域にわたって、第２の配列の相補体と１００％同一であることを意味し得る。
本明細書において、ヌクレオチドの別の配列に「実質的に非相補的」であるヌクレオチド配列への言及は、第１の配列が、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００個、またはそれ以上のヌクレオチドの領域にわたって、第２の配列の相補体と少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、または４０％未満同一であることを意味し得る。
本明細書において、ヌクレオチドの別の配列に「非相補的」であるヌクレオチドの配列は、第１の配列が、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００個、またはそれ以上のヌクレオチドの領域にわたって、第２の配列の相補体と０％同一であることを意味し得る。
ＬＯＣＳオリゴヌクレオチドを使用して検出することができる標的核酸（すなわち、ポリヌクレオチド）の非限定的な例には、ＤＮＡ、メチル化ＤＮＡ、アルキル化ＤＮＡ、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ＲＮＡ、メチル化ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｔＲＮＡ、ｓｍＲＮＡ、プレおよびプリ
マイクロＲＮＡ、他の非コードＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、それらの誘導体、それらのアンプリコン、またはそれらの任意の組み合わせ（デオキシリボヌクレオチド塩基とリボヌクレオチド塩基との混合ポリマーを含む）が含まれる。
いくつかの実施形態では、無傷のＬＯＣＳオリゴヌクレオチドの融解温度（「Ｔｍ」）は、開放ＬＯＣＳ構造のＴｍよりも高い。
蛍光シグナルの分析
開放ＬＯＣＳ構造の解離によって生成される蛍光シグナルは、本発明の方法に従って、標的分子を検出、鑑別、および／または定量化するための任意の好適な方法で分析することができる。
標準的な融解曲線分析を使用することができるが、様々なアッセイ形式の分析に容易に採用され得る様々な他のアプローチが、本明細書に開示および例証されている（実施例を参照されたい）。
非限定的な例として、単一の温度または複数の温度での蛍光シグナルの測定は、ＬＯＣＳオリゴヌクレオチドのループ領域の切断または分解の検出に好適な反応における様々な時点で得ることができる。非限定的な例として、これらの時点は、（ｉ）反応の開始時の時点、および／または（ｉ）反応過程における単一の時点もしくは複数の時点、および／または（ｉｉｉ）反応の終結の時点もしくは終点を含み得る。
いくつかの実施形態では、蛍光シグナルの測定は、ＰＣＲ増幅中の各サイクルでの２つ以上の温度で得ることができる。分析は、第１および／もしくは第２の温度で、ならびに／またはさらなる温度で得られた蛍光のレベルを比較することによって実行することができる。
他の実施形態では、蛍光シグナルの測定は、ＰＣＲ中の各サイクルでの２つ以上の温度で得ることができ、増幅曲線を、各温度で得られた各一連の測定についてプロットすることができる。閾値蛍光値は、特定の各温度について各増幅プロットに割り当てることができ、Ｃｑ値は、増幅プロットが閾値を超えるサイクル数として測定することができる。蛍光シグナルの測定が、ＰＣＲ中の各サイクルでの２つの温度で得られる実施形態では、より低い温度で蛍光シグナルを使用して測定されたＣｑが、第１の標的の開始濃度の直接的な定量化を可能にすることができ、より高い温度で蛍光シグナルを使用して測定されたＣｑを、実施例１２に例証されるように分析して、故に第２の標的の開始濃度の定量化を可能にすることができる。
非限定的な例として、第１の開放ＬＯＣＳの融解温度以上かつ第２の開放ＬＯＣＳの融解温度未満である第１の温度、および第２の開放ＬＯＣＳの融解温度以上である第２の温度を含む２つの温度での、無鋳型対照と比較した蛍光の増幅後の測定は、第１および第２の切断された開放ＬＯＣＳの特異的な検出を可能にする。実施例１５（分析方法Ａ）に実証されるように、第１の温度では、第１のＬＯＣＳの切断は、無鋳型対照反応と比較して、有意な蛍光シグナルを生成し、事前に決定された閾値を超える。この第１の温度では、無傷の第１および第２の閉鎖ＬＯＣＳ、ならびに／または切断された第２の開放ＬＯＣＳは、第１および第２の閉鎖ＬＯＣＳならびに第２の開放ＬＯＣＳのより高い融解温度のために、有意な蛍光シグナルの生成に寄与せず、事前に決定された閾値を超えない。第１の温度よりも高い第２の温度では、第２のＬＯＣＳの切断は、無鋳型対照と比較して、有意な蛍光シグナルを生成し、事前に決定された閾値を超えるが、無傷の第１および第２の閉鎖ＬＯＣＳならびに／または第１の開放ＬＯＣＳは、無鋳型対照と比較して、有意な蛍光シグナルの生成に寄与せず、事前に決定された閾値を超えない。切断された各ＬＯＣＳレ
ポーターの検出は、試料中の対応する標的の存在を示す。
非限定的な例として、第１の閉鎖ＬＯＣＳの融解温度以上かつ第２の閉鎖ＬＯＣＳの融解温度未満である第１の温度、および第２の閉鎖ＬＯＣＳの融解温度以上である第２の温度を含む、特定の温度点での対照ベースライン蛍光と比較した蛍光の増幅後の測定は、第１および第２の切断された開放ＬＯＣＳの特異的な検出を可能にする。
実施例１５（分析方法Ｂ）に実証されるように、対照ベースライン蛍光は、開放および／または閉鎖ＬＯＣＳのいずれも有意な蛍光シグナルを生成しない温度（温度－０）以下で蛍光を測定することによって得ることができる。分析は、第１および／または第２の温度ならびに温度－０で得られた蛍光のレベルを比較し、これらの相対的な蛍光のレベルを事前に決定された閾値に対して比較することによって、実行することができる。実施例１５に実証されるように、第１の温度では、第１のＬＯＣＳの切断は、温度－０でのシグナルと比較して、有意な蛍光シグナルを生成し、事前に決定された閾値を超える。この第１の温度では、無傷の第１および第２の閉鎖ＬＯＣＳ、および／または切断された第２の開放ＬＯＣＳは、有意な蛍光シグナルの生成に寄与せず、シグナルは所定の閾値を超えない。これは、第１および第２の閉鎖ＬＯＣＳならびに第２の開放ＬＯＣＳのより高い融解温度によるものである。第１の温度よりも高い第２の温度では、第２のＬＯＣＳの切断は、温度－０で得られたシグナルと比較して、および／または第１の温度と比較して、有意な蛍光シグナルを生成し、シグナルは、事前に決定された閾値を超える。この第２の温度では、無傷の第１および／または第２の閉鎖ＬＯＣＳ、ならびに第１の開放ＬＯＣＳは、温度－０および／または第１の温度でのシグナルと比較して、有意な蛍光シグナルの生成に寄与せず、事前に決定された閾値を超えない。切断された各ＬＯＣＳレポーターの検出は、試料中の対応する標的の存在を示す。
非限定的な例として、対照ベースライン蛍光はまた、反応の開始時の追加の時点、例えば、ＰＣＲ前などで、第１および第２の温度での蛍光を測定することによっても得ることができる。この追加の時点では、全てのＬＯＣＳは、無傷（閉鎖）であり、有意な蛍光シグナルを生成せず、事前に決定された閾値を超えない。分析は、反応の開始時の時点で第１および第２の温度で得られた蛍光のレベルと、反応中および／または反応後の時点（例えば、ＰＣＲ中またはＰＣＲ後）で第１および第２の温度で得られた蛍光のレベルとを比較することによって、実行することができる。実施例１５（分析方法Ｃ）に実証されるように、第１の温度およびＰＣＲ後の時点で、第１のＬＯＣＳの切断は、第１の温度およびＰＣＲ前の時点で測定した無傷の第１の閉鎖ＬＯＣＳと比較して、有意な蛍光シグナルを生成する。この相対的なシグナルは、事前に決定された閾値を超える。この第１の温度では、無傷の第１および第２の閉鎖ＬＯＣＳ、ならびに／または切断された第２の開放ＬＯＣＳは、第１および第２の閉鎖ＬＯＣＳならびに第２の開放ＬＯＣＳのより高い融解温度のために、ＰＣＲ前に得られたシグナルと比較して、有意な蛍光シグナルの生成に寄与しない。第１の温度よりも高い第２の温度およびＰＣＲ後の時点では、第２のＬＯＣＳの切断は、第２の温度でＰＣＲ前の時点で得られたシグナルと比較して、有意な蛍光シグナルを生成する。この第２の温度およびＰＣＲ後の時点では、無傷の第１もしくは第２の閉鎖ＬＯＣＳ、ならびに／または第１の開放ＬＯＣＳは、同じ第２の温度でのＰＣＲ前の時点と比較して、有意な蛍光シグナルの生成に寄与せず、事前に決定された閾値を超えない。あるいは、第２の温度でＰＣＲ前後に得られた相対的なシグナルと、第１の温度でＰＣＲ前後に得られた相対的なシグナルとの間の差を、事前に決定された閾値と比較して、切断された第２のＬＯＣＳの存在を決定し、ここで実施例１５（分析方法Ｃ）に実証されるように、第２の開放ＬＯＣＳが存在下では、差の値は、事前に決定された閾値よりも大きく、不在下では、差の値は、事前に決定された閾値よりも小さい。切断された各ＬＯＣＳレポーターの検出は、試料中の対応する標的の存在を示す。
非限定的な例として、別の代替的な方法は、切断された各ＬＯＣＳのＴｍでのｄ蛍光／ｄ温度（ｄＦ／ｄＴ）値に相当する、融解特性の融解ピークの高さを測定することである。しかしながら、この方法の有用性は、切断されたＬＯＣＳのＴｍでのｄＦ／ｄＴ値の決定には限定されず、Ｔｍを含む一連の温度も含む。第１または第２の温度（Ａ℃）でのｄＦ／ｄＴ値は、（Ａ－Ｎ）℃および（Ａ＋Ｎ）℃にわたる蛍光レベルの勾配に相当する。実施例１５（分析方法Ｄ）に実証されるように、（第１の温度＋Ｎ）℃および（第１の温度－Ｎ）℃での蛍光シグナルから計算した第１の温度でのｄＦ／ｄＴ値は、第１の開放ＬＯＣＳの存在下でのみ、事前に決定された閾値よりも高い。（第２の温度＋Ｎ）℃および（第２の温度－Ｎ）℃での蛍光シグナルから計算した、第１の温度よりも高い第２の温度でのｄＦ／ｄＴ値は、第２の開放ＬＯＣＳの存在下でのみ、事前に決定された閾値よりも高い。切断された各ＬＯＣＳレポーターの検出は、試料中の対応する標的遺伝子の存在を示す。第１および第２の温度でのｄＦ／ｄＴは、開放とＬＯＣＳとの可能な組み合わせの各々に固有の比として表すことができる。この情報を使用して、比が事前に定義された値の範囲内にあるかどうかを決定することによって、特定の開放ＬＯＣＳ、およびしたがって対応する標的を検出することができる。
いくつかの実施形態では、蛍光シグナルまたはそれらの誘導体を、第１の温度、第２の温度、および／またはさらなる温度で、事前に決定された閾値と比較し、ここで切断された第１の開放ＬＯＣＳからのシグナルは、第１の温度で事前に決定された閾値を超え、切断された開放ＬＯＣＳは、第２の温度で事前に決定された閾値を超え、無傷の第１および第２の閉鎖ＬＯＣＳは、第１および第２の温度で事前に決定された閾値を超えない。したがって、第１および第２の温度での事前に決定された閾値の有用性を使用して、切断された第１および第２の開放ＬＯＣＳを検出することができる。切断された第１および第２の開放ＬＯＣＳの検出は、試料中の第１および第２の標的遺伝子の存在を示す。他の実施形態では、蛍光シグナルまたはそれらの誘導体を、第１の温度、第２の温度、および／またはさらなる温度で、比として表すことができ、ここで開放および／または閉鎖ＬＯＣＳの可能な組み合わせの各々について固有の比の値が存在する。これらの固有の比の値を使用して、切断された第１および第２の開放ＬＯＣＳを検出することができ、試料中の第１および第２の標的遺伝子の存在を示す。
いくつかの実施形態では、単一の蛍光チャネルにおける第１および第２のＬＯＣＳの使用による第１および第２の標的の検出、鑑別、および／または定量化が、説明されている。しかしながら、当業者は、本方法が、実施例１５に実証されるように、３つ以上の標的の検出、鑑別、および／または定量化に適用可能であることを認識するであろう。
ＬＯＣＳオリゴヌクレオチドの例示的な用途
－標的増幅中または増幅後の標的の検出
本発明のＬＯＣＳオリゴヌクレオチドを使用して、増幅された標的核酸配列の存在を決定することができる。ＬＯＣＳレポーターが適用され得る増幅技術に関して、具体的な制限は存在しない。標的アンプリコンの存在が、ＬＯＣＳレポーターの切断または分解を促進して、開放ＬＯＣＳ構造を生成することができることを条件として、様々な反応によって生成されるアンプリコンは、ＬＯＣＳレポーターによって検出することができる。ＬＯＣＳ構造内に含有されるループ領域の切断または分解に有用な方法の非限定的な例には、ＭＮＡザイム、ＤＮＡザイム、リボザイム、制限酵素、エンドヌクレアーゼによる切断、またはポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性を含むがこれらに限定されない、エキソヌクレアーゼによる分解が含まれる。
一般に、核酸増幅技術は、酵素（例えば、ポリメラーゼ）を利用して、１つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーが特異的に結合する標的核酸のコピーを生成する。ＬＯＣＳオリゴヌクレオチドを使用することができる増幅技術の非限定的な例には、ポリメラーゼ連
鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、ヘリカーゼ依存増幅（ＨＤＡ）、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）、ループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、自家持続配列複製（３ＳＲ）、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）のうちの１つ以上が含まれる。
当業者は、上記のＬＯＣＳオリゴヌクレオチドの用途が、非限定的な例示の目的でのみ提供されることを容易に理解するであろう。開示されるＬＯＣＳオリゴヌクレオチドは、任意のプライマーベースの核酸増幅技術で使用することができ、本発明は、具体的に記載されるそれらの実施形態にそれほど限定されない。
－ＬＯＣＳレポーターを使用して生成されるアンプリコンの検出
上記に考察したように、本発明のＬＯＣＳレポーターは、任意のポリヌクレオチド増幅技術で利用することができ、その非限定的な例には、ＰＣＲ、ＲＴ－ＰＣＲ、ＳＤＡ、ＨＤＡ、ＲＰＡ、ＬＡＭＰ、ＲＣＡ、ＴＭＡ、３ＳＲ、またはＮＡＳＢＡが含まれる。
当該技術分野で既知の任意の好適な方法を使用して切断または分解され得るＬＯＣＳレポーターを利用する技術によって生成されるアンプリコン。非限定的な例には、触媒核酸、エキソヌクレアーゼ（実施例１１を参照されたい）、エンドヌクレアーゼ（実施例１０を参照されたい）などの使用が含まれる。
ＭＮＡザイムを利用して、ＰＣＲ、ＲＴ－ＰＣＲ、ＳＤＡ、ＨＤＡ、ＲＰＡ、ＴＭＡ、ＬＡＭＰ、ＲＣＡ、３ＳＲ、およびＮＡＳＢＡなどの方法を通して生成されるアンプリコンを検出することによってＬＯＣＳレポーターを開放することができる。ＭＮＡザイムは、１つ以上のパートザイム（複数可）を含み得る。ＭＮＡザイムは、集合し、かつ例えば、集合促進剤（プライマーを使用してポリヌクレオチド配列から生成されるアンプリコンなどの検出される標的であり得る）の存在下でのみ触媒活性である、多成分核酸酵素である。ＭＮＡザイムは、１つ以上の集合促進剤の存在下で自己集合し、かつ基質を触媒的に修飾する活性ＭＮＡザイムを形成する、複数の部分酵素またはパートザイムで構成される。基質および集合促進剤（標的）は、別個の核酸分子である。パートザイムは、（ｉ）集合促進剤（標的核酸など）に結合するセンサーアーム、（ｉｉ）基質に結合する基質アーム、および（ｉｉｉ）集合時に組み合わされて、完全な触媒コアを提供する部分触媒コア配列を含む、複数のドメインを有する。ＭＮＡザイムは、例えば、異なる標的核酸配列を含む広範囲の集合促進剤を認識するように設計することができる。集合促進剤の存在に応じて、ＭＮＡザイムは、それらの基質を修飾する。この基質修飾は、シグナル生成に関連付けることができ、故にＭＮＡザイムは、酵素的に増幅された出力シグナルを生成することができる。集合促進剤は、生物学的試料または環境試料中に存在する標的核酸（例えば、プライマーを使用してポリヌクレオチド標的から生成されるアンプリコン）であり得る。そのような場合、ＭＮＡザイム活性による基質の修飾の検出は、標的の存在を示す。核酸基質を切断することができるいくつかのＭＮＡザイムが、当該技術分野で知られている。ＭＮＡザイムおよびそれらの修飾形態は、当該技術分野で知られており、ＰＣＴ特許公開番号第ＷＯ／２００７／０４１７７４号、同第ＷＯ／２００８／０４００９５号、同第ＷＯ２００８／１２２０８４号、および関連する米国特許公開番号第２００７－０２３１８１０号、同第２０１０－０１３６５３６号、および同第２０１１－０１４３３３８号（これらの文書の各々の内容の全体が、参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。
－診断用途
ＬＯＣＳオリゴヌクレオチドは、本明細書に記載の方法に従って、診断および／または予後の目的で使用することができる。診断および／または予後の方法は、エクスビボまた
はインビトロで実行することができる。しかしながら、本発明の方法は、必ずしも診断および／または予後の目的で使用される必要はなく、それ故に診断または予後ではない用途もまた、企図される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法を使用して、対象における感染を診断することができる。例えば、これらの方法を使用して、対象における細菌、ウイルス、真菌／酵母、原生生物、および／または線虫による感染を診断することができる。一実施形態では、ウイルスは、エンテロウイルスであり得る。対象は、ウシ、ウマ、ヒツジ、霊長類、鳥類、またはげっ歯類種であり得る。例えば、対象は、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、またはウシなどの哺乳動物であり得る。対象は、感染から生じる疾患に苦しんでいる可能性がある。例えば、対象は、エンテロウイルス感染から生じる髄膜炎を患っている可能性がある。したがって、特定の実施形態では、本発明の方法を使用して、髄膜炎を診断することができる。
本発明の方法は、試料に対して実行することができる。試料は、任意の供給源に由来し得る。例えば、試料は、環境源、産業源から、または化学合成によって得ることができる。
本明細書で企図される場合、「試料」は、例えば、精製、希釈、または任意の他の構成成分の添加によって、元の状態から修飾された試料を含むことが理解される。
診断および／または予後の方法を含むがこれらに限定されない、本発明の方法は、生物学的試料に対して実行することができる。生物学的試料は、対象から採取することができる。保管された生物学的試料もまた、使用することができる。好適な生物学的試料の非限定的な例には、全血またはその構成成分（例えば、血液細胞、血漿、血清）、尿、便、唾液、リンパ液、胆汁液、痰、涙、脳脊髄液、気管支肺胞上皮洗浄液、滑液、精液、腹水腫瘍液、母乳、および膿が含まれる。
キット
本発明は、本発明の方法を実行するための１つ以上の薬剤を含むキットを提供する。典型的には、本発明の方法を実行するためのキットは、本方法の実行に必要な全ての試薬を含有する。
いくつかの実施形態では、キットは、適切な集合促進剤（例えば、本明細書に記載のアンプリコン）の存在下でＭＮＡザイムを形成することができるオリゴヌクレオチド構成成分を含み得る。例えば、キットは、第１および第２のパートザイムを含む少なくとも第１および第２のオリゴヌクレオチド構成成分、ならびに基質を含む第２の容器を含むことができ、ＭＮＡザイムへの、第１および第２のパートザイムならびに基質の自己集合は、試験試料中に集合促進剤（例えば、アンプリコン）の会合を必要とする。したがって、そのような実施形態では、第１および第２のパートザイム、ならびにループ領域内の基質を含むＬＯＣＳオリゴヌクレオチドを、試験試料に適用して、１つ以上の標的アンプリコンの存在を決定することができる。一般に、キットは、本明細書で提供される少なくとも１つのＬＯＣＳオリゴヌクレオチドを含む。
典型的には、本発明のキットはまた、ＰＣＲまたは他の核酸増幅技術などの本発明の方法の実行に必要とされる他の試薬、洗浄試薬、酵素、および／または他の試薬を含む。
キットは、本明細書で定義される、断片化されたキットまたは組み合わされたキットであり得る。
断片化されたキットは、別個の容器内に収容された試薬を含み、小さなガラス容器、プラスチック容器、またはプラスチックもしくは紙のストリップを含んでもよい。そのような容器は、試料および試薬の相互汚染を回避しながら、ある区画から別の区画への試薬の効率的な移動、ならびに定量的な様式でのある区画から別の区画への各容器の薬剤または溶液の添加を可能にし得る。
そのようなキットはまた、試験試料を受容する容器、アッセイで使用される試薬を含有する容器、洗浄試薬を含有する容器、および検出試薬を含有する容器も含み得る。
組み合わされたキットは、反応アッセイの構成要素の全てを単一の容器（例えば、所望の構成要素の各々を収容する単一の箱）内に含む。
本発明のキットはまた、キット構成要素を使用して、適切な方法を行うための説明書も含み得る。本発明のキットおよび方法は、例えば、リアルタイムＰＣＲ機械を含むがこれに限定されない、自動化分析装置およびシステムと組み合わせて使用することができる。
異なる標的の増幅、検出、特定、または定量化に対する用途には、本発明の単一のキットが適用可能である場合も、あるいは例えば、各標的に特異的な試薬を含有する異なるキットが必要とされる場合もある。本発明の方法およびキットは、任意の実体を検出、特定、または定量化することが望ましい任意の状況で用途を見出す。
特定の実施形態に開示されるように、広範に説明される本発明の趣旨または範囲から逸脱することなく、本発明に対して多数の変形および／または修正を行うことができることが、当業者によって理解される。したがって、本実施形態は、全ての観点において例示的であり、限定的ではないと見なされるべきである。
これより、本発明を、以下の特定の実施例を参照することによってさらに詳細に説明するが、これらの実施例は、決して本発明の範囲を制限するものとして解釈されるべきではない。
実施例１：多重化能力を増加させるためのＬＯＣＳレポーターの使用
以下の実施例では、ＬＯＣＳレポーターを使用して、単一の蛍光チャネルから検出することができる標的の数を増加させる。この実施例では、２つのＬＯＣＳレポーターを、フルオロフォア（ＦＡＭ）で５’標識し、クエンチャーで３’標識する。ＬＯＣＳレポーターのループ領域は、核酸基質を含有し、ステム領域は、ＬＯＣＳレポーターをステムループ構成に拘束する一連の相補的な塩基対を含有する。この構成では、フルオロフォアおよびクエンチャーは近接しており、標的の不在下では蛍光がクエンチされる。
オリゴヌクレオチド
この実験に特異的なオリゴヌクレオチドには、ＬＯＣＳ－１（配列番号１）、ＬＯＣＳ－２（配列番号２）、パートザイムＡ１（配列番号３）、パートザイムＢ１（配列番号４）、パートザイムＡ２（配列番号５）、パートザイムＢ２（配列番号６）、順方向プライマー１（配列番号７）、逆方向プライマー１（配列番号８）、順方向プライマー２（配列番号９）、および逆方向プライマー２（配列番号１０）が含まれる。配列は、配列表に列挙する。ＭｇＰａの増幅および検出に特異的なオリゴヌクレオチドは、ＬＯＣＳ－１、パートザイムＡ１、パートザイムＢ１、順方向プライマー１、および逆方向プライマー１である。ＴＶ－Ｂｔｕｂの増幅および検出に特異的なオリゴヌクレオチドは、ＬＯＣＳ－２、パートザイムＡ２、パートザイムＢ２、順方向プライマー２、および逆方向プライマー２である。
反応条件
ＢｉｏＲａｄ（登録商標）ＣＦＸ９６熱サイクラーを使用して、２０μＬの合計反応体積で標的配列のリアルタイム増幅および検出を実行した。サイクリングパラメータは、９５℃で２分間、９５℃で５秒間および６１℃で３０秒間のタッチダウンサイクルを１０回（１サイクルあたり０．５℃の減衰）、ならびに９５℃で５秒間および５２℃で４０秒間のサイクルを４０回（データは５２℃のステップで収集）であった。融解曲線パラメータは、２０℃から９０℃まで０．５℃の増分で、５秒間保持した（データ収集は保留）。全ての反応は、二連で実行し、４０ｎＭの各順方向プライマー、２００ｎＭの各逆方向プライマー、２００ｎＭの各パートザイムＡ、２００ｎＭの各パートザイムＢ、２００ｎＭの各ＬＯＣＳレポーター、２ｍＭのＭｇＣｌ２（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、および１つのＳｅｎｓｉＦＡＳＴプローブＮｏ－ＲＯＸ混合物（Ｂｉｏｌｉｎｅ）を含有した。反応は、ＭｇＰａおよび／もしくはＴＶ－Ｂｔｕｂ遺伝子に相同なＧ－Ｂｌｏｃｋ鋳型（１０，０００もしくは４０コピー）を含有するか、または標的なし（無ヌクレアーゼＨ２Ｏ（ＮＦ Ｈ２Ｏ））のいずれかであった。
結果
ＰＣＲとして知られているインビトロ標的増幅法を使用して、２つのＭＮＡザイム（ＭＮＡザイム１およびＭＮＡザイム２）を使用して、それらの対応するＬＯＣＳレポーター（それぞれＬＯＣＳ－１およびＬＯＣＳ－２）の切断を介して標的核酸の増幅をリアルタイムで監視する。ＭＮＡザイム１は、ＭｇＰａ遺伝子（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ）に相同な配列を検出し、ＬＯＣＳ－１を切断および開放するように設計し、ＭＮＡザイム２は、ＴＶ－Ｂｔｕｂ（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓ）に相同な配列を検出し、ＬＯＣＳ－２を切断および開放するように設計した。この実験では、増幅および検出は、全てのＭＮＡザイム、プライマー、およびＬＯＣＳオリゴヌクレオチドを含有する単一の管内で実行した。ＭｇＰａもしくはＴＶ－Ｂｔｕｂのいずれか、またはＭｇＰａおよびＴＶ－Ｂｔｕｂの両方（同時感染を有する試料を表す）の存在は、ＦＡＭチャネルにおけるシグナルの増加によって検出した。
図４に示される結果は、１０，０００コピー（黒線）、４０コピー（灰色線）、または０コピー（点線）の標的ＭｇＰａ（図４Ａ）、ＴＶ－Ｂｔｕｂ（図４Ｃ）、またはＭｇＰａおよびＴＶ－Ｂｔｕｂの両方（図４Ｅ）を含有する反応から得られたＰＣＲ増幅プロットを示す。１０，０００コピー（黒線）および４０コピー（灰色線）を含有する反応から増幅後に得られた融解曲線特性を、標的ＭｇＰａ（図４Ｂ）、ＴＶ－Ｂｔｕｂ（図４Ｄ）、またはＭｇＰａおよびＴＶ－Ｂｔｕｂの両方（図４Ｆ）について示す。結果は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ（バージョン１４）を使用してプロットした二連の反応の平均である。この実施例のデータは、ＭｇＰａ遺伝子標的（Ｔｍ＝３５℃および４１℃）の存在下で生成されるＬＯＣＳ融解特性が、ＴＶ－Ｂｔｕｂ遺伝子標的（Ｔｍ＝５０℃）の存在下で生成されたＬＯＣＳ融解特性とは異なることを実証する。さらに、ＭｇＰａおよびＴＶ－Ｂｔｕｂの両方の遺伝子標的の存在下でのＬＯＣＳ融解特性はまた、単一の遺伝子標的のみが存在する前述の融解特性とも異なる。両方の標的が存在する場合、融解曲線特性（Ｔｍ＝３５℃、４１℃、および５０℃）は、両方の標的が検出されたことを示す。
この実験のデータはまた、各開放ＬＯＣＳの融解特性が、高い標的濃度（１０，０００遺伝子コピー）および低い標的濃度（４０遺伝子コピー）を含有する反応について再現可能であったことも実証する。この実施例は、単一のウェル内で単一の蛍光チャネルを使用して同時増幅した２つの標的を、それらの固有のＬＯＣＳ融解特性に基づいて区別することができることを実証する。この実施例は、単一の蛍光チャネルを使用して単一のウェル内の複数の標的を検出するのに有用な簡便な方法を提供する。
無傷の閉鎖ＬＯＣＳレポーターの融解温度（Ｔｍ）は、これらのＬＯＣＳが標的増幅の不在下でも反応中に依然として十分にクエンチされるように、反応のアニーリング温度（５２℃）よりも大きくなるように設計した。ステム領域のＴｍは、各ＬＯＣＳレポーターについて固有であるように設計し、これは、ステムを形成する相補領域の長さおよびヌクレオチド組成を修飾することによって達成した。この実施例では、このデータは、ＭＮＡザイムを使用するループ領域の切断が、ＬＯＣＳの開放をもたらし、２つの断片への分離を可能にするというシナリオと一致している。無傷の閉鎖ＬＯＣＳレポーターと開放ＬＯＣレポーターとの間のＴｍの大きな差により、開放ＬＯＣＳ断片は、アニーリングおよびデータ収集温度で二重鎖形成を持続するのに十分安定しておらず、故に蛍光シグナルが生成される。
２つの標的遺伝子のリアルタイム監視により、Ｃｔ（サイクル閾値）として知られている値を生成する任意の閾値を超える蛍光曲線が生成された。増幅段階において観察された蛍光曲線は、標的遺伝子の一方または両方が所与の試料中に存在することを示す。しかしながら、特定の標的の同一性は、増幅曲線を単独で使用して識別することはできない。この状況では、融解曲線分析を実行して、どのＬＯＣＳレポーターが切断されたかを決定し、それにより、試料中に存在する特定の遺伝子標的（複数可）を特定した。増幅段階後、試料は、異なる融解曲線特性が異なるユニバーサルステムに対応する温度勾配に曝露した。開放ＬＯＣＳレポーターと無傷のＬＯＣＳレポーターとの間のＴｍの差により、切断されたＬＯＣＳレポーターステムは、切断されていない閉鎖ＬＯＣＳと比較して、より低温で解離する。さらに、異なるステムの長さおよび塩基対組成により、ＬＯＣＳ－１およびＬＯＣＳ－２内の異なるステム（ステム１およびステム２）は、固有の蛍光融解曲線特性を生成した。
実施例２：様々な遺伝子標的の検出のための同じＬＯＣＳレポーターの適用
この実施例では、２つのＬＯＣＳレポーター（ＬＯＣＳ－１およびＬＯＣＳ－２）を使用して、様々な異なる遺伝子標的を区別して、対象となる任意の標的の分析に対するそれらのユニバーサルおよび適用性を実証する。ＰＣＲ増幅を使用して、いくつかのＭＮＡザイム（ＭＮＡザイム１～６）を使用して、それらの特定の遺伝子標的を検出し、それらの対応するＬＯＣＳレポーター（ＬＯＣＳ－１およびＬＯＣＳ－２）を切断した。ＭＮＡザイム１、３、および４は各々、それらの対応する遺伝子標的の存在下でＬＯＣＳ－１を切断する能力を有する。ＭＮＡザイム２、５、および６は各々、それらの対応する遺伝子標的の存在下でＬＯＣＳ－２を切断する能力を有する。この実施例では、表１に要約される二重鎖の組み合わせを実証し、増幅および検出を単一の管内で同時に実行する。
オリゴヌクレオチド
この実験に特異的なオリゴヌクレオチドには、ＬＯＣＳ－１（配列番号１）、ＬＯＣＳ－２（配列番号２）、パートザイムＡ１（配列番号３）、パートザイムＢ１（配列番号４）、パートザイムＡ２（配列番号５）、パートザイムＢ２（配列番号６）、順方向プライマー１（配列番号７）、逆方向プライマー１（配列番号８）、順方向プライマー２（配列番号９）、逆方向プライマー２（配列番号１０）、パートザイムＡ３（配列番号１１）、パートザイムＢ３（配列番号１２）、パートザイムＡ４（配列番号１３）、パートザイムＢ４（配列番号１４）、順方向プライマー３（配列番号１５）、逆方向プライマー３（配列番号１６）、順方向プライマー４（配列番号１７）、逆方向プライマー４（配列番号１８）、パートザイムＡ５（配列番号１９）、パートザイムＢ５（配列番号２０）、パートザイムＡ６（配列番号２１）、パートザイムＢ６（配列番号２２）、順方向プライマー５（配列番号２３）、逆方向プライマー５（配列番号２４）、順方向プライマー６（配列番号２５）、および逆方向プライマー６（配列番号２６）が含まれる。配列は、配列表に列挙する。
反応構成成分および条件。
ＢｉｏＲａｄ（登録商標）ＣＦＸ９６熱サイクラーを使用して、２０μＬの合計反応体積で標的配列のリアルタイム増幅および検出を実行した。サイクリングパラメータは、９５℃で２分間、９５℃で５秒間および６１℃で３０秒間のタッチダウンサイクルを１０回（１サイクルあたり０．５℃の減衰）、ならびに９５℃で５秒間および５２℃で４０秒間のサイクルを４０回（データは５２℃のステップで収集）であった。融解曲線パラメータは、２０℃から９０℃まで０．５℃の増分で、５秒間保持した（データ収集は保留）。全ての反応は、表１に示されるオリゴヌクレオチドを含有する二連の反応として実行した。各反応は、４０ｎＭの各順方向プライマー、２００ｎＭの各逆方向プライマー、２００ｎＭの各パートザイムＡ、２００ｎＭの各パートザイムＢ、２００ｎＭの各ＬＯＣＳレポーター、２ｍＭのＭｇＣｌ２（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、および１つのＳｅｎｓｉＦＡＳＴプローブＮｏ－ＲＯＸ混合物（Ｂｉｏｌｉｎｅ）を含有した。反応は、Ｇ－Ｂｌｏｃｋ鋳型（１０，０００もしくは４０コピー）を含有するか、または標的なし（ＮＦ Ｈ２Ｏ）のいずれかであった。図５および６に示される結果は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ（バージョン１４）を使用してプロットした二連の平均である。
結果
図５（上部パネル）に示される結果は、１０，０００コピー（黒線）、４０コピー（灰色線）、または０コピー（点線）のＭｇＰａ（図５Ａ１）、ＨＭＰＶ（図５Ｂ１）、およびＣＴ－ｏｍｐＡ（図５Ｃ１）を含有する反応について得られたＰＣＲ増幅プロットを示す。下部パネルに示される結果は、１０，０００コピー（黒線）および４０コピー（灰色線）のＭｇＰａ（図５Ａ２）、ＨＭＰＶ（図５Ｂ２）、およびＣＴ－ｏｍｐＡ（図５Ｃ２）遺伝子標的を含有する反応から得られた融解曲線特性である。３つの標的は、ＭＮＡザイム１、３、および５で特異的に検出され、これらの各々は、標的特異的センサーアームを有したが、これらの全ては、同一の基質結合アームを有した。各ＭＮＡザイムは、その標的集合促進剤の存在下で形成されると、第１のユニバーサル基質および第１のユニバーサルステムを含む同じユニバーサルＬＯＣＳ－１に結合し、それを切断し、それを開放す
ることができた。したがって、各標的の存在は、第１のユニバーサルステムのＴｍに対応する４０℃にピークを有する融解曲線を生成した。
図６（上部パネル）に示される結果は、１０，０００コピー（黒線）、４０コピー（灰色線）、または０コピー（点線）の標的ＴＶ－Ｂｔｕｂ（図６Ａ１）、ＶＺＶ（図６Ｂ１）、およびｒｐｏＢ（図６Ｃ１）を含有する反応について得られたＰＣＲ増幅プロットを示す。下部パネルに示される結果は、１０，０００コピー（黒線）または４０コピー（灰色線）のＴＶ－Ｂｔｕｂ（図６Ａ２）、ＶＺＶ（図６Ｂ２）、およびｒｐｏＢ（図６Ｃ２）遺伝子標的を含有する反応から得られた融解曲線特性である。４つの標的は、ＭＮＡザイム２、３、および６で特異的に検出され、これらの各々は、標的特異的センサーアームを有したが、これらの全ては、同一の基質結合アームを有した。各ＭＮＡザイムは、その標的集合促進剤の存在下で形成されると、第２のユニバーサル基質および第２のユニバーサルステムを含む同じユニバーサルＬＯＣＳ－２に結合し、それを切断し、それを開放することができた。したがって、各標的の存在は、第２のユニバーサルステムのＴｍに対応する５０℃にピークを有する融解曲線を生成した。
この実施例のデータは、異なる標的遺伝子の検出に同じユニバーサルＬＯＣＳレポーターを使用して同等の融解特性が生成されることを実証する。ＬＯＣＳ融解特性は、標的配列とは独立していることが実証されているため、任意のアッセイに容易に実装することができる。この実施例は、ＬＯＣＳレポーターがユニバーサルであり、任意の所望の標的遺伝子または転写産物の検出に適用することができることを実証する。
実施例３：異なる融解温度を有するＬＯＣＳレポーターを生成して、多重化能力を増加させるための、異なるステムの使用
この実施例では、異なるステム組成を含むＬＯＣＳレポーターを使用して、最終融解特性に対するステムの長さおよび塩基対組成の効果を実証する。本実施例では、４つのＬＯＣＳレポーターを、フルオロフォア（ＦＡＭ）で５’標識し、クエンチャーで３’標識する。ＬＯＣＳ－１およびＬＯＣＳ－３は、基質１を含有する同一のループ領域を含有するが、ＬＯＣＳ－３のステム領域（ステム３）は、ＬＯＣＳ－１のステム領域（ステム１）よりも単一の塩基対だけ長く、無傷の（閉鎖）状態および開放状態の両方でわずかにより高い予測Ｔｍを有する構造がもたらされる。標的集合促進剤（ＡＦ－ＣＴ－Ｃｄｓ）の存在下で集合を指向することができる標的センサーアーム、ならびにＬＯＣＳ－１またはＬＯＣＳ－３のいずれかのループ内で基質１に結合し、それを切断することができる基質アームを有するＭＮＡザイムを使用して、等温シグナル検出を監視した。
同様に、ＬＯＣＳ－２およびＬＯＣＳ－４は、基質２を含有する同一のループ領域を含有するが、ＬＯＣＳ－２のステム領域（ステム２）は、ＬＯＣＳ－４のステム領域（ステム４）よりも２塩基対だけ長く、無傷の（閉鎖）状態および開放状態の両方でより高い予測Ｔｍを有する構造がもたらされる。標的集合促進剤（ＡＦ－ＴＦＲＣ）の存在下で集合を指向することができる標的センサーアーム、ならびにＬＯＣＳ－２またはＬＯＣＳ－４のいずれかのループ内で基質２に結合し、それを切断することができる基質アームを有するＭＮＡザイムを使用して、ＰＣＲ増幅を監視した。
－反応構成成分および条件
この実験に特異的なオリゴヌクレオチドには、ＬＯＣＳ－１（配列番号１）、ＬＯＣＳ－２（配列番号２）、ＬＯＣＳ－３（配列番号２７）、ＬＯＣＳ－４（配列番号２８）、パートザイムＡ７（配列番号２９）、パートザイムＢ７（配列番号３０）、パートザイムＡ８（配列番号３１）、パートザイムＢ８（配列番号３２）、ＡＦ－ＣＴ－Ｃｄｓ（配列番号３３）、およびＡＦ－ＴＦＲＣ（配列番号３８）が含まれる。配列は、配列表に列挙する。
標的配列のリアルタイム検出は、２０μＬの合計反応体積で実行した。各反応は、１×ＮＨ４緩衝液（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、８ｍＭのＭｇＣｌ２（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、２００ｎＭの各パートザイム、および２００ｎＭのＬＯＣＳレポーターを含有する。反応は、１０ｎＭの最終濃度の標的集合促進剤を含有するか、または標的を欠如した（ＤＮＡ対照なし）。反応は、ＢｉｏＲａｄ（登録商標）ＣＦＸ９６熱サイクラーで５２℃でインキュベートし、収集は、合計１５０サイクルにわたって１０秒ごとに行った。次に、試料を２０℃から９０℃まで０．５℃の増分で増加する温度勾配に供し、５秒間保持すした（各保持で収集）。図７に示される結果は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ（バージョン１４）を使用してプロットした二連の平均である。
結果
表２および図７に示される結果は、標的を欠如する反応において存在する無傷の閉鎖ＬＯＣＳレポーター（点線）、ならびに特定のＬＯＣＳレポーターを切断および開放することができるＭＮＡザイムの集合を指向した標的を含有する反応における開放ＬＯＣＳレポーター（黒い線）と一致するものについて得られた融解曲線特性の差を示す。
さらに、この実施例のデータは、ステム領域の配列およびまたは長さを変更したときに得られる融解特性の差を実証する。このデータは、開放ＬＯＣＳ－１が、開放ＬＯＣＳ－３（３６℃）の融解特性と比較して、より低いＴｍ（３０℃）を有する融解特性を生成することを実証する。同様に、開放ＬＯＣＳ－４は、開放ＬＯＣＳ－２（５０℃）の融解特性と比較して、より低いＴｍ（３２℃）を有する融解特性を生成する。これらの結果は、ＬＯＣＳ－１およびＬＯＣＳ－４がそれぞれ、ＬＯＣＳ－３およびＬＯＣＳ－２よりも短いステムを有するという事実と一致している。さらに、各ＬＯＣＳは、他のＬＯＣＳレポ
ーターとは異なる固有の融解特性を生成する。この実験は、ステム領域の長さおよび組成を修飾することによって、異なる融解特性を生成することができることを実証する。したがって、一式のＬＯＣＳレポーターを同時に使用して、単一のチャネルからの複数の標的の検出を達成することができる。さらに、この実験で生成されたデータは、等温標的検出を使用して達成され、これは、ＬＯＣＳレポーターを一連の異なるバイオセンシング技術で使用することができることを例証する。
実施例４：いくつかのプラットフォームにわたるＬＯＣＳレポーターの互換性
この実施例では、２つのＬＯＣＳレポーターを、一般的に使用されるいくつかのＰＣＲプラットフォームにわたるそれらの互換性について試験する。２つのＭＮＡザイム（ＭＮＡザイム１およびＭＮＡザイム２）を使用して、それらの対応するＬＯＣＳレポーター（それぞれＬＯＣＳ－１およびＬＯＣＳ－２）の切断を介して標的核酸の増幅をリアルタイムで監視する。この実施例では、２つの異なる遺伝子、つまりＭｇＰａ遺伝子（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ）およびＴＶ－Ｂｔｕｂ（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ
ｖａｇｉｎａｌｉｓ）の増幅および検出を、単一の管内で同時に実行し、これらの両方が、ＦＡＭチャネルでシグナルを生成することができる。
反応構成成分および条件
この実験に特異的なオリゴヌクレオチドには、ＬＯＣＳ－１（配列番号１）、ＬＯＣＳ－２（配列番号２）、パートザイムＡ１（配列番号３）、パートザイムＢ１（配列番号４）、パートザイムＡ２（配列番号５）、パートザイムＢ２（配列番号６）、順方向プライマー１（配列番号７）、順方向プライマー２（配列番号８）、逆方向プライマー１（配列番号９）、および逆方向プライマー２（配列番号１０）が含まれる。ＭｇＰａの増幅および検出に特異的なオリゴヌクレオチドは、ＬＯＣＳ－１、パートザイムＡ１、パートザイムＢ１、順方向プライマー１、および逆方向プライマー１である。
ＴＶ－Ｂｔｕｂの増幅および検出に特異的なオリゴヌクレオチドは、ＬＯＣＳ－２、パートザイムＡ２、パートザイムＢ２、順方向プライマー２、逆方向プライマー１、および逆方向プライマー２である。配列は、配列表に列挙する。
サイクリングパラメータは、９５℃で２分間、９５℃で５秒間および６１℃で３０秒間のタッチダウンサイクルを１０回（１サイクルあたり０．５℃の減衰）、ならびに９５℃で５秒間および５２℃で４０秒間のサイクルを４０回（データは５２℃のステップで収集）であった。ＢｉｏＲａｄ（登録商標）ＣＦＸ９６熱サイクラーでの融解曲線パラメータは、２０℃から９０℃まで０．５℃の増分で、５秒間保持した（データ収集は保留）。Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ４８０熱サイクラーでの融解曲線パラメータは、２０℃～９０℃の範囲あたり０．０２℃の傾斜率で連続収集モードに設定し、各温度で１秒間保持した。ＡＢＩ７５００熱サイクラーでの融解曲線パラメータは、２０℃から９０℃まで１％の傾斜率に設定し、５秒間保持した（データ収集は保留）。Ｘｘｐｒｅｓｓ ＰＣＲ熱サイクラーでの融解曲線パラメータは、３０℃から９０℃までで０．５℃の増分で、０．５秒間保持した（データ収集は保留）。全ての反応は、二連で実行し、４０ｎＭの各順方向プライマー、２００ｎＭの各逆方向プライマー、２００ｎＭの各パートザイムＡ、２００ｎＭの各パートザイムＢ、２００ｎＭの各ＬＯＣＳレポーター、２ｍＭのＭｇＣｌ２（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、および１つのＳｅｎｓｉＦＡＳＴプローブＮｏ－ＲＯＸ混合物（Ｂｉｏｌｉｎｅ）を含有した。ＸＸｐｒｅｓｓ ＰＣＲ熱サイクラーで実行した反応（１５μＬの体積で実行）を除いて、標的配列のリアルタイム増幅および検出は、２０μＬの合計反応体積で実行した。反応は、Ｇ－Ｂｌｏｃｋ鋳型（１０，０００もしくは４０コピー）を含有するか、または標的なし（ＮＦ Ｈ２Ｏ）のいずれかであった。標的配列のリアルタイム増幅および検出は、ＢｉｏＲａｄ（登録商標）ＣＦＸ９６熱サイクラー、Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ４８０熱サイクラー、ＡＢＩ７５００熱サイクラー、およびＸＸｐｒｅｓｓ ＰＣ
Ｒ熱サイクラーを使用して実行した。
－結果
図８および図９の結果は、ＢｉｏＲａｄ（登録商標）ＣＦＸ９６熱サイクラー（パネルＡ）、またはＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ４８０熱サイクラー（パネルＢ）、またはＡＢＩ７５００熱サイクラー（パネルＣ）、またはＸＸｐｒｅｓｓ ＰＣＲ熱サイクラー（パネルＤ）で増幅を実行した場合に、それぞれＭｇＰａおよびＴＶ－Ｂｔｕｂ標的の増幅後に得られた融解曲線を示す。両方の標的は、全ての機械のＦＡＭチャネルで監視した。図８Ｄおよび図９Ｄに示される結果は、３分間の融解曲線プロトコルを使用して得たものであり、故にＬＯＣＳレポーターを使用する融解曲線の区別を、迅速な条件を使用して達成することができることを実証する。このデータは、２つの異なるＬＯＣＳレポーターを使用して異なるプラットフォームにわたって得られた同等の融解曲線特性を生成する能力を実証する。さらに、このデータは、様々な融解曲線パラメータを使用して得られた同等の融解曲線特性を生成する能力を実証する。
実施例５：いくつかの蛍光チャネルにわたるＬＯＣＳレポーターの互換性
この実施例では、１０個のＬＯＣＳレポーターを、一般的に使用されるいくつかの蛍光チャネルにわたる互換性について試験する。２つのＭＮＡザイム（ＭＮＡザイム１およびＭＮＡザイム２）を使用して、それらの対応するＬＯＣＳレポーターの切断を介して標的核酸の増幅をリアルタイムで監視する。この実施例では、同じＬＯＣＳレポーター配列を使用するが、ＬＯＣＳは、異なるフルオロフォアおよびクエンチャー対で標識する。２つの異なる遺伝子、つまりＭｇＰａ遺伝子（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ）およびＴＶ－Ｂｔｕｂ（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓ）の増幅および検出を、単一の管内で同時に実行し、これらの両方が、同じチャネルでシグナルを生成することができる。ＦＡＭ、ＨＥＸ、テキサスレッド、およびＣｙ５を含む、いくつかの蛍光チャネルを試験した。
反応構成成分および条件
この実験に特異的なオリゴヌクレオチドには、ＬＯＣＳ－１（配列番号１）、ＬＯＣＳ－２（配列番号２）、パートザイムＡ１（配列番号３）、パートザイムＢ１（配列番号４）、パートザイムＡ２（配列番号５）、パートザイムＢ２（配列番号６）、順方向プライマー１（配列番号７）、順方向プライマー２（配列番号８）、逆方向プライマー１（配列番号９）、逆方向プライマー２（配列番号１０）、ＬＯＣＳ－５（配列番号３５）、ＬＯＣＳ－６（配列番号３６）、ＬＯＣＳ－７（配列番号３７）、ＬＯＣＳ－８（配列番号３８）、ＬＯＣＳ－９（配列番号３９）、およびＬＯＣＳ－１０（配列番号４０）が含まれる。ＭｇＰａの増幅および検出に特異的なオリゴヌクレオチドは、パートザイムＡ１、パートザイムＢ１、順方向プライマー１、逆方向プライマー１、およびＬＯＣＳ－１、ＬＯＣＳ－５、ＬＯＣＳ－７、またはＬＯＣＳ－９のいずれかである。ＴＶ－Ｂｔｕｂの増幅および検出に特異的なオリゴヌクレオチドは、パートザイムＡ２、パートザイムＢ２、順方向プライマー２、逆方向プライマー２、およびＬＯＣＳ－２、ＬＯＣＳ－６、ＬＯＣＳ－８、またはＬＯＣＳ－１０のいずれかである。配列は、配列表に列挙する。
サイクリングパラメータは、９５℃で２分間、９５℃で５秒間および６１℃で３０秒間のタッチダウンサイクルを１０回（１サイクルあたり０．５℃の減衰）、ならびに９５℃で５秒間および５２℃で４０秒間のサイクルを４０回（データは５２℃のステップで収集）であった。ＢｉｏＲａｄ（登録商標）ＣＦＸ９６熱サイクラーでの融解曲線パラメータは、２０℃から９０℃まで０．５℃の増分で、５秒間保持した（データ収集は保留）。全ての反応は、二連で実行し、４０ｎＭの各順方向プライマー、２００ｎＭの各逆方向プライマー、２００ｎＭの各パートザイムＡ、２００ｎＭの各パートザイムＢ、２００ｎＭの各ＬＯＣＳレポーター、２ｍＭのＭｇＣｌ２（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、および１つのＳｅｎｓ
ｉＦＡＳＴプローブＮｏ－ＲＯＸ混合物（Ｂｉｏｌｉｎｅ）を含有した。ＢｉｏＲａｄ（登録商標）ＣＦＸ９６熱サイクラーを使用して、２０μＬの合計反応体積で標的配列のリアルタイム増幅および検出を実行した。反応は、Ｇ－Ｂｌｏｃｋ鋳型（１０，０００もしくは４０コピー）を含有するか、または標的なし（ＮＦ Ｈ２Ｏ）のいずれかであった。
－結果
図１０の結果は、ＢｉｏＲａｄ（登録商標）ＣＦＸ９６熱サイクラーで増幅を実行した場合に、それぞれＭｇＰａおよびＴＶ－Ｂｔｕｂ標的の増幅後に得られた融解曲線を示す。両方の標的を、単一の蛍光チャネルで同時に監視した。黒色で示される結果は、ＭｇＰａ遺伝子の存在下で得られた融解曲線を示し、灰色で示される結果は、ＴＶ－Ｂｔｕｂ標的の存在下で得られた融解曲線特性を示す。実線は、１０，０００コピーの標的濃度を表し、点線は、４０コピーの標的濃度を表す。図１０Ａに示される結果は、ＦＡＭチャネルでＬＯＣＳ－１およびＬＯＣＳ－２を使用して得られた融解曲線を示す。図１０Ｂに示される融解曲線は、ＨＥＸチャネルでＬＯＣＳ－５およびＬＯＣＳ－６を使用して得た。図１０Ｃに示される融解曲線は、テキサスレッドチャネルでＬＯＣＳ－７およびＬＯＣＳ－８を使用して得、図１０Ｄに示される融解曲線は、Ｃｙ５チャネルでＬＯＣＳ－９およびＬＯＣＳ－１０を使用して得た。このデータは、同じ２つのＬＯＣＳステムおよび基質を使用するが、フルオロフォアおよびクエンチャー対を変化させた、異なる蛍光チャネルにわたって得られた同等の融解曲線特性を生成する能力を実証する。
実施例６：３つのＬＯＣＳレポーターを使用する単一の蛍光チャネルでの３つの標的の同時検出
以下の実施例では、ＬＯＣＳレポーターを使用して、単一の蛍光チャネルから検出することができる標的の数を増加させる。この実施例では、３つのＬＯＣＳレポーターを、フルオロフォア（ＦＡＭ）で５’標識し、クエンチャーで３’標識する。ＬＯＣＳレポーターのループ領域は、核酸基質を含有し、ステム領域は、ＬＯＣＳレポーターをループステム構成に拘束する一連の相補的な塩基対を含有する。この構成では、フルオロフォアおよびクエンチャーは近接しており、標的の不在下では蛍光がクエンチされる。
オリゴヌクレオチド
この実験に特異的なオリゴヌクレオチドには、ＬＯＣＳ－１（配列番号１）、ＬＯＣＳ－２（配列番号２）、パートザイムＡ１（配列番号３）、パートザイムＢ１（配列番号４）、パートザイムＡ２（配列番号５）、パートザイムＢ２（配列番号６）、順方向プライマー１（配列番号７）、逆方向プライマー１（配列番号８）、順方向プライマー２（配列番号９）、逆方向プライマー２（配列番号１０）、ＬＯＣＳ－１１（配列番号４５）、パートザイムＡ９（配列番号４３）、パートザイムＢ９（配列番号４４）、順方向プライマー７（配列番号４１）、および逆方向プライマー７（配列番号４２）が含まれる。配列は、配列表に列挙する。ＭｇＰａの増幅および検出に特異的なオリゴヌクレオチドは、ＬＯＣＳ－１、パートザイムＡ１、パートザイムＢ１、順方向プライマー１、および逆方向プライマー１である。ＴＶ－Ｂｔｕｂの増幅および検出に特異的なオリゴヌクレオチドは、ＬＯＣＳ－２、パートザイムＡ２、パートザイムＢ２、順方向プライマー２、および逆方向プライマー２である。ＣＴｃｒｙの増幅および検出に特異的なオリゴヌクレオチドは、ＬＯＣＳ－１１、パートザイムＡ９、パートザイムＢ９、順方向プライマー７、および逆方向プライマー７である。
反応条件
ＢｉｏＲａｄ（登録商標）ＣＦＸ９６熱サイクラーを使用して、２０μＬの合計反応体積で標的配列のリアルタイム増幅および検出を実行した。サイクリングパラメータは、９５℃で２分間、９５℃で５秒間および６１℃で３０秒間のタッチダウンサイクルを１０回（１サイクルあたり０．５℃の減衰）、ならびに９５℃で５秒間および５２℃で４０秒間
のサイクルを３５回（データは５２℃のステップで収集）であった。融解曲線パラメータは、２０℃から９０℃まで０．５℃の増分で、５秒間保持した（データ収集は保留）。全ての反応は、二連で実行し、４０ｎＭの各順方向プライマー、２００ｎＭの各逆方向プライマー、２００ｎＭの各パートザイムＡ、２００ｎＭの各パートザイムＢ、２００ｎＭの各ＬＯＣＳレポーター、２ｍＭのＭｇＣｌ２（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、および１つのＳｅｎｓｉＦＡＳＴプローブＮｏ－ＲＯＸ混合物（Ｂｉｏｌｉｎｅ）を含有した。反応は、ＭｇＰａおよび／もしくはＴＶ－Ｂｔｕｂおよび／もしくはＣＴｃｒｙ遺伝子に相同なＧブロック鋳型（１０，０００コピー）を含有するか、または標的なし（ＮＦ Ｈ２Ｏ）のいずれかであった。
結果
ＰＣＲとして知られているインビトロ標的増幅法を使用して、３つのＭＮＡザイム（ＭＮＡザイム１、ＭＮＡザイム２、およびＭＮＡザイム９）を使用して、それらの対応するＬＯＣＳレポーター（それぞれＬＯＣＳ－１、ＬＯＣＳ－２、およびＬＯＣＳ－１１）の切断を介して標的核酸の増幅をリアルタイムで監視する。ＭＮＡザイム１は、ＭｇＰａ遺伝子（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ）に相同な配列を検出し、ＬＯＣＳ－１を切断および開放するように設計し、ＭＮＡザイム２は、ＴＶ－Ｂｔｕｂ（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓ）に相同な配列を検出し、ＬＯＣＳ－２を切断および開放するように設計し、ＭＮＡザイム９は、ＣＴｃｒｙ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）に相同な配列を検出し、ＬＯＣＳ－１１を切断および開放するように設計した。この実験では、増幅および検出は、全てのＭＮＡザイム、プライマー、およびＬＯＣＳオリゴヌクレオチドを含有する単一の管内で実行した。ＭｇＰａ、ＴＶ－Ｂｔｕｂ、ＣＴｃｒｙのいずれか、またはこれら３つの様々な組み合わせ（複数の感染を有する試料を表す）の存在は、ＦＡＭチャネルにおけるシグナルの増加によって検出した。
図１１および１２に示される結果は、１０，０００コピーの標的ＭｇＰａ（図１１Ａ）、ＴＶ－Ｂｔｕｂ（図１１Ｂ）、ＣＴｃｒｙ（図１１Ｃ）、ＭｇＰａおよびＴＶ－Ｂｔｕｂの両方（図１１Ｄ）、ＭｇＰａおよびＣＴｃｒｙの両方（図１１Ｅ）、ＴＶ－ＢｔｕｂおよびＣＴｃｒｙの両方（図１１Ｆ）、またはＭｇＰａ、ＴＶ－Ｂｔｕｂ、およびＣＴｃｒｙの３つ全て（図１２）の遺伝子標的を含有する反応から増幅後に得られたそれぞれの融解曲線特性を示す。結果は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ（バージョン１４）を使用してプロットした二連の反応の平均である。
表３に要約されるこの実施例のデータは、ＭｇＰａ遺伝子標的（Ｔｍ＝３９℃および６６℃）の存在下で生成されるＬＯＣＳ融解特性が、ＴＶ－Ｂｔｕｂ（Ｔｍ＝４９℃および６４℃）ならびにＣＴｃｒｙ（Ｔｍ＝３０℃、４１℃、および６４℃）遺伝子標的の存在下で生成されたＬＯＣＳ融解特性とは異なることを実証する。さらに、２つ以上の遺伝子標的の存在下でのＬＯＣＳ融解特性はまた、単一の遺伝子標的のみが存在する前述の融解特性とも異なる。ＭｇＰａおよびＴＶ－Ｂｔｕｂ標的が単一の反応に存在する場合、固有の融解曲線特性（Ｔｍ＝３９℃、４９℃、および６６℃）は、両方の標的が検出されたことを示した。同様に、ＭｇＰａおよびＣＴｃｒｙまたはＴＶ－ＢｔｕｂおよびＣＴｃｒｙが単一の反応に存在する場合、固有の融解曲線特性（それぞれ（Ｔｍ＝３１℃、４１℃、および７４℃）ならびに（Ｔｍ＝３０℃、４１℃、４９℃、６６℃））は、どの２つの標的が検出されたかを示した。ＭｇＰａ、ＴＶ－Ｂｔｕｂ、およびＣＴｃｒｙ標的が全て単一の反応に存在する場合、固有の融解曲線特性（Ｔｍ＝３０℃、４１℃、および４９℃）は、３つ全ての標的が検出されたことを示す。
この実施例は、単一のウェル内で単一の蛍光チャネルを使用して同時増幅した３つの標的を、それらの固有のＬＯＣＳ融解特性に基づいて区別することができることを実証する。この実施例は、単一の蛍光チャネルを使用して単一のウェル内の複数の標的を検出するのに有用な簡便な方法を提供する。異なるステムの長さおよび塩基対の組成により、ＬＯＣＳ－１、ＬＯＣＳ－２、およびＬＯＣＳ－１１内の異なるステム（ステム１、ステム２、およびステム３）は、固有の蛍光融解曲線特性を生成した。
この特定の実施例では、開放ＬＯＣＳ１（ＭｇＰａを示す約３９℃に１つのピーク）および開放ＬＯＣＳ３（ＣＴｃｒｙを示す約３０／３１℃および約４１℃に２つのピーク）のＴｍは、ＭｇＰａおよびＣＴｃｒｙ標的の両方が存在するの場合、合併したピークをもたらす。それにもかかわらず、ＭｇＰａ、ＴＶ－Ｂｔｕｂ、およびＣＴｃｒｙを含有する反応（図１２）は、開放ＬＯＣＳ１のＴｍのピークの消失（約６４℃）によって、ＴＶ－ＢｔｕｂおよびＣＴｃｒｙのみを含有する反応（図１１Ｆ）から区別することができる。合併したピークは、この方法には理想的ではないが、より明確に識別されたピークを生成する代替的なステム配列は、実施例７に記載のステムスクリーニングアッセイを使用して容易に特定することができる。
実施例７：ＬＯＣＳレポーターオリゴヌクレオチドに組み込むことができるユニバーサルステムとしての使用に好適な配列をスクリーニングするための方法
以下の実施例では、一連の二本鎖オリゴヌクレオチド（ＤＳＯ）を、ユニバーサルステムとしての使用に好適であるかどうかについてスクリーニングした。ループによって接続されていないこれらのＤＳＯを、ＳＹＢＲグリーンＩ挿入色素の存在下で徐々に増加する温度に供した。この融解曲線スクリーニングアッセイを使用して、様々な配列の長さおよび組成を調べて、目立たない温度で融解し、その後ユニバーサルステムとしてＬＯＣＳレポーターオリゴヌクレオチドに組み込むことができる一連のＤＳＯを特定することができる。ＳＹＢＲグリーンＩは、二本鎖ＤＮＡ構造への結合時に蛍光シグナルを生成する挿入色素である。増加する温度勾配に曝露されると、ＤＳＯの２つのオリゴヌクレオチド鎖が解離し、蛍光が低下する。以下の実施例は、２つのオリゴヌクレオチドが解離する温度（Ｔｍ）を、ステムの長さおよび組成を変更することによって制御することができることを実証する。さらに、ＤＳＯを様々な濃度で試験して、オリゴヌクレオチド濃度を修飾することによって、Ｔｍをいかにさらに操作することができるかを実証した。
オリゴヌクレオチド
この実験に特異的なオリゴヌクレオチドには、ＤＳＯ－１Ａ（配列番号５６）、ＤＳＯ－１Ｂ（配列番号５７）、ＤＳＯ－２Ａ（配列番号５８）、ＤＳＯ－２Ｂ（配列番号５９
）、ＤＳＯ－３Ａ（配列番号６０）、ＤＳＯ－３Ｂ（配列番号６１）、ＤＳＯ－４Ａ（配列番号６２）、ＤＳＯ－４Ｂ（配列番号６３）、ＤＳＯ－５Ａ（配列番号６４）、ＤＳＯ－５Ｂ（配列番号６５）、ＤＳＯ－６Ａ（配列番号６６）、ＤＳＯ－６Ｂ（配列番号６７）、ＤＳＯ－７Ａ（配列番号６８）、ＤＳＯ－７Ｂ（配列番号６９）、ＤＳＯ－８Ａ（配列番号７０）、およびＤＳＯ－８Ｂ（配列番号７１）が含まれる。配列は、配列表に列挙する。
反応条件
融解曲線分析は、ＢｉｏＲａｄ（登録商標）ＣＦＸ９６熱サイクラーを使用して、２０μＬの合計反応体積で実行した。融解曲線パラメータは、１５℃から７０℃まで０．５℃の増分で、５秒間保持した（データ収集は保留）。全ての反応は、二連で実行し、１００ｎＭ、２００ｎＭ、または３００ｎＭのＤＳＯ－ＡおよびＤＳＯ－Ｂオリゴヌクレオチド、１μＭのＳＹＢＲグリーンＩ、８ｍＭのＭｇＣｌ２（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、ならびに１×ＮＨ４緩衝液（Ｂｉｏｌｉｎｅ）のいずれかを含有した。
結果
表４に示される結果は、ＤＳＯを増加する温度勾配に供したときに得られた融解温度（Ｔｍ）を示す。結果は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ（バージョン１４）を使用してプロットした二連の反応の平均である。
この実施例は、ステムの長さおよびＧＣ含有量を増加させると、より高いＴｍがもたらされることを実証する。さらに、オリゴヌクレオチド濃度を増加させると、わずかにより高いＴｍにもつながり、濃度を１００ｎＭから２００ｎＭに増加させたときに最大の差が観察される。この実施例に記載の方法は、より明確に識別されたピークを生成する代替的なステム配列をより良好に特定するためのスクリーニング方法として使用することができる。
この方法を使用して、塩濃度、Ｍｇ濃度、緩衝液、ｄＮＴＰ濃度、および他の添加剤を含むがこれらに限定されない、反応混合物の他の構成成分の効果を調べることができる。このスクリーニング方法を使用して、ＬＯＣＳへの組み込み時に良好に分離された一連のＴｍをもたらす一連のＤＳＯを特定することができる。代替的な形式では、ＤＳＯを異なるフルオロフォアおよびクエンチャー色素対で標識して、異なる色素の組み合わせが特定のＤＳＯのＴｍに影響を与えるかどうかを調査することができる。
実施例８：２つの蛍光チャネル、および２つのステムのみを利用する４つのＬＯＣＳレポーターを使用する、単一のウェル内の４つの標的の同時検出
以下の実施例では、同じステム組成を含み、異なる基質（ループ）に接続された複数のＬＯＣＳレポーターを、単一の反応容器内で組み合わせて、同じステム領域を複数回使用して、単一の反応における複数の標的を同時に検出および鑑別することができることを実証する。本実施例では、２つのステム（ステム１およびステム２）を使用して、２つの蛍光チャネルにわたる４つの異なる標的を鑑別する。この実施例では、２つのＬＯＣＳレポーターは、ＦＡＭフルオロフォア（ＬＯＣＳ－１２およびＬＯＣＳ－１３）で５’標識し、他の２つは、テキサスレッドフルオロフォア（ＬＯＣＳ－７およびＬＯＣＳ－８）で５’標識する。４つ全てのＬＯＣＳレポーターは、クエンチャーで３’標識する。４つのＬＯＣＳレポーターのループ領域の各々は、異なる核酸基質（基質１、基質２、基質３、および基質４）を含有する。２つのＬＯＣＳレポーター（各フルオロフォアに１つ）は、ステム１（ＬＯＣＳ－７およびＬＯＣＳ－１２）を含有し、他の２つのＬＯＣＳレポーターは、ステム２（ＬＯＣＳ－８およびＬＯＣＳ－１３）を含有する。ステム領域は、ＬＯＣＳレポーターをループステム構成に拘束する一連の相補的な塩基対を含有する。この構成では、フルオロフォアおよびクエンチャーは近接しており、標的の不在下では蛍光がクエ
ンチされる。ステム１は、ステム２よりも低い融解温度を有し、第１の検出温度（４０℃）での標的ＭｇＰａおよびＮＧｏｐａの検出のためにループ１および３に接続されているが、ステム２は、より高融解温度を有し、第２の検出温度（５０℃）での標的ＴＶ－Ｂｔｕｂおよびｇｐｄの鑑別のためにループ２および４に接続されている。
オリゴヌクレオチド
この実験に特異的なオリゴヌクレオチドには、ＬＯＣＳ－７（配列番号３７）、ＬＯＣＳ－８（配列番号３８）、パートザイムＡ１（配列番号３）、パートザイムＢ１（配列番号４）、パートザイムＡ２（配列番号５）、パートザイムＢ２（配列番号６）、順方向プライマー１（配列番号７）、逆方向プライマー１（配列番号８）、順方向プライマー２（配列番号９）、逆方向プライマー２（配列番号１０）、ＬＯＣＳ－１２（配列番号４６）、ＬＯＣＳ－１３（配列番号４７）、パートザイムＡ１０（配列番号４８）、パートザイムＢ１０（配列番号４９）、パートザイムＡ１１（配列番号５０）、パートザイムＢ１１（配列番号５１）、順方向プライマー８（配列番号５２）、逆方向プライマー８（配列番号５３）、順方向プライマー９（配列番号５４）、および逆方向プライマー９（配列番号５５）が含まれる。配列は、配列表に列挙する。ＭｇＰａの増幅および検出に特異的なオリゴヌクレオチドは、ＬＯＣＳ－７、パートザイムＡ１、パートザイムＢ１、順方向プライマー１、および逆方向プライマー１である。ＴＶ－Ｂｔｕｂの増幅および検出に特異的なオリゴヌクレオチドは、ＬＯＣＳ－８、パートザイムＡ２、パートザイムＢ２、順方向プライマー２、および逆方向プライマー２である。ＮＧｏｐａの増幅および検出に特異的なオリゴヌクレオチドは、ＬＯＣＳ－１２、パートザイムＡ１０、パートザイムＢ１０、順方向プライマー８、および逆方向プライマー８である。ｇｐｄの増幅および検出に特異的なオリゴヌクレオチドは、ＬＯＣＳ－１３、パートザイムＡ１１、パートザイムＢ１１、順方向プライマー９、および逆方向プライマー９である。
反応条件
ＢｉｏＲａｄ（登録商標）ＣＦＸ９６熱サイクラーを使用して、２０μＬの合計反応体積で標的配列のリアルタイム増幅および検出を実行した。サイクリングパラメータは、９５℃で２分間、９５℃で５秒間および６１℃で３０秒間のタッチダウンサイクルを１０回（１サイクルあたり０．５℃の減衰）、ならびに９５℃で５秒間および５２℃で４０秒間のサイクルを３５回（データは５２℃のステップで収集）であった。融解曲線パラメータは、２０℃から９０℃まで０．５℃の増分で、５秒間保持した（データ収集は保留）。全ての反応は、二連で実行し、４０ｎＭの各順方向プライマー、２００ｎＭの各逆方向プライマー、２００ｎＭの各パートザイムＡ、２００ｎＭの各パートザイムＢ、２００ｎＭの各ＬＯＣＳレポーター、２ｍＭのＭｇＣｌ２（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、および１つのＳｅｎｓｉＦＡＳＴプローブＮｏ－ＲＯＸ混合物（Ｂｉｏｌｉｎｅ）を含有した。反応は、ＭｇＰａ、ＴＶ－Ｂｔｕｂ、ＮＧｏｐａ、もしくはｇｐｄ遺伝子のいずれかに相同なＧブロック鋳型（１０，０００コピー）を含有するか、または標的（ＮＦ Ｈ２Ｏ）を含有しなかった。
結果
ＰＣＲとして知られているインビトロ標的増幅法を使用して、４つのＭＮＡザイム（ＭＮＡザイム１、ＭＮＡザイム２、ＭＮＡザイム１０、およびＭＮＡザイム１１）を使用して、それらの対応するＬＯＣＳレポーター（それぞれＬＯＣＳ－７、ＬＯＣＳ－８、ＬＯＣＳ－１２、およびＬＯＣＳ－１３）の切断を介して標的核酸の増幅をリアルタイムで監視する。ＭＮＡザイム１は、ＭｇＰａ遺伝子（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ）に相同な配列を検出し、ＬＯＣＳ－７を切断および開放するように設計し、ＭＮＡザイム２は、ＴＶ－Ｂｔｕｂ遺伝子（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓ）に相同な配列を検出し、ＬＯＣＳ－８を切断および開放するように設計し、ＭＮＡザイム１０は、ＮＧｏｐａ遺伝子（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）に相同な配列
を検出し、ＬＯＣＳ－１２を切断および開放するように設計し、ＭＮＡザイム１１は、ｇｐｄ遺伝子（単純ヘルペスウイルス２型）に相同な配列を検出し、ＬＯＣＳ－１３を切断および開放するように設計した。この実験では、増幅および検出は、全てのＭＮＡザイム、プライマー、およびＬＯＣＳオリゴヌクレオチドを含有する単一の管内で実行した。
ＭｇＰａまたはＴＶ－Ｂｔｕｂ遺伝子の存在は、テキサスレッドチャネルのシグナルの増加によって検出し、ＮＧｏｐａまたはｇｐｄ遺伝子の存在は、ＦＡＭチャネルのシグナルの増加によって検出した。テキサスレッドチャネルでのＭｇＰａまたはＴＶ－Ｂｔｕｂの鑑別、およびＦＡＭチャネルでのＮＧｏｐａまたはｇｐｄの鑑別は、固有の融解曲線特性の存在に基づいて決定した。図１３Ａに示される結果は、１０，０００コピーのＭｇＰａ（黒線）またはＴＶ－Ｂｔｕｂ（灰色線）遺伝子標的のいずれかを含有する反応から増幅後にテキサスレッドチャネルで得られたそれぞれの融解曲線特性を実証する。
図１３Ｂに示される結果は、１０，０００コピーのＮＧｏｐａ（黒線）またはｇｐｄ（灰色線）遺伝子標的のいずれかを含有する反応から増幅後にＦＡＭチャネルで得られたそれぞれの融解曲線特性を実証する。結果は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ（バージョン１４）を使用してプロットした二連の反応の平均である。ＭｇＰａの存在は、テキサスレッドシグナルの増加、およびテキサスレッドチャネルでの固有の融解特性（Ｔｍ＝４３℃）の両方によって決定した。ＴＶ－Ｂｔｕｂの存在は、テキサスレッドシグナルの増加、およびテキサスレッドチャネルでの固有の融解特性（Ｔｍ＝５４℃）の両方によって決定した。ＮＧｏｐａの存在は、ＦＡＭシグナルの増加、およびＦＡＭチャネルでの固有の融解特性（Ｔｍ＝２６℃および４２℃）の両方によって決定した。ｇｐｄの存在は、ＦＡＭシグナルの増加、およびＦＡＭチャネル（Ｔｍ＝４９℃）での固有の融解特性の両方によって決定した。
表５に要約されるこの実施例のこのデータは、同じユニバーサルステム領域を、異なる基質（ループ）に接続し、異なる蛍光チャネルにわたって検出することによって、単一の反応で複数回利用することができることを実証する。さらに、このデータは、単一のウェル内で同時増幅し、２つの蛍光チャネルを使用して監視した４つの標的を、それらの固有のＬＯＣＳ融解温度に基づいて区別することができることを実証する。この実施例は、単一のウェル内の複数の標的を検出するのに有用な簡便な方法を提供する。単一の反応で複数の標的を鑑別するための同じステム配列の使用は、高度に多重化されたアッセイの単純明快な設計を促進し、選択した任意の遺伝子標的の検出のためのＬＯＣＳプローブの迅速かつ容易な適合を可能にする。
実施例９－同じステム配列を、ＬＯＣＳレポーター内の異なる基質と組み合わせて、再現可能な融解温度を生成することができる
以下の実施例では、３つのＬＯＣＳレポーターを使用して、同じステムを異なるループ配列（基質）と対合させて、同等の融解特性を生成することができることを実証する。この実施例では、３つ全てのＬＯＣＳレポーターを、ＦＡＭフルオロフォアで５’標識し、
クエンチャーで３’標識する。３つのＬＯＣＳレポーターのループ領域の各々は、核酸酵素（ＭＮＡザイム）の異なる基質を含有するが、３つ全てが、同じステム配列（ステム２）を含有する。
オリゴヌクレオチド
この実験に特異的なオリゴヌクレオチドには、順方向プライマー１０（配列番号７２）、逆方向プライマー１０（配列番号７３）、ＬＯＣＳ－２（配列番号２）、ＬＯＣＳ－１４（配列番号７８）、ＬＯＣＳ－１５（配列番号７９）、パートザイムＡ８（配列番号３１）、パートザイムＢ８（配列番号３２）、パートザイムＡ１２（配列番号７４）、パートザイムＢ１２（配列番号７５）、パートザイムＡ１３（配列番号７６）、およびパートザイムＢ１３（配列番号７７）が含まれる。配列は、配列表に列挙する。ＴＦＲＣ遺伝子の増幅に特異的なオリゴヌクレオチドは、順方向プライマー１０（配列番号７２）および逆方向プライマー１０（配列番号７３）である。ＴＦＲＣアンプリコンの検出およびＬＯＣＳ－２の切断に特異的なオリゴヌクレオチドは、パートザイムＡ８（配列番号３１）およびパートザイムＢ８（配列番号３２）である。ＴＦＲＣアンプリコンの検出およびＬＯＣＳ－１４の切断に特異的なオリゴヌクレオチドは、パートザイムＡ１２（配列番号７４）およびパートザイムＢ１２（配列番号７５）である。ＴＦＲＣアンプリコンの検出およびＬＯＣＳ－１５の切断に特異的なオリゴヌクレオチドは、パートザイムＡ１３（配列番号７６）およびパートザイムＢ１３（配列番号７７）である。
反応条件
ＢｉｏＲａｄ（登録商標）ＣＦＸ９６熱サイクラーを使用して、２０μＬの合計反応体積で標的配列のリアルタイム増幅および検出を実行した。サイクリングパラメータは、９５℃で２分間、９５℃で５秒間および６１℃で３０秒間のタッチダウンサイクルを１０回（１サイクルあたり０．５℃の減衰）、ならびに９５℃で５秒間および５２℃で４０秒間のサイクルを３５回（データは５２℃のステップで収集）であった。融解曲線パラメータは、２０℃から９０℃まで０．５℃の増分で、５秒間保持した（データ収集は保留）。全ての反応は、二連で実行し、４０ｎＭの各順方向プライマー、２００ｎＭの各逆方向プライマー、２００ｎＭの各パートザイムＡ、２００ｎＭの各パートザイムＢ、２００ｎＭの各ＬＯＣＳレポーター、２ｍＭのＭｇＣｌ２（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、および１つのＳｅｎｓｉＦＡＳＴプローブＮｏ－ＲＯＸ混合物（Ｂｉｏｌｉｎｅ）を含有した。反応は、ヒトトランスフェリン受容体（ＴＦＲＣ）遺伝子に相同なＧブロック鋳型（１０，０００コピー）を含有するか、または標的（ＮＦ Ｈ２Ｏ）を含有しなかった。
結果
この実験では、ＰＣＲ増幅、シグナル検出、および融解曲線の鑑別を、一重反応として単一の管内で実行した。ＰＣＲ中、３つのＭＮＡザイム（ＭＮＡザイム８、ＭＮＡザイム１２、およびＭＮＡザイム１３）を使用して、それらの対応するＬＯＣＳレポーター（それぞれＬＯＣＳ－２、ＬＯＣＳ－１４、およびＬＯＣＳ－１５）の切断を介して標的核酸の増幅をリアルタイムで監視した。３つ全てのＭＮＡザイムは、同じ標的配列（ＴＦＲＣ遺伝子）を検出するように設計されているが、各ＭＮＡザイムは、異なる基質配列（ループ）にハイブリダイズし、それを切断することができ、故に異なるＬＯＣＳレポーターを開放する。
図１４に示される結果は、１０，０００コピーのＴＦＲＣ遺伝子標的（黒線）を含有するか、または標的なし（灰色線）のいずれかの反応からＰＣＲ増幅後にＦＡＭチャネルで得られたそれぞれの融解曲線特性を示す。ＴＦＲＣ遺伝子の存在は、閾値を超えるＰＣＲ増幅曲線の存在（データ示さず）、ならびに切断されたＬＯＣＳ－２、ＬＯＣＳ－１４、およびＬＯＣＳ－１５にそれぞれ相関する４９℃、４８℃、および４９℃のＴｍでの融解ピーク（それぞれ図１４Ａ、１４Ｂ、および１４Ｃ）によって実証された。ＴＦＲＣ遺伝
子の不在は、閾値を超えたＰＣＲ増幅曲線の不在（データ示さず）、ならびに切断されていないＬＯＣＳ－２、ＬＯＣＳ－１４、およびＬＯＣＳ－１５にそれぞれ相関する７４℃、７５℃、および７５℃のＴｍでの融解ピーク（それぞれ図１４Ａ、１４Ｂ、および１４Ｃ）の存在によって決定した。結果は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ（バージョン１４）を使用してプロットした二連の反応の平均である。この実施例のデータは、同じユニバーサルステム領域を、異なる基質（ループ）とともに利用して、同等の融解曲線特性を生成することができることを実証する。異なる基質を有するＬＯＣＳレポーターを操作するための同じステム配列の使用は、高度に多重化されたアッセイの単純明快な設計を促進し、選択した任意の遺伝子標的の検出のためのＬＯＣＳプローブの迅速かつ容易な適合を可能にする。
実施例１０－ＬＯＣＳレポーターを開放するための代替的な方法としてのニッキングエンドヌクレアーゼの使用
以下の実施例では、ニッキングエンドヌクレアーゼ（Ｎｔ．ＡｌｗＩ）を使用して、ＭＮＡザイム切断の代替的な方法として、ニッキングエンドヌクレアーゼによる切断後にＬＯＣＳレポーターのループ部分を開放した場合に、同等の融解特性が生成されることを実証する。一般的な戦略を、図３Ｂに示す。この実施例では、二重標識されたＬＯＣＳレポーターは、標的配列に相補的なループ領域、および標的に相補的ではないステム領域を含有する。ＬＯＣＳレポーターのループ領域と標的とのハイブリダイゼーションにより、ニッキングエンドヌクレアーゼ認識部位が完成し、これは、ニッキングエンドヌクレアーゼによるＬＯＣＳレポーターの切断を促進し、標的を無傷のまま残す。分子内結合は分子間結合よりも強いため、無傷のＬＯＣＳ構造のステム領域は、切断された開放ＬＯＣＳ構造のステムよりも高温で融解する。
オリゴヌクレオチド
この実験に特異的なオリゴヌクレオチドには、ＡＦ－ＮＥ－ＴＶ１（配列番号８２）、ＬＯＣＳ－１６（配列番号８０）、ＡＦ－ＮＥ－Ｒ５ｂ（配列番号８３）、およびＬＯＣＳ－１７（配列番号８１）が含まれる。配列は、配列表に列挙する。
反応条件
ＢｉｏＲａｄ（登録商標）ＣＦＸ９６熱サイクラーを使用して、２０μＬの合計反応体積で標的配列のリアルタイム検出を実行した。反応を、５２℃の一定温度でインキュベートし、合計２００回のデータ収集になるように２０秒ごとにデータを収集した。融解曲線パラメータは、２０℃から９０℃まで０．５℃の増分で、５秒間保持した（データ収集は保留）。全ての反応は、二連で実行し、５ｍＭのＭｇＣｌ２（Ａｍｂｉｏｎ）、１×ＰＣＲ緩衝液ＩＩ（ＡＢＩ）、４単位のＮｔ．ＡｌｗＩ（ＮＥＢ）、および２００ｎＭのＬＯＣＳ（ＬＯＣＳ－１６またはＬＯＣＳ－１７のいずれか）を含有した。反応は、ＡＦ－ＮＥ－ＴＶ１もしくはＡＦ－ＮＥ－Ｒ５ｂ（２００ｎＭ）のいずれかを含有するか、または標的を含有しなかった（ＮＦ Ｈ２Ｏ）。
結果
シグナル検出および融解曲線の鑑別は、単一の管内で実行した。図１５Ａおよび１５Ｂに示される結果は、２００ｎＭの標的（黒線、それぞれＡＦ－ＮＥ－ＴＶ１もしくはＡＦ－ＮＥ－Ｒ５ｂ）を含有するか、または標的なし（灰色線、ＮＦ Ｈ２Ｏ）の反応からＦＡＭチャネルで得られたＬＯＣＳ－１６およびＬＯＣＳ－１７のそれぞれの融解曲線特性を示す。結果は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ（バージョン１４）を使用してプロットした二連の反応の平均である。標的ＡＦ－ＮＥ－ＴＶ１の存在は、経時的な蛍光の迅速な増加、および切断されたＬＯＣＳ－１６に対応する２９℃での融解ピークの存在の両方によって検出した。標的ＡＦ－ＮＥ－ＴＶ１の不在は、（ｉ）経時的な蛍光増加の欠如、（ｉｉ）２９℃での融解ピークの不在、および（ｉｉｉ）切断されていないＬＯＣＳ－１
６に対応する６５℃での融解ピークの存在によって決定した（図１５Ａ）。標的ＡＦ－ＮＥ－Ｒ５ｂの存在は、経時的な蛍光の迅速な増加、および切断されたＬＯＣＳ－１７に対応する４８℃での融解ピークの存在の両方によって検出した。標的ＡＦ－ＮＥ－Ｒ５ｂの不在は、（ｉ）経時的な蛍光増加の欠如、（ｉｉ）４８℃での融解ピークの不在、および（ｉｉｉ）切断されていないＬＯＣＳ－１７に対応する７６℃での融解ピークの存在によって決定した（図１５Ｂ）。
この実施例のデータは、ＬＯＣＳレポーターが、ニッキングエンドヌクレアーゼ酵素を使用する方法などの代替的な標的検出方法とともに使用することができることを実証する。さらに、このデータはまた、同じステム（ステム２）を含有するＬＯＣＳレポーターが、ループ分解機構、例えば、ニッキング酵素またはＭＮＡザイムのいずれかによる切断にかかわらず、同じ融解温度（約５０℃）でピークを生成することも実証する。本実施例では、ステム２を含有する無傷の開放ＬＯＣＳレポーターは、それぞれ４８℃および７６℃で融解ピークを生成した。これらの融解ピークは、図４Ｄに実証されるように、ＭＮＡザイムでステム２を使用して生成された融解ピークと同等である。異なるプロトコル（例えば、ニッキング酵素によるループの切断対ＭＮＡザイムによるループの切断）で使用した場合、同じステムを含有するＬＯＣＳについて１～２℃の小さなシフトが観察される場合があるが、これらのシフトは、塩、グリセロール、または他の構成成分の濃度がステムのＴｍに影響を与え得る、反応環境の差を反映している可能性が高い。
実施例１１－ＬＯＣＳレポーターを開放するための代替的な方法としてのＴａｑＭａｎエキソヌクレアーゼの使用
以下の実施例では、ＴａｑＭａｎ／加水分解プローブ様の方法を使用して、ループのＭＮＡザイム切断の代替的な方法として、エキソヌクレアーゼ分解後にＬＯＣＳレポーターのステム部分を開放した場合に、同等の融解特性が生成されることを実証する。この実施例の一般的な戦略を、図３Ａに示す。この実施例では、二重標識されたＬＯＣＳレポーターは、標的配列に相補的なループ領域、および標的に相補的ではないステム領域を含有する。ＰＣＲ増幅中、ＬＯＣＳレポーターのループ領域は、標的および／またはアンプリコン配列とハイブリダイズし得る。ＰＣＲのプライマー伸長段階中、上流のプライマーは、ＬＯＣＳレポーターが標的とハイブリダイズする領域に伸長し、ポリメラーゼは、ＬＯＣＳレポーターのループ領域の５’末端を漸進的に切断するが、ステム領域をそのまま残す。２つのＬＯＣＳステム断片間の分子間力は、閉鎖ＬＯＣＳ分子内でそれらの間に生じる分子内力よりも有意に弱いため、ループ領域の分解は、ＬＯＣＳステムの融解温度を低減する。
オリゴヌクレオチド
この実験に特異的なオリゴヌクレオチドには、順方向プライマー２（配列番号９）、逆方向プライマー２（配列番号１０）、およびＬＯＣＳ－１８（配列番号８４）が含まれる。配列は、配列表に列挙する。
反応条件
ＢｉｏＲａｄ（登録商標）ＣＦＸ９６熱サイクラーを使用して、２０μＬの合計反応体積で標的配列のリアルタイム増幅および検出を実行した。サイクリングパラメータは、９５℃で２分間、９５℃で５秒間、および５２℃で４０秒間を５０サイクル（５２℃のステップでデータ収集）であった。融解曲線パラメータは、２０℃から９０℃まで０．５℃の増分で、５秒間保持した（データ収集は保留）。全ての反応は、二連で実行し、４００ｎＭの各プライマー、２００ｎＭのＬＯＣＳ－１６、２ｍＭのＭｇＣｌ２（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、および１×ＳｅｎｓｉＦＡＳＴプローブ無ＲＯＸ混合物（Ｂｉｏｌｉｎｅ）を含有した。反応は、合成Ｇブロック鋳型（１０，０００コピー）を含有するか、または標的を含有しなかった（ＮＦ Ｈ２Ｏ）。
結果
この実験では、ＰＣＲ増幅、シグナル検出、および融解曲線の鑑別を、単一の管内で実行した。標的遺伝子（ＴＶ－ｂｔｕｂ）の存在は、ＰＣＲ増幅曲線の存在、および分解された開放ＬＯＣＳ－１８に対応する４０°のＴｍでの融解ピークによって検出した。標的遺伝子の不在は、ＰＣＲ増幅曲線の不在、４０℃のＴｍでの融解ピークの不在、および切断されていない閉鎖ＬＯＣＳ－１８に対応する６１℃のＴｍでの融解ピークの存在によって決定した。図１６Ａおよび１６Ｂに示される結果は、１０，０００コピーの遺伝子標的（黒線）を含有するか、または標的なし（灰色線）のいずれかの反応からＦＡＭチャネルで得られたそれぞれの増幅曲線および融解曲線特性を示す。結果は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ
Ｅｘｃｅｌ（バージョン１４）を使用してプロットした二連の反応の平均である。
この実施例のデータは、ＬＯＣＳレポーターが、ＴａｑＭａｎ／加水分解プローブと同様の機構を使用する代替的な標的検出方法、つまりエキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ酵素がアンプリコンにハイブリダイズする配列を分解する方法とともに使用することができることを実証する。本質的に、この実施例では、ＬＯＣＳプローブは、標準的なＴａｑＭａｎプローブ配列と同様に機能するループ部分からなるが、「ＴａｑＭａｎ様プローブ配列」は、それら自体は標的に相補的ではないが、互いに相補的であるハイブリダイズ領域の５’および３に付加された相補的なステム配列を有する。さらに、このデータはまた、同じステム（ステム１）を含有するＬＯＣＳレポーターが、ループ分解の機構、例えば、エキソヌクレアーゼ分解対ＭＮＡザイム切断の機構にかかわらず、同じ融解温度でピークを生成することも実証する。本実施例では、ステム１を含有する閉鎖および開放ＬＯＣＳレポーターは、それぞれ６１℃および４０℃で融解ピークを生成した。これらの融解ピークは、図５Ａ２、５Ｂ２、および５Ｃ２に実証されるように、ＭＮＡザイムでステム１を使用して生成された融解ピークと同等である。本方法は、ＴＯＣＥなどの他のエキソヌクレアーゼベースの融解曲線法と比較して、放出される標識されたプローブ断片が、標的配列の存在を検出するために、その後に捕捉プローブとハイブリダイズする必要がなく、かつフルオロフォアおよびクエンチャーが近接してロックされているため、ＬＯＣＳレポーターが、最初により良好にクエンチされ得るという点で、利点を有する。
実施例１２：増幅中に２つの収集温度を使用して、単一の蛍光チャネル内の複数の標的を同時に検出および定量化するための方法
以下の実施例は、ＬＯＣＳレポーターが、ＰＣＲ中にリアルタイムで２つの別々の温度で蛍光読み取りを収集することによって、単一の蛍光チャネル内の複数の標的の同時検出および定量化を可能にするアプローチを実証する。この戦略は、上記の様々な実施例で実証したＰＣＲ後の融解曲線分析の必要性を排除する。さらに、この実施例は、試料中に存在する場合、いずれかの標的の量の定量化を促進するデータ分析のための２つの代替的な方法について説明する。
この実施例では、異なるステムの長さ、組成、および融解温度を含む２つのＬＯＣＳレポーターを使用して、各ＰＣＲサイクル中に２つの異なる温度（ＴＬおよびＴＨ）でリアルタイムで蛍光を測定することによって、単一の蛍光チャネル内の２つの標的ＸおよびＹを同時に検出、鑑別、および定量化した。アッセイは、標的Ｘを、ＬＯＣＳ－Ｘ（標的Ｘの存在下でのみＭＮＡザイムＸによって切断可能）を使用して監視し、標的Ｙを、ＬＯＣＳ－Ｙ（標的Ｙの存在下でのみＭＮＡザイムＹによって切断可能）を使用して監視するように設計されている。さらに、アッセイは、開放ＬＯＣＳ－Ｘが、開放ＬＯＣＳ－Ｙよりも低いＴｍを有するように設計されている。
開放ＬＯＣＳ－Ｘのステムが融解（解離）し、増加した蛍光をもたらす一方、閉鎖ＬＯＣＳ－Ｘのステムならびに開放および閉鎖ＬＯＣＳ－Ｙの両方のステムが会合およびクエ
ンチしたままであるように、より低い検出温度（ＴＬ）を選択する。開放ＬＯＣＳ－Ｙのステムが融解（解離）し、増加した蛍光をもたらす一方、閉鎖ＬＯＣＳ－Ｙのステムが会合およびクエンチしたままであるように、より高い温度（ＴＨ）を選択する。ＬＯＣＳ－Ｘのステムは、より低いＴｍを有するため、それは、このより高い温度で融解（解離）し、開放立体構造にあるか閉鎖立体構造にあるかにかかわらず、増加した蛍光をもたらすが、閉鎖ＬＯＣＳ－Ｘから生じる蛍光は、バックグラウンド／ベースラインの増加にのみ寄与する。
ＴＬおよＴＨ温度で取得した蛍光測定を使用して、２つのＰＣＲ増幅曲線をプロットすることができる。標的Ｘおよび／またはＹの存在を決定するための閾値を、ＴＬプロット（閾値Ｘ、ＴＸ）およびＴＨプロット（閾値Ｙ、ＴＹ）の両方について設定する。閾値（ＴＸおよびＴＹ）、ならびに反応が定常に達することが知られている様々な終点は、先行実験に基づいて事前に決定することができ、この先行実験では、標的Ｘのみを含有する反応が、ＴＬで終点ＥＸ１で、またはＴＨで終点ＥＸ２で定常に達し、標的Ｙのみを含有する反応が、ＴＨで終点ＥＹ１で定常に達し、標的Ｘおよび標的Ｙの両方を含有する反応が、ＴＨで終点ＥＹ２で定常に達する。任意で、終点ＥＸ１、ＥＸ２、ＥＹ１、およびＥＹ２は、実験試料と並行して実行した陽性対照から誘導してもよい。
ＴＬ増幅プロットに関して、ＰＣＲが、ＴＸを超え、ＴＸを超過する終点ＥＸ１で定常に達する増幅曲線を生成する場合、この結果は、標的Ｘに関連する切断されたＬＯＣＳ－Ｘの存在を示す。標的Ｙもまた存在する場合、切断されたＬＯＣＳ－Ｙは、ＴＬで蛍光を生成しないため、増幅曲線は、影響されないはずである。したがって、ＴＸを超える増幅曲線から得られたＣｑ値は、試料中の標的Ｘの定量化を可能にする。
ＴＨ増幅プロットに関して、ＰＣＲが、ＴＹを超え、ＥＹ１またはＥＹ２のいずれかで定常に達する増幅曲線を生成する場合、これは、標的Ｙの存在を示す。閾値ＴＹは、値ＥＸ２を超えるように設定されているため、標的Ｘのみを含有する反応からの増幅曲線は、この閾値を超えない。標的ＸおよびＹの両方が存在する場合、ＬＯＣＳ－ＸおよびＬＯＣＳ－Ｙの切断は、ＴＹを超え、ＥＹ１よりも大きいＥＹ２で定常に達する増幅曲線を生成し、これは、標的Ｙのみの存在下で切断されたＬＯＣＳ－Ｙに関連する。ＥＸ２＜ＴＹ＜ＥＹ１＜ＥＹ２かつＥＸ２≠ＴＹ≠ＥＹ１≠ＥＹ２であるため、増幅曲線が定常に達する終点は、標的Ｘ、Ｙ、またはその両方の存在を示し得る。しかしながら、ＴＹを超えるＴＨ増幅曲線から得られたＣｑ値は、標的ＸおよびＹの両方の量によって影響されるため、標的Ｙについては半定量的である。Ｃｑ値を調整して、標的Ｙの量の正確な定量化を可能にするための様々な分析方法を、以下に説明する（定量化方法１および２）。
標的Ｙの定量化方法１
ＴＬ３９℃およびＴＨ７２℃でＬＯＣＳ－Ｘの切断された種単独から生じる２つの増幅曲線は、同じ効率およびＣｑを有するが、それぞれ異なる終点ＥＸ１およびＥＸ２で定常に達する。したがって、７２℃での増幅曲線（Ｆ－ＬＯＣＳ－ＸＦＡＦ）においてＬＯＣＳ－Ｘの切断された種から生じる蛍光シグナルは、蛍光調整係数（ＦＡＦ）を適用することによって、３９℃での増幅曲線から外挿することができる。ＦＡＦは、終点ＥＸ１およびＥＸ２の比である。７２℃での増幅曲線における合計蛍光シグナル（Ｆ合計）は、ＬＯＣＳ－Ｘ（Ｆ－ＬＯＣＳ－ＸＦＡＦ）およびＬＯＣＳ－Ｙ（Ｆ－ＬＯＣＳ－Ｙ）の両方の切断された種から生じる蛍光シグナルから生じる。このことから、ＬＯＣＳ－Ｙから生じる７２℃での増幅曲線は、以下のように外挿することができる。
Ｆ合計＝Ｆ－ＬＯＣＳ－ＸＦＡＦ＋Ｆ－ＬＯＣＳ－Ｙであるため、
Ｆ－ＬＯＣＳ－Ｙ＝Ｆ合計－Ｆ－ＬＯＣＳ－ＸＦＡＦ
∴ＬＯＣＳ－Ｙから生じる７２℃での増幅曲線
＝７２℃での実験増幅曲線－３９℃での実験増幅曲線＊ＦＡＦ
Figure 0007423603000006
ＴＹを使用してＬＯＣＳ－Ｙから生じるＴＨ７２℃で増幅曲線から得られたＣｑの値は、完全に定量的である。試料が標的Ｘ、Ｙ、またはその両方を含有するかどうかにかかわらず、この式を適用して、正確な定量化を決定することができる。
標的Ｙの定量化方法２
標的ＸおよびＹの両方が存在する場合、７２℃で実験的に決定されたＣｑ値（Ｃｑ観察）は、標的Ｘを有しない同じ濃度の標的Ｙを含有する試料のＣｑ値からシフトする。標的Ｘの不在下、７２℃で標的Ｙの標準曲線から決定される、Ｃｑ観察値と期待Ｃｑ値との間の関係性（Ｃｑ標準曲線標的Ｙ）を、以下に説明する。
Ｃｑ観察＝Ｃｑ標的Ｙの標準曲線＋Ｃｑの相対シフト
式中、Ｃｑ標的Ｙの標準曲線＝ｆ（標的Ｙのコピー数）である
および
Ｃｑの相対シフト＝ｆ（標的Ｙのコピー数）
Ｃｑ標的Ｙの標準曲線およびＣｑの相対シフトは両方とも、標的Ｙのコピー数の関数であるため、標的Ｙのコピー数は、実験的に決定されたＣｑ値（Ｃｑ観察）から計算することができる。このＣｑ値の相対シフトは、（標的Ｙのコピー数／標的Ｘのコピー数）の自然対数と数学的な関係性（ロジスティック）を有する。７２℃で測定した増幅曲線の最大蛍光レベルの半分を閾値として、Ｃｑ値を決定した場合、ロジスティック関係性は、以下の式として表すことができる。
Figure 0007423603000007
式中、ｙ＝Ｃｑの相対シフト、Ｌ＝Ｃｑの可能な最大シフト、ｋ＝急勾配係数、ｘ＝ｌｎ（標的Ｙのコピー数／標的Ｘのコピー数）であり、標的Ｘのコピー数は、３９℃での増幅曲線から決定されることに留意されたい。
標的Ｘの不在下で決定された標的Ｙの標準曲線方程式にＣｑ値のシフト係数を組み込むことにより、標的Ｘの存在下でのＣｑ値の補正が可能となり、その後に標的Ｙの正確な定量化につながる。
上記の戦略は、任意の標的を検出するように適合させることができるが、この特定の実施例では、標的Ｘは、ＣＴｃｒｙ遺伝子であり、標的Ｙは、ＮＧｏｐａ遺伝子であり、各標的からのアンプリコンの蓄積は、低温（ＴＬ３９℃）で、ならびにＬＯＣＳ－Ｘ（ＬＯＣＳ－１９）およびＬＯＣＳ－Ｙ（ＬＯＣＳ－２０）に関連する蛍光変化によるＰＣＲ中にはより高温（ＴＨ７２℃）で監視し、両方のＬＯＣＳは、同じフルオロフォア（ＪＯＥ）で標識した。
オリゴヌクレオチド
この実験に特異的なオリゴヌクレオチドには、ＬＯＣＳ－１９、ＬＯＣＳ－２０、パートザイムＡ９、パートザイムＢ９、パートザイムＡ１０、パートザイムＢ１０、順方向プライマー７、逆方向プライマー７、順方向プライマー８、および逆方向プライマー１１が
含まれる。配列は、配列表に列挙する。ＣＴｃｒｙの増幅および定量化に特異的なオリゴヌクレオチドは、ＬＯＣＳ－１９、パートザイムＡ９、パートザイムＢ９、順方向プライマー７、および逆方向プライマー７である。ＮＧｏｐａの増幅および定量化に特異的なオリゴヌクレオチドは、ＬＯＣＳ－２０、パートザイムＡ１０、パートザイムＢ１０、順方向プライマー８、および逆方向プライマー１１である。
反応条件
ＢｉｏＲａｄ（登録商標）ＣＦＸ９６熱サイクラーを使用して、２０μＬの合計反応体積で標的配列のリアルタイム検出を実行した。サイクリングパラメータは、９５℃で２分間、その後９５℃で５秒間および６１℃で３０秒間のタッチダウンサイクルを１０回（１サイクルあたり０．５℃の減衰）、ならびに９５℃で５秒間、５２℃で４０秒間、３９℃で１秒間、および７２℃で１秒間のサイクルを４０回（データは３９℃および７２℃のステップの両方で収集）であった。各反応は、４０ｎＭの各順方向プライマー、２００ｎＭの各逆方向プライマー、２００ｎＭの各パートザイム、１００ｎＭのＬＯＣＳ－１９レポーター、２００ｎＭのＬＯＣＳ－２０レポーター、および１×ＰｌｅｘＭａｓｔｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）を含有した。反応は、標的を含有しない（ＮＦ Ｈ２Ｏ）か、または合成ＧブロックＸ（２０，０００、４，０００、８００、１６０、もしくは３２コピー）、ＮＧｏｐａ遺伝子の合成Ｇブロック（２０，０００、４，０００、８００、１６０、もしくは３２コピー）、ＣＴｃｒｙ遺伝子の合成Ｇブロック（２０，０００、４，０００、８００、１６０、もしくは３２コピー）のバックグラウンドでのＣＴｃｒｙ遺伝子の様々な濃度の合成Ｇブロック（２０，０００、４，０００、８００、１６０、もしくは３２コピー）、もしくはＣＴｃｒｙ遺伝子の合成Ｇブロック（２０，０００、４，０００、８００、１６０、もしくは３２コピー）のバックグラウンドでのＮＧｏｐａ遺伝子の様々な濃度の合成Ｇブロック（２０，０００、４，０００、８００、１６０、もしくは３２コピー）のいずれかを含有した。
結果
ＰＣＲ中、２つのＭＮＡザイム（ＭＮＡザイム９およびＭＮＡザイム１０）を使用して、それらの対応するＬＯＣＳレポーター（それぞれＬＯＣＳ－１９およびＬＯＣＳ－２０）の切断を介して標的核酸の増幅をリアルタイムで監視する。ＭＮＡザイム９は、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの検出のためにＣＴｃｒｙに相同な配列を検出し、ＬＯＣＳ－１９を切断および開放するように設計した。ＭＮＡザイム１０は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅの検出のためにＮＧｏｐａに相同な配列を検出し、ＬＯＣＳ－２０を切断および開放するように設計した。
図１７Ａおよび１７Ｂに示される結果は、それぞれ３９℃および７２℃で測定した、２０，０００コピーのＣＴｃｒｙもしくはＮＧｏｐａ、または２０，０００コピーの両方の遺伝子標的のいずれかを含有する反応からＪＯＥチャネルで得られた比較増幅曲線を示す。結果を、二連の反応の平均としてプロットする。３９℃では、２０，０００コピーのＣＴｃｒｙ鋳型（黒実線）を含有する試料は、ＴＸ（ＴＸと表される黒水平線）を超え、ＥＸ１（ＥＸ１と表される黒水平線）に達する蛍光レベルを有する増幅曲線を示す。３９℃では、２０，０００コピーのＣＴｃｒｙ鋳型およびＮＧｏｐａ鋳型の両方を含有する試料（灰色実線）は、ＴＸを超え、ＥＸ１に達する蛍光レベルを有する増幅曲線を示すが、ＣＴｃｒｙ鋳型を含有しない試料（黒点線）は、ＴＸを超えず、ＥＸ１に達しない。したがって、ＥＸ１で３９℃で定常に達する増幅曲線は、試料中のＣＴｃｒｙの存在を確認する。このグラフは、２０，０００コピーのＣＴｃｒｙのみ（黒実線）ならびに２０，０００コピーのＣＴｃｒｙおよびＮＧｏｐａの両方（灰色実線）を含有する試料が、同様のＣｑ値を有することを示す。
３９℃でのＣｑ値は、ＮＧｏｐａの存在によって影響されないため、それを、試料中の
ＣＴｃｒｙの定量化に使用することができる。０、３２、１６０、８００、４，０００、および２０，０００コピーのＣＴｃｒｙ遺伝子標的、ならびに０、３２、１６０、８００、４，０００、および２０，０００コピーのＮＧｏｐａ遺伝子標的の全ての組み合わせの試料中のＣＴｃｒｙの定量化の結果を、表６に要約する。ＮＵＬＬは、３９℃で決定してＣｑ値が存在しないため、試料中にＣＴｃｒｙが存在しない場合を指す。
図１７Ｂは、ＴＹ（ＴＹと表される黒水平線）を超え、ＥＹ１（ＥＹ１と表される黒水平線）で定常に達する蛍光レベルを有する、２０，０００コピーのＮＧｏｐａ鋳型（黒点線）を含有する試料の７２℃での増幅曲線を示す。７２℃では、２０，０００コピーのＣＴｃｒｙおよびＮＧｏｐａの両方を含有する試料（灰色実線）は、ＴＹを超え、ＥＹ２（ＥＹ２と表される黒水平線）で定常に達する蛍光レベルを有する増幅曲線を示すが、標的ＮＧｏｐａ鋳型を含有しない試料（黒実線）は、ＴＹを超えず、ＥＹ１およびＥＹ２に達しないが、終点ＥＸ２（終点ＥＸ２と表される黒水平線）で定常に達するにすぎない。したがって、ＥＸ２で７２℃で定常に達する増幅曲線は、試料中の標的ＣＴｃｒｙの存在は確認するが、ＮＧｏｐａの存在は確認せず、ＥＹ１で定常に達する増幅曲線は、試料中のＮＧｏｐａの存在は確認するが、ＣＴｃｒｙの存在は確認せず、ＥＹ２で定常に達する増幅曲線は、試料中のＣＴｃｒｙおよびＮＧｏｐａの両方の存在を確認する。
７２℃では、２０，０００コピーのＣＴｃｒｙおよびＮＧｏｐａの両方を含有する試料のＣｑ値（灰色実線）は、２０，０００コピーのＮＧｏｐａ鋳型のみを含有する試料のＣｑ値（黒点線）と同じではない。試料中のＣＴｃｒｙの存在は、７２℃でのＮＧｏｐａのＣｑ値を、この実施例では最大約－４．７７だけシフトさせ得る。したがって、７２℃でＣｑの値を正規化せずに使用することにより、ＰＣＲ増幅中の１００％の効率を想定して、期待値よりも２４．７７倍以下のＮＧｏｐａの濃度を決定する。いかなる正規化も行わない、０、３２、１６０、８００、４，０００、および２０，０００コピーのＣＴｃｒｙ遺伝子標的、ならびに０、３２、１６０、８００、４，０００、および２０，０００コピーのＮＧｏｐａ遺伝子標的の全ての組み合わせの試料の７２℃での増幅の分析を、Ｃｑ値については表７に、ＮＧｏｐａの定量化については表８に要約する。ＮＵＬＬは、７２℃で決定されるＣｑ値が存在しないため、試料中にＮＧｏｐａが存在しない場合である。結果は、正規化を行わない方法論が、ＣＴｃｒｙについて完全に定量的であり、ＮＧｏｐａについて半定量的であることを示す。

図１８に示される結果は、それぞれ３９℃および７２℃で測定した、０、３２、および２０，０００コピーのＣＴｃｒｙ遺伝子標的、ならびに０、３２、および２０，０００コピーのＮＧｏｐａ遺伝子標的の全ての可能な組み合わせを含有する反応からＪＯＥチャネルで得られた比較増幅曲線を示す。結果を、二連の反応の平均としてプロットする。このグラフに示される試料は、グラフの左側に示される量のＮＧｏｐａを含有する。２０，０００コピーのＣＴｃｒｙを含有する試料を、黒点線で示し、３２コピーのＣＴｃｒｙを含有する試料を、灰色実線で示し、０コピーのＣＴｃｒｙを含有する試料を、黒実線で示す。図１８Ｂおよび１８Ｅにおいて、７２℃で取得した正規化されていない増幅曲線から、試料中のＣＴｃｒｙの存在が、Ｃｑ値をシフトさせることが観察される。結果を、定量化方法１を使用してさらに分析した。７２℃での増幅曲線から、３９℃での増幅曲線にＦＡＦを乗算したものを減算すると（Ｆ－ＬＯＣＳ－Ｙ＝Ｆ合計－Ｆ－ＬＯＣＳ－ＸＦＡＦであるため）、切断されたＬＯＣＳ－１９からの寄与を有しない、ＬＯＣＳ－２０の切断された種からの蛍光シグナルに対応する外挿された増幅曲線が生成される（図１８Ｃおよび１８Ｆ）。７２℃での全ての外挿された増幅曲線は、同様のＣｑ値を示し、ここで試料中のＣＴｃｒｙの量に関係なく、同じ数のＮＧｏｐａ鋳型が存在する。図１８Ｉは、７２℃での外挿された増幅曲線が、試料がいかなるＮＧｏｐａ鋳型も含有しない場合に、いかなる有意な増幅も示さないことを示す。Ｆ－ＬＯＣＳ－ＸＦＡＦシグナルによる減算による正規化の効果は、表９（Ｆ－ＬＯＣＳ－ＸＦＡＦ正規化Ｃｑ値）および表１０（Ｆ－ＬＯＣＳ－ＸＦＡＦ正規化後のＮＧｏｐａの定量化）においてさらに実証され、これらは、Ｆ－ＬＯＣＳ－ＸＦＡＦシグナルによる減算によって正規化した後の、０、３２、１６０、
８００、４，０００、および２０，０００コピーのＣＴｃｒｙ遺伝子標的、ならびに０、３２、１６０、８００、４，０００、および２０，０００コピーのＮＧｏｐａ遺伝子標的の全ての組み合わせの試料の７２℃での増幅の分析である。ＮＵＬＬは、７２℃で決定してＣｑ値が存在しないため、試料中に標的Ｙが存在しない場合である。

７２℃で取得したデータからの増幅曲線について、ＣＴｃｒｙおよびＮＧｏｐａの両方を含有する試料のＣｑ値は、ＮＧｏｐａのみを含有する試料と比較して、シフトしている。結果を、定量化方法２を使用してさらに分析した。図１９は、Ｃｑの相対シフトに対してプロットした（ＮＧｏｐａのコピー数／ＣＴｃｒｙのコピー数）の自然対数のロジスティック回帰を示し、式中、Ｃｑ閾値は、以下の式によって支配される、増幅曲線の最大蛍光レベルの半分に設定されている。
Figure 0007423603000013
上記の式は、７２℃でＣＴｃｒｙの不在下で決定されるＮＧｏｐａの標準曲線方程式に、以下のように組み込むことができる。
Ｃｑ観察＝ＣｑＮＧｏｐａの標準曲線＋Ｃｑの相対シフト
Figure 0007423603000014
ＣＴｃｒｙのコピー数は、３９℃で取得したデータから決定されるため、上記の式を使用して、数学的溶媒和プログラムによって、７２℃での実験的なＣｑ（Ｃｑ観察）から、試料中のＮＧｏｐａのコピー数を決定することができる。表１１は、二連の平均として示される、０、３２、１６０、８００、４，０００、および２０，０００コピーのＣＴｃｒｙ遺伝子標的、ならびに０、３２、１６０、８００、４，０００、および２０，０００コピーの計算されたＮＧｏｐａ遺伝子標的の全ての組み合わせの試料についてＣｑの相対シフト係数を計算した、７２℃で観察されたＣｑを示す。表１２は、同じ試料の相対シフト係数で正規化したＣｑ値を使用する、コピー数の決定を示す。

実施例１３：６つのＬＯＣＳレポーターを使用する２つの蛍光チャネルでの６つの標的の同時検出
以下の実施例では、ＬＯＣＳレポーターを使用して、２つの蛍光チャネルにわたって検出することができる標的の数を増加させる。この実施例では、２つの蛍光チャネルの各々において、３つの標的を検出する。この実施例では、６つ全てのＬＯＣＳレポーターを、フルオロフォア（ＪＯＥまたはＡｔｔｏ１０１）で５’標識し、クエンチャー（それぞれ３ＩＡＢｋＦＱまたは３ＩＡｂＲＱＳｐ）で３’標識する。ＬＯＣＳレポーターのループ領域は各々、異なる核酸基質を含有し、ステム領域は、ＬＯＣＳレポーターをループステム構成に拘束する一連の相補的な塩基対を含有する。この構成では、フルオロフォアおよびクエンチャーは近接しており、標的の不在下では蛍光がクエンチされる。
オリゴヌクレオチド
この実験に特異的なオリゴヌクレオチドには、ＬＯＣＳ－２１（配列番号８８）、ＬＯＣＳ－２２（配列番号８９）、ＬＯＣＳ－２３（配列番号９０）、ＬＯＣＳ－２４（配列番号９１）、ＬＯＣＳ－２５（配列番号９２）、ＬＯＣＳ－２６（配列番号９３）、パートザイムＡ１４（配列番号９４）、パートザイムＢ１４（配列番号９５）、パートザイムＡ１５（配列番号９６）、パートザイムＢ１５（配列番号９７）、パートザイムＡ１６（配列番号９８）、パートザイムＢ１６（配列番号９９）、パートザイムＡ１７（配列番号１００）、パートザイムＢ１７（配列番号１０１）、パートザイムＡ１８（配列番号１０２）、パートザイムＢ１８（配列番号１０３）、パートザイムＡ１９（配列番号１０４）、パートザイムＢ１９（配列番号１０５）、順方向プライマー１２（配列番号１０６）、逆方向プライマー１２（配列番号１０７）、順方向プライマー９（配列番号５４）、逆方向プライマー９（配列番号５５）、順方向プライマー１３（配列番号１０８）、逆方向プライマー１３（配列番号１０９）、順方向プライマー１４（配列番号１１０）、逆方向プライマー２（配列番号１０）、順方向プライマー１（配列番号７）、逆方向プライマー１（配列番号８）、順方向プライマー１５（配列番号１１１）、逆方向プライマー１５（配列番号１１２）が含まれる。配列は、配列表に列挙する。ｇｐｄの増幅および検出に特異的なオリゴヌクレオチドは、ＬＯＣＳ－２１、パートザイムＡ１４、パートザイムＢ１４、順方向プライマー１２、および逆方向プライマー１２である。ｇｐｄ３の増幅および検出に特異的なオリゴヌクレオチドは、ＬＯＣＳ－２２、パートザイムＡ１５、パートザイムＢ１５、順方向プライマー９、および逆方向プライマー１２である。ｐｏｒＡの増幅および検出に特異的なオリゴヌクレオチドは、ＬＯＣＳ－２３、パートザイムＡ１６、パートザイムＢ１６、順方向プライマー１３、および逆方向プライマー１３である。ＴＶ－Ｂｔｕｂの増幅および検出に特異的なオリゴヌクレオチドは、ＬＯＣＳ－２４、パートザイムＡ１７、パートザイムＢ１７、順方向プライマー１４、および逆方向プライマー２である。ＭｇＰａの増幅および検出に特異的なオリゴヌクレオチドは、ＬＯＣＳ－２５、パートザイムＡ１８、パートザイムＢ１８、順方向プライマー１、および逆方向プライマー１である。ＬＧＶの増幅および検出に特異的なオリゴヌクレオチドは、ＬＯＣＳ－２６、パートザイムＡ１９、パートザイムＢ１９、順方向プライマー１５、および逆方向プライマー１５である。
反応条件
ＢｉｏＲａｄ（登録商標）ＣＦＸ９６熱サイクラーを使用して、２０μＬの合計反応体積で標的配列のリアルタイム増幅および検出を実行した。サイクリングパラメータは、４０℃で１秒間、７０℃で１秒間、８５℃で１秒間、９５℃で２分間、９５℃で５秒間および６１℃で３０秒間のタッチダウンサイクルを１０回（１サイクルあたり０．５℃の減衰）、ならびに９５℃で５秒間、５２℃で４０秒間、および６５℃で１秒間を４０サイクル（データは６５℃のステップで収集）、その後４０℃で１秒間、７０℃で１秒間、および８５℃で１秒間であった。融解曲線パラメータは、２０℃から９５℃まで０．５℃の増分で、５秒間保持した（データ収集は保留）。全ての反応は、二連で実行し、４０ｎＭの各
順方向プライマー、２００ｎＭの各逆方向プライマー、２００ｎＭの各パートザイムＡ、２００ｎＭの各パートザイムＢ、各々２００ｎＭのＬＯＣＳ－２１、ＬＯＣＳ－２２、ＬＯＣＳ－２４、およびＬＯＣＳ－２５、および、各々１５０ｎＭのＬＯＣＳ－２３およびＬＯＣＳ－２６、８ｍＭのＭｇＣｌ２（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、０．２ｍＭのｄＮＴＰ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、２単位のＭｙＴａｑポリメラーゼ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、ならびに１×ＮＨ４緩衝液（Ｂｉｏｌｉｎｅ）を含有した。反応は、ｇｐｄおよび／もしくはｇｐｄ３および／もしくはｐｏｒＡもしくはＴＶ－Ｂｔｕｂおよび／もしくはＭｇＰａおよび／もしくはＬＧＶ遺伝子に相同なＧブロック鋳型（１０，０００コピー）を含有するか、または標的なし（ＮＦ Ｈ２Ｏ）のいずれかであった。
結果
ＰＣＲとして知られているインビトロ標的増幅法を使用して、６つのＭＮＡザイム（ＭＮＡザイム１４、ＭＮＡザイム１５、ＭＮＡザイム１６、ＭＮＡザイム１７、ＭＮＡザイム１８、およびＭＮＡザイム１９）を使用して、それらの対応するＬＯＣＳレポーター（それぞれＬＯＣＳ－２１、ＬＯＣＳ－２２、ＬＯＣＳ－２３、ＬＯＣＳ－２４、ＬＯＣＳ－２５、およびＬＯＣＳ－２６）の切断を介して標的核酸の増幅をリアルタイムで監視する。各チャネル（ＪＯＥおよびテキサスレッド）のいずれかまたは全ての標的の存在は、ＰＣＲの増幅相での蛍光の増加によって決定し（データ示さず）、その後固有のＬＯＣＳ融解特性に基づいて個々の標的を識別した。ＭＮＡザイム１４は、ｇｐｄ遺伝子に相同な配列を検出し、ＬＯＣＳ－２１を切断および開放するように設計し、ＭＮＡザイム１５は、ｇｐｄ３遺伝子に相同な配列を検出し、ＬＯＣＳ－２２を切断および開放するように設計し、ＭＮＡザイム１６は、ｐｏｒＡ遺伝子に相同な配列を検出し、ＬＯＣＳ－２３を切断および開放するように設計し、ＭＮＡザイム１７は、ＴＶ－Ｂｔｕｂ遺伝子に相同な配列を検出し、ＬＯＣＳ－２４を切断および開放するように設計し、ＭＮＡザイム１８は、ＭｇＰａ遺伝子に相同な配列を検出し、ＬＯＣＳ－２５を切断および開放するように設計し、ＭＮＡザイム１９は、ＬＧＶ遺伝子に相同な配列を検出し、ＬＯＣＳ－２６を切断および開放するように設計した。この実験では、増幅および検出は、全てのＭＮＡザイム、プライマー、およびＬＯＣＳオリゴヌクレオチドを含有する単一の管内で実行した。ｇｐｄ、ｇｐｄ３、ｐｏｒＡ、ＴＶ－Ｂｔｕｂ、ＭｇＰａ、ＬＧＶ遺伝子、またはこれら６つの遺伝子の様々な組み合わせ（複数の感染を有する試料を表す）の存在は、ＪＯＥチャネルおよびテキサスレッドチャネルのいずれかまたは両方のシグナルの増加によって検出した（データ示さず）。
図２０～２２に示される結果は、１０，０００コピーの標的ｇｐｄ（図２０Ａ）、ｇｐｄ３（図２０Ｂ）、ｐｏｒＡ（図２０Ｃ）、ｇｐｄおよびｇｐｄ３の両方（図２０Ｄ）、ｇｐｄおよびｐｏｒＡの両方（図２０Ｅ）、ｇｐｄ３およびｐｏｒＡの両方（図２０Ｆ）、またはｇｐｄ、ｇｐｄ３、およびｐｏｒＡの３つ全て（図２２Ａ）、ＴＶ－Ｂｔｕｂ（図２１Ａ）、ＭｇＰａ（図２１Ｂ）、ＬＧＶ（図２１Ｃ）、ＴＶ－ＢｔｕｂおよびＭｇＰａの両方（図２１Ｄ）、ＴＶ－ＢｔｕｂおよびＬＧＶの両方（図２１Ｅ）、ＭｇＰａおよびＬＧＶの両方（図２１Ｆ）、またはＴＶ－Ｂｔｕｂ、ＭｇＰａ、およびＬＧＶの３つ全て（図２２Ｂ）を含有する反応から増幅後に得られたそれぞれの融解曲線特性を示す。結果は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ（バージョン１４）を使用してプロットした二連の反応の平均である。
表１３に要約されるこの実施例のデータは、ｇｐｄ遺伝子標的（Ｔｍ＝５３℃、６８℃、および８５℃）の存在下で生成されるＬＯＣＳ融解特性が、ｇｐｄ３（Ｔｍ＝３０℃、４３℃、７７℃、および８５℃）ならびにｐｏｒＡ（Ｔｍ＝６８℃および７７℃）遺伝子標的の存在下で生成されるＬＯＣＳ融解特性とは異なることを示す。この実施例は、ＴＶ－Ｂｔｕｂ、ＭｇＰａ、および／またはＬＧＶ遺伝子標的の同時検出を、ｇｐｄ、ｇｐｄ３、および／またはｐｏｒＡの検出に加えて、第２のチャネルで達成できることを示す。
ＴＶ－Ｂｔｕｂ遺伝子標的（Ｔｍ＝３０℃、４２℃、６６℃、および８２℃）の存在下で生成されるＬＯＣＳ融解特性は、ＭｇＰａ（５３℃、６６℃、および８２℃）ならびにＬＧＶ（Ｔｍ＝６８℃）遺伝子標的の存在下で生成されるＬＯＣＳ融解特性とは異なる。さらに、単一のチャネルから読み取った２つ以上の遺伝子標的の存在下でのＬＯＣＳ融解特性はまた、単一の遺伝子標的のみが存在する前述の融解特性とも異なる。ＪＯＥチャネルでは、ｇｐｄおよびｇｐｄ３遺伝子標的が単一の反応に存在する場合、固有のＬＯＣＳ融解特性（Ｔｍ＝３０℃、４３℃、５３℃、および８５℃）は、両方の標的が検出されたことを示した。同様に、ｇｐｄおよびｐｏｒＡまたはｇｐｄ３およびｐｏｒＡが単一の反応に存在する場合、固有の融解曲線特性（それぞれ、Ｔｍ＝５３℃および６８℃ならびにＴｍ＝３０℃、４３℃、６８℃、および７７℃）は、どの２つの標的が検出されたかを具体的に示した。同様に、テキサスレッドチャネルでは、ＬＯＣＳ融解特性は、標的の各組み合わせ、ＴＶ－ＢｔｕｂおよびＭｇＰａ（Ｔｍ＝３０℃、４２℃、５３℃、および８２℃）、ＴＶ－ＢｔｕｂおよびＬＧＶ（Ｔｍ＝３０℃、４２℃、および６８℃）、またはＭｇＰａおよびＬＧＶ（Ｔｍ＝５３℃および６８℃）について固有であった。ｇｐｄ、ｇｐｄ３、およびｐｏｒＡ遺伝子標的が全て単一の反応に存在する場合、ＪＯＥチャネル内の固有のＬＯＣＳ融解特性（Ｔｍ＝３０℃、４３℃、５３℃、および６８℃）は、３つ全ての標的が検出されたことを示した。同様に、テキサスレッドチャネルでは、単一におけるＴＶ－Ｂｔｕｂ、ＭｇＰａ、およびＬＧＶ標的の存在は、固有のＬＯＣＳ融解特性（Ｔｍ＝３０℃、４２℃、５３℃、および６８℃）をもたらした。
この実施例は、単一のウェル内で２つの蛍光チャネル（各チャネルで３つの標的を検出）を使用して同時増幅した６つの標的を、それらの固有のＬＯＣＳ融解特性に基づいて区別することができることを実証する。この実施例は、２つの蛍光チャネルのみを使用して単一のウェル内の複数の標的を検出するための簡便な方法を提供する。異なるステムの長さおよび塩基対の組成により、ＬＯＣＳ－２１、ＬＯＣＳ－２２、ＬＯＣＳ－２３、ＬＯＣＳ－２４、ＬＯＣＳ－２５、およびＬＯＣＳ－２６内の異なるステム（ステム５、ステム６、ステム７、ステム８、ステム９、およびステム１０）は、固有の蛍光融解曲線特性を生成した。
実施例１４：５つの蛍光チャネルおよび１０個のＬＯＣＳレポーターを使用する、単一のウェル内の１０個の標的の同時検出および識別
以下の実施例では、ＬＯＣＳレポーターを使用して、各チャネル内で検出することができる標的の数を増加させることによって、５つの蛍光チャネルを使用して単一のウェル内で同時に検出することができる標的の数を増加させる。この実施例では、５つの蛍光チャネルの各々において、２つの標的を検出する。この実施例では、１０個全てのＬＯＣＳレポーターを、フルオロフォア（ＦＡＭ、ＪＯＥ、ＡｔｔｏＲｈｏ１０１、Ｃｙ５、またはＣｙ５．５）で５’標識し、クエンチャー（３ＩＡＢｋＦＱまたは３ＩＡｂＲＱＳｐ）で３’標識する。ＬＯＣＳレポーターのループ領域は、核酸基質を含有し、ステム領域は、ＬＯＣＳレポーターをループステム構成に拘束する一連の相補的な塩基対を含有する。この構成では、フルオロフォアおよびクエンチャーは近接しており、標的の不在下では蛍光がクエンチされる。
オリゴヌクレオチド
この実験に特異的なオリゴヌクレオチドには、ＬＯＣＳ－１０（配列番号４０）、ＬＯＣＳ－１５（配列番号７９）、ＬＯＣＳ－２１（配列番号８８）、ＬＯＣＳ－２２（配列番号８９）、ＬＯＣＳ－２４（配列番号９１）、ＬＯＣＳ－２７（配列番号１１３）、ＬＯＣＳ－２８（配列番号１１４）、ＬＯＣＳ－２９（配列番号１１５）、ＬＯＣＳ－３０（配列番号１１６）、ＬＯＣＳ－３１（配列番号１１７）、パートザイムＡ９（配列番号４３）、パートザイムＢ９（配列番号４４）、パートザイムＡ１０（配列番号４８）、パートザイムＢ１０（配列番号４９）、パートザイムＡ１４（配列番号９４）、パートザイムＢ１４（配列番号９５）、パートザイムＡ１５（配列番号９７）、パートザイムＢ１５（配列番号９８）、パートザイムＡ１６（配列番号９８）、パートザイムＢ１６（配列番号９９）、パートザイムＡ１７（配列番号１００）、パートザイムＢ１７（配列番号１０１）、パートザイムＡ１８（配列番号１０２）、パートザイムＢ１８（配列番号１０３）、パートザイムＡ１９（配列番号１０４）、パートザイムＢ１９（配列番号１０５）、パートザイムＡ２０（配列番号１１８）、パートザイムＢ２０（配列番号１１９）、パートザイムＡ２１（配列番号１２０）、パートザイムＢ２１（配列番号１２１）、順方向プライマー１（配列番号７）、逆方向プライマー１（配列番号８）、逆方向プライマー２（配列番号１０）、順方向プライマー７（配列番号４１）、逆方向プライマー７（配列番号４２）、順方向プライマー８（配列番号５２）、順方向プライマー９（配列番号５４）、逆方向プライマー９（配列番号５５）、順方向プライマー１０（配列番号７２）、逆方向プライマー１０（配列番号７３）、逆方向プライマー１１（配列番号８５）、順方向プライマー１２（配列番号１０６）、逆方向プライマー１２（配列番号１０７）、順方向プライマー１３（配列番号１０８）、逆方向プライマー１３（配列番号１０９）、順方向プライマー１４（配列番号１１０）、順方向プライマー１５（配列番号１１１）、逆方向プライマー１５（配列番号１１２）、順方向プライマー１６（配列番号１２２）、および逆方向プライマー１６（配列番号１２３）が含まれる。配列は、配列表に列挙する。
ＣＴｃｒｙの増幅および検出に特異的なオリゴヌクレオチドは、ＬＯＣＳ－２９、パートザイムＡ９、パートザイムＢ９、順方向プライマー７、および逆方向プライマー７である。ＮＧｏｐａの増幅および検出に特異的なオリゴヌクレオチドは、ＬＯＣＳ－１５、パートザイムＡ１０、パートザイムＢ１０、順方向プライマー８、および逆方向プライマー１１である。ｇｐｄの増幅および検出に特異的なオリゴヌクレオチドは、ＬＯＣＳ－２１、パートザイムＡ１４、パートザイムＢ１４、順方向プライマー１２、および逆方向プライマー１２である。ｇｐｄ３の増幅および検出に特異的なオリゴヌクレオチドは、ＬＯＣＳ－２２、パートザイムＡ１５、パートザイムＢ１５、順方向プライマー９、および逆方向プライマー９である。ｐｏｒＡの増幅および検出に特異的なオリゴヌクレオチドは、ＬＯＣＳ－２７、パートザイムＡ１６、パートザイムＢ１６、順方向プライマー１３、およ
び逆方向プライマー１３である。ＴＶ－Ｂｔｕｂの増幅および検出に特異的なオリゴヌクレオチドは、ＬＯＣＳ－２４、パートザイムＡ１７、パートザイムＢ１７、順方向プライマー１４、および逆方向プライマー２である。ＭｇＰａの増幅および検出に特異的なオリゴヌクレオチドは、ＬＯＣＳ－２８、パートザイムＡ１８、パートザイムＢ１８、順方向プライマー１、および逆方向プライマー１である。ＬＧＶの増幅および検出に特異的なオリゴヌクレオチドは、ＬＯＣＳ－１０、パートザイムＡ１９、パートザイムＢ１９、順方向プライマー１５、および逆方向プライマー１５である。ｐｏｌＡの増幅および検出に特異的なオリゴヌクレオチドは、ＬＯＣＳ－３０、パートザイムＡ２０、パートザイムＢ２０、順方向プライマー１６、および逆方向プライマー１６である。ＴＦＲＣの増幅および検出に特異的なオリゴヌクレオチドは、ＬＯＣＳ－３１、パートザイムＡ２１、パートザイムＢ２１、順方向プライマー１０、および逆方向プライマー１０である。
反応条件
ＢｉｏＲａｄ（登録商標）ＣＦＸ９６熱サイクラーを使用して、２０μＬの合計反応体積で標的配列のリアルタイム増幅および検出を実行した。サイクルパラメータは、３１℃で１秒間、４２℃で１秒間、５３℃で１秒間、６０℃で１秒間、９５℃で２分間、９５℃で５秒間および６１℃で３０秒間のタッチダウンサイクルを１０回（１サイクルあたり０．５℃の減衰）、ならびに９５℃で５秒間、５２℃で４０秒間、および６５℃で５秒間を４０サイクル（データは６５℃のステップで収集）、その後３１℃で１秒間、４２℃で１秒間、５３℃で１秒間、および６０℃で１秒間であった。融解曲線パラメータは、２０℃から９５℃まで０．５℃の増分で、５秒間保持した（データ収集は保留）。全ての反応は、二連で実行し、４０ｎＭの各順方向プライマー、２００ｎＭの各逆方向プライマー、２００ｎＭの各パートザイムＡ、２００ｎＭの各パートザイムＢ、各々２００ｎＭのＬＯＣＳ－１０、ＬＯＣＳ－１５、ＬＯＣＳ－２１、ＬＯＣＳ－２２、ＬＯＣＳ－２４、ＬＯＣＳ－２７、ＬＯＣＳ－２９、およびＬＯＣＳ－３１レポーター、ならびに各々１５０ｎＭのＬＯＣＳ－２８およびＬＯＣＳ－３０、８ｍＭのＭｇＣｌ２（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、０．２ｍＭのｄＮＴＰ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、２単位のＭｙＴａｑポリメラーゼ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、ならびに１×ＮＨ４緩衝液（Ｂｉｏｌｉｎｅ）を含有した。反応は、ＮＧｏｐａおよび／もしくはｐｏｒＡ、ｇｐｄおよび／もしくはｇｐｄ３、ＴＶ－Ｂｔｕｂおよび／もしくはＭｇＰａ、ＣＴｃｒｙおよび／もしくはＬＧＶ、またはｐｏｌＡ遺伝子に相同なＧブロック鋳型（１０，０００コピー）を含有するか、あるいは標的なし（ＮＦ Ｈ２Ｏ）のいずれかであった。全ての反応は、内因性対照として機能するＴＦＲＣ遺伝子標的を含有する１０，０００コピーのヒトゲノムＤＮＡのバックグラウンドを含有した。ＴＦＲＣ遺伝子の検出は、Ｃｙ５．５チャネルの蛍光の増加による内部対照として全ての反応で監視した（データ示さず）。
結果
ＰＣＲとして知られているインビトロ標的増幅法を使用して、１０個のＭＮＡザイム（ＭＮＡザイム９、ＭＮＡザイム１０、およびＭＮＡザイム１４～２１）を使用して、それらの対応するＬＯＣＳレポーター（ＬＯＣＳ－２９、ＬＯＣＳ－１５、ＬＯＣＳ－２１、ＬＯＣＳ－２２、ＬＯＣＳ－２７、ＬＯＣＳ－２４、ＬＯＣＳ－２８、ＬＯＣＳ－１０、ＬＯＣＳ－３０、およびＬＯＣＳ－３１）の切断を介して標的核酸の増幅をリアルタイムで監視する。各チャネル（ＦＡＭ、ＨＥＸ、テキサスレッド、Ｃｙ５、およびＣｙ５．５）内の一方または両方の標的の存在は、ＰＣＲの増幅相中の蛍光の増加によって決定し、その後ＬＯＣＳ融解特性を使用して個々の標的を識別した。
ＭＮＡザイム１０は、ＮＧｏｐａ遺伝子に相同な配列を検出し、ＬＯＣＳ－１５を切断および開放するように設計し、ＭＮＡザイム１６は、ｐｏｒＡ遺伝子に相同な配列を検出し、ＬＯＣＳ－２７を切断および開放するように設計し、ＭＮＡザイム１４は、ｇｐｄ遺伝子に相同な配列を検出し、ＬＯＣＳ－２１を切断および開放するように設計し、ＭＮＡ
ザイム１５は、ｇｐｄ３遺伝子に相同な配列を検出し、ＬＯＣＳ－２２を切断および開放するように設計し、ＭＮＡザイム１７は、ＴＶ－Ｂｔｕｂに相同な配列を検出し、ＬＯＣＳ－２４を切断および開放するように設計し、ＭＮＡザイム１８は、ＭｇＰａ遺伝子に相同な配列を検出し、ＬＯＣＳ－２８を切断および開放するように設計し、ＭＮＡザイム９は、ＣＴｃｒｙ遺伝子に相同な配列を検出し、ＬＯＣＳ－２９を切断および開放するように設計し、ＭＮＡザイム１９は、ＬＧＶ ｐｍｐＨ遺伝子に相同な配列を検出し、ＬＯＣＳ－１０を切断および開放するように設計し、ＭＮＡザイム２０は、ｐｏｌＡ遺伝子に相同な配列を検出し、ＬＯＣＳ－３０を切断および開放するように設計し、ＭＮＡザイム２１は、ヒトＴＦＲＣ遺伝子を検出し、ＬＯＣＳ－３１を切断および開放するように設計した。
この実験では、増幅および検出は、全てのＭＮＡザイムの全てのパートザイム、全てのプライマー、および全てのＬＯＣＳオリゴヌクレオチドを含有する単一の管内で実行した。ＮＧｏｐａ、ｐｏｒＡ、ｇｐｄ、ｇｐｄ３、ＴＶ－Ｂｔｕｂ、ＭｇＰａ、ＣＴｃｒｙ、ＬＧＶ、ｐｏｌＡ、ＴＦＲＣ、またはこれら１０個の遺伝子標的の様々な組み合わせ（複数の感染を有する試料を表す）のいずれかの存在は、ＦＡＭ、ＨＥＸ、テキサスレッド、Ｃｙ５、またはＣｙ５．５チャネルのいずれかのシグナルの増加によって検出した（データ示さず）。
図２３に示される結果は、１０，０００コピーの標的ＮＧｏｐａ（図２３Ａ）、ｐｏｒＡ（図２３Ｂ）、ＮＧｏｐａおよびｐｏｒＡの両方（図２３Ｃ）、ｇｐｄ（図２３Ｄ）、ｇｐｄ３（図２３Ｅ）、ｇｐｄおよびｇｐｄ３の両方（図２３Ｆ）、ＴＶ－Ｂｔｕｂ（図２３Ｇ）、ＭｇＰａ（図２３Ｈ）、ＴＶ－ＢｔｕｂおよびＭｇＰａの両方（図２３Ｉ）、ＣＴｃｒｙ（図２３Ｊ）、ＬＧＶ（図２３Ｋ）、ＣＴｃｒｙおよびＬＧＶの両方（図２３Ｌ）、ｐｏｌＡ（図２３Ｍ）、またはＴＦＲＣ（図２３Ｎ）を含有する反応から増幅後に得られたそれぞれの融解曲線特性を示す。結果は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ（バージョン１４）を使用してプロットした二連の反応の平均である。
表１４に要約されるこの実施例のデータは、単一の標的の存在下で生成されるＬＯＣＳ融解特性が、同じチャネルで蛍光を発する第２の標的の存在によって生成されるＬＯＣＳ融解特性とは異なることを実証する。加えて、単一チャネル内の両方の標的の存在によって生成されるＬＯＣＳ融解特性は、特定の波長で検出される２つの単一の標的のいずれかによって生成されるＬＯＣＳ融解特性とは異なる。この結果は、この実施例の５つ全てのチャネルにわたって一致している。ＦＡＭチャネルでは、ＮＧｏｐａ（Ｔｍ＝５３℃）、ｐｏｒＡ（Ｔｍ＝３０℃および７６℃）、ならびにＮＧｏｐａおよびｐｏｒＡの両方（Ｔｍ＝３０℃および５３℃）の遺伝子標的の存在下で生成されるＬＯＣＳ融解特性は、全て異なった。ＨＥＸチャネルでは、ｇｐｄ（５３℃および７０℃）、ｇｐｄ３（３０℃、４３℃、および７６℃）、ならびにｇｐｄおよびｇｐｄ３の両方（３０℃、４３℃、および５３℃）の遺伝子標的の存在下で生成されるＬＯＣＳ融解特性は、全て異なった。テキサスレッドチャネルでは、ＴＶ－Ｂｔｕｂ（３１℃、４１℃、５９℃、および８３℃）、ＭｇＰａ（６３℃）、ならびにＴＶ－ＢｔｕｂおよびＭｇＰａの両方（３１℃、４１℃、および６３℃）の遺伝子標的の存在下で生成されるＬＯＣＳ融解特性は、全て異なった。Ｃｙ５チャネルでは、ＣＴｃｒｙ（６１℃および７９℃）、ＬＧＶ（４７℃および８０℃）、ならびにＣＴｃｒｙおよびＬＧＶの両方（４７℃および６１℃）の遺伝子標的の存在下で生成されるＬＯＣＳ融解特性は、全て異なった。この実施例では、ヒトゲノムＤＮＡ（ＴＦＲＣ）が、全ての反応でＣｙ５．５チャネルで検出され、それにより、内因性対照として機能する。その結果、ｐｏｌＡを検出する反応は、ＴＦＲＣを同時に検出し、これは、ＬＯＣＳ融解特性において、それぞれＴＦＲＣおよびｐｏｌＡ遺伝子標的に対応する２つのピーク（３９℃および５９℃）によって実証される。Ｃｙ５．５チャネルでは、ｐｏｌＡおよびＴＦＲＣ（３９℃および５９℃）の存在下で生成されるＬＯＣＳ融解特性は、
ＴＦＲＣ（３９℃および８０℃）単独の存在下で生成されるＬＯＣＳ融解特性とは異なり、これは、ｐｏｌＡを含有する反応（ｐｏｌＡおよびＴＦＲＣ融解特性）とｐｏｌＡを欠如する反応（ＴＦＲＣ ＬＯＣＳ融解特性のみ）との間の鑑別を提供する。
この実施例は、単一のウェル内で５つの蛍光チャネル（各ウェル内で２つの標的を検出）を使用して同時増幅した１０個の遺伝子標的を、それらの固有のＬＯＣＳ融解特性に基づいて区別することができることを実証する。この実施例は、５つの蛍光チャネルを使用して単一のウェル内の複数の標的を検出するための簡便な方法を提供し、それにより、単一のＰＣＲ機械の多重能力を２倍にする。
実施例１５：定義された温度点で蛍光を測定することによる、単一チャネル、単一ウェル多重化のための方法
以下の実施例は、実施例１～６で前述したように、広範囲の温度にわたる完全な融解曲線分析を必要とすることなく、単一波長で複数の標的を検出および識別するための代替的なプロトコルを提供する。この実施例では、単一波長で３つの標的を検出および特定するいくつかの方法を、分析戦略の選択と組み合わせた修飾されたＬＯＣＳプロトコルの使用を通して実証する。標的Ｘ、Ｙ、およびＺは、３つのＬＯＣＳレポーターＸ、Ｙ、およびＺを使用して検出することができ、これらは全て、同じフルオロフォアで標識することができる。３つのＬＯＣＳレポーターの各々は、ＬＯＣＳ－ＸのＴｍ＜ＬＯＣＳ－ＹのＴｍ＜ＬＯＣＳ－ＺのＴｍである、異なる融解温度を有する異なるステム領域を含む。加えて、ＬＯＣＳレポーターの各々は、それぞれＭＮＡザイムＸ、Ｙ、またはＺに特異的な基質を含む異なるループ領域を含有する。ＭＮＡザイムＸ、Ｙ、またはＺは、それぞれ標的Ｘ、Ｙ、およびＺを認識および検出し、それぞれＬＯＣＳレポーターＸ、Ｙ、およびＺを切断するように設計されている。標的のＰＣＲ増幅の前および／または後に、限定された数の蛍光測定（合計６つ以下）を得ることができる。様々な分析方法が、特定の温度および時点で取得した測定を利用することができる。これらを、表１５に要約する。
この実施例に記載の戦略を適合させて、任意の標的を検出することができるが、この特定の実施例では、標的Ｘは、ＴＦＲＣ遺伝子であり、標的Ｙは、ｒｐｏＢ遺伝子であり、標的Ｚは、ｐｓｓ遺伝子であり、これらはそれぞれ、プローブＬＯＣＳ－Ｘ（ＬＯＣＳ－２２）、ＬＯＣＳ－Ｙ（ＬＯＣＳ－２１）、およびＬＯＣＳ－Ｚ（ＬＯＣＳ－２３）によって検出され、同じフルオロフォア（ＪＯＥ）で標識される。使用される様々な検出温度は、ＴＸａ＝４０．５℃、ＴＸｂ＝５６．５℃、ＴＸｃ＝７８．５℃、Ｔ０ｂ＝３２℃、ＴＸｂ＝４０．５℃、ＴＹｂ＝５６．５℃、ＴＺｂ＝６５．５℃、ＴＸｃ＝３９．５℃、ＴＹｃ＝５６．５℃、ＴＺｃ＝６５．５℃、ＴＸｄ＝４０℃、ＴＹｄ＝５１℃、およびＴＺｄ＝６５℃である。さらに、以下の分析では、Ｎ＝０．５℃の値を割り当てた。
分析プロトコルＡ１
第１の特定の温度ＴＸａで、ＬＯＣＳ－Ｘの切断は、無鋳型対照と比較して、有意な蛍光シグナルを生成し、これは、閾値ＦＸａを超える。同じ温度で、切断されたＬＯＣＳ－Ｙおよび／またはＬＯＣＳ－Ｚの存在は、これらのＬＯＣＳのステムのより高いＴｍのために、有意な蛍光シグナルの生成に寄与せず、その結果、蛍光レベルが、無鋳型対照と比較して、閾値ＦＸａ未満に留まる。温度ＴＸａでの蛍光の増幅後測定は、切断されたＬＯＣＳ－Ｘの特異的な検出を可能にする。
温度ＴＸａよりも高い第２の特定の温度ＴＹａで、切断されたＬＯＣＳ－Ｙは、閾値ＦＹａよりも有意に大きい相対蛍光シグナルを生成する。温度ＴＹａで、切断されたＬＯＣＳ－Ｘおよび／またはＬＯＣＳ－Ｚによって生成される相対蛍光シグナルは、閾値ＦＹａ
よりも有意に小さい。したがって、温度ＴＹａでの蛍光の増幅後測定は、切断されたＬＯＣＳ－Ｙの特異的な検出を可能にする。
温度ＴＸａおよびＴＹａよりも高い第３の特定温度ＴＺａで、切断されたＬＯＣＳ－Ｚは、閾値ＦＺａよりも有意に大きい相対蛍光シグナルを生成する。温度ＴＺａで、切断されたＬＯＣＳ－Ｘおよび／またはＬＯＣＳ－Ｙによって生成される相対蛍光シグナルは、閾値ＦＺａよりも有意に少ない。したがって、温度ＴＺａでの蛍光の増幅後測定は、切断されたＬＯＣＳ－Ｚの特異的な検出を可能にする。切断された各ＬＯＣＳレポーターの検出は、試料中の対応する標的の存在を示す。
分析プロトコルＡ２
閾値を使用する代わりに、アルゴリズムを使用して、試料中で１つ以上のＬＯＣＳ種が切断された場合に、切断されたＬＯＣＳ種を決定することができる。このアルゴリズムは、３つの検出温度（温度ＴＸａ、ＴＹａ、およびＴＺａ）の各々で測定した無鋳型対照の蛍光レベルに対する、蛍光レベルの比を使用する。上記の３つの温度で測定した相対蛍光レベルの比は、切断されたＬＯＣＳ種の可能な組み合わせの各々に固有であり、試料中の対応する標的遺伝子（複数可）の存在を示すフィンガープリントとして機能する。このアルゴリズムは、一連の７つの論理試験を含み、１つの論理試験は、１つ以上の切断されたＬＯＣＳ種の存在を決定するために、切断されたＬＯＣＳおよび切断されていないＬＯＣＳの可能な各組み合わせに割り当てられる。可能な組み合わせは、（Ｘのみ）、（Ｙのみ）、（Ｚのみ）、（ＸおよびＹのみ）、（ＸおよびＺのみ）、（ＹおよびＺのみ）、または（Ｘ、Ｙ、およびＺ）である。試料が、標的の特定の組み合わせに対して陽性であると決定されるためには、それは、特定の論理試験についてＴＲＵＥと決定される必要がある。論理試験は、（１）３つの異なる温度で測定した蛍光シグナルの比が、事前に定義された値の範囲内にあるかどうか、および（２）蛍光シグナルが、無鋳型対照よりも有意に大きいかどうかを決定する。試料は、ＬＯＣＳ－Ｘ、ＬＯＣＳ－Ｙ、およびＬＯＣＳ－Ｚの切断された種の特定の組み合わせを示すため、対応する標的（複数可）の存在を特定する最大１組の論理試験について、ＴＲＵＥであると決定することができる。試料が全ての論理試験に対してＦＡＬＳＥであると決定された場合、この試料は、陰性であると決定され、ＬＯＣＳの切断された種は含有せず、これは、この試料が、３つの標的のいずれも含有しないことを示す。
分析プロトコルＢ１
第１の特定の温度Ｔ０ｂで、ＬＯＣＳ－Ｘ、ＬＯＣＳ－Ｙ、またはＬＯＣＳ－Ｚの切断された種のいずれも、無鋳型対照よりも有意に高い蛍光シグナルを生成しない。Ｔ０ｂよりも高い第２の特定の温度ＴＸｂで、切断されたＬＯＣＳ－Ｘは、有意な蛍光シグナルを生成するが、切断されたＬＯＣＳ－Ｙおよび／またはＬＯＣＳ－Ｚは、これらのＬＯＣＳのステムのより高いＴｍのために、有意な蛍光シグナルの生成に寄与しない。温度Ｔ０ｂとＴＸｂとの間の増幅後の蛍光シグナルの差は、切断されたＬＯＣＳ－Ｘの存在下で、閾値ＦＸｂよりも高く、切断されたＬＯＣＳ－Ｘの不在下で閾値ＦＸｂよりも低いため、これは、切断ＬＯＣＳ－Ｘの特異的な検出を可能にする。ＴＸｂよりも高い第３の特定温度ＴＹｂで、切断されたＬＯＣＳ－Ｙは、有意な蛍光シグナルを生成する。一方、切断されたＬＯＣＳ－Ｚは、そのステムのより高いＴｍのために、温度ＴＹｂで有意な蛍光シグナルの生成に寄与しない。切断されたＬＯＣＳ－Ｘは、温度ＴＸｂと比較して、温度ＴＹｂでの有意な蛍光の生成の増加にさらに寄与しない。温度ＴＸｂとＴＹｂとの間の増幅後の蛍光シグナルの差は、切断されたＬＯＣＳ－Ｙの存在下で、閾値ＦＹｂよりも高く、切断されたＬＯＣＳ－Ｙの不在下で閾値ＦＹｂよりも低いため、これは、切断されたＬＯＣＳ－Ｙの特異的な検出を可能にする。ＴＹｂよりも高い第４の特定温度ＴＺｂで、切断されたＬＯＣＳ－Ｚは、有意な蛍光シグナルを生成する。切断されたＬＯＣＳ－Ｘおよび／またはＬＯＣＳ－Ｙは、温度ＴＺｂでの有意な蛍光の生成の増加にさらに寄与しない。温度
ＴＹｂとＴＺｂとの間の増幅後の蛍光シグナルの差は、切断されたＬＯＣＳ－Ｚの存在下で、閾値ＦＺｂよりも高く、切断されたＬＯＣＳ－Ｚの不在下で閾値ＦＺｂよりも低いため、これは、切断されたＬＯＣＳ－Ｚの特異的な検出を可能にする。
上記の計算を、以下の式を使用して説明する。
切断されたＬＯＣＳ－Ｘの存在の決定について、
温度ＴＸｂでの増幅後の蛍光レベル－温度Ｔ０ｂでの増幅後の蛍光レベル＞閾値ＦＸｂである場合、ＬＯＣＳ－Ｘは、試料中に存在する。
切断されたＬＯＣＳ－Ｙの存在の決定について、
温度ＴＹｂでの増幅後の蛍光レベル－温度ＴＸｂでの増幅後の蛍光レベル＞閾値ＦＹｂである場合、ＬＯＣＳ－Ｙは、試料中に存在する。
切断されたＬＯＣＳ－Ｚの存在の決定について、
温度ＴＺｂでの増幅後の蛍光レベル－温度ＴＹｂでの増幅後の蛍光レベル＞閾値ＦＺｂである場合、ＬＯＣＳ－Ｚは、試料中に存在する。
切断された各ＬＯＣＳレポーターの検出は、試料中の対応する標的遺伝子の存在を示す。
分析プロトコルＢ２
閾値を使用する代わりに、アルゴリズムを代替的に使用して、試料中の１つ以上のＬＯＣＳ種が切断された場合に、Ｔ０ｂ、ＴＸｂ、ＴＹｂ、およびＴＺｂで測定した増幅後の蛍光レベル間の差から計算した値の比を使用して、切断されたＬＯＣＳ種を決定することができる。値（ａ）（温度ＴＸｂでの増幅後の蛍光レベル－温度Ｔ０ｂでの増幅後の蛍光レベル）、（ｂ）（温度ＴＹｂでの増幅後の蛍光レベル－温度ＴＸｂでの増幅後の蛍光レベル）、および（ｃ）（温度ＴＺｂでの増幅後の蛍光レベル－温度ＴＹｃでの増幅後の蛍光レベル）の比は、切断されたＬＯＣＳ種の可能な組み合わせの各々に固有であり、試料中の対応する標的（複数可）の存在を示すフィンガープリントとして機能する。このアルゴリズムは、一連の８つの論理試験を含み、１つの論理試験は、１つ以上の切断されたＬＯＣＳ種の存在を決定するために、切断されたＬＯＣＳおよび切断されていないＬＯＣＳの可能な各組み合わせに割り当てられる。可能な組み合わせは、（標的なし）、（Ｘのみ）、（Ｙのみ）、（Ｚのみ）、（ＸおよびＹのみ）、（ＸおよびＺのみ）、（ＹおよびＺのみ）、または（Ｘ、Ｙ、およびＺ）である。試料が、標的の特定の組み合わせに対して陽性であると決定されるためには、それは、論理試験についてＴＲＵＥと決定される必要がある。論理試験は、上記の３つの値の差の比が、事前に定義された値の範囲内にあるかどうかを決定する。試料は、最大１つの論理試験についてＴＲＵＥであると決定することができ、これが、ＬＯＣＳ－Ｘ、ＬＯＣＳ－Ｙ、およびＬＯＣＳ－Ｚの切断された種の特定の組み合わせを示し、対応する標的（複数可）の存在を示すか、または（標的なし）論理試験についてＴＲＵＥであると決定される場合に、これは、いかなる標的（複数可）も不在であることを示す。
分析プロトコルＣ１
定義された温度での切断されたＬＯＣＳ種の増幅後の検出はまた、特定の温度での増幅前および増幅後の蛍光測定間の差から得られた情報を使用しても決定することができる。この方法は、それぞれプロトコルＡおよびＢで説明したように、無鋳型対照または参照温度（Ｔ０ｂ）に対する相対的な増幅後の蛍光レベルを決定するための代替手段である。第１の特定温度ＴＸｃで、切断されたＬＯＣＳ－Ｘは、有意な蛍光シグナルを生成し、温度ＴＸｃでの蛍光の増幅前および増幅後の測定間の差は、閾値ＦＸｃよりも高い。一方、切断されたＬＯＣＳ－Ｙおよび／またはＬＯＣＳ－Ｚの存在は、ステムのより高いＴｍの違
いのために、温度ＴＸｃで有意な蛍光シグナルの生成につながらず、温度ＴＸｃでの蛍光の増幅前および増幅後の測定間の差は、閾値ＦＸｃ未満である。したがって、温度ＴＸｃでの蛍光の増幅前および増幅後の測定は、ＬＯＣＳ－Ｘの切断された種の特定の検出を可能にする。温度ＴＸｃに対して、第２の温度ＴＹｃで切断されたＬＯＣＳ－Ｙによって生成される増分蛍光シグナル（ＴＹｃ＞ＴＸｃである場合）は、閾値ＦＹｃよりも有意に高い。一方、温度ＴＸｃに対して、温度ＴＹｃで切断されたＬＯＣＳ－Ｘおよび／またはＬＯＣＳ－Ｚによって生成される増分蛍光シグナルは、閾値ＦＹｃよりも有意に小さい。温度ＴＸｃに対する、ＴＹｃでの増分蛍光シグナルは、温度ＴＹｃでの増幅前および増幅後の蛍光レベル間の差、ならびに温度ＴＸｃでの増幅前および増幅後の蛍光レベル間の差の差の計算から決定される。したがって、温度ＴＸｃおよびＴＹｃでの蛍光レベルの増幅前および増幅後の測定からの情報は、切断されたＬＯＣＳ－Ｙの特定の検出を可能にする。温度ＴＹｃに対して、第３の温度ＴＺｃで切断されたＬＯＣＳ－Ｚによって生成される増分蛍光シグナル（ＴＺｃ＞ＴＹｃである場合）は、閾値ＦＺｃよりも有意に高い。一方、温度ＴＹｃに対して、温度ＴＺｃで切断されたＬＯＣＳ－Ｘおよび／またはＬＯＣＳ－Ｙによって生成される増分蛍光シグナルは、閾値ＦＺｃよりも有意に小さい。温度ＴＹｃに対する、ＴＺｃでの増分蛍光シグナルは、温度ＴＹｃでの増幅前および増幅後の蛍光レベル間の差、ならびに温度ＴＸｃでの増幅前および増幅後の蛍光レベル間の差の差の計算から決定される。したがって、温度ＴＹｃおよびＴＺｃでの蛍光レベルの増幅前および増幅後の測定からの情報は、切断されたＬＯＣＳ－Ｚの特定の検出を可能にする。
上記の計算を、以下に説明する。
ＬＯＣＳ－Ｘの存在の決定について、
温度ＴＸｃでの増幅後の蛍光レベル－温度ＴＸｃでの増幅前の蛍光レベル＞閾値ＦＸｃである場合、ＬＯＣＳ－Ｘは、試料中に存在する。
ＬＯＣＳ－Ｙの存在の決定について、
（温度ＴＹｃでの増幅後の蛍光レベル－温度ＴＹｃでの増幅前の蛍光レベル）－（温度ＴＸｃでの増幅後の蛍光レベル－温度ＴＸｃでの増幅前の蛍光レベル）＞閾値ＦＹｃである場合、ＬＯＣＳ－Ｙが、試料中に存在する。
ＬＯＣＳ－Ｚの存在の決定について、
（温度ＴＺｃでの増幅後の蛍光レベル－温度ＴＺｃでの増幅前の蛍光レベル）－（温度ＴＹｃでの増幅後の蛍光レベル－温度ＴＹｃでの増幅前の蛍光レベル）＞閾値ＦＺｃである場合、ＬＯＣＳ－Ｚが、試料中に存在する。
切断された各ＬＯＣＳレポーターの検出は、試料中の対応する標的の存在を示す。この方法は、６回の蛍光測定を必要とする。
分析プロトコルＣ２
閾値を使用する代わりに、アルゴリズムを使用して、試料中の１つ以上のＬＯＣＳ種が切断された場合に、３つの検出温度ＴＸｃ、ＴＹｃ、およびＴＺｃの各々で測定した増幅前の蛍光レベルと増幅後の蛍光レベルとの間の差から計算した値の比を使用して、切断されたＬＯＣＳ種を決定することができる。値（ｉ）温度ＴＸＣでの増幅後の蛍光レベル－温度ＴＸｃでの予備増幅蛍光レベル、（ｉｉ）（ＴＹｃでの増幅後の蛍光レベル－温度ＴＹｃでの増幅前の蛍光レベル）－（温度ＴＸｃでの増幅後の蛍光レベル－温度ＴＸｃでの増幅前の蛍光レベル）、および（ｉｉｉ）（温度ＴＺｃでの増幅後の蛍光レベル－温度ＴＺｃでの増幅前の蛍光レベル）－（温度ＴＹｃでの増幅後の蛍光レベル－温度ＴＹｃでの増幅前の蛍光レベル）の比は、切断されたＬＯＣＳ種および切断されていないＬＯＣＳ種の可能な組み合わせの各々について固有であり、試料中の対応する標的遺伝子（複数可）の存在を示すフィンガープリントとして機能し得る。このアルゴリズムは、一連の８つの
論理試験を含み、１つの論理試験は、１つ以上の切断されたＬＯＣＳ種の存在を決定するために、切断されたＬＯＣＳおよび切断されていないＬＯＣＳの可能な各組み合わせに割り当てられる。可能な組み合わせは、（標的なし）、（Ｘのみ）、（Ｙのみ）、（Ｚのみ）、（ＸおよびＹのみ）、（ＸおよびＺのみ）、（ＹおよびＺのみ）、または（Ｘ、Ｙ、およびＺ）である。試料が、標的の特定の組み合わせに対して陽性であると決定されるためには、それは、論理試験についてＴＲＵＥと決定される必要がある。論理試験は、値（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉｉ）の差の比が、事前に定義された値の範囲内にあるかどうかを決定する。試料は、最大１つの論理試験についてＴＲＵＥであると決定することができ、これが、ＬＯＣＳ－Ｘ、ＬＯＣＳ－Ｙ、およびＬＯＣＳ－Ｚの切断された種の特定の組み合わせを示すため、対応する標的（複数可）を含有するか、または（標的なし）論理試験についてＴＲＵＥと決定された場合、いかなる標的も含有しない。
分析プロトコルＤ１
別の代替的な方法は、融解特性の融解ピークの高さを測定することであり、これは、切断された各ＬＯＣＳのＴｍでのｄ蛍光／ｄ温度値に相当する。しかしながら、この方法の有用性は、切断されたＬＯＣＳのＴｍでのｄ蛍光／ｄ温度値の決定には限定されず、Ｔｍを含む一連の温度も含む。特定の温度Ａ℃でのｄ蛍光／ｄ温度値は、（Ａ－Ｎ）℃および（Ａ＋Ｎ）℃にわたる蛍光レベルの勾配に相当する。数学的には、それは、以下の式で表すことができる。
ｆ（温度）＝蛍光である場合、

上記の式に見られるように、Ａ℃でのｄ蛍光／ｄ温度値の計算は、（Ａ－Ｎ）℃および（Ａ＋Ｎ）℃の温度での蛍光の２回の測定を必要とする。三重の場合、３つのｄ蛍光／ｄ温度値が必要であるため、６回の増幅後の蛍光測定が必要である。ＬＯＣＳ－Ｘの切断された種の存在下では、温度ＴＸｄでのｄ蛍光／ｄ温度値は、閾値ＦＸｄよりも大きいが、ＬＯＣＳ－Ｘの切断された種の不在下では、温度ＴＸｄでのｄ蛍光／ｄ温度値は、閾値ＦＸｄ未満である。ＬＯＣＳ－Ｙの切断された種の存在下では、温度ＴＹｄでのｄ蛍光／ｄ温度値は、閾値ＦＹｄよりも大きいが、ＬＯＣＳ－Ｙの切断された種の不在下では、温度ＴＹｄでのｄ蛍光／ｄ温度値は、閾値ＦＹｄ未満である。ＬＯＣＳ－Ｚの切断された種の存在下では、温度ＴＺｄでのｄ蛍光／ｄ温度値は、閾値ＦＺｄよりも大きいが、ＬＯＣＳ－Ｚの切断された種の不在下では、温度ＴＺｄでのｄ蛍光／ｄ温度値は、閾値ＦＺｄ未満である。切断された各ＬＯＣＳレポーターの検出は、試料中の対応する標的遺伝子の存在を示す。
分析プロトコルＤ２
閾値を使用する代わりに、アルゴリズムを使用して、試料中の１つ以上のＬＯＣＳ種が切断された場合に、３つの検出温度ＴＸｄ、ＴＹｄ、およびＴＺｄでのｄ蛍光／ｄ温度値の比を使用して、切断されたＬＯＣＳ種を決定することができる。上記の３つの温度でのｄ蛍光／ｄ温度値の比は、切断されたＬＯＣＳ種の可能な組み合わせの各々に固有であり、試料中の対応する標的（複数可）の存在を示すフィンガープリントとして機能する。このアルゴリズムは、一連の８つの論理試験を含み、１つの論理試験は、１つ以上の切断されたＬＯＣＳ種の存在を決定するために、切断されたＬＯＣＳおよび切断されていないＬ
ＯＣＳの可能な各組み合わせに割り当てられる。可能な組み合わせは、（標的なし）、（Ｘのみ）、（Ｙのみ）、（Ｚのみ）、（ＸおよびＹのみ）、（ＸおよびＺのみ）、（ＹおよびＺのみ）、または（Ｘ、Ｙ、およびＺ）である。試料が、標的の特定の組み合わせに対して陽性であると決定されるためには、それは、論理試験についてＴＲＵＥと決定される必要がある。論理試験は、上記の３つの温度でのｄ蛍光／ｄ温度値の比が、事前に定義された値の範囲内にあるかどうかを決定する。試料は、最大１つの論理試験についてＴＲＵＥであると決定することができ、これが、ＬＯＣＳ－Ｘ、ＬＯＣＳ－Ｙ、およびＬＯＣＳ－Ｚの切断された種の特定の組み合わせ、ならびにしたがって対応する標的（複数可）を示すか、または（標的なし）論理試験についてＴＲＵＥと決定された場合、いかなる標的も含有しない。
オリゴヌクレオチド
この実験に特異的なオリゴヌクレオチドには、ＬＯＣＳ－２２（配列番号８９）、ＬＯＣＳ－２１（配列番号８８）、ＬＯＣＳ－２３（配列番号９０）、パートザイムＡ２２（配列番号１２４）、パートザイムＢ２２（配列番号１２５）、パートザイムＡ２３（配列番号１２６）、パートザイムＢ２３（配列番号１２７）、パートザイムＡ２４（配列番号１３０）、パートザイムＢ２４（配列番号１３１）、順方向プライマー１０（配列番号７２）、逆方向プライマー１０（配列番号７３）、順方向プライマー６（配列番号２５）、逆方向プライマー６（配列番号２６）、順方向プライマー１７（配列番号１２８）、および逆方向プライマー１７（配列番号１２９）が含まれる。配列は、配列表に列挙する。ＴＦＲＣ遺伝子の増幅および検出に特異的なオリゴヌクレオチドは、ＬＯＣＳ－２２、パートザイムＡ２２、パートザイムＢ２２、順方向プライマー１０、および逆方向プライマー１０である。ｒｐｏＢ遺伝子の増幅および検出に特異的なオリゴヌクレオチドは、ＬＯＣＳ－２１、パートザイムＡ２３、パートザイムＢ２３、順方向プライマー６、および逆方向プライマー６である。ｐｓｓ遺伝子の増幅および検出に特異的なオリゴヌクレオチドは、ＬＯＣＳ－２３、パートザイムＡ２４、パートザイムＢ２４、順方向プライマー１７、および逆方向プライマー１７である。
反応条件
ＢｉｏＲａｄ（登録商標）ＣＦＸ９６熱サイクラーを使用して、２０μＬの合計反応体積で標的配列のリアルタイム検出を実行した。サイクルパラメータは、データ取得ありで３９．５℃で３０秒間、データ取得ありで５６．５℃で３０秒間、データ取得ありで６５．５℃で３０秒間、９５℃で２分間、９５℃で５秒間および６１℃で３０秒間のタッチダウンサイクルを１０回（１サイクルあたり０．５℃の減衰）、ならびに９５℃で５秒間および５２℃で４０秒間のサイクルを４０回（データは５２℃のステップで収集）、その後データ取得ありで３９．５℃で３０秒間、データ取得ありで４０．５℃で３０秒間、データ取得ありで５０．５℃で３０秒間、データ取得ありで５１．５℃で３０秒間、データ取得ありで５６．５℃で３０秒間、データ取得ありで６４．５℃で３０秒間、データ取得ありで６５．５℃で３０秒間、およびデータ取得ありで７８．５℃で３０秒間であった。各反応は、４０ｎＭの各順方向プライマー、２００ｎＭの各逆方向プライマー、２００ｎＭの各パートザイム、８０ｎＭのＬＯＣＳ－２２レポーター、２１０ｎＭのＬＯＣＳ－２１レポーター、３００ｎＭのＬＯＣＳ－２３レポーター、２ｍＭのＭｇＣｌ２（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、および１×ＳｅｎｓｉＦＡＳＴプローブＮｏ－ＲＯＸ混合物（Ｂｉｏｌｉｎｅ）を含有した。反応は、ゲノムＤＮＡもしくは標的遺伝子の合成Ｇブロック鋳型（ＮＦ Ｈ２Ｏ中の１標的遺伝子あたり１０，０００コピー）を含有するか、または標的なし（ＮＦ
Ｈ２Ｏ）のいずれかであった。
結果
ＰＣＲ中、３つのＭＮＡザイム（ＭＮＡザイム２２、ＭＮＡザイム２３、およびＭＮＡザイム２４）を使用して、それらの対応するＬＯＣＳレポーター（それぞれＬＯＣＳ－２
２、ＬＯＣＳ－２１、およびＬＯＣＳ－２３）の切断を介して標的核酸の増幅をリアルタイムで監視する。ＭＮＡザイム２２は、ＴＦＲＣ遺伝子（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）配列を検出し、ＬＯＣＳ－２２を切断するように設計されている。ＭＮＡザイム２３は、ｒｐｏＢ遺伝子（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）配列を検出し、ＬＯＣＳ－２１を切断するように設計されている。ＭＮＡザイム２４は、ｐｓｓ遺伝子（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）配列を検出し、ＬＯＣＳ－２３を切断するように設計されている。標的遺伝子ＴＦＲＣ、ｒｐｏＢ、またはｐｓｓのいずれかの存在は、ＰＣＲサイクルの増幅前または増幅後の段階でいくつかの温度で測定した、ＪＯＥチャネルの蛍光シグナルによって検出した。
図２４に示される結果は、４０．５℃、５６．５℃、および７８．５℃で測定した、１０，０００コピーのＴＦＲＣ、ｒｐｏＢ、ｐｓｓ、または２つ以上の遺伝子標的の全ての組み合わせを含有する反応からＪＯＥチャネルで得られた増幅後の比較蛍光レベルを示す。結果は、三重反応からの蛍光レベルの平均から、無鋳型対照の三重反応からの平均を減算したものである。４０．５℃では、ＴＦＲＣを含有する試料は、（無鋳型対照と比較して）閾値ＦＸａよりも高い蛍光レベルを有するが、ＴＦＲＣを含有しない試料は、そうではなかった。５６．５℃では、ｒｐｏＢを含有する試料は、（無鋳型対照と比較して）閾値ＦＹａよりも高い蛍光レベルを有するが、ｒｐｏＢを含有しない試料は、そうではなかった。７８．５℃では、ｐｓｓを含有する試料は、（無鋳型対照と比較して）閾値ＦＺａよりも高い蛍光レベルを有するが、ｐｓｓを含有しない試料は、そうではなかった。
表１６は、（１０，０００コピーのＴＦＲＣ、ｒｐｏＢ、ｐｓｓ、または２つ以上の遺伝子標的の全ての組み合わせを含有する試料の各々から４０．５℃、５６．５℃、および７８．５℃で測定した）増幅後の蛍光レベルを、７つの論理試験に供した後に得られた結果を示す。７つの論理試験の各々は、試料が（ＴＦＲＣのみ）、（ｒｐｏＢのみ）、（ｐｓｓのみ）、（ＴＦＲＣおよびｒｐｏＢのみ）、（ＴＦＲＣおよびｐｓｓのみ）、（ｒｐｏＢおよびｐｓｓのみ）、または（ＴＦＲＣ、ｒｐｏＢ、およびｐｓｓ）を含有するかどうかを決定する３つの基準（表１６の２行目）を含む。最初の２つの基準は、異なる温度（４０．５℃、５６．５℃、または７８．５℃）で測定した２つの蛍光レベル間の比から、同じ温度での無鋳型対照からの平均蛍光レベルを減算したものが、事前に定義された値よりも大きいか小さいか、または事前に定義された範囲内にあるかを決定する。最終基準は、観察された蛍光シグナルが、無鋳型対照の蛍光シグナルよりも有意に高いかどうかを決定する。各試料は、論理試験の３つ全ての基準に対してＴＲＵＥである場合にのみ、論理試験に対してＴＲＵＥと見なされる。この実験は、０または１００００コピーの３つの標的鋳型の全ての組み合わせである（無鋳型対照は、０コピーの３つ全ての鋳型を有した）、二連の８種類の試料を使用して実行した。全ての試験した試料は、最大１つの論理試験についてＴＲＵＥと決定されるが、全ての他の論理試験についてＦＡＬＳＥのままであり、標的遺伝子の存在を正確に決定した。無鋳型対照試料は、全ての論理試験についてＦＡＬＳＥのままであった。
図２５は、１０，０００コピーのＴＦＲＣ、ｒｐｏＢ、ｐｓｓ、または２つ以上の遺伝子標的の全ての組み合わせを含有する三連の反応からＪＯＥチャネルで３２℃、４０．５℃、５６．５℃、および６５．５℃で取得した増幅後の差次的な蛍光測定の平均の比較を示す。（ａ）として示される３２℃および４０．５℃で測定した蛍光レベルの差は、ＴＦＲＣを含有する試料中でのみ閾値ＦＸｂよりも大きかった。（ｂ）として示される４０．５℃および５６．５℃で測定した蛍光レベルの差は、ｒｐｏＢを含有する試料中でのみ閾値ＦＹｂよりも大きかった。（ｃ）として示される５６．５℃および６５．５℃で測定した蛍光レベルの差は、ｐｓｓを含有する試料中でのみ閾値ＦＺｂよりも大きかった。
表１７は、１０，０００コピーのＴＦＲＣ、ｒｐｏＢ、ｐｓｓ、または２つ以上の遺伝子標的の全ての組み合わせを含有する試料の各々からの３２℃、４０．５℃、５６．５℃、および６５．５℃の間の増幅後の差次的な蛍光値を、８つの論理試験に供した後に得られた結果を示す。これらの差次的な値は、３２℃および３９．５℃、４０．５℃および５６．５℃、ならびに５６．５℃および６５．５℃で測定した蛍光レベルの差として計算した。８つの論理試験の各々は、試料が（標的なし）、（ＴＦＲＣのみ）、（ｒｐｏＢのみ）、（ｐｓｓのみ）、（ＴＦＲＣおよびｒｐｏＢのみ）、（ＴＦＲＣおよびｐｓｓのみ）、（ｒｐｏＢおよびｐｓｓのみ）、または（ＴＦＲＣ、ｒｐｏＢ、およびｐｓｓ）を含有するかどうかを決定する２つの基準（表１７の２行目）を含む。２つの基準は、２つの差次的な蛍光値間の比が、事前に定義された値よりも大きいか小さいか、または事前に定義された範囲内にあるかどうかを決定する。全ての試験した試料は、１つの論理試験についてのみＴＲＵＥと決定されるが、全ての他の論理試験についてＦＡＬＳＥのままであり、標的遺伝子の存在を正確に決定した。

図２６に示される結果は、１０，０００コピーのＴＦＲＣ、ｒｐｏＢ、ｐｓｓ、または２つ以上の遺伝子標的の全ての組み合わせを含有する反応からＪＯＥチャネルで３９．５℃、５６．５℃、および６５．５℃で増幅前および増幅後の蛍光測定から得られた値の比較を示す。結果は、値（ｉ）３９．５℃での増幅後の蛍光レベル－３９．５℃での増幅前の蛍光レベル、（ｉｉ）（５６．５℃での増幅後の蛍光レベル－５６．５℃での増幅前の蛍光レベル）－（３９．５℃での増幅後の蛍光レベル－温度３９．５℃での増幅前の蛍光レベル）、および（ｉｉｉ）（温度６５．５℃での増幅後の蛍光レベル－温度６５．５℃での増幅前の蛍光レベル）－（温度５６．５℃での増幅後の蛍光レベル－温度５６．５℃での増幅前の蛍光レベル）に対する三連の反応の平均である。ＴＦＲＣを含有する試料について、正規化された蛍光値（ｉ）は、閾値ＦＸｃよりも大きいが、ＴＦＲＣを含有しない試料は、そうではない。ｒｐｏＢを含有する試料について、正規化された蛍光値（ｉｉ）は、閾値ＦＹｃよりも大きいが、ｒｐｏＢを含有しない試料は、そうではない。ｐｓｓを含有する試料について、正規化された蛍光値（ｉｉｉ）は、閾値ＦＺｃよりも大きいが、ｐｓｓを含有しない試料は、そうではない。
表１８は、上記の値（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉｉ）を８つの論理試験に供した後に得られた結果を示す。８つの論理試験の各々は、試料が（標的なし）、（ＴＦＲＣのみ）、（ｒｐｏＢのみ）、（ｐｓｓのみ）、（ＴＦＲＣおよびｒｐｏＢのみ）、（ＴＦＲＣおよびｐｓｓのみ）、（ｒｐｏＢおよびｐｓｓのみ）、または（ＴＦＲＣ、ｒｐｏＢ、およびｐｓｓ）を含有するかどうかを決定する２つの基準（表１８の２行目）を含む。２つの基準の各々は、値（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉｉ）の２つの間の比が、事前に定義された値よりも大きいか小さいか、または事前に定義された範囲内にあるかどうかを決定する。全ての試験した試料は、１つの論理試験についてのみＴＲＵＥと決定されるが、全ての他の論理試験についてＦＡＬＳＥのままであり、標的遺伝子の存在を正確に決定した。

図２７は、３７℃、５０℃、および６５℃で、１０，０００コピーのＴＦＲＣ、ｒｐｏＢ、ｐｓｓ、または２つ以上の遺伝子標的の全ての組み合わせを含有する三連の反応からＪＯＥチャネルで得られた増幅後の比較平均ｄ蛍光／ｄ温度値を示す。これらの値は、３６．５℃、３７．５℃、４９．５℃、５０．５℃、６４．５℃、および６５．５℃で取得した増幅後の蛍光測定から計算した。３７℃でのｄ蛍光／ｄ温度値は、ＴＦＲＣを含有する試料中でのみ閾値ＦＸｄよりも大きかった。５０℃でのｄ蛍光／ｄ温度値は、ｒｐｏＢを含有する試料中でのみ閾値ＦＹｄよりも大きかった。６５℃でのｄ蛍光／ｄ温度値は、ｐｓｓを含有する試料中でのみ閾値ＦＺｄよりも大きかった。
表１９は、１０，０００コピーのＴＦＲＣ、ｒｐｏＢ、ｐｓｓ、または２つ以上の遺伝子標的の全ての組み合わせを含有する試料の各々からの３７℃、５０℃、および６５．５℃でのｄ蛍光／ｄ温度値を、８つの論理試験に供した後に得られた結果を示す。これらの値は、３６．５℃、３７．５℃、４９．５℃、５０．５℃、６４．５℃、および６５．５℃で取得した増幅後の蛍光測定から計算した。８つの論理試験の各々は、試料が（標的なし）、（ＴＦＲＣのみ）、（ｒｐｏＢのみ）、（ｐｓｓのみ）、（ＴＦＲＣおよびｒｐｏＢのみ）、（ＴＦＲＣおよびｐｓｓのみ）、（ｒｐｏＢおよびｐｓｓのみ）、または（ＴＦＲＣ、ｒｐｏＢ、およびｐｓｓ）を含有するかどうかを決定する２つの基準（表１９の２行目）を含む。２つの基準は、２つのｄ蛍光／ｄ温度値間の比が、事前に定義された値よりも大きいか小さいか、または事前に定義された範囲内にあるかどうかを決定する。全ての試験した試料は、１つの論理試験についてのみＴＲＵＥと決定されるが、全ての他の論理試験についてＦＡＬＳＥのままであり、標的遺伝子の存在を正確に決定した。

Claims (20)

  1. 試料中の第１および第２の標的の存在または不在を決定するための方法であって、前記方法が、
    （ａ）前記第１および／もしくは第２の標的またはそれらのアンプリコンを含むと推定される前記試料またはその誘導体を、
    第１および第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドであって、前記閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの各々が、ハイブリダイズしていないヌクレオチドの閉鎖一本鎖ループ部分に接続された、ハイブリダイズしたヌクレオチドの二本鎖ステム部分を含み、
    前記第１および第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分における、ハイブリダイズしたヌクレオチドの数および／またはハイブリダイズしたヌクレオチドの配列が、異なる、第１および第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチド、ならびに
    前記標的またはそのアンプリコンと接触した場合にのみ、前記第１および第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記一本鎖ループ部分を切断または分解することができる酵素と接触させることによって、反応混合物を調製することと、
    （ｂ）前記反応混合物を、
    －前記酵素が、前記第１および第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記ループ部分の切断または分解を誘導して、それにより、第１および第２の開放ステムループオリゴヌクレオチドを生成するのに好適な条件下、
    －第１の温度であって、その温度以上で、前記第１の開放ステムループオリゴヌクレオチドの前記二本鎖ステム部分の鎖が解離して、それにより、前記第１の開放ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のフルオロフォアおよびクエンチャー分子の空間的分離を促進し、第１の検出可能な蛍光シグナルを提供する、第１の温度で、ならびに
    －第２の温度であって、その温度以上で、前記第２の開放ステムループオリゴヌクレオチドの前記二本鎖ステム部分の鎖が解離して、それにより、前記第２の開放ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のフルオロフォアおよびクエンチャー分子の空間的分離を促進し、第２の検出可能な蛍光シグナルを提供する、第２の温度で、処理することであって、
    前記第１の温度が、前記第２の温度よりも低く、
    前記第１の開放ステムループオリゴヌクレオチドの前記フルオロフォアおよび前記第２の開放ステムループオリゴヌクレオチドの前記フルオロフォアが、同じ可視スペクトルの色領域で発光する、処理することと、
    （ｃ）前記第２の温度以上の温度を含むか、またはそれからなる１つ以上の温度で、前記第１および第２の蛍光シグナルのレベルを検出して、それにより、前記試料中の前記標的の存在または不在を決定することと、を含む、方法。
  2. 前記酵素が、多成分核酸酵素（ＭＮＡザイム）を含み、前記反応混合物の前記処理が、前記反応混合物を、
    第１の多成分核酸酵素（ＭＮＡザイム）を前記第１の標的またはそのアンプリコンに結合させ、前記第１のＭＮＡザイムの基質アームを前記第１の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記ループ部分にハイブリダイズして、それにより、前記第１のＭＮＡザイムが、前記第１の開放ステムループオリゴヌクレオチドを形成することによって、前記第１の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記ループ部分の前記切断を促進するのに好適な条件下で処理することを含み、
    前記第１の標的が、前記第１のＭＮＡザイムのセンサーアームにハイブリダイズして、それにより、前記第１のＭＮＡザイムの集合を促進することができる核酸配列またはそのアンプリコンである、請求項１に記載の方法。
  3. 前記酵素が、制限エンドヌクレアーゼを含み、前記反応混合物の前記処理が、
    前記反応混合物を、前記第１の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記ループ部分への第１の標的またはそのアンプリコンのハイブリダイゼーションに好適な条件下で処理して、第１の制限エンドヌクレアーゼが会合する二本鎖配列を形成し、それにより、前記第１の開放ステムループオリゴヌクレオチドを形成する前記第１の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記ループ部分の前記切断を促進することを含む、請求項１に記載の方法。
  4. 前記酵素が、エキソヌクレアーゼ活性を含み、前記反応混合物の前記処理が、
    －第１の標的またはそのアンプリコンを、前記第１の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記ループ部分にハイブリダイズして、前記第１の標的またはそのアンプリコンを含む第１の二本鎖配列を形成すること、
    －第１のプライマーオリゴヌクレオチドを、前記第１の標的またはそのアンプリコンにハイブリダイズして、前記第１の標的またはそのアンプリコンを含む前記第１の二本鎖配列に対して上流（５’）に位置する第２の二本鎖配列を形成すること、
    －エキソヌクレアーゼ活性を含む第１の酵素を、前記第１のプライマーオリゴヌクレオチドの末端にあるか、またはそれに隣接する前記第１の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分と会合させること、および
    －エキソヌクレアーゼ活性を含む前記第１の酵素の触媒活性により、第１の標的またはアンプリコンを含む前記第１の二本鎖配列の前記ループ部分の分解を促進し、前記第１の開放ステムループオリゴヌクレオチドを形成すること
    に好適な条件下で前記反応混合物を処理することを含む、請求項１に記載の方法。
  5. 前記酵素がポリメラーゼ酵素またはエキソヌクレアーゼである、請求項１に記載の方法。
  6. 前記酵素が、エキソヌクレアーゼ活性を含み、前記反応混合物の前記処理が、
    －第１の標的またはそのアンプリコンを、前記第１の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記ループ部分にハイブリダイズして、前記第１の標的またはそのアンプリコンを含む第１の二本鎖配列を形成すること、
    －エキソヌクレアーゼ活性を含む第１の酵素を、前記第１の標的またはそのアンプリコンを含む前記第１の二本鎖配列と会合させること、および
    －エキソヌクレアーゼ活性を含む前記第１の酵素の触媒活性により、前記第１の標的またはアンプリコンを含む前記第１の二本鎖配列の前記ループ部分の分解を促進し、前記第
    １の開放ステムループオリゴヌクレオチドを形成すること
    に好適な条件下で前記反応混合物を処理することを含む、請求項１に記載の方法。
  7. 前記酵素が、触媒活性に第１の補因子を必要とするＤＮＡザイムおよび／またはリボザイムを含み、前記反応混合物の前記処理が、
    －前記第１の補因子を前記ＤＮＡザイムに結合させ、かつ／または前記第１の補因子を前記リボザイムに結合させて、前記ＤＮＡザイムおよび／またはリボザイムを触媒活性にすること、
    －ＤＮＡザイムおよび／またはリボザイムを、第１の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記ループ部分にハイブリダイズすること、
    －前記ＤＮＡザイムおよび／またはリボザイムの触媒活性により、前記第１の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記ループ部分の切断を促進し、前記第１の開放ステムループオリゴヌクレオチドを形成すること
    に好適な条件下で前記反応混合物を処理することを含み、
    前記第１の標的が、前記第１の補因子である、請求項１に記載の方法。
  8. 前記反応混合物の前記処理が、
    －第２のＭＮＡザイムを前記第２の標的またはそのアンプリコンに結合させ、前記第２のＭＮＡザイムの基質アームを前記第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記ループ部分にハイブリダイズして、それにより、前記第２のＭＮＡザイムが、前記第２の開放ステムループオリゴヌクレオチドを形成することによって、前記第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記ループ部分の前記切断を促進すること、
    －第２の標的またはそのアンプリコンを前記第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記ループ部分にハイブリダイズして、第２の制限エンドヌクレアーゼが前記二本鎖配列と会合する二本鎖配列を形成し、それにより、前記第２の開放ステムループオリゴヌクレオチドを形成する前記第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記ループ部分の前記切断を促進すること、
    －第２の標的またはそのアンプリコンを、前記第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記ループ部分にハイブリダイズして、前記第２の標的またはそのアンプリコンを含む第２の二本鎖配列を形成し、
    第２のプライマーオリゴヌクレオチドを、前記第２の標的またはそのアンプリコンにハイブリダイズして、前記第２の標的またはそのアンプリコンを含む前記第２の二本鎖配列に対して上流（５’）に位置する第２の二本鎖配列を形成し、
    エキソヌクレアーゼ活性を含む第２の酵素を、前記第２のプライマーオリゴヌクレオチドの末端にあるか、またはそれに隣接する前記第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分と会合させ、
    エキソヌクレアーゼ活性を含む前記第２の酵素の触媒活性により、前記第２の標的またはアンプリコンを含む前記第２の二本鎖配列の前記ループ部分の分解を促進し、前記第２の開放ステムループオリゴヌクレオチドを形成すること、
    －第２の標的またはそのアンプリコンを、前記第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記ループ部分にハイブリダイズして、前記第２の標的またはそのアンプリコンを含む第２の二本鎖配列を形成し、
    エキソヌクレアーゼ活性を含む第２の酵素を、前記第２の標的またはそのアンプリコンを含む前記第２の二本鎖配列と会合させ、
    エキソヌクレアーゼ活性を含む前記第２の酵素の触媒活性により、前記第２の標的またはアンプリコンを含む前記第２の二本鎖配列の前記ループ部分の分解を促進し、前記第２の開放ステムループオリゴヌクレオチドを形成すること、
    －第２の補因子をＤＮＡザイムに結合させ、かつ／または第２の補因子をリボザイムに結合させて、前記ＤＮＡザイムおよび／またはリボザイムを触媒として活性化させ、
    ＤＮＡザイムおよび／またはリボザイムを、前記第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレ
    オチドの前記ループ部分にハイブリダイズし、
    前記ＤＮＡザイムおよび／またはリボザイムの触媒活性により、前記第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記ループ部分の切断を促進し、前記第２の開放ステムループオリゴヌクレオチドを形成すること
    のうちのいずれか１つ以上に好適な条件下で前記反応混合物を処理することをさらに含み、
    前記第２の標的が、前記第２の補因子である、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 試料中の第３の標的またはそのアンプリコンの存在または不在を決定することであって、
    （ｄ）前記試料またはその誘導体を含む前記反応混合物を、
    第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドであって、前記第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドが、ハイブリダイズしていないヌクレオチドの閉鎖一本鎖ループ部分に接続されたハイブリダイズしたヌクレオチドの二本鎖ステム部分を含み、
    前記第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分における、ハイブリダイズしたヌクレオチドの数および／またはハイブリダイズしたヌクレオチドの配列が、前記第１および第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のものとは異なり、
    前記二本鎖ステム部分が、一方の鎖に接続されたフルオロフォア分子、および反対の鎖に接続されたクエンチャー分子を含む、第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチド、ならびに
    前記標的またはそのアンプリコンと接触した場合にのみ、前記第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記一本鎖ループ部分を切断または分解することができる酵素と接触させることと、
    （ｅ）前記反応混合物を、
    －前記酵素が、前記第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記ループ部分の切断または分解を誘導して、それにより、第３の開放ステムループオリゴヌクレオチドを生成するのに好適な条件下、
    －第３の温度であって、その温度以上で、前記第３の開放ステムループオリゴヌクレオチドの前記二本鎖ステム部分の鎖が解離して、それにより、前記第３の開放ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分の前記フルオロフォアおよびクエンチャー分子の空間的分離を促進し、第３の検出可能な蛍光シグナルを提供する、第３の温度で、処理することであって、
    前記第３の温度が、前記第１および第２の温度よりも高い、処理することと、
    （ｆ）前記第３の温度以上の温度を含むか、またはそれからなる１つ以上の温度で、前記第１、第２、および第３の蛍光シグナルのレベルを検出して、それにより、前記試料中の前記標的の存在または不在を決定すること
    とによって、決定することをさらに含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 試料中の第３の標的またはそのアンプリコンの存在または不在を決定することであって、
    （ｄ）前記試料またはその誘導体を含む前記反応混合物を、
    第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドであって、前記第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドが、ハイブリダイズしていないヌクレオチドの閉鎖一本鎖ループ部分に接続されたハイブリダイズしたヌクレオチドの二本鎖ステム部分を含み、
    前記第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分における、ハイブリダイズしたヌクレオチドの数および／またはハイブリダイズしたヌクレオチドの配列が、前記第１または第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分の配列と同じであり、
    前記二本鎖ステム部分が、一方の鎖に接続されたフルオロフォア分子、および反対の鎖に接続されたクエンチャー分子を含み、前記第３の開放ステムループオリゴヌクレオチドに接続された前記フルオロフォア分子が、前記第１および／または第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記フルオロフォアとは異なる可視スペクトルの色領域で発光する、第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチド、ならびに
    前記標的またはそのアンプリコンと接触した場合にのみ、前記第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記一本鎖ループ部分を切断または分解することができる酵素と接触させることと、
    （ｅ）前記反応混合物を、
    －前記酵素が、前記第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記ループ部分の切断または分解を誘導して、それにより、第３の開放ステムループオリゴヌクレオチドを生成するのに好適な条件下、
    －第３の温度であって、その温度で、前記第３の開放ステムループオリゴヌクレオチドの前記二本鎖ステム部分の鎖が解離して、それにより、前記第３の開放ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分の前記フルオロフォアおよびクエンチャー分子の空間的分離を促進し、第３の検出可能な蛍光シグナルを提供する、第３の温度で、処理することと、
    （ｆ）前記第３の温度以上の温度を含むか、またはそれからなる１つ以上の温度で、前記第１、第２、および第３の蛍光シグナルのレベルを検出して、それにより、前記試料中の前記標的の存在または不在を決定すること
    とによって、決定することをさらに含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記方法が、前記反応混合物を、
    －第３のＭＮＡザイムを前記第３の標的またはそのアンプリコンに結合させ、前記第３のＭＮＡザイムの基質アームを前記第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記ループ部分にハイブリダイズして、それにより、前記第３のＭＮＡザイムが、前記第３の開放ステムループオリゴヌクレオチドを形成することによって、前記第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記ループ部分の前記切断を促進すること、
    －前記第３の標的またはそのアンプリコンを前記第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記ループ部分にハイブリダイズして、第３の制限エンドヌクレアーゼが前記二本鎖配列と会合する二本鎖配列を形成し、それにより、前記第３の開放ステムループオリゴヌクレオチドを形成する前記第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記ループ部分の前記切断を促進すること、
    －第３の標的またはそのアンプリコンを、前記第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記ループ部分にハイブリダイズして、前記第３の標的またはそのアンプリコンを含む第３の二本鎖配列を形成し、
    第３のプライマーオリゴヌクレオチドを、前記第３の標的またはそのアンプリコンにハイブリダイズして、前記第３の標的またはそのアンプリコンを含む前記第３の二本鎖配列に対して上流（５’）に位置する第３の二本鎖配列を形成し、エキソヌクレアーゼ活性を含む第３の酵素を、前記第３のプライマーオリゴヌクレオチドの末端にあるか、またはそれに隣接する前記第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分と会合させ、
    エキソヌクレアーゼ活性を含む前記第３の酵素の触媒活性により、前記第３の標的またはアンプリコンを含む前記第３の二本鎖配列の前記ループ部分の分解を促進し、前記第３の開放ステムループオリゴヌクレオチドを形成すること、
    －第３の標的またはそのアンプリコンを、前記第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記ループ部分にハイブリダイズして、前記第３の標的またはそのアンプリコンを含む第３の二本鎖配列を形成し、
    エキソヌクレアーゼ活性を含む第３の酵素を、前記第３の標的またはそのアンプリコンを含む前記第３の二本鎖配列と会合させ、
    エキソヌクレアーゼ活性を含む前記第３の酵素の触媒活性により、前記第３の標的また
    はアンプリコンを含む前記第３の二本鎖配列の前記ループ部分の分解を促進し、前記第３の開放ステムループオリゴヌクレオチドを形成すること、
    －第３の補因子をＤＮＡザイムに結合させ、かつ／または第３の補因子をリボザイムに結合させて、前記ＤＮＡザイムおよび／またはリボザイムを触媒として活性化させ、
    ＤＮＡザイムおよび／またはリボザイムを、第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記ループ部分にハイブリダイズし、
    前記ＤＮＡザイムおよび／またはリボザイムの触媒活性により、前記第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記ループ部分の切断を促進し、前記第３の開放ステムループオリゴヌクレオチドを形成すること
    のうちのいずれか１つ以上に好適な条件下で処理することを含み、
    前記第３の標的が、前記第３の補因子である、請求項９または１０に記載の方法。
  12. （ａ）
    －前記第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分における、ハイブリダイズしたヌクレオチドの数および／またはハイブリダイズしたヌクレオチドの配列が、前記第１および第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のものとは異なり、
    －前記第３の温度が、前記第１および第２の温度とは異なり、
    －前記第３の閉鎖および開放ステムループオリゴヌクレオチドの前記フルオロフォアが、前記第１および第２の閉鎖および開放ステムループオリゴヌクレオチドの前記フルオロフォアと同じ可視スペクトルの色領域で発光する；または
    （ｂ）
    －前記第１の閉鎖および開放ステムループオリゴヌクレオチドの前記フルオロフォアが、前記第２の閉鎖および開放ステムループオリゴヌクレオチドの前記フルオロフォアと同じ可視スペクトルの色領域で発光し、
    －前記第３の閉鎖および開放ステムループオリゴヌクレオチドの前記フルオロフォアが、前記第１および第２の閉鎖および開放ステムループオリゴヌクレオチドの前記フルオロフォアとは異なる可視スペクトルの色領域で発光する、
    請求項９または１１に記載の方法。
  13. 前記第１および第２の標的の存在または不在を決定することが、前記第１および第２の蛍光シグナルを使用する融解曲線分析を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. （ｃ）部が、前記第１および第２の蛍光シグナルのレベルを、
    －前記第２の温度以上の温度、および
    －前記第１の温度以上かつ前記第２の温度未満の温度で検出することを含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
  15. （ｃ）部が、核酸増幅反応中および／または完了時に、前記第１および第２の蛍光シグナルのレベルを検出することを含む、請求項１４に記載の方法。
  16. －前記第１の標的を含む別個の対照試料上で反復することによって、既知の濃度の前記第１の標的および既知の濃度の前記第１の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドを使用して、第１の標的陽性対照蛍光シグナル；および／または
    －前記第２の標的を含む別個の対照試料上で反復することによって、第２の標的陽性対照蛍光シグナルであって、前記対照試料が、既知の濃度の前記第２の標的を含む、第２の標的陽性対照蛍光シグナル；および／または
    －前記第１および前記第２の標的を含む別個の対照試料上で反復することによって、組み合わされた陽性対照蛍光シグナルであって、前記組み合わされた対照試料が、既知の濃
    度の前記第１の標的および／または既知の濃度の前記第２の標的を含む、組み合わされた陽性対照蛍光シグナル
    を生成することをさらに含む、請求項１４または１５に記載の方法。
  17. 任意の前記陽性対照蛍光シグナルを使用して、前記第１の蛍光シグナルおよび前記第２の蛍光シグナルを正規化することをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
  18. 請求項１または２に記載の方法を、
    （ｉ）前記第１の標的、または
    （ｉｉ）前記第２の標的、または
    （ｉｉｉ）前記第１の標的もしくは前記第２の標的を含有しない別個の陰性対照試料上で反復することによって、陰性対照蛍光シグナルを生成することをさらに含み、
    前記陰性対照蛍光シグナルを使用して、前記第１の蛍光シグナルおよび／または前記第２の蛍光シグナルを正規化することをさらに含む、請求項１３～１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. 前記第１および／または第２の蛍光シグナルを閾値と比較することをさらに含み、
    －前記閾値が、請求項１または２に記載の方法に従って試験された一連の試料に由来する蛍光シグナルを使用して生成され、
    （ｉ）無鋳型対照および前記第１の標的
    （ｉｉ）無鋳型対照および前記第２の標的
    （ｉｉｉ）無鋳型対照、前記第１の標的、および前記第２の標的
    のうちのいずれか１つ以上を含み、それにより、前記試料中の前記第１および第２の標的の前記存在または不在を決定する、請求項１３～１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. 組成物であって、
    第１および第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドであって、前記閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの各々が、ハイブリダイズしていないヌクレオチドの一本鎖ループ部分に接続されたハイブリダイズしたヌクレオチドの二本鎖ステム部分を含み、
    前記第１および第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分における、ハイブリダイズしたヌクレオチドの数および／またはハイブリダイズしたヌクレオチドの配列が、異なり、ならびに
    前記二本鎖ステム部分の各々が、一方の鎖に接続されたフルオロフォア分子、および反対の鎖に接続されたクエンチャー分子を含む、第１および第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドを含み、
    前記フルオロフォア分子が、同じ可視スペクトルの色領域で発光し、前記第１の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記二本鎖ステム部分の融解温度（Ｔｍ）が、前記第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記二本鎖ステム部分のＴｍとは異なり；
    前記第１の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記一本鎖ループ部分が、前記第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記一本鎖ループ部分の配列とは異なり；
    前記第１の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記閉鎖一本鎖ループ部分にハイブリダイズすることができる基質アームを含む、第１のＭＮＡザイム、および
    前記第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記一本鎖ループ部分にハイブリダイズすることができる基質アームを含む、第２のＭＮＡザイムをさらに含む、組成物。
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