JPWO2020031156A5

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Publication number: JPWO2020031156A5
Application number: JP2021507032A
Authority: JP
Publication date: 2022-08-15
Anticipated expiration: 2039-08-09

Claims

試料中の第１および第２の標的の存在または不在を決定するための方法であって、前記方法が、
（ａ）前記第１および／もしくは第２の標的またはそれらのアンプリコンを含むと推定される前記試料またはその誘導体を、
第１および第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドであって、前記閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの各々が、ハイブリダイズしていないヌクレオチドの閉鎖一本鎖ループ部分に接続された、ハイブリダイズしたヌクレオチドの二本鎖ステム部分を含み、
前記第１および第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分における、ハイブリダイズしたヌクレオチドの数および／またはハイブリダイズしたヌクレオチドの配列が、異なる、第１および第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチド、ならびに
前記標的またはそのアンプリコンと接触した場合にのみ、前記第１および第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記一本鎖ループ部分を切断または分解することができる酵素と接触させることによって、反応混合物を調製することと、
（ｂ）前記反応混合物を、
－前記酵素が、前記第１および第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記ループ部分の切断または分解を誘導して、それにより、第１および第２の開放ステムループオリゴヌクレオチドを生成するのに好適な条件下、
－第１の温度であって、その温度以上で、前記第１の開放ステムループオリゴヌクレオチドの前記二本鎖ステム部分の鎖が解離して、それにより、前記第１の開放ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のフルオロフォアおよびクエンチャー分子の空間的分離を促進し、第１の検出可能な蛍光シグナルを提供する、第１の温度で、ならびに
－第２の温度であって、その温度以上で、前記第２の開放ステムループオリゴヌクレオチドの前記二本鎖ステム部分の鎖が解離して、それにより、前記第２の開放ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のフルオロフォアおよびクエンチャー分子の空間的分離を促進し、第２の検出可能な蛍光シグナルを提供する、第２の温度で、処理することであって、
前記第１の温度が、前記第２の温度よりも低く、
前記第１の開放ステムループオリゴヌクレオチドの前記フルオロフォアおよび前記第２の開放ステムループオリゴヌクレオチドの前記フルオロフォアが、同じ可視スペクトルの色領域で発光する、処理することと、
（ｃ）前記第２の温度以上の温度を含むか、またはそれからなる１つ以上の温度で、前
記第１および第２の蛍光シグナルのレベルを検出して、それにより、前記試料中の前記標的の存在または不在を決定することと、を含む、方法。
前記酵素が、多成分核酸酵素（ＭＮＡザイム）を含み、前記反応混合物の前記処理が、前記反応混合物を、
第１の多成分核酸酵素（ＭＮＡザイム）を前記第１の標的またはそのアンプリコンに結合させ、前記第１のＭＮＡザイムの基質アームを前記第１の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記ループ部分にハイブリダイズして、それにより、前記第１のＭＮＡザイムが、前記第１の開放ステムループオリゴヌクレオチドを形成することによって、前記第１の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記ループ部分の前記切断を促進するのに好適な条件下で処理することを含み、
前記第１の標的が、前記第１のＭＮＡザイムのセンサーアームにハイブリダイズして、それにより、前記第１のＭＮＡザイムの集合を促進することができる核酸配列またはそのアンプリコンである、請求項１に記載の方法。
前記酵素が、制限エンドヌクレアーゼを含み、前記反応混合物の前記処理が、
前記反応混合物を、前記第１の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記ループ部分への第１の標的またはそのアンプリコンのハイブリダイゼーションに好適な条件下で処理して、第１の制限エンドヌクレアーゼが会合する二本鎖配列を形成し、それにより、前記第１の開放ステムループオリゴヌクレオチドを形成する前記第１の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記ループ部分の前記切断を促進することを含む、請求項１に記載の方法。
前記酵素が、エキソヌクレアーゼ活性を含み、前記反応混合物の前記処理が、
－第１の標的またはそのアンプリコンを、前記第１の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記ループ部分にハイブリダイズして、前記第１の標的またはそのアンプリコンを含む第１の二本鎖配列を形成すること、
－第１のプライマーオリゴヌクレオチドを、前記第１の標的またはそのアンプリコンにハイブリダイズして、前記第１の標的またはそのアンプリコンを含む前記第１の二本鎖配列に対して上流（５’）に位置する第２の二本鎖配列を形成すること、
－エキソヌクレアーゼ活性を含む第１の酵素を、前記第１のプライマーオリゴヌクレオチドの末端にあるか、またはそれに隣接する前記第１の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分と会合させること、および
－エキソヌクレアーゼ活性を含む前記第１の酵素の触媒活性により、第１の標的またはアンプリコンを含む前記第１の二本鎖配列の前記ループ部分の分解を促進し、前記第１の開放ステムループオリゴヌクレオチドを形成すること
に好適な条件下で前記反応混合物を処理することを含む、請求項１に記載の方法。
前記酵素がポリメラーゼ酵素またはエキソヌクレアーゼである、請求項１に記載の方法。
前記酵素が、エキソヌクレアーゼ活性を含み、前記反応混合物の前記処理が、
－第１の標的またはそのアンプリコンを、前記第１の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記ループ部分にハイブリダイズして、前記第１の標的またはそのアンプリコンを含む第１の二本鎖配列を形成すること、
－エキソヌクレアーゼ活性を含む第１の酵素を、前記第１の標的またはそのアンプリコンを含む前記第１の二本鎖配列と会合させること、および
－エキソヌクレアーゼ活性を含む前記第１の酵素の触媒活性により、前記第１の標的またはアンプリコンを含む前記第１の二本鎖配列の前記ループ部分の分解を促進し、前記第１の開放ステムループオリゴヌクレオチドを形成すること
に好適な条件下で前記反応混合物を処理することを含む、請求項１に記載の方法。
前記酵素が、触媒活性に第１の補因子を必要とするＤＮＡザイムおよび／またはリボザイムを含み、前記反応混合物の前記処理が、
－前記第１の補因子を前記ＤＮＡザイムに結合させ、かつ／または前記第１の補因子を前記リボザイムに結合させて、前記ＤＮＡザイムおよび／またはリボザイムを触媒活性にすること、
－ＤＮＡザイムおよび／またはリボザイムを、第１の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記ループ部分にハイブリダイズすること、
－前記ＤＮＡザイムおよび／またはリボザイムの触媒活性により、前記第１の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記ループ部分の切断を促進し、前記第１の開放ステムループオリゴヌクレオチドを形成すること
に好適な条件下で前記反応混合物を処理することを含み、
前記第１の標的が、前記第１の補因子である、請求項１に記載の方法。
前記処理が、
－第２のＭＮＡザイムを前記第２の標的またはそのアンプリコンに結合させ、前記第２のＭＮＡザイムの基質アームを前記第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記ループ部分にハイブリダイズして、それにより、前記第２のＭＮＡザイムが、前記第２の開放ステムループオリゴヌクレオチドを形成することによって、前記第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記ループ部分の前記切断を促進すること、
－第２の標的またはそのアンプリコンを前記第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記ループ部分にハイブリダイズして、第２の制限エンドヌクレアーゼが前記二本鎖配列と会合する二本鎖配列を形成し、それにより、前記第２の開放ステムループオリゴヌクレオチドを形成する前記第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記ループ部分の前記切断を促進すること、
－第２の標的またはそのアンプリコンを、前記第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記ループ部分にハイブリダイズして、前記第２の標的またはそのアンプリコンを含む第２の二本鎖配列を形成し、
第２のプライマーオリゴヌクレオチドを、前記第２の標的またはそのアンプリコンにハイブリダイズして、前記第２の標的またはそのアンプリコンを含む前記第２の二本鎖配列に対して上流（５’）に位置する第２の二本鎖配列を形成し、
エキソヌクレアーゼ活性を含む第２の酵素を、前記第２のプライマーオリゴヌクレオチドの末端にあるか、またはそれに隣接する前記第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分と会合させ、
エキソヌクレアーゼ活性を含む前記第２の酵素の触媒活性により、前記第２の標的またはアンプリコンを含む前記第２の二本鎖配列の前記ループ部分の分解を促進し、前記第２の開放ステムループオリゴヌクレオチドを形成すること、
－第２の標的またはそのアンプリコンを、前記第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記ループ部分にハイブリダイズして、前記第２の標的またはそのアンプリコンを含む第２の二本鎖配列を形成し、
エキソヌクレアーゼ活性を含む第２の酵素を、前記第２の標的またはそのアンプリコンを含む前記第２の二本鎖配列と会合させ、
エキソヌクレアーゼ活性を含む前記第２の酵素の触媒活性により、前記第２の標的またはアンプリコンを含む前記第２の二本鎖配列の前記ループ部分の分解を促進し、前記第２の開放ステムループオリゴヌクレオチドを形成すること、
－第２の補因子をＤＮＡザイムに結合させ、かつ／または第２の補因子をリボザイムに結合させて、前記ＤＮＡザイムおよび／またはリボザイムを触媒として活性化させ、
ＤＮＡザイムおよび／またはリボザイムを、前記第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記ループ部分にハイブリダイズし、
前記ＤＮＡザイムおよび／またはリボザイムの触媒活性により、前記第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記ループ部分の切断を促進し、前記第２の開放ステムループオリゴヌクレオチドを形成すること
のうちのいずれか１つ以上に好適な条件下で前記反応混合物を処理することをさらに含み、
前記第２の標的が、前記第２の補因子である、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
試料中の第３の標的またはそのアンプリコンの存在または不在を決定することであって、
（ｄ）前記試料またはその誘導体を含む前記反応混合物を、
第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドであって、前記第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドが、ハイブリダイズしていないヌクレオチドの閉鎖一本鎖ループ部分に接続されたハイブリダイズしたヌクレオチドの二本鎖ステム部分を含み、
前記第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分における、ハイブリダイズしたヌクレオチドの数および／またはハイブリダイズしたヌクレオチドの配列が、前記第１および第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のものとは異なり、
前記二本鎖ステム部分が、一方の鎖に接続されたフルオロフォア分子、および反対の鎖に接続されたクエンチャー分子を含む、第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチド、ならびに
前記標的またはそのアンプリコンと接触した場合にのみ、前記第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記一本鎖ループ部分を切断または分解することができる酵素と接触させることと、
（ｅ）前記反応混合物を、
－前記酵素が、前記第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記ループ部分の切断または分解を誘導して、それにより、第３の開放ステムループオリゴヌクレオチドを生成するのに好適な条件下、
－第３の温度であって、その温度以上で、前記第３の開放ステムループオリゴヌクレオチドの前記二本鎖ステム部分の鎖が解離して、それにより、前記第３の開放ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分の前記フルオロフォアおよびクエンチャー分子の空間的分離を促進し、第３の検出可能な蛍光シグナルを提供する、第３の温度で、処理することであって、
前記第３の温度が、前記第１および第２の温度よりも高い、処理することと、
（ｆ）前記第３の温度以上の温度を含むか、またはそれからなる１つ以上の温度で、前記第１、第２、および第３の蛍光シグナルのレベルを検出して、それにより、前記試料中の前記標的の存在または不在を決定すること
とによって、決定することをさらに含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
試料中の第３の標的またはそのアンプリコンの存在または不在を決定することであって、
（ｄ）前記試料またはその誘導体を含む前記反応混合物を、
第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドであって、前記第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドが、ハイブリダイズしていないヌクレオチドの閉鎖一本鎖ループ部分に接続されたハイブリダイズしたヌクレオチドの二本鎖ステム部分を含み、
前記第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分における、ハイブリダイズしたヌクレオチドの数および／またはハイブリダイズしたヌクレオチドの配列が、前記第１または第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分の配列と同じであり、
前記二本鎖ステム部分が、一方の鎖に接続されたフルオロフォア分子、および反対の鎖
に接続されたクエンチャー分子を含み、前記第３の開放ステムループオリゴヌクレオチドに接続された前記フルオロフォア分子が、前記第１および／または第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記フルオロフォアとは異なる可視スペクトルの色領域で発光する、第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチド、ならびに
前記標的またはそのアンプリコンと接触した場合にのみ、前記第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記一本鎖ループ部分を切断または分解することができる酵素と接触させることと、
（ｅ）前記反応混合物を、
－前記酵素が、前記第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記ループ部分の切断または分解を誘導して、それにより、第３の開放ステムループオリゴヌクレオチドを生成するのに好適な条件下、
－第３の温度であって、その温度で、前記第３の開放ステムループオリゴヌクレオチドの前記二本鎖ステム部分の鎖が解離して、それにより、前記第３の開放ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分の前記フルオロフォアおよびクエンチャー分子の空間的分離を促進し、第３の検出可能な蛍光シグナルを提供する、第３の温度で、処理することと、
（ｆ）前記第３の温度以上の温度を含むか、またはそれからなる１つ以上の温度で、前記第１、第２、および第３の蛍光シグナルのレベルを検出して、それにより、前記試料中の前記標的の存在または不在を決定すること
とによって、決定することをさらに含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
前記方法が、前記反応混合物を、
－第３のＭＮＡザイムを前記第３の標的またはそのアンプリコンに結合させ、前記第３のＭＮＡザイムの基質アームを前記第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記ループ部分にハイブリダイズして、それにより、前記第３のＭＮＡザイムが、前記第３の開放ステムループオリゴヌクレオチドを形成することによって、前記第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記ループ部分の前記切断を促進すること、
－前記第３の標的またはそのアンプリコンを前記第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記ループ部分にハイブリダイズして、第３の制限エンドヌクレアーゼが前記二本鎖配列と会合する二本鎖配列を形成し、それにより、前記第３の開放ステムループオリゴヌクレオチドを形成する前記第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記ループ部分の前記切断を促進すること、
－第３の標的またはそのアンプリコンを、前記第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記ループ部分にハイブリダイズして、前記第３の標的またはそのアンプリコンを含む第３の二本鎖配列を形成し、
第３のプライマーオリゴヌクレオチドを、前記第３の標的またはそのアンプリコンにハイブリダイズして、前記第３の標的またはそのアンプリコンを含む前記第３の二本鎖配列に対して上流（５’）に位置する第３の二本鎖配列を形成し、エキソヌクレアーゼ活性を含む第３の酵素を、前記第３のプライマーオリゴヌクレオチドの末端にあるか、またはそれに隣接する前記第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分と会合させ、
エキソヌクレアーゼ活性を含む前記第３の酵素の触媒活性により、前記第３の標的またはアンプリコンを含む前記第３の二本鎖配列の前記ループ部分の分解を促進し、前記第３の開放ステムループオリゴヌクレオチドを形成すること、
－第３の標的またはそのアンプリコンを、前記第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記ループ部分にハイブリダイズして、前記第３の標的またはそのアンプリコンを含む第３の二本鎖配列を形成し、
エキソヌクレアーゼ活性を含む第３の酵素を、前記第３の標的またはそのアンプリコンを含む前記第３の二本鎖配列と会合させ、
エキソヌクレアーゼ活性を含む前記第３の酵素の触媒活性により、前記第３の標的またはアンプリコンを含む前記第３の二本鎖配列の前記ループ部分の分解を促進し、前記第３
の開放ステムループオリゴヌクレオチドを形成すること、
－第３の補因子をＤＮＡザイムに結合させ、かつ／または第３の補因子をリボザイムに結合させて、前記ＤＮＡザイムおよび／またはリボザイムを触媒として活性化させ、
ＤＮＡザイムおよび／またはリボザイムを、第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記ループ部分にハイブリダイズし、
前記ＤＮＡザイムおよび／またはリボザイムの触媒活性により、前記第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記ループ部分の切断を促進し、前記第３の開放ステムループオリゴヌクレオチドを形成すること
のうちのいずれか１つ以上に好適な条件下で処理することを含み、
前記第３の標的が、前記第３の補因子である、請求項９または１０に記載の方法。
（ａ）
－前記第３の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分における、ハイブリダイズしたヌクレオチドの数および／またはハイブリダイズしたヌクレオチドの配列が、前記第１および第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のものとは異なり、
－前記第３の温度が、前記第１および第２の温度とは異なり、
－前記第３の閉鎖および開放ステムループオリゴヌクレオチドの前記フルオロフォアが、前記第１および第２の閉鎖および開放ステムループオリゴヌクレオチドの前記フルオロフォアと同じ可視スペクトルの色領域で発光する；または
（ｂ）
－前記第１の閉鎖および開放ステムループオリゴヌクレオチドの前記フルオロフォアが、前記第２の閉鎖および開放ステムループオリゴヌクレオチドの前記フルオロフォアと同じ可視スペクトルの色領域で発光し、
－前記第３の閉鎖および開放ステムループオリゴヌクレオチドの前記フルオロフォアが、前記第１および第２の閉鎖および開放ステムループオリゴヌクレオチドの前記フルオロフォアとは異なる可視スペクトルの色領域で発光する、
請求項９または１１に記載の方法。
前記第１および第２の標的の存在または不在を決定することが、前記第１および第２の蛍光シグナルを使用する融解曲線分析を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
（ｃ）部が、前記第１および第２の蛍光シグナルのレベルを、
－前記第２の温度以上の温度、および
－前記第１の温度以上かつ前記第２の温度未満の温度で検出することを含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
（ｃ）部が、核酸増幅反応中および／または完了時に、前記第１および第２の蛍光シグナルのレベルを検出することを含む、請求項１４に記載の方法。
－前記第１の標的を含む別個の対照試料上で反復することによって、既知の濃度の前記第１の標的および既知の濃度の前記第１の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドを使用して、第１の標的陽性対照蛍光シグナル；および／または
－前記第２の標的を含む別個の対照試料上で反復することによって、第２の標的陽性対照蛍光シグナルであって、前記対照試料が、既知の濃度の前記第２の標的を含む、第２の標的陽性対照蛍光シグナル；および／または
－前記第１および前記第２の標的を含む別個の対照試料上で反復することによって、組み合わされた陽性対照蛍光シグナルであって、前記組み合わされた対照試料が、既知の濃度の前記第１の標的および／または既知の濃度の前記第２の標的を含む、組み合わされた
陽性対照蛍光シグナル
を生成することをさらに含む、請求項１４または１５に記載の方法。
任意の前記陽性対照蛍光シグナルを使用して、前記第１の蛍光シグナルおよび前記第２の蛍光シグナルを正規化することをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
請求項１または２に記載の方法を、
（ｉ）前記第１の標的、または
（ｉｉ）前記第２の標的、または
（ｉｉｉ）前記第１の標的もしくは前記第２の標的を含有しない別個の陰性対照試料上で反復することによって、陰性対照蛍光シグナルを生成することをさらに含み、
前記陰性対照蛍光シグナルを使用して、前記第１の蛍光シグナルおよび／または前記第２の蛍光シグナルを正規化することをさらに含む、請求項１３～１７のいずれか一項に記載の方法。
前記第１および／または第２の蛍光シグナルを閾値と比較することをさらに含み、
－前記閾値が、請求項１または２に記載の方法に従って試験された一連の試料に由来する蛍光シグナルを使用して生成され、
（ｉ）無鋳型対照および前記第１の標的
（ｉｉ）無鋳型対照および前記第２の標的
（ｉｉｉ）無鋳型対照、前記第１の標的、および前記第２の標的
のうちのいずれか１つ以上を含み、それにより、前記試料中の前記第１および第２の標的の前記存在または不在を決定する、請求項１３～１８のいずれか一項に記載の方法。
組成物であって、
第１および第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドであって、前記閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの各々が、ハイブリダイズしていないヌクレオチドの一本鎖ループ部分に接続されたハイブリダイズしたヌクレオチドの二本鎖ステム部分を含み、
前記第１および第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分における、ハイブリダイズしたヌクレオチドの数および／またはハイブリダイズしたヌクレオチドの配列が、異なり、ならびに
前記二本鎖ステム部分の各々が、一方の鎖に接続されたフルオロフォア分子、および反対の鎖に接続されたクエンチャー分子を含む、第１および第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドを含み、
前記フルオロフォア分子が、同じ可視スペクトルの色領域で発光し、前記第１の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記二本鎖ステム部分の融解温度（Ｔｍ）が、前記第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記二本鎖ステム部分のＴｍとは異なり；
前記第１の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記一本鎖ループ部分が、前記第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記一本鎖ループ部分の配列とは異なり；
前記第１の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記閉鎖一本鎖ループ部分にハイブリダイズすることができる基質アームを含む、第１のＭＮＡザイム、および
前記第２の閉鎖ステムループオリゴヌクレオチドの前記一本鎖ループ部分にハイブリダイズすることができる基質アームを含む、第２のＭＮＡザイムをさらに含む、組成物。