KR100920134B1

KR100920134B1 - Ｙ 염색체 미세결실 검출용 마이크로어레이 및 이를이용한 검출방법

Info

Publication number: KR100920134B1
Application number: KR1020070064872A
Authority: KR
Inventors: 이수만; 김지은; 황승용; 오문주; 연종필
Original assignee: 차의과학대학교 산학협력단
Priority date: 2007-06-29
Filing date: 2007-06-29
Publication date: 2009-10-08
Also published as: KR20090000926A

Abstract

본 발명은 Y 염색체 미세결실 검출용 마이크로어레이 및 이를 이용한 검출방법에 대한 것으로, 남성 불임 관련 유전자의 미세결실을 검출하기 위한 프로브(PROBES)를 포함하는 마이크로어레이에 있어서, 상기 프로브는 Y 염색체의 AZFc 영역에 위치한 TTTY5, TTTY6, TTTY17, BPY2, CDY1, PRY 및 DAZ 유전자 서열과 동일하거나 상보적인 염기서열을 가지는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 한다. 이러한 본 발명에 의하는 경우, 불임 남성 환자에게서 발생하는 특정 유전자의 미세 결실을 분자생물학적 레벨에서 대량으로 간편하고 신속하게 판별할 수 있을 뿐만 아니라, 프라이머에 의한 증폭과 지지체에 대한 부착이 정확하고 용이한 유전자만을 선별한 것이기 때문에 표적 산물과의 혼성화 반응 효과가 우수하다.

Y 염색체, 마이크로어레이, AZF

Description

Ｙ 염색체 미세결실 검출용 마이크로어레이 및 이를 이용한 검출방법{Detection Microarray For Y chromosomal Microdeletion and Detecting Method Using The Same}

도 1은 남성 불임과 관련된 Y 염색체 상의 유전자 및 STS 마커의 위치를 나타낸 모식도이고,

도 2는 본 발명에 의해 남성 불임과 관련된 것으로 밝혀진 Y 염색체 상의 유전자에 대한 미세결실을 전체적으로 나타낸 모식도이고,

도 3은 본 발명에 따른 Y 염색체 상의 유전자 18개를 포함해서 남성 불임과 관련된 것으로 밝혀진 25개 유전자를 프로브로 사용하여, 실제 남성 불임 환자의 Y 염색체 미세결실을 판별한 마이크로어레이 사진이고,

도 4는 본 발명에 따른 남성 불임 관련 Y 염색체 유전자 8개를 마이크로어레이로 제작하기 위해 디자인한 칩 상의 배열 일례를 나타내는 모식도이고,

도 5는 도 4에 따른 배열로 제작된 마이크로어레이를 이용하여 남성 정상인과 환자의 Y 염색체 미세결실을 분석한 마이크로어레이 사진이다.

본 발명은 마이크로어레이에 대한 것으로, 특히 Y 염색체 미세결실을 검출하기 위한 마이크로어레이와 이를 이용한 Y 염색체 미세결실 검출방법에 대한 것이다. 더욱 상세하게는, Y 염색체 상의 유전자 중에서 남성 불임과 관련이 있고, 특히 프라이머에 의한 증폭 및 지지체에 대한 부착이 정확하고 용이한 유전자만을 프로브로 포함하는 마이크로어레이에 대한 것이다.

일반적으로, 남성불임의 진단은 일차적으로 비뇨기과적 진찰이나 정액검사로 이루어지며, 그 결과 남성불임으로 진단받은 경우에는 정밀검사를 통한 진단이 행해진다. 남성불임의 정밀 진단방법으로는 고환조직의 생검 방법, 항-정자 항체 검사방법, 혈액 내 호르몬 검사방법 및 염색체 검사방법이 있다.

고환조직의 생검 방법은 정자감소증(ologozoospermia), 정자사멸증, 무정자증(azoospermia) 등과 같은 심한 이상이 발견된 경우, 고환조직의 일부를 채취하여 직접 검사하는 방법으로, 정액 내에 정자가 없다고 하더라도 정자의 제조원인 고환의 기능이 정상적이라면, 높은 성공률로 치료할 수 있다. 항-정자 항체 검사방법은 정자에 대한 항체의 존재 유무를 분석하는 방법이다. 정자에 대한 항체는 자연스럽게 생기기도 하지만, 일반적으로 염증이나 외상 후 또는 피임을 목적으로 정관 수술을 했다가 복원한 경우에 많이 관찰된다. 검사 결과 정자 표면에서 항-정자 항체 가 높은 수치로 관찰될 경우에는 인공 수정법으로도 수정이 어려우며, 시험관 아기를 실시한다 하더라도 수정에 실패할 확률이 높으므로 특수 처리가 필요하다. 혈액 내 호르몬 검사방법은 남성 호르몬의 체내 수치를 검사하는 방법으로, 남성의 정자는 체내 남성호르몬이 일정 수치 이상으로 유지되어야만 정상적으로 생산된다는 사실에 근거한다. 염색체 검사방법은 남성의 염색체 중에서도 특히 성염색체(Y chromosome)의 이상을 검사하는 방법이다.

남성불임은 도 1을 참고로 Y 염색체의 오른쪽 긴 부분에 위치한 AZF(Azoospermia factor) 부위와 관련되어 있음이 Tiepolo와 Zuffardi에 의해 알려졌고(Tiepolo, L. and Zuffardi, O., Location of factor controlling spermatogenesis in the nonfluorescent portion of the human Y chromosome long arm, Human Gent., 1976, 34, 119-124), AZF 부위는 AZFa, AZFb, AZFc의 세 부분으로 구분할 수 있으며(Vogt, P.H., Edelmann, A., Hirschmann, P., Shan, Z., Tenscher, S., Urbitsch, P., The Y chromosomes and in fertility in the male, Abstracts of the 12th Ammual Meeting of the EHSRE, 1996, 32), Y 염색체의 많은 연구 결과로부터 불임남성의 약 10%에서 이 세 부분에서의 결실이 발견되며, 특히, 무정자증 또는 심각한 정자감소증과 관련되어 있다는 사실이 밝혀졌다 (Vogt, P.H., Human chromosome deletions in Yq11, AZF candidate genes and male infertility: history and update, Molecular Human Reproduction, 1998, 4, 739-744).

남성 불임과 관련된 Y 염색체 상의 유전자로는 SRY, HSFY2, CDY2, BPY2, CDY1, PRY, DAZ 등이 제시된 바 있다 (Koopman P., Sry and Sox9: mammalian testis-determining genes., Cell Mol Life Sci. 1999 Jun; 55(6-7): 839-56; Tessari A, et al., Characterization of HSFY, a novel AZFb gene on the Y chromosome with a possible role in human spermatogenesis, Mol Hum Reprod . 2004 Apr; 10(4): 253-8; Kleiman SE, et al., Members of the CDY family have different expression patterns: CDY1 transcripts have the best correlation with complete spermatogenesis, Hum Genet. 2003 Nov; 113(6): 486-92; Tse JY, et al, Specific expression of VCY2 in human male germ cells and its involvement in the pathogenesis of male infertility, Biol Reprod . 2003 Sep;69(3):746-51; Kleiman SE, et al., Members of the CDY family have different expression patterns: CDY1 transcripts have the best correlation with complete spermatogenesis, Hum Genet. 2003 Nov;113(6):486-92; Stouffs K, et al., Expression pattern of the Y-linked PRY gene suggests a function in apoptosis but not in spermatogenesis, Mol Hum Reprod . 2004 Jan;10(1):15-21; Ferlin A, et al, A novel approach for the analysis of DAZ gene copy number in severely idiopathic infertile men, J Endocrinol Invest. 2002 Jan;25(1):RC1-3; 미국특허 제5,776,682호; 제5,783,390호; 및 제5,840,549호)

현재 남성불임을 진단하는 방법으로 가장 일반적으로 사용되고 있는 방법은 염색체 검사 방법에 의한 것으로 Y 염색체 상의 STS (Sequence Tagged Site) 마커를 이용하여 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)을 수행하여 얻어진 PCR 산물을 겔(Gel) 상에서 확인하는 방법이다. 이는 비교적 간편하고 과정이 용이하기 때문에 널리 이용되고 있다. 그러나, 종래의 분자 생물학적 PCR을 이용하는 방법은 정확성이 떨어지고, 분석 시간이 길어지는 등의 여러 가지 기술적 문제와 대량 분석의 한계를 가지고 있다. 따라서, 종래의 분자 생물학적 PCR을 이용하는 방법이 가지고 있는 문제점을 해결하고, 대량의 시료를 정확하고 신속하게 분석할 수 있는 새로운 남성불임 관련 DNA의 결실을 분석하는 방법을 개발하여야 할 필요성이 끊임없이 대두 되었다.

본 발명은 먼저 종래와 같은 STS 마커가 아닌 Y 염색체 상의 유전자를 대상으로 Y 염색체의 미세결실을 진단함으로써, STS 마커를 사용하는데 따른 문제점, 즉 결실 부위를 제대로 판별하지 못하는 문제점 등을 해결하기 위한 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 Y 염색체의 AZFc 영역에 위치하는 유전자, 특히 TTTY5, TTTY6 및 TTTY17 유전자를 포함해서 프라이머에 의한 증폭과 형광물질의 표지 및 지지체에 대한 부착이 정확하고 용이한 유전자만을 선별함으로써, 이전과 같이 환자 gDNA로부터 얻은 표적 산물이 잘 증폭되지 않거나 여기에 형광물질이 잘 표지되지 않거나 또는 프로브로 사용되는 일부 유전자가 지지체에 붙지 않는 문제점을 해결하기 위한 것이다.

또한, 본 발명은 상기한 바와 같이 프라이머에 의한 증폭과 형광물질의 표지 및 지지체에 대한 부착이 정확하고 용이한 8개 유전자만을 선별하여 제작한 마이크로어레이와 이를 이용한 검출방법을 제공함으로써, 표적 산물과의 혼성화 반응 효과가 우수할 뿐만 아니라, 다수의 유전자를 이용하는 종전의 기술보다 불임 남성 환자에게서 발생하는 특정 유전자의 미세 결실을 대량으로 간편하고 신속하게 판별하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명에 따른 Y 염색체 미세결실 검출용 마이크로어레이는, 남성 불임 관련 유전자의 미세결실을 검출하기 위한 프로브(PROBES)를 포함하는 마이크로어레이에 있어서, 상기 프로브는 각각 Y 염색체의 AZFc 영역에 위치한 TTTY5 유전자 서열 중 서열번호 3 또는 4와 동일하거나 상기 서열번호 3 또는 4에 상보적인 염기서열, TTTY6 유전자 서열 중 서열번호 5 또는 6과 동일하거나 상기 서열번호 5 또는 6에 상보적인 염기서열, TTTY17 유전자 서열 중 서열번호 7 또는 8과 동일하거나 상기 서열번호 7 또는 8에 상보적인 염기서열, BPY2 유전자 서열 중 서열번호 9 또는 10과 동일하거나 상기 서열번호 9 또는 10에 상보적인 염기서열, CDY1 유전자 서열 중 서열번호 11 또는 12와 동일하거나 상기 서열번호 11 또는 12에 상보적인 염기서열, PRY 유전자 서열 중 서열번호 13 또는 14와 동일하거나 상기 서열번호 13 또는 14에 상보적인 염기서열, 및 DAZ 유전자 서열 중 서열번호 15 또는 16과 동일하거나 상기 서열번호 15 또는 16에 상보적인 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에 따른 Y 염색체 미세결실 검출방법은, Y 염색체의 AZFc 영역에 위치한 TTTY5 유전자 서열 중 서열번호 3 또는 4와 동일하거나 상기 서열번호 3 또는 4에 상보적인 염기서열, TTTY6 유전자 서열 중 서열번호 5 또는 6과 동일하거나 상기 서열번호 5 또는 6에 상보적인 염기서열, TTTY17 유전자 서열 중 서열번호 7 또는 8과 동일하거나 상기 서열번호 7 또는 8에 상보적인 염기서열, BPY2 유전자 서열 중 서열번호 9 또는 10과 동일하거나 상기 서열번호 9 또는 10에 상보적인 염기서열, CDY1 유전자 서열 중 서열번호 11 또는 12와 동일하거나 상기 서열번호 11 또는 12에 상보적인 염기서열, PRY 유전자 서열 중 서열번호 13 또는 14와 동일하거나 상기 서열번호 13 또는 14에 상보적인 염기서열, DAZ 유전자 서열 중 서열번호 15 또는 16과 동일하거나 상기 서열번호 15 또는 16에 상보적인 염기서열, 및 SRY 유전자 서열 중 서열번호 1 또는 2와 동일하거나 상기 서열번호 1 또는 2에 상보적인 염기서열을 각각 포함하는 프로브를 마이크로어레이의 지지체에 고정화하는 단계;와, 상기 고정화된 올리고뉴클레오티드와 남성으로부터 분리한 gDNA 시료를 혼성화(hybridization)시킨 뒤, 상기 혼성화 여부를 판별하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 한다.

기타 실시예들의 구체적인 사항들은 상세한 설명 및 도면들에 포함되어 있다. 이하, 첨부된 도면을 참조로 하여 본 발명의 구체적인 실시형태 상세하게 설명하기로 한다.

본 발명은 기본적으로 남성 불임 관련 유전자의 미세결실을 검출하기 위한 프로브(PROBES)를 포함하는 마이크로어레이에 있어서, 상기 프로브가 Y 염색체의 AZFc 영역에 위치한 TTTY5, TTTY6, TTTY17, BPY2, CDY1, PRY 및 DAZ 유전자 서열과 동일하거나 상기 유전자 서열에 상보적인 염기서열을 가지는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 한다. 이러한 본 발명에 의하는 경우, 불임 남성 환자에게서 발생하는 특정 유전자의 미세 결실을 분자생물학적 레벨에서 대량으로 간편하고 신속하게 판별할 수 있을 뿐만 아니라, 프라이머에 의한 증폭과 지지체에 대한 부착이 정확하고 용이한 유전자만을 선별한 것이기 때문에 표적 산물과의 혼성화 반응 효과가 우수하다. 또한, 본 발명은 STS 마커가 아닌 Y 염색체 상의 유전자를 대상으로 Y 염색체의 미세결실을 진단하므로, STS 마커를 사용하는데 따른 문제점, 즉 결실 부위를 제대로 판별하지 못하는 문제점 등을 해결할 수 있다.

본 발명에 따른 마이크로어레이에 있어서, 상기 프로브는 지지체에 의해 마이크로어레이 상에 결합될 수 있고, 상기 지지체는 마이크로어레이의 제작에 통상적으로 사용되는 슬라이드글라스, 멤브레인, 반도체 칩(semiconductive chip), 실리콘 또는 젤(gel) 등을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 또한, 상기 프로브는 마이크로어레이의 종류에 따라 남성 불임 관련 유전자를 검출할 수 있는 어떤 바이오 물질도 포함할 수 있으나, 바람직하게는 cDNA, 올리고뉴클레오티드, PNA(peptide nucleic acid), LNA(locked nucleic acid)와 HNA(hexitol nucleic acid) 등의 DNA 유사체(analogues), 펩타이드 또는 단백질인 것을 특징으로 한다.

본 발명자들에 의해 남성 불임과 관련성을 가지는 것으로 새롭게 입증된 Y 염색체 상의 유전자들은 TMSB4Y, AMELY, RPS4Y2, VCY, ZFY, TBL1Y, SMCY, XKRY, CYorf15A, NLGN4Y, EIF1AY, UTY, RBM1, CYorf15B, TTTY5, TTTY6, TTTY17, 및 DDX3Y 이다. 특히, 상기 남성 불임과 관련성을 가지는 것으로 새롭게 입증된 Y 염색체 상의 유전자들 중, AZFc에 위치하는 TTTY5, TTTY6, 및 TTTY17은 대부분의 남성 불임환자에서 미세결실을 나타냄으로써, 남성불임의 진단 또는 진단키트의 구성에 있어서 바람직한 표적(target)으로 사용될 수 있다(도 2 참조).

남성 불임 진단을 위한 상기 유전자들의 미세결실 검출은 상기 유전자들을 증폭할 수 있는 프라이머쌍을 사용하여 환자의 gDNA 시료를 중합효소연쇄반응 등을 수행하여 증폭하고, 얻어진 산물 중에 상기 유전자들의 증폭된 산물이 존재하는지 여부를 검출함으로써 수행할 수 있다. 상기 프라이머 쌍은 NCBI Gene bank에 공지된 Y 염색체의 뉴클레오티드 서열로부터 제작할 수 있다.

그리고, 상기 유전자들의 미세결실의 검출은 2 종 이상의 유전자를 동시에 증폭할 수 있는 2종 이상의 프라이머쌍을 사용한 다중중합효소연쇄반응(Multiplex-Polymerase Chain Reaction; M-PCR)에 의해 바람직하게 수행될 수도 있다. 또한, 상기 다중 중합효소연쇄반응은 남성 불임과 관련되는 것으로 이미 알려진 유전자들을 검출할 수 있는 프라이머쌍과 본 발명자들에 의해 남성 불임과 관련성을 가지는 것으로 새롭게 입증된 상기 18개의 유전자들에 대한 프라이머쌍을 조합하여 복수의 M-PCR 세트를 제작하여 수행할 수도 있다.

본 발명자들은 상기와 같이 남성 불임과 관련있는 것으로 새롭게 입증된 Y 염색체 상의 18개 유전자를 바탕으로, 이미 남성 불임과 관련 있는 것으로 알려진 다른 유전자와 함께 다중중합효소연쇄반응(M-PCR)으로 남성 불임을 진단하는 방법 및 Y 염색체 미세결실 검출용 키트에 대하여, 2007년 03월 08일에 출원(출원번호: 제10-2007-0022842호)한 바가 있다. 도 2는 본 발명에 의해 남성 불임과 관련된 것으로 밝혀진 Y 염색체 상의 유전자에 대한 미세결실을 전체적으로 나타낸 모식도이고, 이것은 상기한 특허출원 제10-2007-0022842호에 따라 프라이머쌍을 사용한 다중중합효소연쇄반응으로 얻은 결과이다.

이후, 본 발명자들은 대량의 시료를 더욱 간편하고 용이하게 분석하기 위하여, 상기 새롭게 알게 된 18개 유전자를 포함하여 25개의 유전자를 프로브로 사용하는 DNA 칩을 제작하였다. 도 3은 본 발명에 따른 Y 염색체 상의 유전자 18개를 포함해서 남성 불임과 관련된 것으로 밝혀진 25개 유전자를 프로브로 사용하여, 실제 남성 불임 환자의 Y 염색체 미세결실을 판별한 마이크로어레이 사진이다. 그러나, 도 3에서 알 수 있는 바와 같이, 상기 18개 유전자 중 일부를 포함하여 상당수의 유전자 프로브 스팟(spot)에서, 환자의 표적 산물 시료가 혼성화하지 못하는 결과가 발생하였다.

이는 남성 불임과 관련된 것으로 확인된 상기 25개 유전자가 프라이머쌍에 의한 다중중합효소연쇄반응으로는 좋은 결과를 얻을 수 있을지는 몰라도, 마이크로어레이의 프로브로 사용하기에는 부적합하다는 것을 의미하고, 이것은 환자 gDNA로부터 얻은 표적 산물이 잘 증폭되지 않거나 상기 표적 산물에 형광물질이 잘 표지되지 않거나 또는 프로브로 사용되는 일부 유전자가 지지체에 잘 붙지 않기 때문인 것으로 예상되었다.

이에 따라, 본 발명자들은 Y 염색체의 AZFc 영역에 위치하는 유전자, 특히 TTTY5, TTTY6 및 TTTY17 유전자를 포함해서 프라이머에 의한 증폭과 형광물질의 표지 및 지지체에 대한 부착이 정확하고 용이한 유전자만을 선별하여, 마이크로어레이의 프로브로 사용하고자 하였다. 본 발명자들은 도 2에 도시된 Y 염색체의 미세결실 분 석 결과와 도 3에 나타난 마이크로어레이 사진을 분석한 결과, 공통적으로 AZFc 영역에 위치하는 유전자들이 남성 불임과의 관련성이 상당히 높고, 마이크로어레이의 프로브로 사용하더라도 문제가 없는 것을 알게 되었다.

그래서, 선택된 것이 Y 염색체의 AZFc 영역에 위치한 TTTY5, TTTY6, TTTY17, BPY2, CDY1, PRY 및 DAZ 유전자이고, 본 발명은 이러한 유전자 서열과 동일하거나 상보적인 염기서열을 포함하는 유전자를 프로브로 사용하는 마이크로어레이 및 이를 이용한 Y 염색체 미세결실 검출방법이다. 본 발명은 이와 같이 프라이머에 의한 증폭과 형광물질의 표지 및 지지체에 대한 부착이 정확하고 용이한 유전자만을 선별하여 제작한 마이크로어레이와 이를 이용한 검출방법이기 때문에, 표적 산물과의 혼성화 반응 효과가 우수할 뿐만 아니라, 다수의 유전자를 이용하는 종전의 기술보다 불임 남성 환자에게서 발생하는 특정 유전자의 미세 결실을 대량으로 간편하고 신속하게 판별할 수 있는 것이다.

도 4는 본 발명에 따른 남성 불임 관련 Y 염색체 유전자 8개를 마이크로어레이로 제작하기 위해 디자인한 칩 상의 배열 일례를 나타내는 모식도이고, 여기에는 상기와 같이 마이크로어레이의 프로브로써 최적으로 적합한 TTTY5, TTTY6, TTTY17, BPY2, CDY1, PRY 및 DAZ 유전자와 함께, Yp 영역에 위치하는 SRY 유전자를 더 포함하는 것으로 나타나 있다. 상기 SRY 유전자는 남성에만 있는 유전자로써, 미지의 시료를 가지고 Y 염색체 미세 결실을 분석 했을때, 상기 시료가 남성으로부터 분리된 것인지를 간단하게 확인할 수 있게 해 준다. 이에 따라, 본 발명에 따른 상기 프로브는, Y 염색체의 Yp 영역에 위치한 SRY 유전자 서열과 동일하거나 상보적인 염기서열을 가지는 올리고뉴클레오티드를 더 포함할 수 있다.

본 발명에 따라 마이크로어레이의 프로브로 사용되는 Y 염색체 상의 유전자들, 즉 SRY, TTTY5, TTTY6, TTTY17, BPY2, CDY1, PRY 및 DAZ 유전자의 NCBI Gene bank 상의 Gene ID, Y 염색체상의 위치, 및 크기(bp)는 하기 표 1에 나타낸 바와 같다.

유전자	Gene ID	위치	크기(bp)	서열번호	방향	크기(bp)
SRY	6736	Yp	313bp	1	정방향	5'-CGAACTCTGGCACCTTTCAA-3'
				2	역방향	5'-CTGATTTCGCATTCTGGGA-3'
TTTY5	83863	AZFc	196 bp	3	정방향	5'-AGGATCTCGGAATCTACAAGGG-3'
				4	역방향	5'-GATTGCAGATCCACAGGCTTAC-3'
TTTY6	84672	AZFc	243 bp	5	정방향	5'-CTCCATTCATCCTGAGTCTTGC-3'
				6	역방향	5'-CTCATGTGAGCCTTGATTTTCC-3'
TTTY17	252949	AZFc	300 bp	7	정방향	5'-TAGCAGGATAACCACGTCCACT-3'
				8	역방향	5'-GTGAGCTGAGATTGTGCAAACA-3'
BPY2	9083	AZFc	261bp	9	정방향	5'-ACTTTCCTTTCTTGTCCCTGCT-3'
				10	역방향	5'-CCATTCTCACTTCATTTCTGGC-3'
CDY1	9085	AZFc	317bp	11	정방향	5'-GGCGAAAGCTGACAGCAAG-3'
				12	역방향	5'-CCTTAGTTCTTGTGTCCTGAGCA-3'
PRY	9081	AZFc	409bp	13	정방향	5'-AGCCTACTTCATCTCAGGACCC-3'
				14	역방향	5'-ACCAGAATCTCTGCCAGAAACA-3'
DAZ(1) DAZ(2) DAZ(3) DAZ(4)	1617 57055 57054 57135	AZFc	512bp	15	정방향	5'-AAATGCAGTAACCTCGGCTTTA-3'
				16	역방향	5'-ATGTATCTGTGGGCAAAGTGCT-3'

즉, 본 발명은 Y 염색체의 AZFc 영역에 위치한 TTTY5, TTTY6, TTTY17, BPY2, CDY1, PRY 및 DAZ 유전자 서열과 동일하거나 상보적인 염기서열을 가지는 올리고뉴클레오티드를 프로브로 이용하여, 남성 불임 관련 유전자의 미세결실을 검출하는 것을 특징으로 하는 마이크로어레이이다.

여기서, 상기 올리고뉴클레오티드는 상기한 TTTY5, TTTY6, TTTY17, BPY2, CDY1, PRY 및 DAZ 유전자 서열과 동일하거나 상보적인 염기서열을 포함하는 AZFc 영역의 전부 또는 일부일 수도 있지만, 상기 유전자 각각의 서열과 동일하거나 상보적인 염기서열을 가지는 7개의 올리고뉴클레오티드인 것이 바람직하고, 이에 따른 상기 7개의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 프로브는 상기 마이크로어레이 지지체의 서로 다른 스팟(spot)에 부착되는 것이 더욱 바람직하다. 상기한 유전자들이 서로 구분되는 올리고뉴클레오티드에 포함되거나 서로 다른 스팟에 부착되는 경우, 남성 불임 여부에 대한 확인뿐만 아니라 어느 유전자 결실이라는 것까지 구분하여 판별할 수 있기 때문이다.

또한, 상기 TTTY5, TTTY6, TTTY17, BPY2, CDY1, PRY 및 DAZ 유전자 서열과 동일하거나 상보적인 염기서열은, 상기 각 유전자의 전체 또는 어느 특정한 위치의 일부일 수 있고, 이것은 서열번호 3 내지 서열번호 16으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 염기서열을 포함하는 것도 가능하다.

또한, 상기 TTTY5, TTTY6, TTTY17, BPY2, CDY1, PRY 및 DAZ 유전자 서열과 동일하거나 상보적인 염기서열은, 상기한 표 1에 나타난 바와 같이, 각각 서열번호 3이나 4; 서열번호 5나 6; 서열번호 7이나 8;서열번호 9나 10; 서열번호 11이나 12; 서열번호 13이나 14; 및, 서열번호 15나 16의 염기서열 또는 이에 상보적인 염기서열을 포함하는 것일 수 있다. 이와 함께, 상기 SRY 유전자 서열과 동일하거나 상보적인 염기서열은, 서열번호 1이나 2의 염기서열 또는 이에 상보적인 염기서열을 포함하는 것이 바람직하다.

이와 같이, 상기한 표 1에 기재된 염기서열은 환자로부터 분리한 gDNA로부터 표적 산물을 얻기 위한 PCR 증폭시 프라이머로 사용될 수도 있지만, 마이크로어레이 제작을 위한 프로브 서열이 될 수도 있다.

한편, 본 발명의 다른 실시형태는 상술한 바와 같은 8개 유전자의 염기서열을 각각 포함하는 프로브를 마이크로어레이의 지지체에 고정화하고, 남성으로부터 분리한 gDNA 시료를 상기 고정시킨 프로브와 혼성화(hybridization)시킨 다음, 이에 따른 혼성화 여부를 판별하여, Y 염색체의 미세결실을 검출하는 방법일 수 있다.

이러한 본 발명은 상기한 바와 같이 프라이머에 의한 증폭과 형광물질의 표지 및 지지체에 대한 부착이 정확하고 용이한 8개 유전자만을 선별하여 프로브로 사용하는 것이기 때문에, 표적 산물과의 혼성화 반응 효과가 우수할 뿐만 아니라, 다수의 유전자를 이용하는 종전의 기술보다 불임 남성 환자에게서 발생하는 특정 유전자의 미세 결실을 대량으로 간편하고 신속하게 판별할 수 있는 것이다.

여기서, 상기 gDNA는 남성 정상인이나 환자의 혈액, 머리카락, 구강 내의 상피조직 등으로부터 통상의 방법에 따라 분리할 수 있으며, 이 중 혈액은 다른 조직들에 비해 gDNA를 분리했을 시 많은 양을 얻을 수 있으므로, 혈액으로부터 분리하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 상기 혼성화 여부 판별을 위하여, 상기 마이크로어레이의 지지체에 고정화된 올리고뉴클레오티드와 상기 gDNA 시료 중 하나 이상에는 형광물질이 표지되는 것이 더욱 바람직하고, 이에 따라, 상기 혼성화 여부를 판별하는 단계는, 먼저, 남성 환자의 혈액에서 채취한 gDNA 시료에, 서열번호 3과 4; 서열번호 5와 6; 서열번호 7과 8;서열번호 9와 10; 서열번호 11과 12; 서열번호 13과 14; 및, 서열번호 15와 16의 염기서열을 가지는 프라이머쌍을 가하여 상기 시료를 증폭시키는 단계; 상기 증폭된 시료를 상기 마이크로어레이의 지지체에 고정화된 프로브와 혼성화시키는 단계; 상기 혼성화시킨 마이크로어레이를 세척하여 혼성화되지 않은 시료를 제거하는 단계; 및, 상기 시료를 제거한 마이크로어레이 상의 형광을 판독하는 단계;를 포함하는 것일 수 있다.

이하에서는 본 발명의 바람직한 하나의 실시형태를 첨부된 도면을 참조하여 상세하게 설명하기로 한다. 본 발명은 하기의 실시예에 의하여 보다 더 잘 이해 될 수 있으며, 하기의 실시예는 본 발명의 예시 목적을 위한 것이며, 첨부된 특허청구범위에 의하여 한정되는 보호범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.

실시예 1: 남성 불임 환자의 혈액(blood)에서 gDNA 추출

남성 불임 환자의 혈액 3㎖를 EDTA 시험관(tube)에 채혈한 후, 15㎖ 코니컬 튜브(conical tube)로 옮겼다. 여기에 TKM1 buffer(10mM Tris-HCl pH7.6, 10mM KCl, 10mM MgCl₂, 2mM EDTA) 3㎖과 Nondiet P-40 75㎕를 넣어 잘 혼합한 후 2200 rpm에서 10분간 원심분리를 하여 펠렛을 얻었다. 펠렛에 다시 TKM1 buffer 3㎖를 넣어 피펫팅을 한 후 2200 rpm에서 10분간 원심분리하여 다시 펠렛을 얻었다. 여기에 TKM2 buffer(10mM Tris-HCl pH7.6, 10mM KCl, 10mM MgCl₂, 2mM EDTA, 0.4M NaCl) 0.48㎖을 넣어 펠렛을 잘 풀어준 후 10% SDS 30㎕를 넣어주고, 55℃에서 2시간 배양하였다. 배양된 용액을 E-tube(Eppendorf tube)로 옮겨 6M NaCl 0.18㎖ 첨가한 후 12000 rpm에서 10분간 원심분리하였다. 여기서 상층액만을 15㎖ 코니컬 튜브로 옮겨 2배의 100% 에탄올을 넣고 천천히 앞뒤로 뒤집어 DNA만을 얻고 여기에 다시 차가운 70% 에탄올 1㎖을 넣어 4℃, 12000 rpm에서 5분간 원심분리를 한 후 펠렛을 얻었다. 에탈올이 모두 없어질 때까지 펠렛을 건조하고, 100㎕의 3차 증류수를 넣어 펠렛을 녹이고, 남성 불임 환자로부터 gDNA 시료를 얻었다.

실시예 2: 남성불임 관련 DNA를 부착시킨 유리판 제조

남성불임과 관련성을 갖는 것으로 상기 표 1에 도시된 바와 같은 Y 염색체 상의 각 유전자를 PCR로 증폭하고 정제하여 고상 지지체에 부착시켰다.

먼저, 주형이 되는 DNA를 1 본쇄로 변형시키기 위해서 95 ℃에서 10분간 열처리를 한 후, 95 ℃에서 25초간 DNA를 변성하는 단계(denaturation), 60℃에서 25초간 어닐링(annealing) 단계, 72 ℃에서 25초간 DNA 합성 단계(extension)를 총 30-35회 실시하여 PCR 증폭을 실시할 수 있으며, 마지막 DNA 합성 단계는 72℃에서 10분간 실시하였다. 반응이 끝난 PCR 증폭 산물은 브로모에티듐 0.5㎍/㎖를 가한 0.5×TBE 를 전기영동 완충액으로 하여 2%의 한천 겔에서 전기영동을 실시한 다음, UV 트랜스일루미네이터(transilluminator) 하에서 관찰했다. 정확한 위치에서의 PCR 증폭산물이 확인이 되면, 증폭산물을 포함하는 PCR 혼합액에 0.1배 부피의 3M 소디움 아세테이트(pH5.2) 및 2.5배 부피의 100% 에탄올 또는 1.0배 부피의 이소프로판올을 가하여 -70℃에서 1시간 이상 방치한 후, 13,000 rpm, 4℃에서 20분 동안 원심분리하였다. 그런 다음 상층액을 버리고, 수득한 펠렛에 250㎕의 70% 에탄올을 가하여 13,000rpm, 4℃에서 10분간 원심분리한 후, 상층액을 버리고 펠렛을 수득하였다. 수득한 펠렛을 상온에서 건조시켜 남아있는 에탄올을 모두 제가하고, 6㎕의 3x SSC에 현탁한 다음, 마이크로어레이를 이용하여 현탁된 유전자를 고상 지지체로 선택된 유리판(Cartetian, USA)에 점적하고, 80℃에서 1시간 동안 배양하여 남성불임 관련 DNA를 부착시킨 유리판을 제조하였다.

실시예 3: Cy3 - dCTP 를 이용한 시료 DNA의 표지

정상 남성과 환자의 혈액에서 채취한 gDNA에 상기 나열된 모든 프라이머 쌍을 가하고, 멀티플렉스 PCR을 수행하여 시료 DNA를 증폭하고, Cy3-dCTP로 표지하였다.

즉, 시료 DNA(100ng/㎕) 1㎕, 프라이머-Mix(20pmol/㎕) 5㎕, dATP(10mM) 0.5㎕, dTTP(10mM) 0.5㎕, dGTP(10mM) 0.5㎕, dCTP(10mM) 2.5㎕, Cy3-dCTP 2.5㎕, 10x Taq 완충용액 5㎕, Taq 중합효소 0.3㎕(1.25unit) 및 증류수 7.2㎕의 조성으로 PCR 혼합액을 제조하였다. PCR 혼합액을 온도순환기에서 95 ℃에서 10분간 열처리를 한 후, 95 ℃에서 25초간 DNA를 변성하는 단계(denaturation), 60℃에서 25초간 어닐링(annealing) 단계, 72 ℃에서 25초간 DNA 합성 단계(extension)를 총 30-35회 실시하여 PCR 증폭을 실시할 수 있으며, 마지막 DNA 합성 단계는 72℃에서 10분간 실시하였다. PCR이 완료되면, 증폭산물을 포함하는 PCR 혼합액에 1.0배 부피의 이소프로판올을 가하여 -70℃에서 1시간 이상 방치한 후, 13,000 rpm, 4℃에서 20분 동안 원심분리하였다. 그런 다음 상층액을 버리고, 수득한 펠렛에 250㎕의 70% 에탄올을 가하여 13,000rpm, 4℃에서 10분간 원심분리한 후, 상층액을 버리고 펠렛을 수득하여 형광이 표지된 PCR 산물을 얻었다.

실시예 4: 혼성화(교잡)반응

상기한 실시예 2에 따라 유리판에 부착된 남성불임 관련 DNA와 상기한 실시예 3에 따라 형광 표지된 시료 DNA를 교잡시켰다.

실시예 3에서 얻은 형광 표지된 펠렛 1.3㎕의 20x SSC 및 0.3㎕의 10%의 SDS를 가하여 혼합하고, 마이크로어레이를 이용하여 전기 남성불임 관련 DNA가 부착된 유리판에 점적한 후, 커버글라스를 덮어 교잡 카세트(hybridization caseete)에 넣은 다음, 65℃에서 1시간 동안 배양하여 유리판에 부착된 남성불임 관련 DNA와 형광표지된 시료 DNA를 교잡시켰다. 1시간 후, 교잡이 완료된 유리판을 2x SSC/0.2% SDS 용액에서 6분 동안 세척하고, 0.05x SSC에서 1분 동안 세척한 다음, 800rpm, 25℃에서 3분 동안 원심분리 하였다. 원심분리를 통해 건조된 유리판의 DNA를 DNA 칩용 스캐너(Axon, USA)로 스캐닝 하였다.

도 5는 본 발명에 따른 마이크로어레이를 이용하여 남성 정상인과 환자의 Y 염색체 미세결실을 분석한 마이크로어레이 사진이다. 여기에 도시된 바와 같이, SRY 유전자를 제외하고 정상인에서는 남성 불임과 관련된 7개 유전자 모두에서 형광표지가 나타났지만, 남성 불임 환자에 있어서 Y 염색체 미세결실이 있는 부분은 형광표지가 나타나지 않았고, 이 결과로 어떤 유전자의 미세결실이 있는지를 명확하고 분명하게 판별할 수 있다.

특히, 상기 실시예에 따른 결과에서는 도 5에서 알 수 있는 바와 같이 실험 대상인 남성 불임 환자의 경우 TTTY17, DAZ, BRY2 유전자에서 미세결실이 보였는데, 이는 도 2에서 가장 높은 미세결실을 보이는 3개의 유전자와 동일한 결과이다. 본 발명은 이러한 3개 유전자를 포함하여 Y 염색체의 AZFc 영역에 공통적으로 존재하는 7개 유전자를 선택한 것이고, 이에 따라 환자 gDNA로부터 표적 산물을 증폭시키는 경우 상기 AZFc 영역만을 증폭시키면 족하기 때문에 Y 염색체 상의 미세결실과 이를 통한 남성 불임 여부를 종래보다 현저히 간단하고 용이하게 판별할 수 있는 것이다.

한편, 상기에서 본 발명을 특정의 바람직한 실시 예에 관련하여 도식화하고 설명하였지만, 이하의 특허청구범위에 의해 마련되는 본 발명의 기술적 특징이나 분야를 이탈하지 않는 한도 내에서 본 발명이 다양하게 개조 및 변화될 수 있다는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게는 명백한 것이다.

본 발명에 따른 Y 염색체 미세결실 검출용 마이크로어레이 및 Y 염색체 미세결실 검출 방법은, STS 마커가 아닌 Y 염색체 상의 유전자를 대상으로 Y 염색체의 미세결실을 진단하므로, STS 마커를 사용하는데 따른 문제점, 즉 결실 부위를 제대로 판별하지 못하는 문제점 등을 해결할 수 있다.

또한, 본 발명은 Y 염색체의 AZFc 영역에 위치하는 유전자, 특히 TTTY5, TTTY6 및 TTTY17 유전자를 포함해서 프라이머에 의한 증폭과 형광물질의 표지 및 지지체에 대한 부착이 정확하고 용이한 유전자만을 선별한 것이기 때문에, 이전과 같이 환자 gDNA로부터 얻은 표적 산물이 잘 증폭되지 않거나 형광물질이 잘 표지되지 않거나 또는 프로브로 사용되는 일부 유전자가 지지체에 붙지 않는 문제점을 해결할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기한 바와 같이 프라이머에 의한 증폭과 형광물질의 표지 및 지지체에 대한 부착이 정확하고 용이한 8개 유전자만을 선별하여 제작한 마이크로어레이와 이를 이용한 검출방법이기 때문에, 표적 산물과의 혼성화 반응 효과가 우수할 뿐만 아니라, 다수의 유전자를 이용하는 종전의 기술보다 불임 남성 환자에게서 발생하는 특정 유전자의 미세 결실을 대량으로 간편하고 신속하게 판별할 수 있는 것이다.

<110> College of medicine, Pochon cha university <120> Detection Microarray For Y chromosomal Microdeletion and Detecting Method Using The Same <160> 16 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe 1 <400> 1 cgaactctgg cacctttcaa 20 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe 2 <400> 2 ctgatttcgc attctggga 19 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe 3 <400> 3 aggatctcgg aatctacaag gg 22 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe 4 <400> 4 gattgcagat ccacaggctt ac 22 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe 5 <400> 5 ctccattcat cctgagtctt gc 22 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe 6 <400> 6 ctcatgtgag ccttgatttt cc 22 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe 7 <400> 7 tagcaggata accacgtcca ct 22 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe 8 <400> 8 gtgagctgag attgtgcaaa ca 22 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe 9 <400> 9 actttccttt cttgtccctg ct 22 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe 10 <400> 10 ccattctcac ttcatttctg gc 22 <210> 11 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe 11 <400> 11 ggcgaaagct gacagcaag 19 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe 12 <400> 12 ccttagttct tgtgtcctga gca 23 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe 13 <400> 13 agcctacttc atctcaggac cc 22 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe 14 <400> 14 accagaatct ctgccagaaa ca 22 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe 15 <400> 15 aaatgcagta acctcggctt ta 22 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe 16 <400> 16 atgtatctgt gggcaaagtg ct 22

Claims

남성 불임 관련 유전자의 미세결실을 검출하기 위한 프로브(PROBES)를 포함하는 마이크로어레이에 있어서,

상기 프로브는 각각 Y 염색체의 AZFc 영역에 위치한

TTTY5 유전자 서열 중 서열번호 3 또는 4와 동일하거나 상기 서열번호 3 또는 4에 상보적인 염기서열,

TTTY6 유전자 서열 중 서열번호 5 또는 6과 동일하거나 상기 서열번호 5 또는 6에 상보적인 염기서열,

TTTY17 유전자 서열 중 서열번호 7 또는 8과 동일하거나 상기 서열번호 7 또는 8에 상보적인 염기서열,

BPY2 유전자 서열 중 서열번호 9 또는 10과 동일하거나 상기 서열번호 9 또는 10에 상보적인 염기서열,

CDY1 유전자 서열 중 서열번호 11 또는 12와 동일하거나 상기 서열번호 11 또는 12에 상보적인 염기서열,

PRY 유전자 서열 중 서열번호 13 또는 14와 동일하거나 상기 서열번호 13 또는 14에 상보적인 염기서열, 및

DAZ 유전자 서열 중 서열번호 15 또는 16과 동일하거나 상기 서열번호 15 또는 16에 상보적인 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 Y 염색체 미세결실 검출용 마이크로어레이.
제1항에 있어서, 상기 프로브는,

Y 염색체의 Yp 영역에 위치한 SRY 유전자 서열 중 서열번호 1 또는 2와 동일하거나 상기 서열번호 1 또는 2에 상보적인 염기서열을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 Y 염색체 미세결실 검출용 마이크로어레이.
삭제
제1항에 있어서, 상기 프로브는, 마이크로어레이 지지체의 서로 다른 스팟(spot)에 부착되는 것을 특징으로 하는 Y 염색체 미세결실 검출용 마이크로어레이.
삭제
삭제
삭제
Y 염색체의 AZFc 영역에 위치한

TTTY5 유전자 서열 중 서열번호 3 또는 4와 동일하거나 상기 서열번호 3 또는 4에 상보적인 염기서열,

TTTY6 유전자 서열 중 서열번호 5 또는 6과 동일하거나 상기 서열번호 5 또는 6에 상보적인 염기서열,

TTTY17 유전자 서열 중 서열번호 7 또는 8과 동일하거나 상기 서열번호 7 또는 8에 상보적인 염기서열,

BPY2 유전자 서열 중 서열번호 9 또는 10과 동일하거나 상기 서열번호 9 또는 10에 상보적인 염기서열,

CDY1 유전자 서열 중 서열번호 11 또는 12와 동일하거나 상기 서열번호 11 또는 12에 상보적인 염기서열,

PRY 유전자 서열 중 서열번호 13 또는 14와 동일하거나 상기 서열번호 13 또는 14에 상보적인 염기서열,

DAZ 유전자 서열 중 서열번호 15 또는 16과 동일하거나 상기 서열번호 15 또는 16에 상보적인 염기서열, 및

SRY 유전자 서열 중 서열번호 1 또는 2와 동일하거나 상기 서열번호 1 또는 2에 상보적인 염기서열을 각각 포함하는 프로브를 마이크로어레이의 지지체에 고정화하는 단계; 및,

상기 고정화된 올리고뉴클레오티드와 남성으로부터 분리한 gDNA 시료를 혼성화(hybridization)시킨 뒤, 상기 혼성화 여부를 판별하는 단계;를 포함하는 Y 염색체 미세결실 검출방법.
제8항에 있어서, 상기 남성으로부터 분리한 gDNA는 남성 불임 환자의 혈액으로부터 분리된 것을 특징으로 하는 Y 염색체 미세결실 검출방법.
제8항에 있어서, 상기 마이크로어레이의 지지체에 고정화된 올리고뉴클레오티드와 상기 gDNA 시료 중 하나 이상에는 형광물질이 표지된 것을 특징으로 하는 Y 염색체 미세결실 검출방법.
제10항에 있어서, 상기 혼성화 여부를 판별하는 단계는,

남성 환자의 혈액에서 채취한 gDNA 시료에, 서열번호 3과 4; 서열번호 5와 6; 서열번호 7과 8;서열번호 9와 10; 서열번호 11과 12; 서열번호 13과 14; 및, 서열번호 15와 16의 염기서열을 가지는 프라이머쌍을 가하여 상기 시료를 증폭시키는 단계;

상기 증폭된 시료를 상기 마이크로어레이의 지지체에 고정화된 프로브와 혼성화시키는 단계;

상기 혼성화시킨 마이크로어레이를 세척하여 혼성화되지 않은 시료를 제거하는 단계; 및,

상기 시료를 제거한 마이크로어레이 상의 형광을 판독하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 Y 염색체 미세결실 검출방법.