KR100443384B1 - 남성불임 진단키트 및 그를 이용하여 남성불임 관련디엔에이의 결실을 분석하는 방법 - Google Patents
남성불임 진단키트 및 그를 이용하여 남성불임 관련디엔에이의 결실을 분석하는 방법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR100443384B1 KR100443384B1 KR10-2002-0002636A KR20020002636A KR100443384B1 KR 100443384 B1 KR100443384 B1 KR 100443384B1 KR 20020002636 A KR20020002636 A KR 20020002636A KR 100443384 B1 KR100443384 B1 KR 100443384B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- male infertility
- dna
- diagnostic kit
- dutp
- related dna
- Prior art date
Links
- 208000007466 Male Infertility Diseases 0.000 title claims abstract description 138
- 238000012217 deletion Methods 0.000 title claims abstract description 44
- 230000037430 deletion Effects 0.000 title claims abstract description 44
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 34
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 title claims description 34
- 206010021929 Infertility male Diseases 0.000 title description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 75
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 29
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims abstract description 28
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 26
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 26
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims abstract description 25
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 19
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 claims abstract description 18
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 16
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims abstract description 14
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims abstract description 14
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims abstract description 14
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims description 24
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims description 18
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 13
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 11
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 10
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 8
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 claims description 7
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 claims description 7
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 claims description 7
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 claims description 7
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 claims description 6
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 claims description 6
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 6
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 5
- 238000012921 fluorescence analysis Methods 0.000 claims description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 5
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 claims description 5
- QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-L (5-bromo-4-chloro-1h-indol-3-yl) phosphate Chemical compound C1=C(Br)C(Cl)=C2C(OP([O-])(=O)[O-])=CNC2=C1 QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 4-Nitrophenyl Phosphate Chemical compound OP(O)(=O)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 4
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims description 4
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 claims description 4
- 210000004209 hair Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 4
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 claims description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 claims description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 3
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 claims description 3
- JRBJSXQPQWSCCF-UHFFFAOYSA-N 3,3'-Dimethoxybenzidine Chemical compound C1=C(N)C(OC)=CC(C=2C=C(OC)C(N)=CC=2)=C1 JRBJSXQPQWSCCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- HSTOKWSFWGCZMH-UHFFFAOYSA-N 3,3'-diaminobenzidine Chemical compound C1=C(N)C(N)=CC=C1C1=CC=C(N)C(N)=C1 HSTOKWSFWGCZMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- NGRLGBBJGNXVML-UHFFFAOYSA-N 4-(4-amino-3,5-dimethylphenyl)-2,6-dimethylaniline Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1.CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 NGRLGBBJGNXVML-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- WUBBRNOQWQTFEX-UHFFFAOYSA-N 4-aminosalicylic acid Chemical compound NC1=CC=C(C(O)=O)C(O)=C1 WUBBRNOQWQTFEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-L 4-nitrophenyl phosphate(2-) Chemical group [O-][N+](=O)C1=CC=C(OP([O-])([O-])=O)C=C1 XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 2
- SHTFMUPUBYXPCD-UHFFFAOYSA-N [3-[(4-chloro-2-methylphenyl)carbamoyl]naphthalen-2-yl] dihydrogen phosphate Chemical compound CC1=CC(Cl)=CC=C1NC(=O)C1=CC2=CC=CC=C2C=C1OP(O)(O)=O SHTFMUPUBYXPCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 claims description 2
- 229960004909 aminosalicylic acid Drugs 0.000 claims description 2
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 2
- 150000004986 phenylenediamines Chemical group 0.000 claims description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims 13
- CDZLPCWIYPBGMN-UHFFFAOYSA-N 4-chloronaphthalen-1-ol Chemical compound ClC1=CC=C(C2=CC=CC=C12)O.ClC1=CC=C(C2=CC=CC=C12)O CDZLPCWIYPBGMN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 claims 1
- AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N Deoxyuridine 5'-triphosphate Chemical compound O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N 0.000 claims 1
- SGYWVVRZQIRWFG-UHFFFAOYSA-N NC=1C=CC=2N(C3=CC=CC=C3C2C1)CC.NC=1C=CC=2N(C3=CC=CC=C3C2C1)CC Chemical compound NC=1C=CC=2N(C3=CC=CC=C3C2C1)CC.NC=1C=CC=2N(C3=CC=CC=C3C2C1)CC SGYWVVRZQIRWFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims 1
- LCCNCVORNKJIRZ-UHFFFAOYSA-N parathion Chemical compound CCOP(=S)(OCC)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 LCCNCVORNKJIRZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 abstract description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 4
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 abstract description 3
- 208000000509 infertility Diseases 0.000 abstract 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 abstract 1
- 231100000535 infertility Toxicity 0.000 abstract 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 6
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Chemical compound CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 210000002593 Y chromosome Anatomy 0.000 description 5
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 5
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- HMUNWXXNJPVALC-UHFFFAOYSA-N 1-[4-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]piperazin-1-yl]-2-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)ethanone Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)N1CCN(CC1)C(CN1CC2=C(CC1)NN=N2)=O HMUNWXXNJPVALC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- VZSRBBMJRBPUNF-UHFFFAOYSA-N 2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)-N-[3-oxo-3-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)propyl]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)C(=O)NCCC(N1CC2=C(CC1)NN=N2)=O VZSRBBMJRBPUNF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- LDXJRKWFNNFDSA-UHFFFAOYSA-N 2-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)-1-[4-[2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidin-5-yl]piperazin-1-yl]ethanone Chemical compound C1CN(CC2=NNN=C21)CC(=O)N3CCN(CC3)C4=CN=C(N=C4)NCC5=CC(=CC=C5)OC(F)(F)F LDXJRKWFNNFDSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 4
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 4
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 230000000469 anti-sperm effect Effects 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 3
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 230000002381 testicular Effects 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 241000593245 Bionia Species 0.000 description 2
- 208000031639 Chromosome Deletion Diseases 0.000 description 2
- 101000915402 Homo sapiens Deleted in azoospermia protein 1 Proteins 0.000 description 2
- NIPNSKYNPDTRPC-UHFFFAOYSA-N N-[2-oxo-2-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)ethyl]-2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound O=C(CNC(=O)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F)N1CC2=C(CC1)NN=N2 NIPNSKYNPDTRPC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AFCARXCZXQIEQB-UHFFFAOYSA-N N-[3-oxo-3-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)propyl]-2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound O=C(CCNC(=O)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F)N1CC2=C(CC1)NN=N2 AFCARXCZXQIEQB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 206010003883 azoospermia Diseases 0.000 description 2
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 2
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 2
- 102000055460 human DAZ1 Human genes 0.000 description 2
- 210000001182 human Y chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 2
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 2
- OHVLMTFVQDZYHP-UHFFFAOYSA-N 1-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)-2-[4-[2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidin-5-yl]piperazin-1-yl]ethanone Chemical compound N1N=NC=2CN(CCC=21)C(CN1CCN(CC1)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F)=O OHVLMTFVQDZYHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MCTWTZJPVLRJOU-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-1H-imidazole Chemical compound CN1C=CN=C1 MCTWTZJPVLRJOU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PFCXGATXIMYSDD-UHFFFAOYSA-N 1-methylpyrrolidin-2-one pyrrolidine Chemical compound N1CCCC1.CN1C(CCC1)=O PFCXGATXIMYSDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FALRKNHUBBKYCC-UHFFFAOYSA-N 2-(chloromethyl)pyridine-3-carbonitrile Chemical compound ClCC1=NC=CC=C1C#N FALRKNHUBBKYCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WZFUQSJFWNHZHM-UHFFFAOYSA-N 2-[4-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]piperazin-1-yl]-1-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)ethanone Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)N1CCN(CC1)CC(=O)N1CC2=C(CC1)NN=N2 WZFUQSJFWNHZHM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- LVSPDZAGCBEQAV-UHFFFAOYSA-N 4-chloronaphthalen-1-ol Chemical compound C1=CC=C2C(O)=CC=C(Cl)C2=C1 LVSPDZAGCBEQAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OXEUETBFKVCRNP-UHFFFAOYSA-N 9-ethyl-3-carbazolamine Chemical compound NC1=CC=C2N(CC)C3=CC=CC=C3C2=C1 OXEUETBFKVCRNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710159080 Aconitate hydratase A Proteins 0.000 description 1
- 101710159078 Aconitate hydratase B Proteins 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710105008 RNA-binding protein Proteins 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 229910021538 borax Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012468 concentrated sample Substances 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 239000006059 cover glass Substances 0.000 description 1
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 1
- 230000002559 cytogenic effect Effects 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 230000035558 fertility Effects 0.000 description 1
- 210000003917 human chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 230000009027 insemination Effects 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 208000008634 oligospermia Diseases 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 210000003765 sex chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 235000010339 sodium tetraborate Nutrition 0.000 description 1
- 230000000920 spermatogeneic effect Effects 0.000 description 1
- 230000021595 spermatogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 description 1
- 229940014800 succinic anhydride Drugs 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 1
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 1
- BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N trisodium borate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]B([O-])[O-] BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
- A61B5/00—Measuring for diagnostic purposes; Identification of persons
- A61B5/0059—Measuring for diagnostic purposes; Identification of persons using light, e.g. diagnosis by transillumination, diascopy, fluorescence
- A61B5/0071—Measuring for diagnostic purposes; Identification of persons using light, e.g. diagnosis by transillumination, diascopy, fluorescence by measuring fluorescence emission
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/906—Fertility tests
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Hematology (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Medical Informatics (AREA)
- Surgery (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
본 발명은 남성불임 관련 DNA를 검출(detection)하기 위한 탐침 또는 남성불임 관련 DNA를 부착시킨 고상 지지체, PCR 혼합물과 세척용 완충용액을 포함하는 남성불임 진단키트 및 전기 남성불임 진단키트를 이용하여 남성불임 관련 DNA의 결실을 분석하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 의하면, 고상 지지체에 탐침 또는 남성불임 관련 DNA를 부착시키고, 바이오틴이 결합되거나 또는 형광물질로 표지된 시료 DNA를 전기 고상 지지체에 부착된 DNA와 반응시킨 다음, 전기 바이오틴과 반응하는 효소 및 전기 효소의 기질을 가하고 효소활성을 측정하거나 또는 형광물질의 형광을 측정함으로써, 대량의 시료를 정확하고 신속하게 분석할 수 있다.
Description
본 발명은 남성불임 진단키트 및 그를 이용하여 남성불임 관련 DNA의 결실을 분석하는 방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 남성불임 관련 DNA를 검출(detection)하기 위한 탐침 또는 남성불임 관련 DNA를 부착시킨 고상 지지체,PCR 혼합물과 세척용 완충용액을 포함하는 남성불임 진단키트 및 전기 남성불임 진단키트를 이용하여 남성불임 관련 DNA의 결실을 분석하는 방법에 관한 것이다.
일반적으로, 남성불임의 진단은 일차적으로 비뇨기과적 진찰이나 정액검사로 이루어지며, 그 결과 남성불임으로 진단받은 경우에는 정밀검사를 통한 진단이 행해진다. 남성불임의 정밀 진단방법으로는 고환조직의 생검방법, 항-정자 항체 검사방법, 혈액 내 호르몬 검사방법 및 염색체 검사방법이 있다. 첫번째, 고환조직의 생검방법은 정자감소증(oligozoospermia), 정자사멸증, 무정자증(azoospermia) 등과 같은 심한 이상이 발견된 경우, 고환조직의 일부를 채취하여 직접 검사하는 방법으로, 정액 내에 정자가 없다고 하더라도 정자의 제조원인 고환의 기능이 정상적이라면, 높은 성공률로 치료할 수 있다. 두번째, 항-정자 항체 검사방법은 말 그대로 정자에 대한 항체의 존재유무를 분석하는 방법이다. 정자에 대한 항체는 자연스럽게 생기기도 하지만, 일반적으로 염증이나 외상 후 또는 피임을 목적으로 정관수술을 했다가 복원한 경우에 많이 관찰된다. 검사 결과 정자 표면에서 항-정자 항체가 높은 수치로 관찰될 경우에는 인공 수정법으로도 수정이 어려우며, 시험관 아기를 실시한다 하더라도 수정에 실패할 확률이 높으므로 특수 처리가 필요하다. 세번째, 혈액 내 호르몬 검사방법은 남성 호르몬의 체내 수치를 검사하는 방법으로, 남성의 정자는 체내 남성호르몬이 일정 수치 이상으로 유지되어야만 정상적으로 생산된다는 사실에 근거한다. 네번째, 염색체 검사방법은 남성의 염색체 중에서도 특히 성염색체의 이상을 집중적으로 검사하는 방법이다. 이 외에도, 정자의 DNA를 검사하는 방법 또는 사람 난자를 대신한 햄스터 난자를 이용한 정자의수정능력검사 등이 있으며, 전기 방법들 중에서 현재 가장 일반적으로 이용되고 있는 것은 염색체 검사 방법이다.
한편, 남성 불임은 Y 염색체의 오른쪽 긴 부분에 위치한 AZF(Azoospermic factor) 부위와 관련되어 있음이 티에폴로와 주파디에 의해 알려졌고(Tiepolo, L. and Zuffardi, O., Location of factors controlling spermatogenesis in the nonfluorescent portion of the human Y chromosome long arm,Human Genet.,1976, 34, 119-124), AZF 부위는 세 부분으로 구분할 수 있으며(Vogt, P.H., Edelmann, A., Hirschmann, P., Shan, Z., Tenscher, S., Urbitsch, P., The Y chromosome and in fertility in the male, Abstracts of the 12th Annual Meeting of the EHSRE, 1996, 32), 이 세 부분에서의 결실이 무정자증 또는 심각한 정자감소증과 관련되어 있다는 사실이 밝혀졌다(Vogt, P.H., Human chromosome deletions in Yq11, AZF candidate genes and male infertility: history and update,Molecular Human Reproduction, 1998, 4, 739-744). 또한, AZF 부위 내 결실과 관련하여 DAZ(Deleted in AZoospermia)가 발견되었고(Reijo, R., Lee, T.Y,, Salo, P., Alagappan, R., Brown, L.G., Rosenberg, M., Rozen, S., Jaffe, T., Straus, D., Hovatta, O., Chapella, A., Silber, S., Page, D.C., Diverse spermatogenic defects in human caused by Y chromosome deletions encompassing a novel RNA-binding protein gene,Nat Genet.,1995, 10, 383-393), 현재에도 계속해서 남성불임과 관련된 DNA 부위나 유전자들을 구별하고 분리하고 있는 추세이다(Lahn, B.T. and Page, D.C., Functional coherence of the human Y chromosome,Science,1987, 278, 675-680 and Vogt, P.H., Affara, N., Davey, P., Hammer, M., Jobling, M.A., Lau, Y-F. C., Mitchell, M., Schempp, W., Tyler-Smith, C., Williams, G., Yen, P. and Rappold, G.A., Report on the third international workshop on Y chromosome mappong,Cytogenetics & Cell Genetics,1997,79, 1-20).
상술하였듯이, 현재 남성불임을 진단하는 방법으로 가장 일반적으로 이용되고 있는 방법은 염색체 검사방법으로, 이를 위해서도 여러가지 기계, 다양한 방법들이 이용될 수 있으나, PCR을 이용하는 방법으로 Y 염색체상의 AZF 부위 내 결실을 분석하는 것이 비교적 간편하고 과정이 용이하기 때문에 보편적으로 이용되고 있다. 그러나, 종래의 분자 생물학적 PCR을 이용하는 방법은 정확성이 떨어지고, 분석 시간이 길어지는 등의 여러가지 기술적 문제와 대량 분석의 한계를 가지고 있다.
따라서, 종래의 분자 생물학적 PCR을 이용하는 방법이 가지고 있는 문제점을 해결하고, 대량의 시료를 정확하고 신속하게 분석할 수 있는 새로운 남성불임 관련 DNA의 결실을 분석하는 방법을 개발하여야 할 필요성이 끊임없이 대두되었다.
이에, 본 발명자들은 종래의 분자 생물학적 PCR을 이용하는 방법이 가지고 있는 문제점을 해결할 수 있는 새로운 남성불임 관련 DNA의 결실을 분석하는 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 고상 지지체에 탐침 또는 남성불임 관련 DNA를부착시키고, 바이오틴이 결합되거나 또는 형광물질로 표지된 시료 DNA를 전기 고상 지지체에 부착된 DNA와 반응시킨 다음, 전기 바이오틴과 반응하는 효소 및 전기 효소의 기질을 가하고 효소활성을 측정하거나 또는 형광물질의 형광을 측정함으로써, 대량의 시료를 정확하고 신속하게 분석할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
결국, 본 발명의 주된 목적은 남성불임 진단키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 전기 남성불임 진단키트를 이용하여 남성불임 관련 DNA의 결실을 분석하는 방법을 제공하는 것이다.
도 1은 부가의 프라이머를 이용하여 시료의 남성불임 관련 DNA의 결실을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2는 형광표지된 시료 DNA를 이용하여 시료의 남성불임 관련 DNA의 결실을 분석한 결과를 나타내는 사진이다.
도 3은 형광표지된 남성불임 관련 DNA를 이용하여 시료의 남성불임 관련 DNA 중 SPGY1의 결실을 분석한 결과를 나타내는 사진이다.
본 발명은 (i) 남성불임 관련 DNA를 증폭하기 위한 프라이머의 염기서열을 포함하는 탐침을 부착시킨 고상 지지체; (ii) 남성불임 관련 DNA를 증폭하기 위한 프라이머, dNTP, DNA 중합효소 및 완충용액으로 구성된 PCR 혼합물; (iii) 전기 프라이머가 주형 DNA에 결합하는 부위보다 3'-말단쪽에 위치하는 15개 내지 30개의 염기로 구성되고, 5'-말단에 바이오틴이 결합되어 있는 부가의 프라이머; (iv) 표지효소가 결합된 스트랩트아비딘 및 전기 표지효소의 기질; 및, (v) PCR 후의 세척용 완충용액 및 표지효소 반응 후의 세척용 완충용액을 포함하는 남성불임 진단키트 및 (i) 시료 DNA를 전기 남성불임 진단키트의 고상 지지체에 PCR 혼합물과 함께 가하여 첫번째 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하고, 곧바로 부가의 프라이머를 가하여 두번째 PCR을 수행한 다음, 지지체를 PCR 후의 세척용 완충용액으로 세척하는 단계; (ii) 전기 세척한 지지체에 표지효소가 결합된 스트랩트아비딘을 가하여 부가의 프라이머에 결합되어 있는 바이오틴과 결합시키고, 전기 표지효소의 기질을 가하여 반응시킨 다음, 표지효소 반응 후의 세척용 완충용액으로 세척하고, 표지효소의 활성을 측정하여, 남성불임 관련 DNA의 결실을 분석하는 단계를 포함하는 전기 남성불임 진단 키트를 이용하여 남성불임 관련 DNA의 결실을 분석하는 방법을 제공한다: 이때, 고상 지지체는 플라스틱으로 제조될 수 있고, 스트랩트아비딘에 결합된 표지효소는 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase) 또는 페록시다아제(peroxidase)일 수 있으며, 표지효소의 활성은 발색 또는 흡광으로 측정할 수 있다. 표지효소가 알칼라인 포스파타아제일때, 기질은 p-니트로페닐 포스페이트(p-nitrophenylphosphate, pNPP), 5-브로모-4-클로로-3-인돌일포스페이트(5-bromo-4-chloro-3-indolylphosphate) 또는 나프톨 AS-TR 포스페이트(naphthol AS-TR phosphate)일 수 있고, 표지효소가 페록시다아제일때, 기질은 페닐렌다이아민 (phenylenediamine), 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(3,3',5,5'-tetramethylbenzi dine), 다이아니시딘(dianisidine), 아미노살리실릭 산(aminosalicylic acid), 3,3'-다이아미노벤지딘(3,3'-diaminobenzidine), 3-아미노-9-에틸카바졸(3-amino-9-ethylcarbazole) 또는 4-클로로-1-나프톨(4-chloro-1-naphthol)일 수 있다. 분석되는 시료 DNA는 혈액, 정액 또는 모근세포에서 추출될 수 있다. 전기 남성불임 진단키트 및 그를 이용하여 남성불임 관련 DNA의 결실을 분석하는 방법에 있어서, 부가의 프라이머는 첫번째 PCR을 통해 증폭된 DNA를 부분적으로 재증폭하는 기능및 첫번째 PCR을 통해 증폭된 DNA가 실제적으로 남성불임 관련 DNA인지를 결정하는 기능을 담당하여, 결과의 정확성을 높이는 역할을 한다.
또한, 본 발명은 (i) 남성불임 관련 DNA를 부착시킨 고상 지지체; (ii) 남성불임 관련 DNA를 증폭하기 위한 프라이머, dNTP, 형광물질이 결합된 dNTP, DNA 중합효소 및 완충용액으로 구성된 PCR 혼합물; (iii) 교잡반응 후의 세척용 완충용액을 포함하는 남성불임 진단키트 및 (i) 시료 DNA를 전기 남성불임 진단키트의 PCR 혼합물과 혼합하고, PCR을 수행함으로써, 시료 DNA를 형광표지하는 단계; (ii) 전기 형광표지된 시료 DNA를 전기 남성불임 진단키트의 고상 지지체에 가하여 교잡시키고, 교잡반응 후의 세척용 완충용액으로 세척한 후, 형광분석하여, 남성불임 관련 DNA의 결실을 분석하는 단계를 포함하는 전기 남성불임 진단키트를 이용하여 남성불임 관련 DNA의 결실을 분석하는 방법을 제공한다: 이때, 고상 지지체는 유리로 제조될 수 있고, 형광물질이 결합된 dNTP는 아미노다이곡시제니-9-dNTP(aminodigoxigenie-9-dNTP), 쿠마린-5-dUTP (coumarin-5-dUPT), 시아닌-3-dNTP(cyanine-3-dNTP), 시아닌-5-dNTP(cyanine-5-dNTP, Cy5-dNTP), DNP-dNTP, 플루오레신 클로로트리아지닐-4-dUTP(fluorescein chlorotriazinyl-4- dUTP), 플루오레신-dUTP(fluorescein-dUTP), 리사민-dUTP (lissamine-dUTP), 나프토플루오레신-dUTP(napthofluorescein-dUTP), 피렌-dUTP (pyrene-dUTP), 테트라메틸로다민-6-dUTP (tetramethylrhodamine-6-dUTP) 또는 텍사스 레드-dUTP(texas red-dUTP)일 수 있으며, 분석되는 시료 DNA는 혈액, 정액 또는 모근세포에서 추출될 수 있다. 전기 남성불임 진단키트 및 그를 이용하여 남성불임 관련 DNA의 결실을 분석하는 방법을 응용하여, 고상 지지체에 남성불임 관련 DNA 대신 시료 DNA를 부착시키고, 시료 DNA 대신 남성불임 관련 DNA를 형광표지한 후, 고상 지지체에 부착된 시료 DNA와 형광표지된 남성불임 관련 DNA를 교잡시키고, 형광분석함으로써, 남성불임 관련 DNA의 결실을 분석하는 것도 가능하다.
구체적으로, 본 발명은 (i) 탐침(서열번호 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 및 36)을 부착시킨 마이크로플레이트; (ii) 남성불임 관련 DNA를 증폭하기 위한 프라이머(서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 및 18), dNTP, Taq 중합효소 및 완충용액으로 구성된 PCR 혼합물; (iii) 5'-말단에 바이오틴이 결합되어 있는 부가의 프라이머(서열번호 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 및 27); (iv) 알칼라인 포스파타아제가 결합된 스트랩트아비딘 및 전기 표지효소의 기질인 pNPP; (v) PCR 후의 세척용 완충용액 0.5x SSC/0.1% Tween 20 및 표지효소 반응 후의 세척용 완충용액 150mM NaCl/0.1% Tween 20/100mM Tris-HCl(pH 7.5)을 포함하는 남성불임 진단키트와 (i) 남성불임 관련 DNA인 SPGY1, SY127, SY158, SY254, SY255, MK5 및 SRY를 부착시킨 유리판; (ii) 남성불임 관련 DNA를 증폭하기 위한 프라이머(서열번호 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47 및 48), dNTP, Cy5-dCTP, Taq 중합효소 및 완충용액을 포함하는 PCR 혼합물; 및, (iii) 교잡반응 후의 세척용 완충용액 2x SSC/0.2% SDS 및 0.5x SSC를 포함하는 남성불임 진단키트를 제공한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 부가의 프라이머를 이용하여 남성불임 관련 DNA의 결실을 분석하는 방법
실시예 1-1: 프라이머와 탐침의 제작 및 탐침의 부착
남성불임 관련 DNA를 증폭하기 위한 프라이머와 부가의 프라이머 및 전기 DNA를 검출하기 위한 탐침을 제작하고, 고상 지지체에 부착시켰다: 남성불임 관련 DNA를 증폭하기 위한 프라이머 a 및 b; 전기 프라이머 a 또는 b가 주형 DNA에 결합하는 부위보다 3'-말단쪽에 위치하는 15개 내지 30개의 염기로 구성되고, 5'-말단에 바이오틴이 결합되어 있는 부가의 프라이머 c; 및, 전기 프라이머 a 또는 b의 염기서열을 포함하는 탐침을 제작하였다. 전기 탐침은 PCR 효율을 높이기 위하여, 5'-말단에 포스페이트가 결합된 스페이서(spacer, 예를 들면, 폴리-d(T))를 추가로 포함할 수 있다. 탐침간의 자발적인 결합을 저해하기 위하여, 전기 제작한 탐침을 90℃ 내지 100℃에서 5내지 10분, 바람직하게는 94℃에서 10분간 가열하고, 곧바로 얼음에서 10분간 냉각시켰다. 냉각 후, 짧게 원심분리하여 탐침을 응집시키고, 냉각된 1-메틸이미다졸(1-methylimidazole, pH 7.0)과 1-에틸-3-(3-다이메틸아미노프로필)-카보다이이미드(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide(EDC))를 최종농도 10mM이 되도록 가하여 혼합하였다. 전기 혼합액을 고상 지지체로 선택된 PCR용 뉴클레오링크(NucleoLink) 96웰 마이크로플레이트(Nunc, 덴마크)에 웰당 100㎕씩 주입하고, 증발되지 않도록 테잎 등으로 처리한 다음, 40℃ 내지 60℃에서 5 내지 9시간, 바람직하게는 50℃에서 7시간 동안 배양하여, 탐침을 마이크로플레이트에 부착시켰다.
배양 후, 마이크로플레이트에 부착되지 않은 탐침을 제거하기 위하여, 마이크로플레이트의 각 웰을 세척하였다: 마이크로플레이트의 웰로부터 전기 혼합액을 제거하고, 각 웰을 200㎕의 0.4N NaOH/0.25% Tween 20 용액으로 상온에서 3번 세척한 다음, 동일 부피의 동일 용액에서 10분간 상온배양하고, 각 웰을 200㎕의 동일 용액과 증류수로 상온에서 각각 3번씩 세척하였다. 이어, 200㎕의 증류수를 가하여 5분간 상온배양하고 3번씩 세척하는 과정을 3회 반복하였다.
실시예 1-2: PCR 및 탐침과 교잡되지 않은 산물의 제거
전기 실시예 1-1에서 제작한 마이크로플레이트에 시료 DNA를 가하고, PCR을 수행하였다: 먼저, 시료 DNA(100ng/㎕) 0.5㎕ 내지 2㎕, 바람직하게는 1㎕, 프라이머 a(100pmol/㎕) 0.1㎕ 내지 2㎕, 바람직하게는 0.5㎕, 프라이머 b(100pmol/㎕) 0.1㎕ 내지 2㎕, 바람직하게는 0.5㎕, dNTP-Mix(10mM) 0.5㎕ 내지 2㎕, 바람직하게는 1㎕, 10 ×Taq 완충용액 3㎕ 내지 6㎕, 바람직하게는 5㎕, Taq 중합효소(1 내지5unit/㎕) 0.5㎕ 내지 2㎕, 바람직하게는 1㎕ 및 증류수의 조성으로 PCR 혼합액을 제조하고, 전기 PCR 혼합액을 온도순환기(thermo cycler)에서 94℃에서 5분간 처리하고, 94℃에서 30초, 58℃에서 30초, 72℃에서 30초의 순환을 30번 반복하여, 첫 번째 PCR을 수행하였다.
전기 첫 번째 PCR이 완료되면, 0.5㎕ 내지 2㎕, 바람직하게는 1㎕의 프라이머 c(100pmol/㎕)만을 새로이 가하고, 전기 조건과 동일한 온도순환 조건에서 두 번째 PCR을 수행한 다음, 각 웰을 200㎕의 0.5x SSC/0.1% Tween 20 용액으로 3번 세척하고, 200㎕의 동일 용액을 가하여 60℃에서 15분간 배양한 후, 200㎕의 동일 용액으로 3번 세척하였다.
실시예 1-3: PCR 결과의 확인
표지효소가 결합된 스트랩트아비딘 및 전기 표지효소의 기질을 가하여 효소 활성에 의한 발색으로써, 전기 실시예 1-2의 PCR 결과를 확인하였다: 150mM NaCl/100mM Tris-HCl(pH 7.5) 용액으로 희석한 스트랩트아비딘-알칼라인 포스파타아제 용액을 PCR이 완료된 마이크로플레이트의 각 웰에 100㎕씩 가하여 35℃ 내지 45℃, 바람직하게는 40℃에서 30분 내지 90분, 바람직하게는 60분 동안 배양하고, 200㎕의 150mM NaCl/0.1% Tween 20/100mM Tris-HCl(pH 7.5) 용액을 가하여 60℃에서 5분 내지 15분, 바람직하게는 10분 동안 방치한 다음, 동일 용액으로 3번 세척하였다. 세척한 각 웰에 알칼라인 포스파타아제의 기질인 pNPP(p-nitrophenylphosphate) 용액(Sigma, USA)을 100㎕씩 가하여 60분 내지 120분, 바람직하게는 90분 동안 상온배양하고, 1N NaOH를 가하여 효소-기질 반응을 중지시킨 다음, 효소 활성에 의한 발색을 ELISA 리더(ELISA reader)를 이용하여 405nm에서의 흡광도로 측정하였다.
실시예 2: 시료의 남성불임 관련 DNA 내 결실의 분석
남성불임과 관련된 AZF 부위 내에 존재하는 SY147, SY152, SY158, SY254, SY269, SPGY1, SRY, SY84 및 SY86을 이용하여, 전기 실시예 1과 동일한 방법으로 시료의 남성불임 관련 DNA의 결실을 분석하였다.
남성불임 관련 DNA를 증폭하기 위한 프라이머로서, 5'-AGCTTCTCTTTCTCGTTTGAT-3: SY147a(서열번호 1), 5'-CAGATGTAATTCCAATGTGCAG-3': SY147b(서열번호 2), 5'-AAGACAGTCTGCCATGTTTC-3': SY152a(서열번호 3), 5'-AGGAGGGTACTTAGCAGTAA-3': SY152b(서열번호 4), 5'-AGTTCCATGTGTGATGAAAGA-3': SY158a(서열번호 5), 5'-TTTACAGTGGTTTGTAGCGG-3': SY158b(서열버호 6), 5'-ACCAGAAGGCAAAATCGT-3': SY254a(서열번호 7), 5'-AACCGTATCTACCAAAGCAG-3': SY254b(서열번호 8), 5'-GACAAGTGTTCCTTGGAGAT-3': SY269a(서열번호 9), 5'-TGCATTGGCATGAATGTGTA-3': SY269b(서열번호 10), 5'-ACAGCCATTAAGTTTAGCAT-3': SPGY1a(서열번호 11), 5'-TGATAGTCTGAACACAAGCA-3': SPGY1b(서열번호 12), 5'-CATGAACGCATTCATCGTGTG-3': SRYa(서열번호 13), 5'-GGTCGATACTTATAATTCGGG-3':SRYb(서열번호 14), 5'-CAAAGAGAAGGGTCTGAAAG-3': SY84a(서열번호 15), 5'-GGCTTCATCAGCAAGACAAA-3': SY84b(서열번호 16), 5'-ACACACAGACTATGCTTCAG-3': SY86a(서열번호 17) 및, 5'-AGACACACACAGAGGGACAA-3': SY86b(서열번호 18)를 제작하였다(바이오니아, 한국).
부가의 프라이머로서, 5'-말단에 바이오틴이 결합된 5'-TGGAATATCAGCCAAGATGT-3': SY147c(서열번호 19), 5'-CTTAGCAGTAACNTTTCTGC-3': SY152c(서열번호 20), 5'-AGTGAGTTGATTAGCAGAATG-3': SY158c(서열번호 21), 5'-TCAGTTTCATCCATCTATGGA-3', SY254c(서열번호 22), 5'-TGTATTCATGGTCTTCTCGA-3': SY269c(서열번호 23), 5'-ACTTCTCCAAGAAGTACCTG-3': SPGY1c(서열번호 24), 5'-TATTTCTCTCTGTGCATGGC-3': SRYc(서열번호 25), 5'-CCTTTTGAAAGGAGTTAGCC-3': SY84c(서열번호 26) 및, 5'-GAGAAGACAGCATCTACAAC-3': SY86c(서열번호 27)를 제작하였다(바이오니아, 한국).
마이크로플레이트에 부착시키기 위한 탐침으로서, 5'-말단에 포스페이트가 결합된 스페이서를 포함하는 5'-TTTTTTTTTTTTTTTAGCTTCTCTTTCTCGTTTGAT-3': SY147p(서열번호 28),
5'-TTTTTTTTTTTTTTTAAGACAGTCTGCCATGTTTC-3': SY152p(서열번호 29),
5'-TTTTTTTTTTTTTTTAGTTCCATGTGTGATGAAAGA-3': SY158p(서열번호 30),
5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTACCAGAAGGCAAAATCGT-3': SY254p(서열번호 31),
5'-TTTTTTTTTTTTTTTGACAAGTGTTCCTTGGAGAT-3': SY269p(서열번호 32),
5'-TTTTTTTTTTTTTTTTACAGCCATTAAGTTTAGCAT-3': SPGY1p(서열번호 33),
5'-TTTTTTTTTTTTTTTCATGAACGCATTCATCGTGTG-3': SRYp(서열번호 34),
5'-TTTTTTTTTTTTTTTCAAAGAGAAGGGTCTGAAAG-3': SY84p 및(서열번호 35),
5'-TTTTTTTTTTTTTTTACACACAGACTATGCTTCAG-3': SY86p(서열번호 36)를 제작하였다(바이오니아, 한국).
전기 SY147p, SY152p, SY158p, SY254p, SY269p, SPGY1p, SRYp, SY84p 및 SY86p을 전기 실시예 1-1과 동일한 방법으로 마이크로플레이트의 각 웰에 부착시키고, 각각에 해당하는 전기 프라이머 a, b 및 c를 이용하여 전기 실시예 1-2와 동일한 방법으로 두 번의 PCR을 수행한 다음, 전기 실시예 1-3과 동일한 방법으로 PCR 결과를 확인하였다. 도 1은 부가의 프라이머를 이용하여 시료의 남성불임 관련 DNA의 결실을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 1에서 (-)는 PCR시 시료를 가하지 않은 음성대조군, (1)은 SY147, (2)는 SY152, (3)은 SY158, (4)는 SY254, (5)는 SY269, (6)은 SPGY1, (7)은 SRY, (8)은 SY84 및, (9)는 SY86을 나타낸다. 도 1에서 보듯이, 정상인의 경우에는 관련된 모든 DNA에서 흡광도가 높게 나타나는 반면, 환자 A의 경우 SY147, SY158, SY269 및 SPGY1에서 흡광도가 낮게 나타나고, 환자 B의 경우 SY152, SY158 및 SY269에서 흡광도가 낮게 나타나는 것을 알 수 있다. 이 결과로부터 환자 A는 SY147, SY158, SY269 및 SPGY1에서 결실이 일어났고, 환자 B는 SY152, SY158 및 SY269에서 결실이 일어난 것을 확인 할 수 있으며, 따라서 환자 A 및 환자 B는 남성불임이라고 진단할 수 있다.
실시예 3: 형광표지를 이용하여 남성불임 관련 DNA의 결실을 분석하는 방법
실시예 3-1: 유전자의 부착
남성불임 관련 DNA를 증폭하고 정제하여 고상 지지체에 부착시켰다: 남성불임 관련 DNA(100ng/㎕) 0.5㎕ 내지 2㎕, 바람직하게는 1㎕, 프라이머 a(100pmol/㎕) 및 b(100pmol/㎕) 0.1㎕ 내지 2㎕, 바람직하게는 0.5㎕, dNTP-Mix(10mM) 0.5㎕ 내지 2㎕, 바람직하게는 1㎕, 10 ×Taq 완충용액 3㎕ 내지 10㎕, 바람직하게는 5㎕, Taq 중합효소(1 내지 5unit/㎕, ClonTech, USA) 1㎕ 내지 5㎕, 바람직하게는 2.5㎕ 및 증류수의 조성으로 PCR 혼합액을 제조하였다. 전기 PCR 혼합액을 온도순환기에서 94℃에서 5분간 처리하고, 94℃에서 30초, 61℃에서 30초, 72℃에서 30초의 순환을 35번 반복한 다음, 72℃에서 10분 동안 반응을 유지하였다. PCR이 완료되면, 증폭산물을 포함하는 PCR 혼합액에 0.1배 부피의 3M 소디움 아세테이트(pH 5.2) 및 2.5배 부피의 100% 에탄올 또는 1.0배 부피의 이소프로판올을 가하여 -20℃에 6시간 이상 또는 -70℃에서 1시간 이상 방치한 후, 14,000rpm, 4℃에서 15분 동안 원심분리하였다. 그런 다음, 상층액을 버리고, 수득한 펠렛에 500㎕의 70% 에탄올을 가하여 전기와 동일한 조건으로 원심분리한 후, 상층액을 버리고 펠렛을 수득하였다. 수득한 펠렛을 상온에서 건조시켜 남아있는 에탄올을 모두 제거하고, 6㎕의 3x SSC에 현탁한 다음, 마이크로어레이를 이용하여 현탁된 유전자를 고상 지지체로 선택된 유리판(Cartetian, USA)에 점적하고, 80℃에서 1시간 동안 배양하여 남성불임 관련 DNA를 부착시킨 유리판을 제조하였다.
또한, 전기 사용한 프라이머 a 및 b를 모두 가하고, 멀티-PCR을 수행하여 증폭하고 정제한 시료 DNA를 남성불임 관련 DNA 대신에 유리판에 부착시켰다.
실시예 3-2: Cy5-dCTP를 이용한 시료 DNA의 표지
전기 실시예 1-1에서 사용한 모든 프라이머 a 및 b를 가하고, 멀티-PCR을 수행하여 시료 DNA를 증폭하고, Cy5-dCTP로 표지하였다: 시료 DNA(100ng/㎕) 0.5㎕ 내지 2㎕, 바람직하게는 1㎕, 프라이머 a(100pmol/㎕) 및 b(100pmol/㎕) 0.1㎕ 내지 2㎕, 바람직하게는 0.5㎕, dNTP-Mix(10mM) 0.5㎕ 내지 2㎕, 바람직하게는 1㎕, 10 ×Taq 완충용액 3㎕ 내지 10㎕, 바람직하게는 5㎕, Taq 중합효소(1 내지 5unit/㎕, ClonTech, USA) 1㎕ 내지 5㎕, 바람직하게는 2.5㎕ 및 증류수의 조성으로 PCR 혼합액을 제조하였다. 전기 PCR 혼합액을 온도순환기에서 94℃에서 5분간 처리하고, 94℃에서 1분, 60℃에서 1분, 72℃에서 1분의 순환을 30번 반복한 다음, 72℃에서 10분 동안 반응을 유지하였다. PCR이 완료되면, 증폭산물을 포함하는 PCR 혼합액에 0.1배 부피의 3M 소디움 아세테이트(pH 5.2) 및 1.0배 부피의 이소프로판올을 가하여 -70℃에 1시간 동안 방치한 후, 14,000rpm, 4℃에서 30분 동안 원심분리하였다. 그런 다음, 상층액을 제거하고 500㎕의 70% 에탄올을 가하여 전기와 동일한 조건으로 원심분리한 후, 다시 상층액을 제거하여 펠렛을 수득하였다. 수득한 펠렛을 상온에서 건조시켜 남아있는 에탄올을 모두 제거하고, 1ng/1㎕이 되도록 증류수에 현탁시켰다. 현탁된 DNA에 10㎕의 랜덤(random) 프라이머를 가하여 95℃에서 5분간 가열하고, 10㎕의 5x dCTP Buffer, 3㎕의 Cy5-dCTP, 1㎕의 클래노우 효소(Klenow-Fragment Enzyme)를 가하여 37℃에서 15분 동안 배양한 후, 2㎕의 정지용액(stop solution)을 가하여 반응을 중지시킴으로써, DNA를 형광표지하였다(Prime-It II Random Primer Labeling kit, Stratagene, USA).
또한, 전기 실시예 3-1에서 남성불임 관련 DNA 대신 시료의 DNA를 유리판에 부착시킨 경우를 위하여 전기와 동일한 방법으로 남성불임 관련 DNA 각각을 적절한 프라이머를 이용한 PCR을 통해 형광표지하였다.
실시예 3-3: 교잡반응
유리판에 부착된 남성불임 관련 DNA와 형광표지된 시료 DNA를 교잡시켰다: 남성불임 관련 DNA가 부착된 유리판을 1x SSC 용액에 1분간 방치하고, 60mJ의 UV를 처리한 후, 45mL의 1-메틸-2 피롤리딘(1-methyl-2 pyrrolidone)에 0.314g의 숙신산 무수물(succinic anhydride)을 용해시킨 후, 5mL의 1M 소디움 보레이트를 가하여 제조한 정지 용액에 15분 동안 방치하였다. 그런 다음, 전기 유리판을 95℃의 증류수에서 2분 동안 가열하고, 곧바로 에탄올에 넣었다가 500 rpm, 25℃에서 2분 동안 원심분리하여 유리판의 수분을 제거하였다. 전기 실시예 3-2의 방법으로 형광표지된 시료 DNA에 450㎕의 TE 완충용액을 가하여 혼합하고, 마이크론-30(Micron-30, Millipore, USA)을 사용하여 농축시켰다. 농축된 시료 DNA에 1.3㎕의 20x SSC 및 0.3㎕의 10% SDS를 가하여 혼합하고, 마이크로어레이를 이용하여 전기 남성불임관련 DNA가 부착된 유리판에 점적한 후, 커버글래스를 덮어 교잡 카세트(hybridization cassette)에 넣은 다음, 65℃에서 5시간 동안 배양하여 유리판에 부착된 남성불임 관련 DNA와 형광표지된 시료 DNA를 교잡시켰다. 5시간 후, 교잡이 완료된 전기 유리판을 2x SSC/0.2% SDS 용액에서 6분 동안 세척하고, 0.05x SSC에서 1분 동안 세척한 다음, 500rpm, 25℃에서 2분 동안 원심분리하였다. 원심분리를 통해 건조된 유리판의 DNA를 DNA 칩용 스캐너(Axon, USA)로 스캐닝하였다.
또한, 남성불임 관련 DNA 대신 유리판에 부착된 시료 DNA와 형광표지된 남성불임 관련 DNA의 교잡반응을 전기와 동일한 방법으로 수행하였다.
실시예 4: 시료의 남성불임 관련 DNA 내 결실의 분석
남성불임과 관련된 AZF 부위 내에 존재하는 SPGY1, SY127, SY158, SY254, SY255, MK5 및 SRY를 이용하여, 전기 실시예 3과 동일한 방법으로 시료의 남성불임 관련 DNA의 결실을 분석하였다.
실시예 4-1: 형광표지된 시료 DNA를 이용한 시료의 남성불임 관련 DNA 내 결실의 분석
SPGY1, SY127, SY158, SY254, SY255 및 MK5를 유리판에 부착시키고, 시료 유전자와 교잡반응시켜, 시료의 남성불임 관련 DNA의 결실을 분석하였다: 남성불임관련 DNA 및 시료 DNA를 증폭하기 위한 프라이머 5'-TTCACATACAGCCATTAAGTTTAGC-3': SPGY1a(서열번호 37), 5`-ACAATTTTGATAGTCTGAACACAAGC-3':SPGY1b(서열번호 38), 5'-TAGAGGCTAGGCTCACAAAC-3': SY127a(서열번호 39), 5'-AAGCTGCAGGCAGTAATAAG-3': SY127b(서열번호 40), 5`-CTCAGAAGTCCTCCTAATAGTTCC-3': SY158a(서열번호 41), 5'-ACAGTGGTTTGTAGCGGGTA-3': SY158b(서열번호 42), 5'-GGGTGTTACCAGAAGGCAAA-3': SY254a(서열번호 43), 5'-GACCGTATCTACCAAAGCAGCA-3': SY254b(서열번호 44), 5'-GTGCTGAGTTACAGGATTCG-3': SY255a(서열번호 45), 5'-TATGTGCTCGTCATGTGCAG-3': SY255b(서열번호 46), 5’-CACGCATATAGTAATACACGAGATA-3': MK5a(서열번호 47) 및 5'-AGATGCCACATAACTTGAGC-3': MK5b(서열번호 48)를 제작하였다(제노텍, 한국). 그런 다음, 전기 실시예 3-1과 동일한 방법으로 전기 남성불임 관련 DNA를 증폭하고 정제하여 유리판에 부착시키고, 전기 실시예 3-2와 동일한 방법으로 시료 DNA를 증폭하고 형광표지한 다음, 전기 실시예 3-3과 동일한 방법으로 유리판에 부착된 남성불임 관련 DNA와 형광표지된 시료 DNA를 교잡시키고, 형광분석하여 결과를 확인하였다. 도 2는 형광표지된 시료 DNA를 이용하여 시료의 남성불임 관련 DNA의 결실을 분석한 결과를 나타내는 사진이다. 도 2에서 보듯이, 정상인의 경우에는 관련된 모든 DNA에서 형광을 나타내는 반면, 환자의 경우 MK5, SY127 및 SY134에서만 형광을 나타내는 것을 알 수 있다. 이 결과로부터 환자는 SY158, SY254, SY255 및 SPGY1에서 결실이 일어난 것을 확인할 수 있으며, 따라서 환자는 남성불임이라고 진단할 수 있다.
실시예 4-2: 형광표지된 남성불임 관련 DNA를 이용한 시료의 남성불임 관련 DNA 내 결실의 분석
SPGY1, SY127, SY158, SY254, SY255, MK5 및 SRY와 유리판에 부착시킨 시료 DNA의 교잡반응을 통해, 시료의 남성불임 관련 DNA의 결실을 분석하였다: 남성불임 관련 DNA 및 시료 DNA를 증폭하기 위한 프라이머로서, 5'-TTCACATACAGCCATTAAGTTTAGC-3': SPGY1a(서열번호 37), 5`-ACAATTTTGATAGTCTGAACACAAGC-3': SPGY1b(서열번호 38), 5'- TAGAGGCTAGGCTCACAAAC-3': SY127a(서열번호 39), 5'-AAGCTGCAGGCAGTAATAAG-3': SY127b(서열번호 40), 5`-CTCAGAAGTCCTCCTAATAGTTCC-3': SY158a(서열번호 41), 5'-ACAGTGGTTTGTAGCGGGTA-3': SY158b(서열번호 42), 5'-GGGTGTTACCAGAAGGCAAA-3': SY254a(서열번호 43), 5'-GACCGTATCTACCAAAGCAGCA-3': SY254b(서열번호 44), 5'- GTGCTGAGTTACAGGATTCG-3': SY255a(서열번호 45), 5'-TATGTGCTCGTCATGTGCAG-3': SY255b(서열번호 46), 5;-CACGCATATAGTAATACACGAGATA-3': MK5a(서열번호 47), 5'- AGATGCCACATAACTTGAGC-3': MK5b(서열번호 48), 5'-CATGAACGCATTCATCGTGTG-3': SRYa(서열번호 13) 및 5'-GGTCGATACTTATAATTCGGG-3': SRYb(서열번호 14)를 제작하였다(제노텍, 한국). 전기 제작한 프라이머를 이용하여 전기 실시예 3-1과 동일한 방법으로 시료 DNA를 증폭하고 정제하여 유리판에 부착시키고, 전기 실시예 3-2과 동일한 방법으로 남성불임 관련 DNA를 증폭하고 형광표지한 다음, 전기 실시예 3-3과 동일한 방법으로 유리판에 부착된 시료 DNA와 형광표지된 남성불임 관련 유전자를 교잡시키고, 형광분석하여 결과를 확인하였다. 전기 결과 중 유리판에 부착시킨 시료 DNA와 SPGY1을 교잡시킨 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3은 형광표지된 남성불임 관련 DNA를 이용하여 시료의 남성불임 관련 DNA 중 SPGY1의 결실을 분석한 결과를 나타내는 사진이다. 도 3에서 보듯이, 정상인의 경우에는 SPGY1에 대하여 모두 형광을 나타내는 반면, 환자의 경우 형광을 나타내지 않는 것을 알 수 있다. 이 결과로부터 환자는 SPGY1에서 결실이 일어난 것을 확인할 수 있으며, 따라서 환자는 남성불임이라고 진단할 수 있다.
이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 남성불임 관련 DNA를 검출(detection)하기 위한 탐침 또는 남성불임 관련 DNA를 부착시킨 고상 지지체, PCR 혼합물과 세척용 완충용액을 포함하는 남성불임 진단키트 및 전기 남성불임 진단키트를 이용하여 남성불임 관련 DNA의 결실을 분석하는 방법을 제공한다. 본 발명에 의하면, 고상 지지체에 탐침 또는 남성불임 관련 DNA를 부착시키고, 바이오틴이 결합되거나 또는 형광물질로 표지된 시료 DNA를 전기 고상 지지체에 부착된 DNA와 반응시킨 다음, 전기 바이오틴과 반응하는 효소 및 전기 효소의 기질을 가하고 효소활성을 측정하거나 또는 형광물질의 형광을 측정함으로써, 대량의 시료를 정확하고 신속하게 분석할 수 있다.
<110> GenoCheck Co. Ltd. <120> A Diagnostic Kit for Male Sterility and a Method for Detecting De letion of Male Sterility-related DNA Using the Same <160> 48 <170> KopatentIn 1.6 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer SY147a <400> 1 agcttctctt tctcgtttga t 21 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer SY147b <400> 2 cagatgtaat tccaatgtgc ag 22 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer SY152a <400> 3 aagacagtct gccatgtttc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer SY152b <400> 4 aggagggtac ttagcagtaa 20 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer SY158a <400> 5 agttccatgt gtgatgaaag a 21 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer SY158b <400> 6 tttacagtgg tttgtagcgg 20 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer SY254a <400> 7 accagaaggc aaaatcgt 18 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer SY254b <400> 8 aaccgtatct accaaagcag 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer SY269a <400> 9 gacaagtgtt ccttggagat 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SY269b <400> 10 tgcattggca tgaatgtgta 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer SPGY1a <400> 11 acagccatta agtttagcat 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer SPGY1b <400> 12 tgatagtctg aacacaagca 20 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer SRYa <400> 13 catgaacgca ttcatcgtgt g 21 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer SRYb <400> 14 ggtcgatact tataattcgg g 21 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer SY84a <400> 15 caaagagaag ggtctgaaag 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer SY84b <400> 16 ggcttcatca gcaagacaaa 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer SY86a <400> 17 acacacagac tatgcttcag 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer SY86b <400> 18 agacacacac agagggacaa 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer SY147c <400> 19 tggaatatca gccaagatgt 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer SY152c <400> 20 cttagcagta acntttctgc 20 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer SY158c <400> 21 agtgagttga ttagcagaat g 21 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer SY254c <400> 22 tcagtttcat ccatctatgg a 21 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer SY269c <400> 23 tgtattcatg gtcttctcga 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer SPGY1c <400> 24 acttctccaa gaagtacctg 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer SRYc <400> 25 tatttctctc tgtgcatggc 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer SY84c <400> 26 ccttttgaaa ggagttagcc 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer SY86c <400> 27 gagaagacag catctacaac 20 <210> 28 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer SY147p <400> 28 tttttttttt tttttagctt ctctttctcg tttgat 36 <210> 29 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer SY152p <400> 29 tttttttttt tttttaagac agtctgccat gtttc 35 <210> 30 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer SY158p <400> 30 tttttttttt tttttagttc catgtgtgat gaaaga 36 <210> 31 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer SY254p <400> 31 tttttttttt tttttttacc agaaggcaaa atcgt 35 <210> 32 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer SY269p <400> 32 tttttttttt tttttgacaa gtgttccttg gagat 35 <210> 33 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer SPGY1p <400> 33 tttttttttt ttttttacag ccattaagtt tagcat 36 <210> 34 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer SRYp <400> 34 tttttttttt tttttcatga acgcattcat cgtgtg 36 <210> 35 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer SY84p <400> 35 tttttttttt tttttcaaag agaagggtct gaaag 35 <210> 36 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer SY86p <400> 36 tttttttttt tttttacaca cagactatgc ttcag 35 <210> 37 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer SPGY1a <400> 37 ttcacataca gccattaagt ttagc 25 <210> 38 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer SPGY1b <400> 38 acaattttga tagtctgaac acaagc 26 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer SY127a <400> 39 tagaggctag gctcacaaac 20 <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer SY127b <400> 40 aagctgcagg cagtaataag 20 <210> 41 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer SY158a <400> 41 ctcagaagtc ctcctaatag ttcc 24 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer SY158b <400> 42 acagtggttt gtagcgggta 20 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer SY254a <400> 43 gggtgttacc agaaggcaaa 20 <210> 44 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer SY254b <400> 44 gaccgtatct accaaagcag ca 22 <210> 45 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer SY255a <400> 45 gtgctgagtt acaggattcg 20 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer SY255b <400> 46 tatgtgctcg tcatgtgcag 20 <210> 47 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer MK5a <400> 47 cacgcatata gtaatacacg agata 25 <210> 48 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer MK5b <400> 48 agatgccaca taacttgagc 20
Claims (14)
- (i) 남성불임 관련 DNA를 증폭하기 위한 프라이머의 염기서열을 포함하는 탐침을 부착시킨 고상 지지체; (ii) 남성불임 관련 DNA를 증폭하기 위한 프라이머, dNTP, DNA 중합효소 및 완충용액으로 구성된 PCR 혼합물; (iii) 전기 프라이머가 주형 DNA에 결합하는 부위보다 3'-말단쪽에 위치하는 15개 내지 30개의 염기로 구성되고, 5'-말단에 바이오틴이 결합되어 있는 부가의 프라이머; (iv) 표지효소가 결합된 스트랩트아비딘 및 전기 표지효소의 기질; 및, (v) PCR 후의 세척용 완충용액 및 표지효소 반응 후의 세척용 완충용액을 포함하는 남성불임 진단키트.
- 제 1항에 있어서,고상 지지체는 플라스틱으로 제조되는 것을 특징으로 하는남성불임 진단키트.
- 제 1항에 있어서,표지효소는 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase)이고, 기질 은 p-니트로페닐 포스페이트(p-nitrophenylphosphate, pNPP), 5-브로 모-4-클로로-3-인돌일포스페이트(5-bromo-4-chloro-3-indolylphosphate) 또는 나프톨 AS-TR 포스페이트(naphthol AS-TR phosphate) 인 것을 특징으로 하는남성불임 진단키트,
- 제 1항에 있어서,표지효소는 페록시다아제(peroxidase)이고, 기질은 페닐렌다이아민 (phenylenediamine), 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(3,3',5,5'-tetra methylbenzidine), 다이아니시딘(dianisidine), 아미노살리실릭 산 (aminosalicylic acid), 3,3'-다이아미노벤지딘(3,3'-diaminobenzi dine), 3-아미노-9-에틸카바졸(3-amino-9-ethylcarbazole) 또는 4-클 로로-1-나프톨(4-chloro-1-naphthol)인 것을 특징으로 하는남성불임 진단키트.
- 다음의 각 단계를 포함하는 제 1항의 남성불임 진단키트를 이용하여 남성불임 관련 DNA의 결실을 분석하는 방법:(i) 시료 DNA를 제 1항의 남성불임 진단키트의 고상 지지체에 PCR 혼합물 과 함께 가하여 첫번째 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하고, 곧바로 부 가의 프라이머를 가하여 두번째 PCR을 수행한 다음, 지지체를 PCR 후의 세척용 완충용액으로 세척하는 단계; 및,(ii) 전기 세척한 지지체에 표지효소가 결합된 스트랩트아비딘을 가하여 부 가의 프라이머에 결합되어 있는 바이오틴과 결합시키고, 전기 표지효 소의 기질을 가하여 반응시킨 다음, 표지효소 반응 후의 세척용 완충 용액으로 세척하고, 표지효소의 활성을 측정하여, 남성불임 관련 DNA 의 결실을 분석하는 단계.
- 제 5항에 있어서,시료 DNA는 혈액, 정액 또는 모근세포에서 추출되는 것을 특징으로 하 는제 1항의 남성불임 진단키트를 이용하여 남성불임 관련 DNA의 결실을 분석하는 방법.
- 제 5항에 있어서,표지효소의 활성은 발색 또는 흡광으로 측정하는 것을 특징으로 하는제 1항의 남성불임 진단키트를 이용하여 남성불임 관련 DNA의 결실을 분석하는 방법.
- (i) 탐침(서열번호 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 및 36)을 부착시킨 마이크로플레이트; (ii) 남성불임 관련 DNA를 증폭하기 위한 프라이머(서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 및 18), dNTP, Taq 중합효소 및 완충용액으로 구성된 PCR 혼합물; (iii) 5'-말단에 바이오틴이 결합되어 있는 부가의 프라이머(서열번호 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 및 27); (iv) 알칼라인 포스파타아제가 결합된 스트랩트아비딘 및 전기 효소의 기질인 pNPP; 및, (v) PCR 후의 세척용 완충용액 0.5x SSC/0.1% Tween 20 및 효소반응 후의 세척용 완충용액 150mM NaCl/0.1% Tween 20/100mM Tris-HCl(pH 7.5)을 포함하는 남성불임 진단키트.
- (i) 남성불임 관련 DNA를 부착시킨 고상 지지체; (ii) 남성불임 관련 DNA를 증폭하기 위한 프라이머, dNTP, 형광물질이 결합된 dNTP, DNA 중합효소 및 완충용액으로 구성된 PCR 혼합물; 및, (iii) 교잡반응 후의 세척용 완충용액을 포함하는 남성불임 진단키트.
- 제 9항에 있어서,고상 지지체는 유리로 제조되는 것을 특징으로 하는남성불임 진단키트.
- 제 9항에 있어서,형광물질이 결합된 dNTP는 아미노다이곡시제니-9-dNTP(aminodigoxi genie-9-dNTP), 쿠마린-5-dUTP(coumarin-5-dUPT), 시아닌-3- dNTP (cyanine-3-dNTP ), 시아닌-5-dNTP(cyanine-5-dNTP, Cy5-dNTP), DNP- dNTP, 플루오레신 클로로트리아지닐-4- dUTP(fluorescein chloro triazinyl-4- dUTP), 플루오레신-dUTP(fluorescein-dUTP), 리사민- dUTP(lissamine-dUTP), 나프토플루오레신-dUTP(napthofluorescein- dUTP), 피렌-dUTP (pyrene-dUTP), 테트라메틸로다민-6-dUTP (tetra methylrhodamine-6-dUTP) 또는 텍사스 레드-dUTP(texas red-dUTP)인 것을 특징으로 하는남성불임 진단키트.
- 다음의 각 단계를 포함하는 제 9항의 남성불임 진단키트를 이용하여 남성불임 관련 DNA의 결실을 분석하는 방법:(i) 시료 DNA를 제 9항의 남성불임 진단키트의 PCR 혼합물과 혼합하고, PCR을 수행함으로써, 시료 DNA를 형광표지하는 단계; 및,(ii) 전기 형광표지된 시료 DNA를 전기 남성불임 진단키트의 고상 지지체에 가하여 교잡시키고, 교잡반응 후의 세척용 완충용액으로 세척한 후, 형광분석하여, 남성불임 관련 DNA의 결실을 분석하는 단계.
- 제 12항에 있어서,시료 DNA는 혈액, 정액 또는 모근세포에서 추출되는 것을 특징으로 하 는제 9항의 남성불임 진단키트를 이용하여 남성불임 관련 DNA의 결실을 분석하는 방법.
- (i) 남성불임 관련 DNA인 SPGY1, SY127, SY158, SY254, SY255, MK5 및 SRY를 부착시킨 유리판; (ii) 남성불임 관련 DNA를 증폭하기 위한 프라이머(서열번호 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47 및 48), dNTP, Cy5-dCTP, Taq 중합효소 및 완충용액을 포함하는 PCR 혼합물; 및, (iii) 교잡반응 후의 세척용 완충용액 2x SSC/0.2% SDS 및 0.5x SSC를 포함하는 남성불임 진단키트.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR10-2002-0002636A KR100443384B1 (ko) | 2002-01-17 | 2002-01-17 | 남성불임 진단키트 및 그를 이용하여 남성불임 관련디엔에이의 결실을 분석하는 방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR10-2002-0002636A KR100443384B1 (ko) | 2002-01-17 | 2002-01-17 | 남성불임 진단키트 및 그를 이용하여 남성불임 관련디엔에이의 결실을 분석하는 방법 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20030062456A KR20030062456A (ko) | 2003-07-28 |
| KR100443384B1 true KR100443384B1 (ko) | 2004-08-09 |
Family
ID=32218316
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR10-2002-0002636A KR100443384B1 (ko) | 2002-01-17 | 2002-01-17 | 남성불임 진단키트 및 그를 이용하여 남성불임 관련디엔에이의 결실을 분석하는 방법 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR100443384B1 (ko) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100920134B1 (ko) | 2007-06-29 | 2009-10-08 | 차의과학대학교 산학협력단 | Ｙ 염색체 미세결실 검출용 마이크로어레이 및 이를이용한 검출방법 |
-
2002
- 2002-01-17 KR KR10-2002-0002636A patent/KR100443384B1/ko not_active IP Right Cessation
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100920134B1 (ko) | 2007-06-29 | 2009-10-08 | 차의과학대학교 산학협력단 | Ｙ 염색체 미세결실 검출용 마이크로어레이 및 이를이용한 검출방법 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20030062456A (ko) | 2003-07-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5766847A (en) | Process for analyzing length polymorphisms in DNA regions | |
| USRE37984E1 (en) | Process for analyzing length polymorphisms in DNA regions | |
| WO1995002068A1 (fr) | Methode de discrimination des acides nucleiques et necessaire d'essai a cette fin | |
| JPS6322197A (ja) | 択一的ヌクレオチド配列の識別方法 | |
| AU727542B2 (en) | Prolactin receptor gene as a genetic marker for increased litter size in pigs | |
| US5874217A (en) | Microsatellite sequences for canine genotyping | |
| EP1484399A1 (en) | Mouse spermatogenesis genes, human male sterility-associated genes and diagnostic system using the same | |
| KR102185440B1 (ko) | 개의 고콜레스테롤혈증 조기 예측 또는 진단용 조성물 | |
| JPH1099085A (ja) | ヒトミトコンドリアｄｎａの多形性 | |
| KR100443384B1 (ko) | 남성불임 진단키트 및 그를 이용하여 남성불임 관련디엔에이의 결실을 분석하는 방법 | |
| US5922544A (en) | Method of cell detection | |
| JP2009005698A (ja) | イヌ科動物の遺伝子型決定のためのマイクロサテライト配列 | |
| KR20200073853A (ko) | 개의 망막위축증 조기 예측 또는 진단용 조성물 | |
| EP3124619B1 (en) | Reagents, method and kit for across and within dog breed glaucoma diagnosis | |
| KR102124770B1 (ko) | 개의 고관절탈구 조기 예측 또는 진단용 조성물 | |
| JPH0670799A (ja) | ハイブリダイゼーション法 | |
| US7081335B2 (en) | Prolactin receptor gene as a genetic marker for increased litter size in animals | |
| KR102141604B1 (ko) | 개의 슬개골탈구 조기 예측 또는 진단용 조성물 | |
| JP2982304B2 (ja) | 核酸の識別方法及び核酸の識別用検査セット | |
| JP2006506054A (ja) | 遺伝情報の増幅のための方法 | |
| KR102715907B1 (ko) | 우유의 β-카제인 A1 형 유전자와 β-카제인 A2 형 유전자 검출용 조성물 및 검출 방법 | |
| KR102167792B1 (ko) | 개의 고칼슘혈증 조기 예측 또는 진단용 조성물 | |
| KR101997453B1 (ko) | 한우 f11 결핍증의 진단용 조성물 및 이의 용도 | |
| JP2014512840A (ja) | ブラキスパイナ突然変異の検出 | |
| KR100920134B1 (ko) | Ｙ 염색체 미세결실 검출용 마이크로어레이 및 이를이용한 검출방법 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| PA0109 | Patent application |
Patent event code: PA01091R01D Comment text: Patent Application Patent event date: 20020117 |
|
| PA0201 | Request for examination | ||
| PG1501 | Laying open of application | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| PE0701 | Decision of registration |
Patent event code: PE07011S01D Comment text: Decision to Grant Registration Patent event date: 20040429 |
|
| GRNT | Written decision to grant | ||
| PR0701 | Registration of establishment |
Comment text: Registration of Establishment Patent event date: 20040727 Patent event code: PR07011E01D |
|
| PR1002 | Payment of registration fee |
Payment date: 20040728 End annual number: 3 Start annual number: 1 |
|
| PG1601 | Publication of registration | ||
| LAPS | Lapse due to unpaid annual fee | ||
| PC1903 | Unpaid annual fee |