KR100443384B1 - 남성불임 진단키트 및 그를 이용하여 남성불임 관련디엔에이의 결실을 분석하는 방법 - Google Patents

남성불임 진단키트 및 그를 이용하여 남성불임 관련디엔에이의 결실을 분석하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 남성불임 관련 DNA를 검출(detection)하기 위한 탐침 또는 남성불임 관련 DNA를 부착시킨 고상 지지체, PCR 혼합물과 세척용 완충용액을 포함하는 남성불임 진단키트 및 전기 남성불임 진단키트를 이용하여 남성불임 관련 DNA의 결실을 분석하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 의하면, 고상 지지체에 탐침 또는 남성불임 관련 DNA를 부착시키고, 바이오틴이 결합되거나 또는 형광물질로 표지된 시료 DNA를 전기 고상 지지체에 부착된 DNA와 반응시킨 다음, 전기 바이오틴과 반응하는 효소 및 전기 효소의 기질을 가하고 효소활성을 측정하거나 또는 형광물질의 형광을 측정함으로써, 대량의 시료를 정확하고 신속하게 분석할 수 있다.

Description

남성불임 진단키트 및 그를 이용하여 남성불임 관련 디엔에이의 결실을 분석하는 방법{A Diagnostic Kit for Male Sterility and a Method for Detecting Deletion of Male Sterility-related DNA Using the Same}
본 발명은 남성불임 진단키트 및 그를 이용하여 남성불임 관련 DNA의 결실을 분석하는 방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 남성불임 관련 DNA를 검출(detection)하기 위한 탐침 또는 남성불임 관련 DNA를 부착시킨 고상 지지체,PCR 혼합물과 세척용 완충용액을 포함하는 남성불임 진단키트 및 전기 남성불임 진단키트를 이용하여 남성불임 관련 DNA의 결실을 분석하는 방법에 관한 것이다.
일반적으로, 남성불임의 진단은 일차적으로 비뇨기과적 진찰이나 정액검사로 이루어지며, 그 결과 남성불임으로 진단받은 경우에는 정밀검사를 통한 진단이 행해진다. 남성불임의 정밀 진단방법으로는 고환조직의 생검방법, 항-정자 항체 검사방법, 혈액 내 호르몬 검사방법 및 염색체 검사방법이 있다. 첫번째, 고환조직의 생검방법은 정자감소증(oligozoospermia), 정자사멸증, 무정자증(azoospermia) 등과 같은 심한 이상이 발견된 경우, 고환조직의 일부를 채취하여 직접 검사하는 방법으로, 정액 내에 정자가 없다고 하더라도 정자의 제조원인 고환의 기능이 정상적이라면, 높은 성공률로 치료할 수 있다. 두번째, 항-정자 항체 검사방법은 말 그대로 정자에 대한 항체의 존재유무를 분석하는 방법이다. 정자에 대한 항체는 자연스럽게 생기기도 하지만, 일반적으로 염증이나 외상 후 또는 피임을 목적으로 정관수술을 했다가 복원한 경우에 많이 관찰된다. 검사 결과 정자 표면에서 항-정자 항체가 높은 수치로 관찰될 경우에는 인공 수정법으로도 수정이 어려우며, 시험관 아기를 실시한다 하더라도 수정에 실패할 확률이 높으므로 특수 처리가 필요하다. 세번째, 혈액 내 호르몬 검사방법은 남성 호르몬의 체내 수치를 검사하는 방법으로, 남성의 정자는 체내 남성호르몬이 일정 수치 이상으로 유지되어야만 정상적으로 생산된다는 사실에 근거한다. 네번째, 염색체 검사방법은 남성의 염색체 중에서도 특히 성염색체의 이상을 집중적으로 검사하는 방법이다. 이 외에도, 정자의 DNA를 검사하는 방법 또는 사람 난자를 대신한 햄스터 난자를 이용한 정자의수정능력검사 등이 있으며, 전기 방법들 중에서 현재 가장 일반적으로 이용되고 있는 것은 염색체 검사 방법이다.
한편, 남성 불임은 Y 염색체의 오른쪽 긴 부분에 위치한 AZF(Azoospermic factor) 부위와 관련되어 있음이 티에폴로와 주파디에 의해 알려졌고(Tiepolo, L. and Zuffardi, O., Location of factors controlling spermatogenesis in the nonfluorescent portion of the human Y chromosome long arm,Human Genet.,1976, 34, 119-124), AZF 부위는 세 부분으로 구분할 수 있으며(Vogt, P.H., Edelmann, A., Hirschmann, P., Shan, Z., Tenscher, S., Urbitsch, P., The Y chromosome and in fertility in the male, Abstracts of the 12th Annual Meeting of the EHSRE, 1996, 32), 이 세 부분에서의 결실이 무정자증 또는 심각한 정자감소증과 관련되어 있다는 사실이 밝혀졌다(Vogt, P.H., Human chromosome deletions in Yq11, AZF candidate genes and male infertility: history and update,Molecular Human Reproduction, 1998, 4, 739-744). 또한, AZF 부위 내 결실과 관련하여 DAZ(Deleted in AZoospermia)가 발견되었고(Reijo, R., Lee, T.Y,, Salo, P., Alagappan, R., Brown, L.G., Rosenberg, M., Rozen, S., Jaffe, T., Straus, D., Hovatta, O., Chapella, A., Silber, S., Page, D.C., Diverse spermatogenic defects in human caused by Y chromosome deletions encompassing a novel RNA-binding protein gene,Nat Genet.,1995, 10, 383-393), 현재에도 계속해서 남성불임과 관련된 DNA 부위나 유전자들을 구별하고 분리하고 있는 추세이다(Lahn, B.T. and Page, D.C., Functional coherence of the human Y chromosome,Science,1987, 278, 675-680 and Vogt, P.H., Affara, N., Davey, P., Hammer, M., Jobling, M.A., Lau, Y-F. C., Mitchell, M., Schempp, W., Tyler-Smith, C., Williams, G., Yen, P. and Rappold, G.A., Report on the third international workshop on Y chromosome mappong,Cytogenetics & Cell Genetics,1997,79, 1-20).
상술하였듯이, 현재 남성불임을 진단하는 방법으로 가장 일반적으로 이용되고 있는 방법은 염색체 검사방법으로, 이를 위해서도 여러가지 기계, 다양한 방법들이 이용될 수 있으나, PCR을 이용하는 방법으로 Y 염색체상의 AZF 부위 내 결실을 분석하는 것이 비교적 간편하고 과정이 용이하기 때문에 보편적으로 이용되고 있다. 그러나, 종래의 분자 생물학적 PCR을 이용하는 방법은 정확성이 떨어지고, 분석 시간이 길어지는 등의 여러가지 기술적 문제와 대량 분석의 한계를 가지고 있다.
따라서, 종래의 분자 생물학적 PCR을 이용하는 방법이 가지고 있는 문제점을 해결하고, 대량의 시료를 정확하고 신속하게 분석할 수 있는 새로운 남성불임 관련 DNA의 결실을 분석하는 방법을 개발하여야 할 필요성이 끊임없이 대두되었다.
이에, 본 발명자들은 종래의 분자 생물학적 PCR을 이용하는 방법이 가지고 있는 문제점을 해결할 수 있는 새로운 남성불임 관련 DNA의 결실을 분석하는 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 고상 지지체에 탐침 또는 남성불임 관련 DNA를부착시키고, 바이오틴이 결합되거나 또는 형광물질로 표지된 시료 DNA를 전기 고상 지지체에 부착된 DNA와 반응시킨 다음, 전기 바이오틴과 반응하는 효소 및 전기 효소의 기질을 가하고 효소활성을 측정하거나 또는 형광물질의 형광을 측정함으로써, 대량의 시료를 정확하고 신속하게 분석할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
결국, 본 발명의 주된 목적은 남성불임 진단키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 전기 남성불임 진단키트를 이용하여 남성불임 관련 DNA의 결실을 분석하는 방법을 제공하는 것이다.
도 1은 부가의 프라이머를 이용하여 시료의 남성불임 관련 DNA의 결실을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2는 형광표지된 시료 DNA를 이용하여 시료의 남성불임 관련 DNA의 결실을 분석한 결과를 나타내는 사진이다.
도 3은 형광표지된 남성불임 관련 DNA를 이용하여 시료의 남성불임 관련 DNA 중 SPGY1의 결실을 분석한 결과를 나타내는 사진이다.
본 발명은 (i) 남성불임 관련 DNA를 증폭하기 위한 프라이머의 염기서열을 포함하는 탐침을 부착시킨 고상 지지체; (ii) 남성불임 관련 DNA를 증폭하기 위한 프라이머, dNTP, DNA 중합효소 및 완충용액으로 구성된 PCR 혼합물; (iii) 전기 프라이머가 주형 DNA에 결합하는 부위보다 3'-말단쪽에 위치하는 15개 내지 30개의 염기로 구성되고, 5'-말단에 바이오틴이 결합되어 있는 부가의 프라이머; (iv) 표지효소가 결합된 스트랩트아비딘 및 전기 표지효소의 기질; 및, (v) PCR 후의 세척용 완충용액 및 표지효소 반응 후의 세척용 완충용액을 포함하는 남성불임 진단키트 및 (i) 시료 DNA를 전기 남성불임 진단키트의 고상 지지체에 PCR 혼합물과 함께 가하여 첫번째 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하고, 곧바로 부가의 프라이머를 가하여 두번째 PCR을 수행한 다음, 지지체를 PCR 후의 세척용 완충용액으로 세척하는 단계; (ii) 전기 세척한 지지체에 표지효소가 결합된 스트랩트아비딘을 가하여 부가의 프라이머에 결합되어 있는 바이오틴과 결합시키고, 전기 표지효소의 기질을 가하여 반응시킨 다음, 표지효소 반응 후의 세척용 완충용액으로 세척하고, 표지효소의 활성을 측정하여, 남성불임 관련 DNA의 결실을 분석하는 단계를 포함하는 전기 남성불임 진단 키트를 이용하여 남성불임 관련 DNA의 결실을 분석하는 방법을 제공한다: 이때, 고상 지지체는 플라스틱으로 제조될 수 있고, 스트랩트아비딘에 결합된 표지효소는 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase) 또는 페록시다아제(peroxidase)일 수 있으며, 표지효소의 활성은 발색 또는 흡광으로 측정할 수 있다. 표지효소가 알칼라인 포스파타아제일때, 기질은 p-니트로페닐 포스페이트(p-nitrophenylphosphate, pNPP), 5-브로모-4-클로로-3-인돌일포스페이트(5-bromo-4-chloro-3-indolylphosphate) 또는 나프톨 AS-TR 포스페이트(naphthol AS-TR phosphate)일 수 있고, 표지효소가 페록시다아제일때, 기질은 페닐렌다이아민 (phenylenediamine), 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(3,3',5,5'-tetramethylbenzi dine), 다이아니시딘(dianisidine), 아미노살리실릭 산(aminosalicylic acid), 3,3'-다이아미노벤지딘(3,3'-diaminobenzidine), 3-아미노-9-에틸카바졸(3-amino-9-ethylcarbazole) 또는 4-클로로-1-나프톨(4-chloro-1-naphthol)일 수 있다. 분석되는 시료 DNA는 혈액, 정액 또는 모근세포에서 추출될 수 있다. 전기 남성불임 진단키트 및 그를 이용하여 남성불임 관련 DNA의 결실을 분석하는 방법에 있어서, 부가의 프라이머는 첫번째 PCR을 통해 증폭된 DNA를 부분적으로 재증폭하는 기능및 첫번째 PCR을 통해 증폭된 DNA가 실제적으로 남성불임 관련 DNA인지를 결정하는 기능을 담당하여, 결과의 정확성을 높이는 역할을 한다.
또한, 본 발명은 (i) 남성불임 관련 DNA를 부착시킨 고상 지지체; (ii) 남성불임 관련 DNA를 증폭하기 위한 프라이머, dNTP, 형광물질이 결합된 dNTP, DNA 중합효소 및 완충용액으로 구성된 PCR 혼합물; (iii) 교잡반응 후의 세척용 완충용액을 포함하는 남성불임 진단키트 및 (i) 시료 DNA를 전기 남성불임 진단키트의 PCR 혼합물과 혼합하고, PCR을 수행함으로써, 시료 DNA를 형광표지하는 단계; (ii) 전기 형광표지된 시료 DNA를 전기 남성불임 진단키트의 고상 지지체에 가하여 교잡시키고, 교잡반응 후의 세척용 완충용액으로 세척한 후, 형광분석하여, 남성불임 관련 DNA의 결실을 분석하는 단계를 포함하는 전기 남성불임 진단키트를 이용하여 남성불임 관련 DNA의 결실을 분석하는 방법을 제공한다: 이때, 고상 지지체는 유리로 제조될 수 있고, 형광물질이 결합된 dNTP는 아미노다이곡시제니-9-dNTP(aminodigoxigenie-9-dNTP), 쿠마린-5-dUTP (coumarin-5-dUPT), 시아닌-3-dNTP(cyanine-3-dNTP), 시아닌-5-dNTP(cyanine-5-dNTP, Cy5-dNTP), DNP-dNTP, 플루오레신 클로로트리아지닐-4-dUTP(fluorescein chlorotriazinyl-4- dUTP), 플루오레신-dUTP(fluorescein-dUTP), 리사민-dUTP (lissamine-dUTP), 나프토플루오레신-dUTP(napthofluorescein-dUTP), 피렌-dUTP (pyrene-dUTP), 테트라메틸로다민-6-dUTP (tetramethylrhodamine-6-dUTP) 또는 텍사스 레드-dUTP(texas red-dUTP)일 수 있으며, 분석되는 시료 DNA는 혈액, 정액 또는 모근세포에서 추출될 수 있다. 전기 남성불임 진단키트 및 그를 이용하여 남성불임 관련 DNA의 결실을 분석하는 방법을 응용하여, 고상 지지체에 남성불임 관련 DNA 대신 시료 DNA를 부착시키고, 시료 DNA 대신 남성불임 관련 DNA를 형광표지한 후, 고상 지지체에 부착된 시료 DNA와 형광표지된 남성불임 관련 DNA를 교잡시키고, 형광분석함으로써, 남성불임 관련 DNA의 결실을 분석하는 것도 가능하다.
구체적으로, 본 발명은 (i) 탐침(서열번호 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 및 36)을 부착시킨 마이크로플레이트; (ii) 남성불임 관련 DNA를 증폭하기 위한 프라이머(서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 및 18), dNTP, Taq 중합효소 및 완충용액으로 구성된 PCR 혼합물; (iii) 5'-말단에 바이오틴이 결합되어 있는 부가의 프라이머(서열번호 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 및 27); (iv) 알칼라인 포스파타아제가 결합된 스트랩트아비딘 및 전기 표지효소의 기질인 pNPP; (v) PCR 후의 세척용 완충용액 0.5x SSC/0.1% Tween 20 및 표지효소 반응 후의 세척용 완충용액 150mM NaCl/0.1% Tween 20/100mM Tris-HCl(pH 7.5)을 포함하는 남성불임 진단키트와 (i) 남성불임 관련 DNA인 SPGY1, SY127, SY158, SY254, SY255, MK5 및 SRY를 부착시킨 유리판; (ii) 남성불임 관련 DNA를 증폭하기 위한 프라이머(서열번호 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47 및 48), dNTP, Cy5-dCTP, Taq 중합효소 및 완충용액을 포함하는 PCR 혼합물; 및, (iii) 교잡반응 후의 세척용 완충용액 2x SSC/0.2% SDS 및 0.5x SSC를 포함하는 남성불임 진단키트를 제공한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 부가의 프라이머를 이용하여 남성불임 관련 DNA의 결실을 분석하는 방법
실시예 1-1: 프라이머와 탐침의 제작 및 탐침의 부착
남성불임 관련 DNA를 증폭하기 위한 프라이머와 부가의 프라이머 및 전기 DNA를 검출하기 위한 탐침을 제작하고, 고상 지지체에 부착시켰다: 남성불임 관련 DNA를 증폭하기 위한 프라이머 a 및 b; 전기 프라이머 a 또는 b가 주형 DNA에 결합하는 부위보다 3'-말단쪽에 위치하는 15개 내지 30개의 염기로 구성되고, 5'-말단에 바이오틴이 결합되어 있는 부가의 프라이머 c; 및, 전기 프라이머 a 또는 b의 염기서열을 포함하는 탐침을 제작하였다. 전기 탐침은 PCR 효율을 높이기 위하여, 5'-말단에 포스페이트가 결합된 스페이서(spacer, 예를 들면, 폴리-d(T))를 추가로 포함할 수 있다. 탐침간의 자발적인 결합을 저해하기 위하여, 전기 제작한 탐침을 90℃ 내지 100℃에서 5내지 10분, 바람직하게는 94℃에서 10분간 가열하고, 곧바로 얼음에서 10분간 냉각시켰다. 냉각 후, 짧게 원심분리하여 탐침을 응집시키고, 냉각된 1-메틸이미다졸(1-methylimidazole, pH 7.0)과 1-에틸-3-(3-다이메틸아미노프로필)-카보다이이미드(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide(EDC))를 최종농도 10mM이 되도록 가하여 혼합하였다. 전기 혼합액을 고상 지지체로 선택된 PCR용 뉴클레오링크(NucleoLink) 96웰 마이크로플레이트(Nunc, 덴마크)에 웰당 100㎕씩 주입하고, 증발되지 않도록 테잎 등으로 처리한 다음, 40℃ 내지 60℃에서 5 내지 9시간, 바람직하게는 50℃에서 7시간 동안 배양하여, 탐침을 마이크로플레이트에 부착시켰다.
배양 후, 마이크로플레이트에 부착되지 않은 탐침을 제거하기 위하여, 마이크로플레이트의 각 웰을 세척하였다: 마이크로플레이트의 웰로부터 전기 혼합액을 제거하고, 각 웰을 200㎕의 0.4N NaOH/0.25% Tween 20 용액으로 상온에서 3번 세척한 다음, 동일 부피의 동일 용액에서 10분간 상온배양하고, 각 웰을 200㎕의 동일 용액과 증류수로 상온에서 각각 3번씩 세척하였다. 이어, 200㎕의 증류수를 가하여 5분간 상온배양하고 3번씩 세척하는 과정을 3회 반복하였다.
실시예 1-2: PCR 및 탐침과 교잡되지 않은 산물의 제거
전기 실시예 1-1에서 제작한 마이크로플레이트에 시료 DNA를 가하고, PCR을 수행하였다: 먼저, 시료 DNA(100ng/㎕) 0.5㎕ 내지 2㎕, 바람직하게는 1㎕, 프라이머 a(100pmol/㎕) 0.1㎕ 내지 2㎕, 바람직하게는 0.5㎕, 프라이머 b(100pmol/㎕) 0.1㎕ 내지 2㎕, 바람직하게는 0.5㎕, dNTP-Mix(10mM) 0.5㎕ 내지 2㎕, 바람직하게는 1㎕, 10 ×Taq 완충용액 3㎕ 내지 6㎕, 바람직하게는 5㎕, Taq 중합효소(1 내지5unit/㎕) 0.5㎕ 내지 2㎕, 바람직하게는 1㎕ 및 증류수의 조성으로 PCR 혼합액을 제조하고, 전기 PCR 혼합액을 온도순환기(thermo cycler)에서 94℃에서 5분간 처리하고, 94℃에서 30초, 58℃에서 30초, 72℃에서 30초의 순환을 30번 반복하여, 첫 번째 PCR을 수행하였다.
전기 첫 번째 PCR이 완료되면, 0.5㎕ 내지 2㎕, 바람직하게는 1㎕의 프라이머 c(100pmol/㎕)만을 새로이 가하고, 전기 조건과 동일한 온도순환 조건에서 두 번째 PCR을 수행한 다음, 각 웰을 200㎕의 0.5x SSC/0.1% Tween 20 용액으로 3번 세척하고, 200㎕의 동일 용액을 가하여 60℃에서 15분간 배양한 후, 200㎕의 동일 용액으로 3번 세척하였다.
실시예 1-3: PCR 결과의 확인
표지효소가 결합된 스트랩트아비딘 및 전기 표지효소의 기질을 가하여 효소 활성에 의한 발색으로써, 전기 실시예 1-2의 PCR 결과를 확인하였다: 150mM NaCl/100mM Tris-HCl(pH 7.5) 용액으로 희석한 스트랩트아비딘-알칼라인 포스파타아제 용액을 PCR이 완료된 마이크로플레이트의 각 웰에 100㎕씩 가하여 35℃ 내지 45℃, 바람직하게는 40℃에서 30분 내지 90분, 바람직하게는 60분 동안 배양하고, 200㎕의 150mM NaCl/0.1% Tween 20/100mM Tris-HCl(pH 7.5) 용액을 가하여 60℃에서 5분 내지 15분, 바람직하게는 10분 동안 방치한 다음, 동일 용액으로 3번 세척하였다. 세척한 각 웰에 알칼라인 포스파타아제의 기질인 pNPP(p-nitrophenylphosphate) 용액(Sigma, USA)을 100㎕씩 가하여 60분 내지 120분, 바람직하게는 90분 동안 상온배양하고, 1N NaOH를 가하여 효소-기질 반응을 중지시킨 다음, 효소 활성에 의한 발색을 ELISA 리더(ELISA reader)를 이용하여 405nm에서의 흡광도로 측정하였다.
실시예 2: 시료의 남성불임 관련 DNA 내 결실의 분석
남성불임과 관련된 AZF 부위 내에 존재하는 SY147, SY152, SY158, SY254, SY269, SPGY1, SRY, SY84 및 SY86을 이용하여, 전기 실시예 1과 동일한 방법으로 시료의 남성불임 관련 DNA의 결실을 분석하였다.
남성불임 관련 DNA를 증폭하기 위한 프라이머로서, 5'-AGCTTCTCTTTCTCGTTTGAT-3: SY147a(서열번호 1), 5'-CAGATGTAATTCCAATGTGCAG-3': SY147b(서열번호 2), 5'-AAGACAGTCTGCCATGTTTC-3': SY152a(서열번호 3), 5'-AGGAGGGTACTTAGCAGTAA-3': SY152b(서열번호 4), 5'-AGTTCCATGTGTGATGAAAGA-3': SY158a(서열번호 5), 5'-TTTACAGTGGTTTGTAGCGG-3': SY158b(서열버호 6), 5'-ACCAGAAGGCAAAATCGT-3': SY254a(서열번호 7), 5'-AACCGTATCTACCAAAGCAG-3': SY254b(서열번호 8), 5'-GACAAGTGTTCCTTGGAGAT-3': SY269a(서열번호 9), 5'-TGCATTGGCATGAATGTGTA-3': SY269b(서열번호 10), 5'-ACAGCCATTAAGTTTAGCAT-3': SPGY1a(서열번호 11), 5'-TGATAGTCTGAACACAAGCA-3': SPGY1b(서열번호 12), 5'-CATGAACGCATTCATCGTGTG-3': SRYa(서열번호 13), 5'-GGTCGATACTTATAATTCGGG-3':SRYb(서열번호 14), 5'-CAAAGAGAAGGGTCTGAAAG-3': SY84a(서열번호 15), 5'-GGCTTCATCAGCAAGACAAA-3': SY84b(서열번호 16), 5'-ACACACAGACTATGCTTCAG-3': SY86a(서열번호 17) 및, 5'-AGACACACACAGAGGGACAA-3': SY86b(서열번호 18)를 제작하였다(바이오니아, 한국).
부가의 프라이머로서, 5'-말단에 바이오틴이 결합된 5'-TGGAATATCAGCCAAGATGT-3': SY147c(서열번호 19), 5'-CTTAGCAGTAACNTTTCTGC-3': SY152c(서열번호 20), 5'-AGTGAGTTGATTAGCAGAATG-3': SY158c(서열번호 21), 5'-TCAGTTTCATCCATCTATGGA-3', SY254c(서열번호 22), 5'-TGTATTCATGGTCTTCTCGA-3': SY269c(서열번호 23), 5'-ACTTCTCCAAGAAGTACCTG-3': SPGY1c(서열번호 24), 5'-TATTTCTCTCTGTGCATGGC-3': SRYc(서열번호 25), 5'-CCTTTTGAAAGGAGTTAGCC-3': SY84c(서열번호 26) 및, 5'-GAGAAGACAGCATCTACAAC-3': SY86c(서열번호 27)를 제작하였다(바이오니아, 한국).
마이크로플레이트에 부착시키기 위한 탐침으로서, 5'-말단에 포스페이트가 결합된 스페이서를 포함하는 5'-TTTTTTTTTTTTTTTAGCTTCTCTTTCTCGTTTGAT-3': SY147p(서열번호 28),
5'-TTTTTTTTTTTTTTTAAGACAGTCTGCCATGTTTC-3': SY152p(서열번호 29),
5'-TTTTTTTTTTTTTTTAGTTCCATGTGTGATGAAAGA-3': SY158p(서열번호 30),
5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTACCAGAAGGCAAAATCGT-3': SY254p(서열번호 31),
5'-TTTTTTTTTTTTTTTGACAAGTGTTCCTTGGAGAT-3': SY269p(서열번호 32),
5'-TTTTTTTTTTTTTTTTACAGCCATTAAGTTTAGCAT-3': SPGY1p(서열번호 33),
5'-TTTTTTTTTTTTTTTCATGAACGCATTCATCGTGTG-3': SRYp(서열번호 34),
5'-TTTTTTTTTTTTTTTCAAAGAGAAGGGTCTGAAAG-3': SY84p 및(서열번호 35),
5'-TTTTTTTTTTTTTTTACACACAGACTATGCTTCAG-3': SY86p(서열번호 36)를 제작하였다(바이오니아, 한국).
전기 SY147p, SY152p, SY158p, SY254p, SY269p, SPGY1p, SRYp, SY84p 및 SY86p을 전기 실시예 1-1과 동일한 방법으로 마이크로플레이트의 각 웰에 부착시키고, 각각에 해당하는 전기 프라이머 a, b 및 c를 이용하여 전기 실시예 1-2와 동일한 방법으로 두 번의 PCR을 수행한 다음, 전기 실시예 1-3과 동일한 방법으로 PCR 결과를 확인하였다. 도 1은 부가의 프라이머를 이용하여 시료의 남성불임 관련 DNA의 결실을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 1에서 (-)는 PCR시 시료를 가하지 않은 음성대조군, (1)은 SY147, (2)는 SY152, (3)은 SY158, (4)는 SY254, (5)는 SY269, (6)은 SPGY1, (7)은 SRY, (8)은 SY84 및, (9)는 SY86을 나타낸다. 도 1에서 보듯이, 정상인의 경우에는 관련된 모든 DNA에서 흡광도가 높게 나타나는 반면, 환자 A의 경우 SY147, SY158, SY269 및 SPGY1에서 흡광도가 낮게 나타나고, 환자 B의 경우 SY152, SY158 및 SY269에서 흡광도가 낮게 나타나는 것을 알 수 있다. 이 결과로부터 환자 A는 SY147, SY158, SY269 및 SPGY1에서 결실이 일어났고, 환자 B는 SY152, SY158 및 SY269에서 결실이 일어난 것을 확인 할 수 있으며, 따라서 환자 A 및 환자 B는 남성불임이라고 진단할 수 있다.
실시예 3: 형광표지를 이용하여 남성불임 관련 DNA의 결실을 분석하는 방법
실시예 3-1: 유전자의 부착
남성불임 관련 DNA를 증폭하고 정제하여 고상 지지체에 부착시켰다: 남성불임 관련 DNA(100ng/㎕) 0.5㎕ 내지 2㎕, 바람직하게는 1㎕, 프라이머 a(100pmol/㎕) 및 b(100pmol/㎕) 0.1㎕ 내지 2㎕, 바람직하게는 0.5㎕, dNTP-Mix(10mM) 0.5㎕ 내지 2㎕, 바람직하게는 1㎕, 10 ×Taq 완충용액 3㎕ 내지 10㎕, 바람직하게는 5㎕, Taq 중합효소(1 내지 5unit/㎕, ClonTech, USA) 1㎕ 내지 5㎕, 바람직하게는 2.5㎕ 및 증류수의 조성으로 PCR 혼합액을 제조하였다. 전기 PCR 혼합액을 온도순환기에서 94℃에서 5분간 처리하고, 94℃에서 30초, 61℃에서 30초, 72℃에서 30초의 순환을 35번 반복한 다음, 72℃에서 10분 동안 반응을 유지하였다. PCR이 완료되면, 증폭산물을 포함하는 PCR 혼합액에 0.1배 부피의 3M 소디움 아세테이트(pH 5.2) 및 2.5배 부피의 100% 에탄올 또는 1.0배 부피의 이소프로판올을 가하여 -20℃에 6시간 이상 또는 -70℃에서 1시간 이상 방치한 후, 14,000rpm, 4℃에서 15분 동안 원심분리하였다. 그런 다음, 상층액을 버리고, 수득한 펠렛에 500㎕의 70% 에탄올을 가하여 전기와 동일한 조건으로 원심분리한 후, 상층액을 버리고 펠렛을 수득하였다. 수득한 펠렛을 상온에서 건조시켜 남아있는 에탄올을 모두 제거하고, 6㎕의 3x SSC에 현탁한 다음, 마이크로어레이를 이용하여 현탁된 유전자를 고상 지지체로 선택된 유리판(Cartetian, USA)에 점적하고, 80℃에서 1시간 동안 배양하여 남성불임 관련 DNA를 부착시킨 유리판을 제조하였다.
또한, 전기 사용한 프라이머 a 및 b를 모두 가하고, 멀티-PCR을 수행하여 증폭하고 정제한 시료 DNA를 남성불임 관련 DNA 대신에 유리판에 부착시켰다.
실시예 3-2: Cy5-dCTP를 이용한 시료 DNA의 표지
전기 실시예 1-1에서 사용한 모든 프라이머 a 및 b를 가하고, 멀티-PCR을 수행하여 시료 DNA를 증폭하고, Cy5-dCTP로 표지하였다: 시료 DNA(100ng/㎕) 0.5㎕ 내지 2㎕, 바람직하게는 1㎕, 프라이머 a(100pmol/㎕) 및 b(100pmol/㎕) 0.1㎕ 내지 2㎕, 바람직하게는 0.5㎕, dNTP-Mix(10mM) 0.5㎕ 내지 2㎕, 바람직하게는 1㎕, 10 ×Taq 완충용액 3㎕ 내지 10㎕, 바람직하게는 5㎕, Taq 중합효소(1 내지 5unit/㎕, ClonTech, USA) 1㎕ 내지 5㎕, 바람직하게는 2.5㎕ 및 증류수의 조성으로 PCR 혼합액을 제조하였다. 전기 PCR 혼합액을 온도순환기에서 94℃에서 5분간 처리하고, 94℃에서 1분, 60℃에서 1분, 72℃에서 1분의 순환을 30번 반복한 다음, 72℃에서 10분 동안 반응을 유지하였다. PCR이 완료되면, 증폭산물을 포함하는 PCR 혼합액에 0.1배 부피의 3M 소디움 아세테이트(pH 5.2) 및 1.0배 부피의 이소프로판올을 가하여 -70℃에 1시간 동안 방치한 후, 14,000rpm, 4℃에서 30분 동안 원심분리하였다. 그런 다음, 상층액을 제거하고 500㎕의 70% 에탄올을 가하여 전기와 동일한 조건으로 원심분리한 후, 다시 상층액을 제거하여 펠렛을 수득하였다. 수득한 펠렛을 상온에서 건조시켜 남아있는 에탄올을 모두 제거하고, 1ng/1㎕이 되도록 증류수에 현탁시켰다. 현탁된 DNA에 10㎕의 랜덤(random) 프라이머를 가하여 95℃에서 5분간 가열하고, 10㎕의 5x dCTP Buffer, 3㎕의 Cy5-dCTP, 1㎕의 클래노우 효소(Klenow-Fragment Enzyme)를 가하여 37℃에서 15분 동안 배양한 후, 2㎕의 정지용액(stop solution)을 가하여 반응을 중지시킴으로써, DNA를 형광표지하였다(Prime-It II Random Primer Labeling kit, Stratagene, USA).
또한, 전기 실시예 3-1에서 남성불임 관련 DNA 대신 시료의 DNA를 유리판에 부착시킨 경우를 위하여 전기와 동일한 방법으로 남성불임 관련 DNA 각각을 적절한 프라이머를 이용한 PCR을 통해 형광표지하였다.
실시예 3-3: 교잡반응
유리판에 부착된 남성불임 관련 DNA와 형광표지된 시료 DNA를 교잡시켰다: 남성불임 관련 DNA가 부착된 유리판을 1x SSC 용액에 1분간 방치하고, 60mJ의 UV를 처리한 후, 45mL의 1-메틸-2 피롤리딘(1-methyl-2 pyrrolidone)에 0.314g의 숙신산 무수물(succinic anhydride)을 용해시킨 후, 5mL의 1M 소디움 보레이트를 가하여 제조한 정지 용액에 15분 동안 방치하였다. 그런 다음, 전기 유리판을 95℃의 증류수에서 2분 동안 가열하고, 곧바로 에탄올에 넣었다가 500 rpm, 25℃에서 2분 동안 원심분리하여 유리판의 수분을 제거하였다. 전기 실시예 3-2의 방법으로 형광표지된 시료 DNA에 450㎕의 TE 완충용액을 가하여 혼합하고, 마이크론-30(Micron-30, Millipore, USA)을 사용하여 농축시켰다. 농축된 시료 DNA에 1.3㎕의 20x SSC 및 0.3㎕의 10% SDS를 가하여 혼합하고, 마이크로어레이를 이용하여 전기 남성불임관련 DNA가 부착된 유리판에 점적한 후, 커버글래스를 덮어 교잡 카세트(hybridization cassette)에 넣은 다음, 65℃에서 5시간 동안 배양하여 유리판에 부착된 남성불임 관련 DNA와 형광표지된 시료 DNA를 교잡시켰다. 5시간 후, 교잡이 완료된 전기 유리판을 2x SSC/0.2% SDS 용액에서 6분 동안 세척하고, 0.05x SSC에서 1분 동안 세척한 다음, 500rpm, 25℃에서 2분 동안 원심분리하였다. 원심분리를 통해 건조된 유리판의 DNA를 DNA 칩용 스캐너(Axon, USA)로 스캐닝하였다.
또한, 남성불임 관련 DNA 대신 유리판에 부착된 시료 DNA와 형광표지된 남성불임 관련 DNA의 교잡반응을 전기와 동일한 방법으로 수행하였다.
실시예 4: 시료의 남성불임 관련 DNA 내 결실의 분석
남성불임과 관련된 AZF 부위 내에 존재하는 SPGY1, SY127, SY158, SY254, SY255, MK5 및 SRY를 이용하여, 전기 실시예 3과 동일한 방법으로 시료의 남성불임 관련 DNA의 결실을 분석하였다.
실시예 4-1: 형광표지된 시료 DNA를 이용한 시료의 남성불임 관련 DNA 내 결실의 분석
SPGY1, SY127, SY158, SY254, SY255 및 MK5를 유리판에 부착시키고, 시료 유전자와 교잡반응시켜, 시료의 남성불임 관련 DNA의 결실을 분석하였다: 남성불임관련 DNA 및 시료 DNA를 증폭하기 위한 프라이머 5'-TTCACATACAGCCATTAAGTTTAGC-3': SPGY1a(서열번호 37), 5`-ACAATTTTGATAGTCTGAACACAAGC-3':SPGY1b(서열번호 38), 5'-TAGAGGCTAGGCTCACAAAC-3': SY127a(서열번호 39), 5'-AAGCTGCAGGCAGTAATAAG-3': SY127b(서열번호 40), 5`-CTCAGAAGTCCTCCTAATAGTTCC-3': SY158a(서열번호 41), 5'-ACAGTGGTTTGTAGCGGGTA-3': SY158b(서열번호 42), 5'-GGGTGTTACCAGAAGGCAAA-3': SY254a(서열번호 43), 5'-GACCGTATCTACCAAAGCAGCA-3': SY254b(서열번호 44), 5'-GTGCTGAGTTACAGGATTCG-3': SY255a(서열번호 45), 5'-TATGTGCTCGTCATGTGCAG-3': SY255b(서열번호 46), 5’-CACGCATATAGTAATACACGAGATA-3': MK5a(서열번호 47) 및 5'-AGATGCCACATAACTTGAGC-3': MK5b(서열번호 48)를 제작하였다(제노텍, 한국). 그런 다음, 전기 실시예 3-1과 동일한 방법으로 전기 남성불임 관련 DNA를 증폭하고 정제하여 유리판에 부착시키고, 전기 실시예 3-2와 동일한 방법으로 시료 DNA를 증폭하고 형광표지한 다음, 전기 실시예 3-3과 동일한 방법으로 유리판에 부착된 남성불임 관련 DNA와 형광표지된 시료 DNA를 교잡시키고, 형광분석하여 결과를 확인하였다. 도 2는 형광표지된 시료 DNA를 이용하여 시료의 남성불임 관련 DNA의 결실을 분석한 결과를 나타내는 사진이다. 도 2에서 보듯이, 정상인의 경우에는 관련된 모든 DNA에서 형광을 나타내는 반면, 환자의 경우 MK5, SY127 및 SY134에서만 형광을 나타내는 것을 알 수 있다. 이 결과로부터 환자는 SY158, SY254, SY255 및 SPGY1에서 결실이 일어난 것을 확인할 수 있으며, 따라서 환자는 남성불임이라고 진단할 수 있다.
실시예 4-2: 형광표지된 남성불임 관련 DNA를 이용한 시료의 남성불임 관련 DNA 내 결실의 분석
SPGY1, SY127, SY158, SY254, SY255, MK5 및 SRY와 유리판에 부착시킨 시료 DNA의 교잡반응을 통해, 시료의 남성불임 관련 DNA의 결실을 분석하였다: 남성불임 관련 DNA 및 시료 DNA를 증폭하기 위한 프라이머로서, 5'-TTCACATACAGCCATTAAGTTTAGC-3': SPGY1a(서열번호 37), 5`-ACAATTTTGATAGTCTGAACACAAGC-3': SPGY1b(서열번호 38), 5'- TAGAGGCTAGGCTCACAAAC-3': SY127a(서열번호 39), 5'-AAGCTGCAGGCAGTAATAAG-3': SY127b(서열번호 40), 5`-CTCAGAAGTCCTCCTAATAGTTCC-3': SY158a(서열번호 41), 5'-ACAGTGGTTTGTAGCGGGTA-3': SY158b(서열번호 42), 5'-GGGTGTTACCAGAAGGCAAA-3': SY254a(서열번호 43), 5'-GACCGTATCTACCAAAGCAGCA-3': SY254b(서열번호 44), 5'- GTGCTGAGTTACAGGATTCG-3': SY255a(서열번호 45), 5'-TATGTGCTCGTCATGTGCAG-3': SY255b(서열번호 46), 5;-CACGCATATAGTAATACACGAGATA-3': MK5a(서열번호 47), 5'- AGATGCCACATAACTTGAGC-3': MK5b(서열번호 48), 5'-CATGAACGCATTCATCGTGTG-3': SRYa(서열번호 13) 및 5'-GGTCGATACTTATAATTCGGG-3': SRYb(서열번호 14)를 제작하였다(제노텍, 한국). 전기 제작한 프라이머를 이용하여 전기 실시예 3-1과 동일한 방법으로 시료 DNA를 증폭하고 정제하여 유리판에 부착시키고, 전기 실시예 3-2과 동일한 방법으로 남성불임 관련 DNA를 증폭하고 형광표지한 다음, 전기 실시예 3-3과 동일한 방법으로 유리판에 부착된 시료 DNA와 형광표지된 남성불임 관련 유전자를 교잡시키고, 형광분석하여 결과를 확인하였다. 전기 결과 중 유리판에 부착시킨 시료 DNA와 SPGY1을 교잡시킨 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3은 형광표지된 남성불임 관련 DNA를 이용하여 시료의 남성불임 관련 DNA 중 SPGY1의 결실을 분석한 결과를 나타내는 사진이다. 도 3에서 보듯이, 정상인의 경우에는 SPGY1에 대하여 모두 형광을 나타내는 반면, 환자의 경우 형광을 나타내지 않는 것을 알 수 있다. 이 결과로부터 환자는 SPGY1에서 결실이 일어난 것을 확인할 수 있으며, 따라서 환자는 남성불임이라고 진단할 수 있다.
이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 남성불임 관련 DNA를 검출(detection)하기 위한 탐침 또는 남성불임 관련 DNA를 부착시킨 고상 지지체, PCR 혼합물과 세척용 완충용액을 포함하는 남성불임 진단키트 및 전기 남성불임 진단키트를 이용하여 남성불임 관련 DNA의 결실을 분석하는 방법을 제공한다. 본 발명에 의하면, 고상 지지체에 탐침 또는 남성불임 관련 DNA를 부착시키고, 바이오틴이 결합되거나 또는 형광물질로 표지된 시료 DNA를 전기 고상 지지체에 부착된 DNA와 반응시킨 다음, 전기 바이오틴과 반응하는 효소 및 전기 효소의 기질을 가하고 효소활성을 측정하거나 또는 형광물질의 형광을 측정함으로써, 대량의 시료를 정확하고 신속하게 분석할 수 있다.
<110> GenoCheck Co. Ltd. <120> A Diagnostic Kit for Male Sterility and a Method for Detecting De letion of Male Sterility-related DNA Using the Same <160> 48 <170> KopatentIn 1.6 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer SY147a <400> 1 agcttctctt tctcgtttga t 21 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer SY147b <400> 2 cagatgtaat tccaatgtgc ag 22 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer SY152a <400> 3 aagacagtct gccatgtttc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer SY152b <400> 4 aggagggtac ttagcagtaa 20 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer SY158a <400> 5 agttccatgt gtgatgaaag a 21 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer SY158b <400> 6 tttacagtgg tttgtagcgg 20 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer SY254a <400> 7 accagaaggc aaaatcgt 18 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer SY254b <400> 8 aaccgtatct accaaagcag 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer SY269a <400> 9 gacaagtgtt ccttggagat 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SY269b <400> 10 tgcattggca tgaatgtgta 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer SPGY1a <400> 11 acagccatta agtttagcat 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer SPGY1b <400> 12 tgatagtctg aacacaagca 20 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer SRYa <400> 13 catgaacgca ttcatcgtgt g 21 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer SRYb <400> 14 ggtcgatact tataattcgg g 21 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer SY84a <400> 15 caaagagaag ggtctgaaag 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer SY84b <400> 16 ggcttcatca gcaagacaaa 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> 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Claims (14)

  1. (i) 남성불임 관련 DNA를 증폭하기 위한 프라이머의 염기서열을 포함하는 탐침을 부착시킨 고상 지지체; (ii) 남성불임 관련 DNA를 증폭하기 위한 프라이머, dNTP, DNA 중합효소 및 완충용액으로 구성된 PCR 혼합물; (iii) 전기 프라이머가 주형 DNA에 결합하는 부위보다 3'-말단쪽에 위치하는 15개 내지 30개의 염기로 구성되고, 5'-말단에 바이오틴이 결합되어 있는 부가의 프라이머; (iv) 표지효소가 결합된 스트랩트아비딘 및 전기 표지효소의 기질; 및, (v) PCR 후의 세척용 완충용액 및 표지효소 반응 후의 세척용 완충용액을 포함하는 남성불임 진단키트.
  2. 제 1항에 있어서,
    고상 지지체는 플라스틱으로 제조되는 것을 특징으로 하는
    남성불임 진단키트.
  3. 제 1항에 있어서,
    표지효소는 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase)이고, 기질 은 p-니트로페닐 포스페이트(p-nitrophenylphosphate, pNPP), 5-브로 모-4-클로로-3-인돌일포스페이트(5-bromo-4-chloro-3-indolylphosphate) 또는 나프톨 AS-TR 포스페이트(naphthol AS-TR phosphate) 인 것을 특징으로 하는
    남성불임 진단키트,
  4. 제 1항에 있어서,
    표지효소는 페록시다아제(peroxidase)이고, 기질은 페닐렌다이아민 (phenylenediamine), 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(3,3',5,5'-tetra methylbenzidine), 다이아니시딘(dianisidine), 아미노살리실릭 산 (aminosalicylic acid), 3,3'-다이아미노벤지딘(3,3'-diaminobenzi dine), 3-아미노-9-에틸카바졸(3-amino-9-ethylcarbazole) 또는 4-클 로로-1-나프톨(4-chloro-1-naphthol)인 것을 특징으로 하는
    남성불임 진단키트.
  5. 다음의 각 단계를 포함하는 제 1항의 남성불임 진단키트를 이용하여 남성불임 관련 DNA의 결실을 분석하는 방법:
    (i) 시료 DNA를 제 1항의 남성불임 진단키트의 고상 지지체에 PCR 혼합물 과 함께 가하여 첫번째 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하고, 곧바로 부 가의 프라이머를 가하여 두번째 PCR을 수행한 다음, 지지체를 PCR 후의 세척용 완충용액으로 세척하는 단계; 및,
    (ii) 전기 세척한 지지체에 표지효소가 결합된 스트랩트아비딘을 가하여 부 가의 프라이머에 결합되어 있는 바이오틴과 결합시키고, 전기 표지효 소의 기질을 가하여 반응시킨 다음, 표지효소 반응 후의 세척용 완충 용액으로 세척하고, 표지효소의 활성을 측정하여, 남성불임 관련 DNA 의 결실을 분석하는 단계.
  6. 제 5항에 있어서,
    시료 DNA는 혈액, 정액 또는 모근세포에서 추출되는 것을 특징으로 하 는
    제 1항의 남성불임 진단키트를 이용하여 남성불임 관련 DNA의 결실을 분석하는 방법.
  7. 제 5항에 있어서,
    표지효소의 활성은 발색 또는 흡광으로 측정하는 것을 특징으로 하는
    제 1항의 남성불임 진단키트를 이용하여 남성불임 관련 DNA의 결실을 분석하는 방법.
  8. (i) 탐침(서열번호 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 및 36)을 부착시킨 마이크로플레이트; (ii) 남성불임 관련 DNA를 증폭하기 위한 프라이머(서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 및 18), dNTP, Taq 중합효소 및 완충용액으로 구성된 PCR 혼합물; (iii) 5'-말단에 바이오틴이 결합되어 있는 부가의 프라이머(서열번호 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 및 27); (iv) 알칼라인 포스파타아제가 결합된 스트랩트아비딘 및 전기 효소의 기질인 pNPP; 및, (v) PCR 후의 세척용 완충용액 0.5x SSC/0.1% Tween 20 및 효소반응 후의 세척용 완충용액 150mM NaCl/0.1% Tween 20/100mM Tris-HCl(pH 7.5)을 포함하는 남성불임 진단키트.
  9. (i) 남성불임 관련 DNA를 부착시킨 고상 지지체; (ii) 남성불임 관련 DNA를 증폭하기 위한 프라이머, dNTP, 형광물질이 결합된 dNTP, DNA 중합효소 및 완충용액으로 구성된 PCR 혼합물; 및, (iii) 교잡반응 후의 세척용 완충용액을 포함하는 남성불임 진단키트.
  10. 제 9항에 있어서,
    고상 지지체는 유리로 제조되는 것을 특징으로 하는
    남성불임 진단키트.
  11. 제 9항에 있어서,
    형광물질이 결합된 dNTP는 아미노다이곡시제니-9-dNTP(aminodigoxi genie-9-dNTP), 쿠마린-5-dUTP(coumarin-5-dUPT), 시아닌-3- dNTP (cyanine-3-dNTP ), 시아닌-5-dNTP(cyanine-5-dNTP, Cy5-dNTP), DNP- dNTP, 플루오레신 클로로트리아지닐-4- dUTP(fluorescein chloro triazinyl-4- dUTP), 플루오레신-dUTP(fluorescein-dUTP), 리사민- dUTP(lissamine-dUTP), 나프토플루오레신-dUTP(napthofluorescein- dUTP), 피렌-dUTP (pyrene-dUTP), 테트라메틸로다민-6-dUTP (tetra methylrhodamine-6-dUTP) 또는 텍사스 레드-dUTP(texas red-dUTP)인 것을 특징으로 하는
    남성불임 진단키트.
  12. 다음의 각 단계를 포함하는 제 9항의 남성불임 진단키트를 이용하여 남성불임 관련 DNA의 결실을 분석하는 방법:
    (i) 시료 DNA를 제 9항의 남성불임 진단키트의 PCR 혼합물과 혼합하고, PCR을 수행함으로써, 시료 DNA를 형광표지하는 단계; 및,
    (ii) 전기 형광표지된 시료 DNA를 전기 남성불임 진단키트의 고상 지지체에 가하여 교잡시키고, 교잡반응 후의 세척용 완충용액으로 세척한 후, 형광분석하여, 남성불임 관련 DNA의 결실을 분석하는 단계.
  13. 제 12항에 있어서,
    시료 DNA는 혈액, 정액 또는 모근세포에서 추출되는 것을 특징으로 하 는
    제 9항의 남성불임 진단키트를 이용하여 남성불임 관련 DNA의 결실을 분석하는 방법.
  14. (i) 남성불임 관련 DNA인 SPGY1, SY127, SY158, SY254, SY255, MK5 및 SRY를 부착시킨 유리판; (ii) 남성불임 관련 DNA를 증폭하기 위한 프라이머(서열번호 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47 및 48), dNTP, Cy5-dCTP, Taq 중합효소 및 완충용액을 포함하는 PCR 혼합물; 및, (iii) 교잡반응 후의 세척용 완충용액 2x SSC/0.2% SDS 및 0.5x SSC를 포함하는 남성불임 진단키트.
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