KR100908691B1 - Ｙ 염색체 미세결실 검출을 위한 남성 불임 진단용 키트 - Google Patents

Ｙ 염색체 미세결실 검출을 위한 남성 불임 진단용 키트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 남성 불임과 관련성을 갖는 Y 염색체 상의 유전자의 미세결실을 검출하는 단계를 포함하는 남성 불임의 진단방법 및 상기 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머쌍을 포함하는 Y 염색체 미세결실 검출용 키트에 관한 것이다.
본 발명에 따른 진단 방법 및 검출용 키트는 STS 마커가 아닌 Y 염색체 상의 유전자를 대상으로 Y 염색체의 미세결실을 진단하므로, STS 마커를 사용하는데 따른 문제점, 즉 결실 부위를 제대로 판별하지 못하는 문제점 등을 해결할 수 있다. 또한, 남성 불임과 관련되는 Y 염색체의 Yp, AZFa, AZFb, AZFc에 위치하는 다양한 유전자들의 미세결실을 다중 중합효소연쇄반응(Multiplex-Polymerase Chain Reaction; M-PCR) 방법에 의해 동시에 검출함으로써, 정자형성 과정에 관여하는 유전자에 있어서, 각각의 불임 환자에게 발생하는 특정 유전자의 미세결실을 분자생물학적 레벨에서 판별할 수 있으며, 대량의 시료를 간편하고, 정확하며, 신속하게 분석할 수 있다.
남성 불임, Y 염색체, 미세결실, 다중 중합효소연쇄반응

Description

Ｙ 염색체 미세결실 검출을 위한 남성 불임 진단용 키트{Diagnostic kits for male infertility for detecting Y chromosomal microdeletion}
도 1은 남성 불임과 관련된 Y 염색체 상의 유전자 및 STS 마커의 위치를 나타낸 모식도이다.
도 2는 본 발명의 진단방법 및/또는 검출용 키트에 사용된 다중 중합효소연쇄반응((Polymerase Chain Reaction; PCR) 세트의 조합을 나타낸다.
도 3은 본 발명의 진단방법 및/또는 검출용 키트를 사용하여, 정상인의 gDNA를 대상으로 다중 중합효소연쇄반응을 수행한 결과를 나타낸다.
도 4는 본 발명의 진단방법 및/또는 검출용 키트(복수의 M-PCR 세트)를 사용하여, 불임 환자의 gDNA를 대상으로 다중 중합효소연쇄반응을 수행한 결과를 나타낸다.
도 5는 본 발명에 의해 밝혀진 남성 불임과 관련된 Y 염색체 상의 유전자의 미세결실을 전체적으로 나타낸 모식도이다. 도 5에서 알 수 있는 바와 같이, AZFc에 위치하는 TTTY5, TTTY6, 및 TTTY17은 대부분의 남성 불임환자에서 미세결실을 나타낸다.
본 발명은 남성 불임의 진단 방법 및 Y 염색체 미세결실 검출용 키트에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 남성 불임과 관련성을 갖는 Y 염색체 상의 유전자의 미세결실을 검출하는 단계를 포함하는 남성 불임의 진단방법 및 상기 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머쌍을 포함하는 Y 염색체 미세결실 검출용 키트에 관한 것이다.
일반적으로, 남성불임의 진단은 일차적으로 비뇨기과적 진찰이나 정액검사로 이루어지며, 그 결과 남성불임으로 진단받은 경우에는 정밀검사를 통한 진단이 행해진다. 남성불임의 정밀 진단방법으로는 고환조직의 생검 방법, 항-정자 항체 검사방법, 혈액 내 호르몬 검사방법 및 염색체 검사방법이 있다.
고환조직의 생검 방법은 정자감소증(ologozoospermia), 정자사멸증, 무정자증(azoospermia) 등과 같은 심한 이상이 발견된 경우, 고환조직의 일부를 채취하여 직접 검사하는 방법으로, 정액 내에 정자가 없다고 하더라도 정자의 제조원인 고환의 기능이 정상적이라면, 높은 성공률로 치료할 수 있다. 항-정자 항체 검사방법은 정자에 대한 항체의 존재 유무를 분석하는 방법이다. 정자에 대한 항체는 자연스럽게 생기기도 하지만, 일반적으로 염증이나 외상 후 또는 피임을 목적으로 정관 수술을 했다가 복원한 경우에 많이 관찰된다. 검사 결과 정자 표면에서 항-정자 항체가 높은 수치로 관찰될 경우에는 인공 수정법으로도 수정이 어려우며, 시험관 아기를 실시한다 하더라도 수정에 실패할 확률이 높으므로 특수 처리가 필요하다. 혈액 내 호르몬 검사방법은 남성 호르몬의 체내 수치를 검사하는 방법으로, 남성의 정자 는 체내 남성호르몬이 일정 수치 이상으로 유지되어야만 정상적으로 생산된다는 사실에 근거한다. 염색체 검사방법은 남성의 염색체 중에서도 특히 성염색체(Y chromosome)의 이상을 검사하는 방법이다.
남성불임은 Y 염색체의 오른쪽 긴 부분에 위치한 AZF(Azoospermia factor) 부위와 관련되어 있음이 Tiepolo와 Zuffardi에 의해 알려졌고(Tiepolo, L. and Zuffardi, O., Location of factor controlling spermatogenesis in the nonfluorescent portion of the human Y chromosome long arm, Human Gent., 1976, 34, 119-124), AZF 부위는 AZFa, AZFb, AZFc의 세 부분으로 구분할 수 있으며(Vogt, P.H., Edelmann, A., Hirschmann, P., Shan, Z., Tenscher, S., Urbitsch, P., The Y chromosomes and in fertility in the male, Abstracts of the 12th Ammual Meeting of the EHSRE, 1996, 32), Y 염색체의 많은 연구 결과로부터 불임남성의 약 10%에서 이 세 부분에서의 결실이 발견되며, 특히, 무정자증 또는 심각한 정자감소증과 관련되어 있다는 사실이 밝혀졌다 (Vogt, P.H., Human chromosome deletions in Yq11, AZF candidate genes and male infertility: history and update, Molecular Human Reproduction, 1998, 4, 739-744).
남성 불임과 관련된 Y 염색체 상의 유전자로는 SRY, HSFY2, CDY2, BPY2, CDY1, PRY, DAZ 등이 제시된 바 있다 (Koopman P., Sry and Sox9: mammalian testis-determining genes., Cell Mol Life Sci . 1999 Jun; 55(6-7): 839-56; Tessari A, et al., Characterization of HSFY, a novel AZFb gene on the Y chromosome with a possible role in human spermatogenesis, Mol Hum Reprod . 2004 Apr; 10(4): 253-8; Kleiman SE, et al., Members of the CDY family have different expression patterns: CDY1 transcripts have the best correlation with complete spermatogenesis, Hum Genet. 2003 Nov; 113(6): 486-92; Tse JY, et al, Specific expression of VCY2 in human male germ cells and its involvement in the pathogenesis of male infertility, Biol Reprod . 2003 Sep;69(3):746-51; Kleiman SE, et al., Members of the CDY family have different expression patterns: CDY1 transcripts have the best correlation with complete spermatogenesis, Hum Genet. 2003 Nov;113(6):486-92; Stouffs K, et al., Expression pattern of the Y-linked PRY gene suggests a function in apoptosis but not in spermatogenesis, Mol Hum Reprod. 2004 Jan;10(1):15-21; Ferlin A, et al, A novel approach for the analysis of DAZ gene copy number in severely idiopathic infertile men, J Endocrinol Invest. 2002 Jan;25(1):RC1-3; 미국특허 제5,776,682호; 제5,783,390호; 및 제5,840,549호)
한편, 사용되고 있는 염색체 검사 방법에 의한 남성 불임의 진단 방법은 Y 염색체 상의 STS (Sequence Tagged Site) 마커를 이용하여 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)을 수행하여 얻어진 PCR 산물을 겔(Gel) 상에서 확인하는 방법이다. 이는 비교적 간편하고 과정이 용이하기 때문에 널리 이용되고 있다. 그러나 STS 마커는 진단하는 병원이나 기관에 따라 선택하는 기준이 상이하여 그 개수나 종류에 차이가 있어 체계적인 진단 방법의 필요성이 있으며, AZFc 부분에 위치하는 STS 마커들이 주로 사용되고 있어 결실 부위를 제대로 판별하지 못하는 경우가 발생할 수 있다.
또한, 정자형성 과정에는 하나 이상의 다양한 유전자들이 관여하고 있다고 알려져 있으므로, 종래에 남성 불임과 관련되는 것으로 알려진 유전자 만으로는 불임을 야기하는 결실 부위를 분자생물학적 레벨에서 판별하는 것이 곤란하다.
본 발명자들은 STS 마커가 아닌 Y 염색체 상의 유전자로서, 남성 불임과 관련되는 유전자들에 대한 다양한 검색을 수행하였으며, 놀랍게도 Y 염색체의 Yp, AZFa, AZFb, AZFc에 위치하는 다양한 유전자가 남성 불임과 관련된다는 것을 발견하였다.
따라서, 본 발명은 상기 Y 염색체의 Yp, AZFa, AZFb, AZFc에 위치하는 유전자의 미세결실을 검출하는 단계를 포함하는 남성 불임의 진단 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머쌍을 포함하는, 남성 불임과 관련된 Y 염색체의 미세결실 검출용 키트를 제공하는 것을 포함한다.
본 발명의 일 태양에 따라, 남성 환자로부터 분리한 gDNA 시료 중, TMSB4Y, AMELY, RPS4Y2, VCY, ZFY, TBL1Y, SMCY, XKRY, CYorf15A, NLGN4Y, EIF1AY, UTY, RBM1, CYorf15B, TTTY5, TTTY6, TTTY17, 및 DDX3Y로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 유전자의 미세결실을 검출하는 단계를 포함하는, 남성 불임의 진단 방법이 제공된다.
본 발명의 다른 태양에 따라, TMSB4Y, AMELY, RPS4Y2, VCY, ZFY, TBL1Y, SMCY, XKRY, CYorf15A, NLGN4Y, EIF1AY, UTY, RBM1, CYorf15B, TTTY5, TTTY6, TTTY17, 및 DDX3Y로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머쌍을 포함하는, 남성 환자로부터 분리한 gDNA 시료 중의 상기 유전자의 미세결실 검출용 키트가 제공된다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명에 따른 진단 방법 및 검출용 키트는 STS 마커가 아닌 Y 염색체 상의 유전자를 대상으로 Y 염색체의 미세결실을 진단하므로, STS 마커를 사용하는데 따른 문제점, 즉 결실 부위를 제대로 판별하지 못하는 문제점 등을 해결할 수 있다. 또한, 남성 불임과 관련되는 Y 염색체의 Yp, AZFa, AZFb, AZFc에 위치하는 다양한 유전자들의 미세결실을 다중 중합효소연쇄반응(Multiplex-Polymerase Chain Reaction; M-PCR) 방법에 의해 동시에 검출함으로써, 정자형성 과정에 관여하는 유전자에 있어서, 각각의 불임 환자에게 발생하는 특정 유전자의 미세결실을 분자생물학적 레벨에서 판별할 수 있으며, 대량의 시료를 간편하고, 정확하며, 신속하게 분석할 수 있다.
본 발명의 진단방법은 남성 환자로부터 gDNA 시료를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 gDNA는 환자의 혈액, 머리카락, 구강 내의 상피조직 등으로부터 통상의 방법에 따라 분리할 수 있으며, 이 중 혈액은 다른 조직들에 비해 gDNA를 분리했을 시 많은 양을 얻을 수 있으므로, 혈액으로부터 분리하는 것이 바람직하다.
본 발명에 의해 남성 불임과 관련성을 가지는 것으로 새롭게 입증된 Y 염색 체 상의 유전자들은 TMSB4Y, AMELY, RPS4Y2, VCY, ZFY, TBL1Y, SMCY, XKRY, CYorf15A, NLGN4Y, EIF1AY, UTY, RBM1, CYorf15B, TTTY5, TTTY6, TTTY17, 및 DDX3Y 로서, NCBI Gene bank의 Gene ID, Y 염색체상의 위치, 및 크기(bp)는 다음 표 1과 같다.
유전자 Gene ID 위치 크기(bp)
1 TMSB4Y 9087 AZFb 247 bp
2 AMELY 266 Yp 402 bp
3 RPS4Y2 140032 AZFb 519 bp
4 VCY 9084 AZFb 600 bp
5 ZFY 7544 Yp 170 bp
6 TBL1Y 90665 Yp 410 bp
7 SMCY 8284 AZFb 555 bp
8 XKRY 9082 AZFb 662 bp
9 CYorf15A 246126 AZFb 191 bp
10 NLGN4Y 22829 AZFb 296 bp
11 EIF1AY 9086 AZFb 409 bp
12 UTY 7404 AZFa 461 bp
13 RBM1 5940 AZFb 635 bp
14 CYorf15B 84663 AZFb 150 bp
15 TTTY5 83863 AZFc 196 bp
16 TTTY6 84672 AZFc 243 bp
17 TTTY17 252949 AZFc 300 bp
18 DDX3Y 8653 AZFa 354 bp
특히, 상기 남성 불임과 관련성을 가지는 것으로 새롭게 입증된 Y 염색체 상의 유전자들 중, AZFc에 위치하는 TTTY5, TTTY6, 및 TTTY17은 대부분의 남성 불임환자에서 미세결실을 나타냄으로써, 남성불임의 진단 또는 진단키트의 구성에 있어서 바람직한 표적(target)으로 사용될 수 있다 (도 5 참조).
남성 불임 진단을 위한 상기 유전자들의 미세결실 검출은 상기 유전자들을 증폭할 수 있는 프라이머쌍을 사용하여 환자의 gDNA 시료를 중합효소연쇄반응 등을 수행하여 증폭하고, 얻어진 산물 중에 상기 유전자들의 증폭된 산물이 존재하는지 여부를 검출함으로써 수행할 수 있다. 상기 프라이머 쌍은 NCBI Gene bank에 공지된 Y 염색체의 뉴클레오티드 서열로부터 제작할 수 있으며, 그 예는 하기 표 2에 나타낸 바와 같다.
유전자 서열번호 방향 서열
TMSB4Y 3 정방향 5'-GAAACCCCTTAATCATCCCATC-3'
4 역방향 5'-GTCCTTTCAAACTCATCCAACG-3'
AMELY 7 정방향 5'-CAAAATGCCCGTTTGGTCTA-3'
8 역방향 5'-TAGGTGTGGAAGCTTGCTGG-3'
RPS4Y2 9 정방향 5'-CAGAACATTGGAAGTTTCCCC-3'
10 역방향 5'-ATCACACCAACACGACCGAG-3'
VCY 11 정방향 5'-AGGCAGCCTGGAGTTAGTC-3'
12 역방향 5'-AGATGGGCGCCCCTTACTC-3'
ZFY 13 정방향 5'-TCAGCCTTCTCCTTTGGGTT-3'
14 역방향 5'-CCCAGTTTTTCAAAGCCCTC-3'
TBL1Y 17 정방향 5'-CTGGAAGGAGCCATGTGATG-3'
18 역방향 5'-TGCCACTGGACATAGGAGGA-3'
SMCY 19 정방향 5'-TCCATTTTCCCAGGTTTGTG-3'
20 역방향 5'-CTTAGCCATAAGGCCCAAGC-3'
XKRY 21 정방향 5'-ACACAGCAAAATCTGGCAGC-3'
22 역방향 5'-GCTTAATGGCAGCAAAGTCG-3'
CYorf15A 23 정방향 5'-ATACGGGAGGATGTGTGTAG-3'
24 역방향 5'-ACCCTAGGTTTTCTCCTCTG-3'
NLGN4Y 25 정방향 5'-CCCTCTGTGGGACCAATTCT-3'
26 역방향 5'-TTTCTGGCCTGTATCTGGCA-3'
EIF1AY 27 정방향 5'-CAGCACAATACAGCACATTCGT-3'
28 역방향 5'-CATCTCCAATATCGTCAAACTGG-3'
UTY 29 정방향 5'-TCTCTTTCTGCCTTCCTTTGTG-3'
30 역방향 5'-GACAAAAGATGATTACTGGCCG-3'
RBM1 31 정방향 5'-GTCGCGTGTCTGATTTGCTT-3'
32 역방향 5'-TTATCCGGAAACCATCCTCC-3'
CYorf15B 33 정방향 5'-AGTTCCAGGTTGATTGTGATGG-3'
34 역방향 5'-AGGACTGTCTGGCCATTTGTAA-3'
TTTY5 35 정방향 5'-AGGATCTCGGAATCTACAAGGG-3'
36 역방향 5'-GATTGCAGATCCACAGGCTTAC-3'
TTTY6 37 정방향 5'-CTCCATTCATCCTGAGTCTTGC-3'
38 역방향 5'-CTCATGTGAGCCTTGATTTTCC-3'
TTTY17 39 정방향 5'-TAGCAGGATAACCACGTCCACT-3'
40 역방향 5'-GTGAGCTGAGATTGTGCAAACA-3'
DDX3Y 41 정방향 5'-CCCGATTTTTCGCTTCTCTT-3'
42 역방향 5'-ACGGGACAAGCAAACACAAA-3'
즉, 본 발명의 진단방법은 상기 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머쌍을 사용한 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction; PCR)에 의해 수행될 수 있으며, 상기 프라이머쌍은 서열번호 3 및 4; 서열번호 7 및 8; 서열번호 9 및 10; 서열번호 11 및 12; 서열번호 13 및 14; 서열번호 17 및 18; 서열번호 19 및 20; 서열번호 21 및 22; 서열번호 23 및 24; 서열번호 25 및 26; 서열번호 27 및 28; 서열번호 29 및 30; 서열번호 31 및 32; 서열번호 33 및 34; 서열번호 35 및 36; 서열번호 37 및 38; 서열번호 39 및 40; 및 서열번호 41 및 42로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택될 수 있다. 바람직하게는 상기 프라이머쌍은 서열번호 35 및 36; 서열번호 37 및 38; 서열번호 39 및 40; 및 서열번호 41 및 42로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택될 수 있다.
또한, 상기 유전자들의 미세결실의 검출은 2 종 이상의 유전자를 동시에 증폭할 수 있는 2종 이상의 프라이머쌍을 사용한 다중 중합효소연쇄반응(Multiplex-Polymerase Chain Reaction; M-PCR)에 의해 바람직하게 수행될 수 있다. 즉, 상기 유전자들의 미세결실의 검출은 TMSB4Y, AMELY, RPS4Y2, VCY, ZFY, TBL1Y, SMCY, XKRY, CYorf15A, NLGN4Y, EIF1AY, UTY, RBM1, CYorf15B, TTTY5, TTTY6, TTTY17, 및/또는 DDX3Y 의 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머쌍을 사용한 다중 중합효소연쇄반응에 의해 바람직하게 수행될 수 있으며, 상기 프라이머쌍은 표 2에 나타낸 프라이머쌍, 즉, 서열번호 3 및 4; 서열번호 7 및 8; 서열번호 9 및 10; 서열번호 11 및 12; 서열번호 13 및 14; 서열번호 17 및 18; 서열번호 19 및 20; 서열번호 21 및 22; 서열번호 23 및 24; 서열번호 25 및 26; 서열번호 27 및 28; 서열번호 29 및 30; 서열번호 31 및 32; 서열번호 33 및 34; 서열번호 35 및 36; 서열번호 37 및 38; 서열번호 39 및 40; 및 서열번호 41 및 42로 이루어진 군으로부터 2 종 이상 선택될 수 있다. 바람직하게는 상기 프라이머쌍은 서열번호 35 및 36; 서열번호 37 및 38; 서열번호 39 및 40; 및 서열번호 41 및 42로 이루어진 군으로부터 2종 이상 선택될 수 있다.
상기 다중 중합효소연쇄반응은 상기 프라이머쌍, DNA 중합효소, dNTP, 및 완충액(예를 들어, Tris-Cl, KCl, (NH4)2SO4, 15mM MgCl2; pH8.7)를 포함하는 PCR 시료[즉, 마스터 믹스(Master Mix)]를 구성하고, 이를 다중 중합효소연쇄반응 장치를 사용하여 수행할 수 있다. 다중 중합효소연쇄반응에 사용되는 상기 PCR 시료의 양은 약 25 ul일 수 있으며, 약 30 사이클을 수행될 수 있다.
또한, 상기 다중 중합효소연쇄반응은 남성 불임과 관련되는 것으로 알려진 유전자들을 검출할 수 있는 프라이머쌍과 상기 표 2에 열거한 프라이머쌍을 조합하여 복수의 M-PCR 세트를 제작하여 수행할 수도 있다. 상기 남성 불임과 관련되는 것으로 알려진 유전자, NCBI Gene bank의 Gene ID, Y 염색체상의 위치, 크기(bp), 및 사용가능한 프라이머쌍은 다음 표 3과 같다.
유전자 Gene ID 위치 크기(bp) 서열번호 방향 크기(bp)
SRY 6736 Yp 313bp 5 정방향 5'-CGAACTCTGGCACCTTTCAA-3'
6 역방향 5'-CTGATTTCGCATTCTGGGA-3'
HSFY2 159119 AZFb 282bp 15 정방향 5'-AACCATTGTGATGGTCTAGATAAG-3'
16 역방향 5'-GGATCCTTGTGACAAAACCTG-3'
CDY2 9426 AZFb 176bp 43 정방향 5'-GACCACAAGAAAACTGTGAGTGG-3'
44 역방향 5'-AGTGGGTGCATCTGAGTCTTG-3'
BPY2 9083 AZFc 261bp 45 정방향 5'-ACTTTCCTTTCTTGTCCCTGCT-3'
46 역방향 5'-CCATTCTCACTTCATTTCTGGC-3'
CDY1 9085 AZFc 317bp 47 정방향 5'-GGCGAAAGCTGACAGCAAG-3'
48 역방향 5'-CCTTAGTTCTTGTGTCCTGAGCA-3'
PRY 9081 AZFc 409bp 49 정방향 5'-AGCCTACTTCATCTCAGGACCC-3'
50 역방향 5'-ACCAGAATCTCTGCCAGAAACA-3'
DAZ(1) DAZ(2) DAZ(3) DAZ(4) 1617 57055 57054 57135 AZFc 512bp 51 정방향 5'-AAATGCAGTAACCTCGGCTTTA-3'
52 역방향 5'-ATGTATCTGTGGGCAAAGTGCT-3'
상기 복수의 M-PCR 세트를 이용한 다중 중합효소연쇄반응은, 상기한 바와 같이, 상기 프라이머쌍, DNA 중합효소, 및 dNTP를 포함하는 M-PCR 세트[즉, 마스터 믹스(Master Mix)]를 구성하고, 이를 다중 중합효소연쇄반응 장치를 사용하여 수행할 수 있다. 다중 중합효소연쇄반응에 사용되는 상기 PCR 시료의 양은 약 25 ul일 수 있으며, 약 30 사이클을 수행될 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 남성 불임의 진단방법은 본 발명에 의해 남성 불임과 관련되는 것으로 새롭게 밝혀진 유전자들(표 1 및 2) 및 상기 남성 불임과 관련되는 것으로 알려진 유전자들(표 3)을 증폭할 수 있는 프라이머쌍, DNA 중합효소, 및 dNTP를 포함하는, 복수의 M-PCR 세트를 이용한 다중 중합효소연쇄반응에 의해 바람직하게 수행될 수 있다.
상기한 다중 중합효소연쇄반응 수행을 위한 프라이머쌍을 포함한 M-PCR 세트는 예를 들어, 하기 표 4a (제1 M-PCR 세트), 표 4b(제2 M-PCR 세트), 표 4c(제3 M-PCR 세트), 표 4d(제4 M-PCR 세트), 및 표 4e(제5 M-PCR 세트)의 세트일 수 있다. 또한, 상기 각각의 세트는 AMELX (Gene ID: 265, 크기: 91 bp) 등의 내부 콘트롤 유전자(internal control gene)를 콘트롤로서 포함할 수 있다.
유전자 서열번호 방향 서열
AMELX 1 정방향 5'-CGTACCATCCTCTCCTGTTGG-3'
2 역방향 5'-CAGAACTTCAGGCAAGACCCT-3'
TMSB4Y 3 정방향 5'-GAAACCCCTTAATCATCCCATC-3'
4 역방향 5'-GTCCTTTCAAACTCATCCAACG-3'
SRY 5 정방향 5'-CGAACTCTGGCACCTTTCAA-3'
6 역방향 5'-CTGATTTCGCATTCTGGGA-3'
AMELY 7 정방향 5'-CAAAATGCCCGTTTGGTCTA-3'
8 역방향 5'-TAGGTGTGGAAGCTTGCTGG-3'
RPS4Y2 9 정방향 5'-CAGAACATTGGAAGTTTCCCC-3'
10 역방향 5'-ATCACACCAACACGACCGAG-3'
VCY 11 정방향 5'-AGGCAGCCTGGAGTTAGTC-3'
12 역방향 5'-AGATGGGCGCCCCTTACTC-3'
유전자 서열번호 방향 서열
AMELX 1 정방향 5'-CGTACCATCCTCTCCTGTTGG-3'
2 역방향 5'-CAGAACTTCAGGCAAGACCCT-3'
ZFY 13 정방향 5'-TCAGCCTTCTCCTTTGGGTT-3'
14 역방향 5'-CCCAGTTTTTCAAAGCCCTC-3'
HSFY2 15 정방향 5'-AACCATTGTGATGGTCTAGATAAG-3'
16 역방향 5'-GGATCCTTGTGACAAAACCTG-3'
TBL1Y 17 정방향 5'-CTGGAAGGAGCCATGTGATG-3'
18 역방향 5'-TGCCACTGGACATAGGAGGA-3'
SMCY 19 정방향 5'-TCCATTTTCCCAGGTTTGTG-3'
20 역방향 5'-CTTAGCCATAAGGCCCAAGC-3'
XKRY 21 정방향 5'-ACACAGCAAAATCTGGCAGC-3'
22 역방향 5'-GCTTAATGGCAGCAAAGTCG-3'
유전자 서열번호 방향 서열
AMELX 1 정방향 5'-CGTACCATCCTCTCCTGTTGG-3'
2 역방향 5'-CAGAACTTCAGGCAAGACCCT-3'
CYorf15A 23 정방향 5'-ATACGGGAGGATGTGTGTAG-3'
24 역방향 5'-ACCCTAGGTTTTCTCCTCTG-3'
NLGN4Y 25 정방향 5'-CCCTCTGTGGGACCAATTCT-3'
26 역방향 5'-TTTCTGGCCTGTATCTGGCA-3'
EIF1AY 27 정방향 5'-CAGCACAATACAGCACATTCGT-3'
28 역방향 5'-CATCTCCAATATCGTCAAACTGG-3'
UTY 29 정방향 5'-TCTCTTTCTGCCTTCCTTTGTG-3'
30 역방향 5'-GACAAAAGATGATTACTGGCCG-3'
RBM1 31 정방향 5'-GTCGCGTGTCTGATTTGCTT-3'
32 역방향 5'-TTATCCGGAAACCATCCTCC-3'
유전자 서열번호 방향 서열
AMELX 1 정방향 5'-CGTACCATCCTCTCCTGTTGG-3'
2 역방향 5'-CAGAACTTCAGGCAAGACCCT-3'
CYorf15B 33 정방향 5'-AGTTCCAGGTTGATTGTGATGG-3'
34 역방향 5'-AGGACTGTCTGGCCATTTGTAA-3'
TTTY5 35 정방향 5'-AGGATCTCGGAATCTACAAGGG-3'
36 역방향 5'-GATTGCAGATCCACAGGCTTAC-3'
TTTY6 37 정방향 5'-CTCCATTCATCCTGAGTCTTGC-3'
38 역방향 5'-CTCATGTGAGCCTTGATTTTCC-3'
TTTY17 39 정방향 5'-TAGCAGGATAACCACGTCCACT-3'
40 역방향 5'-GTGAGCTGAGATTGTGCAAACA-3'
DDX3Y 41 정방향 5'-CCCGATTTTTCGCTTCTCTT-3'
42 역방향 5'-ACGGGACAAGCAAACACAAA-3'
유전자 서열번호 방향 서열
AMELX 1 정방향 5'-CGTACCATCCTCTCCTGTTGG-3'
2 역방향 5'-CAGAACTTCAGGCAAGACCCT-3'
CDY2 43 정방향 5'-GACCACAAGAAAACTGTGAGTGG-3'
44 역방향 5'-AGTGGGTGCATCTGAGTCTTG-3'
BPY2 45 정방향 5'-ACTTTCCTTTCTTGTCCCTGCT-3'
46 역방향 5'-CCATTCTCACTTCATTTCTGGC-3'
CDY1 47 정방향 5'-GGCGAAAGCTGACAGCAAG-3'
48 역방향 5'-CCTTAGTTCTTGTGTCCTGAGCA-3'
PRY 49 정방향 5'-AGCCTACTTCATCTCAGGACCC-3'
50 역방향 5'-ACCAGAATCTCTGCCAGAAACA-3'
DAZ 51 정방향 5'-AAATGCAGTAACCTCGGCTTTA-3'
52 역방향 5'-ATGTATCTGTGGGCAAAGTGCT-3'
즉, 본 발명에 따른 남성 불임의 진단방법에 따라, 서열번호 3 및 4의 프라이머쌍; 서열번호 5 및 6의 프라이머쌍; 서열번호 7 및 8의 프라이머쌍; 서열번호 9 및 10의 프라이머쌍; 서열번호 11 및 12의 프라이머쌍; DNA 중합효소; dNTP; 및 중합효소연쇄반응용 완충액을 포함하는 제1 M-PCR 세트,
서열번호 13 및 14의 프라이머쌍; 서열번호 15 및 16의 프라이머쌍; 서열번호 17 및 18의 프라이머쌍; 서열번호 19 및 20의 프라이머쌍; 및 서열번호 21 및 22의 프라이머쌍; DNA 중합효소; dNTP; 및 중합효소연쇄반응용 완충액을 포함하는 제2 M-PCR 세트,
서열번호 23 및 24의 프라이머쌍; 서열번호 25 및 26의 프라이머쌍; 서열번호 27 및 28의 프라이머쌍; 서열번호 29 및 30의 프라이머쌍; 서열번호 31 및 32의 프라이머쌍; DNA 중합효소; dNTP; 및 중합효소연쇄반응용 완충액을 포함하는, 제3 M-PCR 세트,
서열번호 33 및 34의 프라이머쌍; 서열번호 35 및 36의 프라이머쌍; 서열번호 37 및 38의 프라이머쌍; 서열번호 39 및 40의 프라이머쌍; 서열번호 41 및 42의 프라이머쌍; DNA 중합효소; dNTP; 및 중합효소연쇄반응용 완충액을 포함하는 PCR 시료를 포함하는 제4 M-PCR 세트, 및
서열번호 43 및 44의 프라이머쌍; 서열번호 45 및 46의 프라이머쌍; 서열번호 47 및 48의 프라이머쌍; 서열번호 49 및 50의 프라이머쌍; 서열번호 51 및 52의 프라이머쌍; DNA 중합효소; dNTP; 및 중합효소연쇄반응용 완충액을 포함하는 제5 M-PCR 세트로 이루어진 군으로부터 2 종 내지 5 종 선택된 M-PCR 세트를 사용하여 다중 중합효소연쇄반응을 수행함으로써, 남성 환자로부터 분리한 gDNA 시료 중, TMSB4Y, SRY, AMELY, RPS4Y2, VCY, ZFY, HSFY2, TBL1Y, SMCY, XKRY, CYorf15A, NLGN4Y, EIF1AY, UTY, RBM1, CYorf15B, TTTY5, TTTY6, TTTY17, DDX3Y, CDY2, BPY2, CDY1, PRY, DAZ 등의 유전자의 미세결실을 검출할 수 있다.
또한, 상기한 바와 같이 복수의 M-PCR 세트를 사용하여 검출하는 방법 이외에도, 본 발명에 의해 대부분의 남성 불임환자에서 미세결실을 나타내는 것을 밝혀진 TTTY5, TTTY6, 및 TTTY17과 함께, 남성불임과 관련되는 것으로 알려진 유전자들의 조합에 의한 단일의 M-PCR 세트를 구성하여 남성 불임을 검출할 수도 있다. 예를 들어, TTTY5, TTTY6, PRY, TTTY17, DAZ, 및 BPY2 를 증폭할 수 있는 프라이머쌍, DNA 중합효소, 및 dNTP를 포함하는, 단일의 M-PCR 세트를 이용한 다중 중합효소연쇄반응에 의해 수행될 수도 있다. 상기 프라이머쌍은 각각 서열번호 35 및 36의 프라이머쌍; 서열번호 37 및 38의 프라이머쌍; 서열번호 49 및 50의 프라이머쌍; 서열번호 39 및 40의 프라이머쌍; 서열번호 51 및 52의 프라이머쌍; 및 서열번호 45 및 46의 프라이머쌍일 수 있다 (하기 표 5 참조).
유전자 서열번호 방향 서열
AMELX 1 정방향 5'-CGTACCATCCTCTCCTGTTGG-3'
2 역방향 5'-CAGAACTTCAGGCAAGACCCT-3'
TTTY5 35 정방향 5'-AGGATCTCGGAATCTACAAGGG-3'
36 역방향 5'-GATTGCAGATCCACAGGCTTAC-3'
TTTY6 37 정방향 5'-CTCCATTCATCCTGAGTCTTGC-3'
38 역방향 5'-CTCATGTGAGCCTTGATTTTCC-3'
PRY 49 정방향 5'-AGCCTACTTCATCTCAGGACCC-3'
50 역방향 5'-ACCAGAATCTCTGCCAGAAACA-3'
TTTY17 39 정방향 5'-TAGCAGGATAACCACGTCCACT-3'
40 역방향 5'-GTGAGCTGAGATTGTGCAAACA-3'
DAZ 51 정방향 5'-AAATGCAGTAACCTCGGCTTTA-3'
52 역방향 5'-ATGTATCTGTGGGCAAAGTGCT-3'
BPY2 45 정방향 5'-ACTTTCCTTTCTTGTCCCTGCT-3'
46 역방향 5'-CCATTCTCACTTCATTTCTGGC-3'
본 발명의 남성 불임의 진단방법에 있어서, 상기 다중 중합효소연쇄반응은 공통의 중합효소연쇄반응 조건으로 수행된다. 예를 들어, 주형이 되는 DNA를 1 본쇄로 변형시키기 위해서 95 ℃에서 10분간 열처리를 한 후, 95 ℃에서 30초간 DNA를 변성하는 단계(denaturation), 60℃에서 1분 30초간 어닐링(annealing) 단계, 72 ℃에서 1분 30초간 DNA 합성 단계(extension)를 총 30-35회 실시하여 PCR 증폭을 실시할 수 있으며, 마지막 DNA 합성 단계는 72℃에서 10분간 실시할 수 있다. 반응이 끝난 PCR 증폭 산물은 브로모에티듐 0.5㎍/㎖를 가한 0.5×TBE 를 전기영동 완충액으로 하여 2%의 한천 겔에서 전기영동을 실시한 다음, UV 트랜스일루미네이터(transilluminator) 하에서 관찰한다.
본 발명은 TMSB4Y, AMELY, RPS4Y2, VCY, ZFY, TBL1Y, SMCY, XKRY, CYorf15A, NLGN4Y, EIF1AY, UTY, RBM1, CYorf15B, TTTY5, TTTY6, TTTY17, 및 DDX3Y로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머쌍을 포함하는, 남성 환자로부터 분리한 gDNA 시료 중의 상기 유전자의 미세결실 검출용 키트를 포함한다.
본 발명에 따른 검출용 키트는 남성 환자로부터 분리한, 바람직하게는 혈액으로부터 분리한, gDNA 시료 중의 상기 유전자의 미세결실을 검출함으로써, 남성 불임을 분자생물학적 레벨에서 검출하는 것을 가능하게 한다. 즉, 상기 프라이머쌍을 포함하는 본 발명의 검출용 키트를 사용하여 환자의 gDNA 시료를 중합효소연쇄반응 등을 수행하여 증폭하고, 얻어진 산물 중에 상기 유전자들(즉, TMSB4Y, AMELY, RPS4Y2, VCY, ZFY, TBL1Y, SMCY, XKRY, CYorf15A, NLGN4Y, EIF1AY, UTY, RBM1, CYorf15B, TTTY5, TTTY6, TTTY17, 및/또는 DDX3Y)의 증폭된 산물이 존재하는지 여부를 검출할 수 있다. 상기 중합효소연쇄반응에 사용되는 프라이머쌍은 서열번호 3 및 4; 서열번호 7 및 8; 서열번호 9 및 10; 서열번호 11 및 12; 서열번호 13 및 14; 서열번호 17 및 18; 서열번호 19 및 20; 서열번호 21 및 22; 서열번호 23 및 24; 서열번호 25 및 26; 서열번호 27 및 28; 서열번호 29 및 30; 서열번호 31 및 32; 서열번호 33 및 34; 서열번호 35 및 36; 서열번호 37 및 38; 서열번호 39 및 40; 및 서열번호 41 및 42로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택될 수 있다. 바람직하게는 상기 프라이머쌍은 서열번호 35 및 36; 서열번호 37 및 38; 서열번호 39 및 40; 및 서열번호 41 및 42로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택될 수 있다.
본 발명에 따른 검출용 키트는 다중 중합효소연쇄반응(Multiplex-Polymerase Chain Reaction; M-PCR)이 가능하도록 조합된 형태의 프라이머쌍을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 상기 표 2에 나타낸 바와 같이, 서열번호 3 및 4; 서열번호 7 및 8; 서열번호 9 및 10; 서열번호 11 및 12; 서열번호 13 및 14; 서열번호 17 및 18; 서열번호 19 및 20; 서열번호 21 및 22; 서열번호 23 및 24; 서열번호 25 및 26; 서열번호 27 및 28; 서열번호 29 및 30; 서열번호 31 및 32; 서열번호 33 및 34; 서열번호 35 및 36; 서열번호 37 및 38; 서열번호 39 및 40; 및 서열번호 41 및 42로 이루어진 군으로부터 선택된 프라이머쌍을 포함할 수 있다. 바람직하게는 상기 프라이머쌍은 서열번호 35 및 36; 서열번호 37 및 38; 서열번호 39 및 40; 및 서열번호 41 및 42로 이루어진 군으로부터 선택된 프라이머쌍을 포함할 수 있다. 상기 검출용 키트는 상기한 프라이머쌍, DNA 중합효소, 및 dNTP를 포함하는 PCR 시료[즉, 마스터 믹스(Master Mix)]로 바람직하게 구성된다.
또한, 본 발명에 따른 검출용 키트는 남성 불임과 관련되는 것으로 알려진 유전자들을 증폭할 수 있는 프라이머쌍과 본 발명에 의해 새롭게 발견된 유전자들을 증폭할 수 있는 프라이머쌍을 조합하여 제작한 복수의 M-PCR 세트를 포함할 수도 있다. 즉, 본 발명의 검출용 키트는 본 발명에 의해 남성 불임과 관련되는 것으로 새롭게 밝혀진 유전자들(표 1 및 2) 및 상기 남성 불임과 관련되는 것으로 알려진 유전자들(표 3)을 증폭할 수 있는 프라이머쌍, DNA 중합효소, 및 dNTP를 포함하는 약 3 내지 5개의 M-PCR 세트[즉, 마스터 믹스(Master Mix)]를 포함할 수 있다.
상기한 M-PCR 세트는 예를 들어, 상기 표 4a (제1 M-PCR 세트), 표 4b(제2 M-PCR 세트), 표 4c(제3 M-PCR 세트), 표 4d(제4 M-PCR 세트), 및 표 4e(제5 M-PCR 세트)의 세트일 수 있다. 또한, 상기 각각의 세트는 AMELX (Gene ID: 265, 크기: 91 bp) 등의 내부 콘트롤 유전자(internal control gene)를 콘트롤로서 포함할 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 검출용 키트는 서열번호 3 및 4의 프라이머쌍; 서열번호 5 및 6의 프라이머쌍; 서열번호 7 및 8의 프라이머쌍; 서열번호 9 및 10의 프라이머쌍; 서열번호 11 및 12의 프라이머쌍; DNA 중합효소; dNTP; 및 중합효소연쇄반응용 완충액을 포함하는 제1 M-PCR 세트,
서열번호 13 및 14의 프라이머쌍; 서열번호 15 및 16의 프라이머쌍; 서열번호 17 및 18의 프라이머쌍; 서열번호 19 및 20의 프라이머쌍; 및 서열번호 21 및 22의 프라이머쌍; DNA 중합효소; dNTP; 및 중합효소연쇄반응용 완충액을 포함하는 제2 M-PCR 세트,
서열번호 23 및 24의 프라이머쌍; 서열번호 25 및 26의 프라이머쌍; 서열번호 27 및 28의 프라이머쌍; 서열번호 29 및 30의 프라이머쌍; 서열번호 31 및 32의 프라이머쌍; DNA 중합효소; dNTP; 및 중합효소연쇄반응용 완충액을 포함하는, 제3 M-PCR 세트,
서열번호 33 및 34의 프라이머쌍; 서열번호 35 및 36의 프라이머쌍; 서열번호 37 및 38의 프라이머쌍; 서열번호 39 및 40의 프라이머쌍; 서열번호 41 및 42의 프라이머쌍; DNA 중합효소; dNTP; 및 중합효소연쇄반응용 완충액을 포함하는 PCR 시료를 포함하는 제4 M-PCR 세트, 및
서열번호 43 및 44의 프라이머쌍; 서열번호 45 및 46의 프라이머쌍; 서열번호 47 및 48의 프라이머쌍; 서열번호 49 및 50의 프라이머쌍; 서열번호 51 및 52의 프라이머쌍; DNA 중합효소; dNTP; 및 중합효소연쇄반응용 완충액을 포함하는 제5 M-PCR 세트로 이루어진 군으로부터 2 종 내지 5 종 선택된 M-PCR 세트를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 검출용 키트는 본 발명에 의해 남성 불임과 관련되는 것으로 새롭게 밝혀진 유전자들(표 1 및 2) 및 상기 남성 불임과 관련되는 것으로 알려진 유전자들(표 3)의 다양한 조합에 의한 단일의 M-PCR 세트로 제작될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 검출용 키트는 TTTY5, TTTY6, PRY, TTTY17, DAZ, 및 BPY2 를 증폭할 수 있는 프라이머쌍; DNA 중합효소; dNTP; 및 중합효소연쇄반응용 완충액을 포함하는 단일의 M-PCR 세트로 이루어질 수 있으며, 상기 프라이머쌍은 각각 서열번호 35 및 36의 프라이머쌍; 서열번호 37 및 38의 프라이머쌍; 서열번호 49 및 50의 프라이머쌍; 서열번호 39 및 40의 프라이머쌍; 서열번호 51 및 52의 프라이머쌍; 및 서열번호 45 및 46의 프라이머쌍일 수 있다.
본 발명의 검출용 키트를 사용하여, 통상의 중합효소연쇄반응 조건으로 다중 중합효소연쇄반응을 수행할 수 있다. 예를 들어, 주형이 되는 DNA를 1 본쇄로 변형시키기 위해서 95 ℃에서 10분간 열처리를 한 후, 95 ℃에서 30초간 DNA를 변성하는 단계(denaturation), 60℃에서 1분 30초간 어닐링(annealing) 단계, 72 ℃에서 1분 30초간 DNA 합성 단계(extension)를 총 30-35회 실시하여 PCR 증폭을 실시할 수 있으며, 마지막 DNA 합성 단계는 72℃에서 10분간 실시할 수 있다. 반응이 끝난 PCR 증폭 산물은 브로모에티듐 0.5㎍/㎖를 가한 0.5×TBE 를 전기영동 완충액으로 하여 2%의 한천 겔에서 전기영동을 실시한 다음, UV 트랜스일루미네이터(transilluminator) 하에서 관찰한다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 본 발명을 제한하는 것이 아니다.
실시예 1. 남성 불임 환자의 혈액(blood)에서 gDNA 추출
남성 불임 환자의 혈액 3㎖를 EDTA 시험관(tube)에 채혈한 후, 15㎖ 코니컬 튜브(conical tube)로 옮겼다. 여기에 TKM1 buffer(10mM Tris-HCl pH7.6, 10mM KCl, 10mM MgCl2, 2mM EDTA) 3㎖과 Nondiet P-40 75㎕를 넣어 잘 혼합한 후 2200 rpm에서 10분간 원심분리를 하여 펠렛을 얻었다. 펠렛에 다시 TKM1 buffer 3㎖를 넣어 피펫팅을 한 후 2200 rpm에서 10분간 원심분리하여 다시 펠렛을 얻었다. 여기에 TKM2 buffer(10mM Tris-HCl pH7.6, 10mM KCl, 10mM MgCl2, 2mM EDTA, 0.4M NaCl) 0.48㎖을 넣어 펠렛을 잘 풀어준 후 10% SDS 30㎕를 넣어주고, 55℃에서 2시간 배양하였다. 배양된 용액을 E-tube(Eppendorf tube)로 옮겨 6M NaCl 0.18㎖ 첨가한 후 12000 rpm에서 10분간 원심분리하였다. 여기서 상층액만을 15㎖ 코니컬 튜브로 옮겨 2배의 100% 에탄올을 넣고 천천히 앞뒤로 뒤집어 DNA만을 얻고 여기에 다시 차가운 70% 에탄올 1㎖을 넣어 4℃, 12000 rpm에서 5분간 원심분리를 한 후 펠렛을 얻었다. 에탈올이 모두 없어질 때까지 펠렛을 건조하고, 100㎕의 3차 증류수를 넣어 펠렛을 녹이고, 남성 불임 환자로부터 gDNA 시료를 얻었다.
실시예 2. 다중 중합효소연쇄반응(M-PCR)을 통한 Y 염색체 미세결실 유전자의 확인 (복수의 M-PCR 세트)
M-PCR 세트로서, 표 4a 내지 표 4e의 5개의 M-PCR 세트를 구성하였으며, Y 염색체의 Yq(AZFa, AZFb, AZFc) 지역에 있는 마커들을 선별하여 하기 표 6a 내지 표 6c의 3개의 M-PCR 세트를 구성하였다. 각각의 세트는 내부 콘트롤 유전자로서 AMELX (Gene ID: 265, 크기: 75 bp) 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머쌍을 포함한다.
유전자/마커 크기 서열번호 방향 서열
AMELX 75bp 53 정방향 5'-GAGGCCAATGTCTGAGGGAG-3'
54 역방향 5'-TGTGGAACTCTGGTTGTGCC-3'
sY147 100bp 55 정방향 5'-TTTCTCGTTTGATGATCCTAG-3'
56 역방향 5'-TTAATATGAGAATGAGAACAGATGT-3'
sY152 125bp 57 정방향 5'-AAGACAGTCTGCCATGTTTCA-3'
58 역방향 5'-ACAGGAGGGTACTTAGCAGT-3'
sY158 215bp 59 정방향 5'-CTCAGAAGTCCTCCTAATAGTTCC-3'
60 역방향 5'-ACAGTGGTTTGTAGCGGGTA-3'
sY86 318bp 61 정방향 5'-GTGACACACAGACTATGCTTC-3'
62 역방향 5'-ACACACAGAGGGACAACCCT-3'
SPGY1 460bp 63 정방향 5'-TTCACATACAGCCATTAAGTTTAGC-3'
64 역방향 5'-ACAATTTGATAGTCTGAACACAAGC-3'
유전자/마커 크기 서열번호 방향 서열
AMELX 75bp 53 정방향 5'-GAGGCCAATGTCTGAGGGAG-3'
54 역방향 5'-TGTGGAACTCTGGTTGTGCC-3'
sY255 123bp 65 정방향 5'-GTTACAGGATTCGGCGTGAT-3'
66 역방향 5'-CTCGTCATGTGCAGCCAC-3'
sY138 164bp 67 정방향 5'-CACATGAAGCACTGGAACTG-3'
68 역방향 5'-AGGGCCTGAGTCTCCAGG-3'
sY127 274bp 69 정방향 5'-GGCTCACAAACGAAAAGAAA-3'
70 역방향 5'-CTGCAGGCAGTAATAAGGGA-3'
sY84 326bp 71 정방향 5'-AGAAGGGTCTGAAAGCAGGT-3'
72 역방향 5'-GCCTACTACCTGGAGGCTTC-3'
sY14 472bp 73 정방향 5'-GAATATTCCCGCTCTCCGGA-3'
74 역방향 5'-GCTGGTGCTCCATTCTTGAG-3'
유전자/마커 크기 서열번호 방향 서열
AMELX 75bp 53 정방향 5'-GAGGCCAATGTCTGAGGGAG-3'
54 역방향 5'-TGTGGAACTCTGGTTGTGCC-3'
sY124 109bp 75 정방향 5'-CAGGCAGGACAGCTTAAAAG-3'
76 역방향 5'-ACTGTGGCAAAGTTGCTTTC-3'
sY130 173bp 77 정방향 5'-AGAGAGTTTTCTAACAGGGCG-3'
78 역방향 5'-TGGGAATCACTTTTGCAACT-3'
sY242 233bp 79 정방향 5'-ACACAGTAGCAGCGGGAGTT-3'
80 역방향 5'-TCTGCCACTAAACTGTAAGCTCC-3'
sY157 286bp 81 정방향 5'-CTTAGGAAAAAGTGAAGCCG-3'
82 역방향 5'-CCTGCTGTCAGCAAGATACA-3'
sY254 380bp 83 정방향 5'-GGGTGTTACCAGAAGGCAAA-3'
84 역방향 5'-GAACCGTATCTACCAAAGCAGC-3'
실시예 1과 동일한 방법으로 정상인으로부터 gDNA를 분리하였다. 상기 정상인의 gDNA 및 실시예 1에서 분리한 남성 불임 환자의 gDNA의 농도를 각각 100 ng으로 맞추고, PCR 튜브(tube) 8개에 DNA 1㎕씩 분주한 후, 8개의 마스터 믹스(Master Mix)(조성: 프라이머쌍, DNA 중합효소, dNTP, 완충용액, 증류수)를 각 24㎕씩 넣고 PCR 장치(Corbett research사, Australia)를 사용하여 수행하였다. 반응 조건은 95℃에서 10분간 열처리를 한 후, 95℃에서 30초간 DNA를 변성하는 단계(denaturation), 60℃에서 1분30초간 어닐링(annealing)단계, 72℃에서 1분 30초간 DNA 합성 단계(extension)를 총 35회 실시하여 PCR 증폭을 실시하였으며, 마지막 DNA 합성 단계는 72℃에서 10분간 실시하였다. PCR 증폭 산물을 확인하기 위해 전체 결과물 중 10㎕를 취해 브로모에티듐 0.5㎍/㎖를 가한 0.5×TBE를 전기영동 완충액으로 하여 2%의 한천 겔에서 100V로 약 30~40분 정도 전기영동을 실시한 다음, UV 트랜스일루미네이터(transilluminator)하에서 관찰하였다.
상기에서 얻어진 결과는 각각 도 3(정상인의 gDNA) 및 도 4(불임 환자의 gDNA)와 같다. 도 3 및 도 4에 나타난 바와 같이, 각 세트별로 남성 불임 환자에 있어서, Y 염색체 미세결실이 있는 부분은 PCR 결과에서 밴드가 나타나지 않았고, 이 결과로 어떤 유전자 혹은 STS 마커의 미세결실이 있는지를 확인할 수 있다.
본 발명에 따른 진단 방법 및 검출용 키트는 STS 마커가 아닌 Y 염색체 상의 유전자를 대상으로 Y 염색체의 미세결실을 진단하므로, STS 마커를 사용하는데 따른 문제점, 즉 결실 부위를 제대로 판별하지 못하는 문제점 등을 해결할 수 있다. 또한, 남성 불임과 관련되는 Y 염색체의 Yp, AZFa, AZFb, AZFc에 위치하는 다양한 유전자들의 미세결실을 다중 중합효소연쇄반응(Multiplex-Polymerase Chain Reaction; M-PCR) 방법에 의해 동시에 검출함으로써, 정자형성 과정에 관여하는 유전자에 있어서, 각각의 불임 환자에게 발생하는 특정 유전자의 미세결실을 분자생물학적 레벨에서 판별할 수 있으며, 대량의 시료를 간편하고, 정확하며, 신속하게 분석할 수 있다.
<110> GENOCHECK CO., LTD. <120> Diagnostic methods for male infertility and detection kits for Y chromosomal microdeletion <130> PN0095 <160> 84 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 1 cgtaccatcc tctcctgttg g 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 2 cagaacttca ggcaagaccc t 21 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 3 gaaacccctt aatcatccca tc 22 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 4 gtcctttcaa actcatccaa cg 22 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 5 cgaactctgg cacctttcaa 20 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 6 ctgatttcgc attctggga 19 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 7 caaaatgccc gtttggtcta 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 8 taggtgtgga agcttgctgg 20 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 9 cagaacattg gaagtttccc c 21 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 10 atcacaccaa cacgaccgag 20 <210> 11 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 11 aggcagcctg gagttagtc 19 <210> 12 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 12 agatgggcgc cccttactc 19 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 13 tcagccttct cctttgggtt 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 14 cccagttttt caaagccctc 20 <210> 15 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 15 aaccattgtg atggtctaga taag 24 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 16 ggatccttgt gacaaaacct g 21 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 17 ctggaaggag ccatgtgatg 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 18 tgccactgga cataggagga 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 19 tccattttcc caggtttgtg 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 20 cttagccata aggcccaagc 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 21 acacagcaaa atctggcagc 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 22 gcttaatggc agcaaagtcg 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 23 atacgggagg atgtgtgtag 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 24 accctaggtt ttctcctctg 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 25 ccctctgtgg gaccaattct 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 26 tttctggcct gtatctggca 20 <210> 27 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 27 cagcacaata cagcacattc gt 22 <210> 28 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 28 catctccaat atcgtcaaac tgg 23 <210> 29 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 29 tctctttctg ccttcctttg tg 22 <210> 30 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 30 gacaaaagat gattactggc cg 22 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 31 gtcgcgtgtc tgatttgctt 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 32 ttatccggaa accatcctcc 20 <210> 33 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 33 agttccaggt tgattgtgat gg 22 <210> 34 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 34 aggactgtct ggccatttgt aa 22 <210> 35 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 35 aggatctcgg aatctacaag gg 22 <210> 36 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 36 gattgcagat ccacaggctt ac 22 <210> 37 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 37 ctccattcat cctgagtctt gc 22 <210> 38 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 38 ctcatgtgag ccttgatttt cc 22 <210> 39 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 39 tagcaggata accacgtcca ct 22 <210> 40 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 40 gtgagctgag attgtgcaaa ca 22 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 41 cccgattttt cgcttctctt 20 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 42 acgggacaag caaacacaaa 20 <210> 43 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 43 gaccacaaga aaactgtgag tgg 23 <210> 44 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 44 agtgggtgca tctgagtctt g 21 <210> 45 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 45 actttccttt cttgtccctg ct 22 <210> 46 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 46 ccattctcac ttcatttctg gc 22 <210> 47 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 47 ggcgaaagct gacagcaag 19 <210> 48 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 48 ccttagttct tgtgtcctga gca 23 <210> 49 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 49 agcctacttc atctcaggac cc 22 <210> 50 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 50 accagaatct ctgccagaaa ca 22 <210> 51 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 51 aaatgcagta acctcggctt ta 22 <210> 52 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 52 atgtatctgt gggcaaagtg ct 22 <210> 53 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 53 gaggccaatg tctgagggag 20 <210> 54 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 54 tgtggaactc tggttgtgcc 20 <210> 55 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 55 tttctcgttt gatgatccta g 21 <210> 56 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 56 ttaatatgag aatgagaaca gatgt 25 <210> 57 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 57 aagacagtct gccatgtttc a 21 <210> 58 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 58 acaggagggt acttagcagt 20 <210> 59 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 59 ctcagaagtc ctcctaatag ttcc 24 <210> 60 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 60 acagtggttt gtagcgggta 20 <210> 61 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 61 gtgacacaca gactatgctt c 21 <210> 62 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 62 acacacagag ggacaaccct 20 <210> 63 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 63 ttcacataca gccattaagt ttagc 25 <210> 64 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 64 acaatttgat agtctgaaca caagc 25 <210> 65 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 65 gttacaggat tcggcgtgat 20 <210> 66 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 66 ctcgtcatgt gcagccac 18 <210> 67 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 67 cacatgaagc actggaactg 20 <210> 68 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 68 agggcctgag tctccagg 18 <210> 69 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 69 ggctcacaaa cgaaaagaaa 20 <210> 70 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 70 ctgcaggcag taataaggga 20 <210> 71 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 71 agaagggtct gaaagcaggt 20 <210> 72 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 72 gcctactacc tggaggcttc 20 <210> 73 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 73 gaatattccc gctctccgga 20 <210> 74 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 74 gctggtgctc cattcttgag 20 <210> 75 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 75 caggcaggac agcttaaaag 20 <210> 76 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 76 actgtggcaa agttgctttc 20 <210> 77 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 77 agagagtttt ctaacagggc g 21 <210> 78 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 78 tgggaatcac ttttgcaact 20 <210> 79 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 79 acacagtagc agcgggagtt 20 <210> 80 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 80 tctgccacta aactgtaagc tcc 23 <210> 81 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 81 cttaggaaaa agtgaagccg 20 <210> 82 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 82 cctgctgtca gcaagataca 20 <210> 83 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 83 gggtgttacc agaaggcaaa 20 <210> 84 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 84 gaaccgtatc taccaaagca gc 22

Claims (18)

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  10. 프라이머쌍으로서 TMSB4Y, AMELY, RPS4Y2, VCY, ZFY, TBL1Y, SMCY, XKRY, CYorf15A, NLGN4Y, EIF1AY, UTY, RBM1, CYorf15B, TTTY5, TTTY6, TTTY17, 및 DDX3Y로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머쌍을 포함하고, 상기 프라이머쌍이 서열번호 3 및 4; 서열번호 7 및 8; 서열번호 9 및 10; 서열번호 11 및 12; 서열번호 13 및 14; 서열번호 17 및 18; 서열번호 19 및 20; 서열번호 21 및 22; 서열번호 23 및 24; 서열번호 25 및 26; 서열번호 27 및 28; 서열번호 29 및 30; 서열번호 31 및 32; 서열번호 33 및 34; 서열번호 35 및 36; 서열번호 37 및 38; 서열번호 39 및 40; 및 서열번호 41 및 42로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택되는, 남성 환자로부터 분리한 gDNA 시료 중의 상기 유전자의 미세결실 검출을 위한 남성 불임 진단용 키트.
  11. 제10항에 있어서, 상기 gDNA 시료가 남성 환자의 혈액으로부터 분리된 것임을 특징으로 하는 남성 불임 진단용 키트.
  12. 제10항에 있어서, 상기 검출이 상기 프라이머쌍을 사용한 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction; PCR)에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 남성 불임 진단용 키트.
  13. 삭제
  14. 제10항에 있어서, 상기 프라이머쌍이 서열번호 35 및 36; 서열번호 37 및 38; 서열번호 39 및 40; 및 서열번호 41 및 42로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택되는 것을 특징으로 하는 남성 불임 진단용 키트.
  15. 제10항에 있어서, 상기 유전자가 2 종 이상 선택되고, 상기 검출이 서열번호 3 및 4; 서열번호 7 및 8; 서열번호 9 및 10; 서열번호 11 및 12; 서열번호 13 및 14; 서열번호 17 및 18; 서열번호 19 및 20; 서열번호 21 및 22; 서열번호 23 및 24; 서열번호 25 및 26; 서열번호 27 및 28; 서열번호 29 및 30; 서열번호 31 및 32; 서열번호 33 및 34; 서열번호 35 및 36; 서열번호 37 및 38; 서열번호 39 및 40; 및 서열번호 41 및 42로 이루어진 군으로부터 2종 이상 선택된 프라이머쌍을 사용한 다중 중합효소연쇄반응(Multiplex-Polymerase Chain Reaction; M-PCR)에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 남성 불임 진단용 키트.
  16. 삭제
  17. 서열번호 3 및 4의 프라이머쌍; 서열번호 5 및 6의 프라이머쌍; 서열번호 7 및 8의 프라이머쌍; 서열번호 9 및 10의 프라이머쌍; 서열번호 11 및 12의 프라이머쌍; DNA 중합효소; dNTP; 및 중합효소연쇄반응용 완충액을 포함하는 제1 M-PCR 세트,
    서열번호 13 및 14의 프라이머쌍; 서열번호 15 및 16의 프라이머쌍; 서열번호 17 및 18의 프라이머쌍; 서열번호 19 및 20의 프라이머쌍; 및 서열번호 21 및 22의 프라이머쌍; DNA 중합효소; dNTP; 및 중합효소연쇄반응용 완충액을 포함하는 제2 M-PCR 세트,
    서열번호 23 및 24의 프라이머쌍; 서열번호 25 및 26의 프라이머쌍; 서열번호 27 및 28의 프라이머쌍; 서열번호 29 및 30의 프라이머쌍; 서열번호 31 및 32의 프라이머쌍; DNA 중합효소; dNTP; 및 중합효소연쇄반응용 완충액을 포함하는, 제3 M-PCR 세트,
    서열번호 33 및 34의 프라이머쌍; 서열번호 35 및 36의 프라이머쌍; 서열번호 37 및 38의 프라이머쌍; 서열번호 39 및 40의 프라이머쌍; 서열번호 41 및 42의 프라이머쌍; DNA 중합효소; dNTP; 및 중합효소연쇄반응용 완충액을 포함하는 PCR 시료를 포함하는 제4 M-PCR 세트, 및
    서열번호 43 및 44의 프라이머쌍; 서열번호 45 및 46의 프라이머쌍; 서열번호 47 및 48의 프라이머쌍; 서열번호 49 및 50의 프라이머쌍; 서열번호 51 및 52의 프라이머쌍; DNA 중합효소; dNTP; 및 중합효소연쇄반응용 완충액을 포함하는 제5 M-PCR 세트
    로 이루어진 군으로부터 2 종 내지 5 종 선택된 M-PCR 세트를 포함하는, 남성 환자로부터 분리한 gDNA 시료 중의 Y 염색체의 미세결실 검출을 위한 남성 불임 진단용 키트.
  18. 서열번호 35 및 36의 프라이머쌍; 서열번호 37 및 38의 프라이머쌍; 서열번호 49 및 50의 프라이머쌍; 서열번호 39 및 40의 프라이머쌍; 서열번호 51 및 52의 프라이머쌍; 서열번호 45 및 46의 프라이머쌍; DNA 중합효소; dNTP; 및 중합효소연쇄반응용 완충액을 포함하는 M-PCR 세트를 포함하는, 남성 환자로부터 분리한 gDNA 시료 중의 Y 염색체의 미세결실 검출을 위한 남성 불임 진단용 키트.
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