CN114574601A - 一种检测幽门螺旋杆菌23SrRNA基因突变的引物和探针组合物及其应用、试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及生物检测技术领域，具体公开了一种检测幽门螺旋杆菌23S rRNA基因突变的引物和探针组合物及其应用、试剂盒。所述引物和探针组合物包括用于检测幽门螺杆菌23S rRNA基因的A2142C位点、A2142G位点和A2143G位点的突变型引物和探针组合物、用于检测幽门螺杆菌16S rRNA基因的引物和探针组合物、用于检测人源RNAse P基因的引物和和探针组合物、以及封阻引物。所述引物和探针组合物在制备用于检测幽门螺旋杆菌23S rRNA基因突变的试剂或试剂盒的应用。所述试剂盒包括上述引物和探针组合物。本申请提高幽门螺旋杆菌23S rRNA基因突变的检测效率。
Description
技术领域
本申请涉及生物检测技术领域，具体涉及一种检测幽门螺旋杆菌23S rRNA基因突变的引物和探针组合物及其应用、试剂盒。
背景技术
幽门螺杆菌(Helicobacter Pylori，HP)感染与上消化道疾病有关，包括胃炎、消化性溃疡疾病、胃粘膜相关淋巴组织(MALT)淋巴瘤和胃癌等疾病密切相关，部分患者消化道不适症状与幽门螺杆菌相关。根除幽门螺杆菌的治疗被认为是治疗幽门螺杆菌相关疾病的有效方法。目前，克拉霉素是临床上根除幽门螺杆菌常用的抗生素之一，但由于该药曾经的广泛应用，导致幽门螺杆菌耐药率逐年上升，幽门螺旋杆菌的根除率正在下降。根据研究已表明 23S rRNA基因V结构域肽基转移酶基因的点突变是临床上克拉霉素耐药表型的原因，这些点突变导致肽基转移酶环构象的破坏并抑制了克拉霉素和23S rRNA基因之间结合，导致药物不能阻止细菌蛋白的合成，最终产生耐药现象。
扩增阻滞突变系统PCR(Amplification Refractory Mutation System PCR，ARMS-PCR)，又名等位基因特异性PCR(Allele Specification PCR，AS-PCR)，原理为：利用TaqDNA聚合酶缺少3'-5'外切酶活性，PCR引物3'端末位碱基必须与模板DNA互补才能才能有效扩增，针对不同的已知突变设计不同的引物去检测出突变基因。该方法灵敏度高，其主要的限制因素是若突变位置为弱碱基序列，该方法的特异性将受到影响。
基于封阻引物(Blocker)富集技术来检测突变位点也有相应的文献报告。Blocker引物是一段与野生型模板完全互补匹配的核酸序列。利用这种方法能够有效地降低野生型的扩增，提高在野生型模板背景情况下突变型模板的检出能力。因此为了进一步提高Blocker富集技术的封闭效率，我们设计Blocker引物的退火温度应高于ARMS引物的退火温度，其目的是保证Blocker引物优先于野生型模板结合有效降低野生型的扩增，提高突变型的检测效率。
发明内容
为了提高幽门螺旋杆菌23S rRNA基因突变的检测效率，本申请提供一种检测幽门螺旋杆菌23SRNA耐药基因的引物和探针组合物、试剂盒和方法。
第一方面，本申请提供的一种检测幽门螺旋杆菌23S rRNA基因突变的引物和探针组合物，采用如下技术方案：
一种检测幽门螺旋杆菌23S rRNA基因突变的引物和探针组合物，所述引物和探针组合物包括用于检测幽门螺旋杆菌23S rRNA基因的A2142C位点、A2142G位点和A2143G位点的突变型引物和探针组合物、用于检测用于检测幽门螺旋杆菌16S rRNA基因的2142位点和2143位点的引物和探针组合物、用于检测人源RNAse P基因的引物和探针组合物、以及封阻引物；
所述突变型引物和探针组合物包括：
23S-A2142G正向突变型引物：5'-GTAAAGGTCCACGGGGTCTTC-3'
23S-A2142C正向突变型引物：5'-TAAAGGTCCACGGGGTCTTG-3'
23S-A2143G正向突变型引物：5'-AGTAAAGGTCCACGGGGTCTC-3'
23S-A21反向突变型引物：5'-AGAGATTCAGTGAAATTGTAGTGGAG-3'
23S-A21突变型探针：5'-AAAATTCCTCCTACCCGCGGCAA-3'
所述23S-A21突变型探针的5'端标记荧光报告基团、3'端标记荧光淬灭基团；
所述16S rRNA基因的引物和探针组合物包括：
16S正向引物：5'-CAGCCATGTTGCGGTGAA-3'
16S反向引物：5'-AAACACAACTCCCATGGTGTGA-3'
16S探针：5'-ACGTTCCCGGGTCTTGTACTCACCG-3'
所述16S探针的5'端标记荧光报告基团、3'端标记荧光淬灭基团；
所述人源RNAse P基因的引物和探针组合物包括：
RNP正向引物：5'-AGATTTGGACCTGCGAGCG-3'
RNP反向引物：5'-GAGCGGCTGTCTCCACAAGT-3'
RNP探针：5'-TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG-3'
所述RNP探针的5'端标记荧光报告基团、3'端标记荧光淬灭基团；
所述封阻引物包括：
23S Blocker引物：5'-CCACGGGGTCTTTC-3'
所述23S Blocker引物的3'端标记MGB；
所述23S-A21突变型探针、所述16S探针和所述RNP探针的5'端标记荧光报告基团各不相同。
可选的，所述23S-A21突变型探针的5'端标记荧光报告基团FAM、3'端标记荧光淬灭基团BHQ1。
可选的，所述16S探针的5'端标记荧光报告基团VIC、3'端标记荧光淬灭基团BHQ1。
可选的，所述内参基因探针的5'端标记荧光报告基团CY5、3'端标记荧光淬灭基团BHQ1。
第二方面，本申请提供的一种上述引物和探针组合物在制备用于检测幽门螺旋杆菌23S rRNA基因突变的试剂或试剂盒的应用。
第三方面，本申请提供的一种检测幽门螺旋杆菌23S rRNA基因突变的试剂盒，采用如下技术方案：
一种检测幽门螺旋杆菌23S rRNA基因突变的试剂盒，包括上述引物和探针组合物。
可选的，所述试剂盒还包括尿嘧啶-N-糖基化酶(UDG酶)、缓冲液(例如：10×TaqMan 缓冲液)、dNTPs、DNA聚合酶(例如：TaqMan DNA聚合酶)。
可选的，所述试剂盒的使用方法包括如下步骤：
(1)提取待测样本DNA；
(2)单管多重荧光定量PCR反应：
以样本DNA为模板，利用上述引物和探针组合物进行单管多重荧光定量PCR反应，得到实时荧光定量PCR扩增曲线；
(3)根据实时荧光定量PCR扩增曲线判断突变情况。
可选的，所述突变情况的判断方法为：
①若待测样本的FAM荧光通道有明显扩增信号、或者FAM荧光通道的CtFAM值>37时，则为突变阴性；
②若待测样本的FAM荧光通道有明显扩增信号且FAM荧光通道的CtFAM值≤37时，则计算FAM荧光通道CtFAM值与HEX(VIC)荧光通道CtHEX(VIC)值的差值ΔCt，即ΔCt＝CtFAM值 -CtHEX(VIC)值；
若ΔCt≥9，则为突变阴性；
若ΔCt<9，则为突变阳性。
可选的，所述单管多重荧光定量PCR反应的反应体系如下：
可选的，所述单管多重荧光定量PCR反应的扩增程序为：37℃5min，进行1个循环；95℃预变性5min，进行1个循环；95℃变性15s，60℃退火与延伸40s，进行45个循环。
可选的，在退火与延伸时收集靶标基因荧光通道和内参基因荧光通道的荧光信号，得到实时荧光定量PCR扩增曲线。
综上所述，本申请具有以下有益效果：
本申请中优选采用单管多重ARMS-PCR方法结合封阻引物Blocker技术，由于ARMS-PCR能有效的识别突变型目的靶标且封阻引物Blocker能封闭核酸模板，因此，该方法大大提高了突变型靶标的检出率，对临床样本检测达到了非常好的实验预期。
附图说明
图1是23S rRNA突变型(A2142G)样本的实时荧光定量PCR的扩增曲线(石蜡样本)；
图2是23S rRNA野生型样本的实时荧光定量PCR的扩增曲线(石蜡样本)；
图3是23S rRNA突变型(A2143G)样本的实时荧光定量PCR的扩增曲线(粪便样本)；
图4是23S rRNA突变型(A2142C)样本的实时荧光定量PCR的扩增曲线(粪便样本)；
图5是23S rRNA野生型样本的测序结果(粪便样本)；
图6是23S rRNA突变型(A2143G)样本的测序结果(粪便样本)。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本申请作进一步详细说明。
试剂和设备
Taqman酶，诺唯赞。
UDG酶，诺唯赞。
dNTP，诺唯赞。
实时定量PCR扩增仪(型号7500)，ABI公司。
实施例1：引物和探针组合物的设计及合成
根据Genebank DNA序列数据库中已知的幽门螺旋杆菌基因的23S rRNA基因序列，设计引物及探针。
幽门螺旋杆菌基因的23S rRNA基因序列如SEQ ID NO.1所示。
(GTTAAATACCGACCTGCATGAATGGCGTAACGAGATGGGAGCTGTCTCAACCAGA GATTCAGTGAAATTGTAGTGGAGGTGAAAATTCCTCCTACCCGCGGCAAGACGGAAAG ACCCCGTGGACCTTTACTACAACTTAGCACTGCTAATGGGAATATCATGCGCAGGATAGG TGGGAGGCTTTGAAGTAAGGGCTTTGGCTCTTATGGAGCCATCCTTGAGATACCACCCTT GATGTTTCTGTTAGCTAACTGGCCTGTGTTATCCACAGGCAGGACAATGCTTGGT)
23S rRNA基因突变的引物和探针组合物
23S-A2142G正向突变型引物5'-GTAAAGGTCCACGGGGTCTTC-3'，如SEQ ID NO.2所示；
23S-A2142C正向突变型引物5'-TAAAGGTCCACGGGGTCTTG-3'，如SEQ ID NO.3所示；
23S-A2143G正向突变型引物5'-AGTAAAGGTCCACGGGGTCTC-3'，如SEQ ID NO.4所示；
23S-A21反向突变型引物3'-AGAGATTCAGTGAAATTGTAGTGGAG-5'，如SEQ ID NO.5所示；
23S-A21突变型探针(FAM)5'-AAAATTCCTCCTACCCGCGGCAA-3'(BHQ1)，如SEQ IDNO.6所示。
23S Blocker引物5'-CCACGGGGTCTTTC-3'(MGB)，如SEQ ID NO.7所示。
根据Genebank DNA序列数据库中已知的幽门螺旋杆菌基因的16S rRNA基因序列，设计引物及探针。
幽门螺旋杆菌基因的16S rRNA基因序列如SEQ ID NO.8所示。
(GGGTGCAAGCGTTACTCGGAATCACTGGGCGTAAAGAGCGCGTAGGCGGGATAG TCAGTCAGGTGTGAAATCCTATGGCTTAACCATAGAACTGCATTTGAAACTACTATTCTA GAGTGTGGGAGAGGTAGGTGGAATTCTTGGTGTAGGGGTAAAATCCGTAGAGATCAAG AGGAATACTCATTGCGAAGGCGACCTGCTGGAACATTACTGACGCTGATTGCGCGAAAG CGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGGATGCTAGTTGTTGGAGGGCTTAGTCTCTCCAGTAATGCAGCTAACGCATTAAGCATCCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAA)
16S rRNA基因的引物和探针组合物
16S正向引物5'-CAGCCATGTTGCGGTGAA-3'，如SEQ ID NO.9所示；
16S反向引物5'-AAACACAACTCCCATGGTGTGA-3'，如SEQ ID NO.10所示；
16S探针(VIC)5'-ACGTTCCCGGGTCTTGTACTCACCG-3'(BHQ1)，如SEQ ID NO.11 所示。
根据Genebank DNA序列数据库中已知的人源RNAse P基因的序列，设计引物及探针。
人源RNAse P基因的序列如SEQ ID NO.12所示。
(AGACTGGCGCGCGCGGACGGTCATGGGACTTCAGCATGGCGGTGTTTGCAGATT TGGACCTGCGAGCGGGTTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCGGACTTGTGGAGACAGCCGC TCACCGTGAGTTGCCCCGGCTTCGCGCCTGGCCAACCTCATGCCACCCAGACCATCGGG CCACACTCCGGAGTAACTATTTCCTGATGGGTCTCGGTCAGGTCTCCCAGAGTCTCTGG GATGTCCCTGGAGGCTGATGCCCGCCGAGGTGTTGGTCTGATTCCTAGCGCGGGAAACT CGAAGGTTCTGGGGGTTGTTATCTGGTTCAGCTACTTTCCTGCAATGAGGGAACTGAGG CCTAACGAGGGCGAGGGATTTGCATAGGGGCCTACAGCTGATAGGTGACAGAAGCCGG AGCTGGACTCCAAGGGTACAATCTTCTAAGCTTCTAAGTTACTATCAGCCCTTCCTGATT CTCACGACAGTGTCTAAACAAATACTGGAATTTG)
人源RNAse P基因的引物和探针组合物
RNP正向引物5'-AGATTTGGACCTGCGAGCG-3'，如SEQ ID NO.13所示；
RNP反向引物5'-GAGCGGCTGTCTCCACAAGT-3'，如SEQ ID NO.14所示；
RNP探针：(CY5)5'-TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG-3'(BHQ1)，如SEQ ID NO.15 所示。
实施例2：待测样本DNA的提取
利用磁珠法石蜡包埋组织基因组DNA提取试剂盒，从人石蜡包埋组织中提取DNA，最终获得DNA提取液100μL。DNA提取液可直接用于实时荧光定量PCR反应，每次实时荧光定量PCR反应的最大使用量是10μL。剩余的DNA提取液在-80℃下保存。
实施例3：检测幽门螺旋杆菌23S rRNA基因突变的试剂盒
检测幽门螺旋杆菌23S rRNA基因突变的试剂盒，具体组成如表1所示。
表1检测幽门螺旋杆菌23S rRNA基因突变的试剂盒的具体组成
其中，17μL的23S rRNA反应液和3μL的23S酶混合液组成一份用于单管多重荧光定量PCR反应的反应体系。
配制用于单管多重荧光定量PCR反应的反应体系时，反应体系的配制份数＝待测样本的份数+2份。将配制好的反应体系按照每份20μL的量分装到PCR反应管中，其中2个PCR反应管中分别加入10μL的23S阳性对照和10μL的23S阴性对照，其他PCR反应管中分别加入10μL的DNA提取液。
单管多重荧光定量PCR反应的扩增程序为：37℃酶反应5min，进行1个循环；95℃预变性5min，进行1个循环；95℃变性15s，60℃退火与延伸40s，进行45个循环。
以阳性对照的CY5通道扩增曲线升起的拐点处为阈值线，复制阈值，将FAM和HEX(VIC) 通道的阈值设置成与CY5通道一致。在退火与延伸时收集FAM和HEX(VIC)通道的荧光信号，分别得到待测样本、阳性对照和阴性对照的实时荧光定量PCR扩增曲线。
结合待测样本、阳性对照和阴性对照的实时荧光定量PCR扩增曲线判断突变情况，突变情况的判断方法为：
①若待测样本的FAM荧光通道有明显扩增信号、或者FAM荧光通道的CtFAM值>37时，则为突变阴性；
②若待测样本的FAM荧光通道有明显扩增信号且FAM荧光通道的CtFAM值≤37时，则计算FAM荧光通道CtFAM值与HEX(VIC)荧光通道CtHEX(VIC)值的差值ΔCt，即ΔCt＝CtFAM值 -CtHEX(VIC)值；
若ΔCt≥9，则为突变阴性；
若ΔCt<9，则为突变阳性。
实施例4：检测幽门螺旋杆菌23S rRNA基因突变的试剂盒的验证(石蜡样本)
将使用本申请试剂盒的检测结果与Sanger基因测序法的检测结果进行一致性比较。
采集200例幽门螺杆菌感染且需要采用石蜡包埋的胃黏膜组织，利用磁珠法石蜡包埋组织基因组DNA提取试剂盒将该石蜡组织进行DNA提取，得到DNA提取液。每例DNA提取液分别使用本申请试剂盒与Sanger基因测序法进行检测。通过比较本申请试剂盒对样本23S rRNA基因的A2142C、A2142G和A2143G突变位点的检测结果与Sanger基因测序法对样本相同突变位点的检测结果，来计算两种方法的符合率。
与Sanger基因测序法比较，符合率高代表两种方法一致性高，表明本申请试剂盒的检测结果精准度高；反之，符合率低代表两种方法一致性低，表明本申请试剂盒的检测结果精准度低。
根据检测结果可知，本申请试剂盒的检测结果与Sanger基因测序法的检测结果的符合率为100％。其中，对200例样本的23S rRNA基因突变位点的检测结果进行统计，统计结果如表2所示。
表2统计结果
临床灵敏度：92/(92+1)×100％＝98.9％；
临床特异性：105/(105+2)×100％＝98.1％；
阳性预测值＝92/(92+2)×100％＝97.9％；
阴性预测值＝105/(105+1)×100％＝99.1％；
总符合率＝(92+105)/200×100％＝98.5％。
由此可以看出，比较本申请试剂盒的检测结果与Sanger基因测序法的检测结果，显示总符合率高。由此可知，本申请试剂盒的特异性强、灵敏度高、检出率高。并且，本申请试剂盒的检测成本低，结果精确可靠、直观，具有较好的实用性。
实施例5：检测幽门螺旋杆菌23S rRNA基因突变的试剂盒的验证(粪便样本)
相较于实施例4，实施例5的区别在于，检测样本不同。实施例5的检测样本是幽门螺杆菌感染且需要检测该菌的耐药情况的粪便样本。
将本申请试剂盒的检测结果与Sanger基因测序法的检测结果进行一致性比较。
采集200例幽门螺杆菌感染且需要检测该菌的耐药情况的粪便样本，利用磁珠法石蜡包埋组织基因组DNA提取试剂盒将该石蜡组织进行DNA提取，得到DNA提取液。每例DNA提取液分别使用本申请建立的检测方法与Sanger基因测序法进行检测。
根据结果可知，使用本申请试剂盒的检测结果与基因测序法检测结果的符合率为100％。其中，对200例样本的23S rRNA基因突变位点的检测结果进行统计，统计结果如表3所示。
表3统计结果
临床灵敏度：111/(111+4)×100％＝96.5％；
临床特异性：82/(82+3)×100％＝96.5％；
阳性预测值＝111/(111+3)×100％＝97.4％；
阴性预测值＝82/(82+4)×100％＝95.3％；
总符合率＝(111+82)/200×100％＝96.5％。
由此可以看出，比较本申请试剂盒的检测结果与Sanger基因测序法的检测结果，显示总符合率高。由此可知，本申请试剂盒的特异性强、灵敏度高、检出率高。并且，本申请试剂盒的检测成本低，结果精确可靠、直观，具有较好的实用性。
可以理解的是，以上实施方式仅仅是为了说明本发明的原理而采用的示例性实施方式，然而本发明并不局限于此。对于本领域内的普通技术人员而言，在不脱离本发明的精神和实质的情况下，可以做出各种变型和改进，这些变型和改进也视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 北京新基永康生物科技有限公司
<120> 一种检测幽门螺旋杆菌23S rRNA基因突变的引物和探针组合物及其应用、试剂盒
<140> 202210075292X
<141> 2022-01-22
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 288
<212> DNA
<213> 幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)
<400> 1
gttaaatacc gacctgcatg aatggcgtaa cgagatggga gctgtctcaa ccagagattc 60
agtgaaattg tagtggaggt gaaaattcct cctacccgcg gcaagacgga aagaccccgt 120
ggacctttac tacaacttag cactgctaat gggaatatca tgcgcaggat aggtgggagg 180
ctttgaagta agggctttgg ctcttatgga gccatccttg agataccacc cttgatgttt 240
ctgttagcta actggcctgt gttatccaca ggcaggacaa tgcttggt 288
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gtaaaggtcc acggggtctt c 21
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
taaaggtcca cggggtcttg 20
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
agtaaaggtc cacggggtct c 21
<210> 5
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
agagattcag tgaaattgta gtggag 26
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aaaattcctc ctacccgcgg caa 23
<210> 7
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ccacggggtc tttc 14
<210> 8
<211> 378
<212> DNA
<213> 幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)
<400> 8
gggtgcaagc gttactcgga atcactgggc gtaaagagcg cgtaggcggg atagtcagtc 60
aggtgtgaaa tcctatggct taaccataga actgcatttg aaactactat tctagagtgt 120
gggagaggta ggtggaattc ttggtgtagg ggtaaaatcc gtagagatca agaggaatac 180
tcattgcgaa ggcgacctgc tggaacatta ctgacgctga ttgcgcgaaa gcgtggggag 240
caaacaggat tagataccct ggtagtccac gccctaaacg atggatgcta gttgttggag 300
ggcttagtct ctccagtaat gcagctaacg cattaagcat cccgcctggg gagtacggtc 360
gcaagattaa aactcaaa 378
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cagccatgtt gcggtgaa 18
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
aaacacaact cccatggtgt ga 22
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
acgttcccgg gtcttgtact caccg 25
<210> 12
<211> 500
<212> DNA
<213> Human origin
<400> 12
agactggcgc gcgcggacgg tcatgggact tcagcatggc ggtgtttgca gatttggacc 60
tgcgagcggg ttctgacctg aaggctctgc gcggacttgt ggagacagcc gctcaccgtg 120
agttgccccg gcttcgcgcc tggccaacct catgccaccc agaccatcgg gccacactcc 180
ggagtaacta tttcctgatg ggtctcggtc aggtctccca gagtctctgg gatgtccctg 240
gaggctgatg cccgccgagg tgttggtctg attcctagcg cgggaaactc gaaggttctg 300
ggggttgtta tctggttcag ctactttcct gcaatgaggg aactgaggcc taacgagggc 360
gagggatttg cataggggcc tacagctgat aggtgacaga agccggagct ggactccaag 420
ggtacaatct tctaagcttc taagttacta tcagcccttc ctgattctca cgacagtgtc 480
taaacaaata ctggaatttg 500
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
agatttggac ctgcgagcg 19
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gagcggctgt ctccacaagt 20
<210> 15
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ttctgacctg aaggctctgc gcg 23
Claims (10)
1.一种检测幽门螺旋杆菌23S rRNA基因突变的引物和探针组合物，其特征在于，所述引物和探针组合物包括用于检测幽门螺杆菌23S rRNA基因的A2142C位点、A2142G位点和A2143G位点的突变型引物和探针组合物、用于检测幽门螺杆菌16S rRNA基因的引物和探针组合物、用于检测人源RNAse P基因的引物和和探针组合物、以及封阻引物；
所述突变型引物和探针组合物包括：
23S-A2142G正向突变型引物：5'-GTAAAGGTCCACGGGGTCTTC-3'
23S-A2142C正向突变型引物：5'-TAAAGGTCCACGGGGTCTTG-3'
23S-A2143G正向突变型引物：5'-AGTAAAGGTCCACGGGGTCTC-3'
23S-A21反向突变型引物：5'-AGAGATTCAGTGAAATTGTAGTGGAG-3'
23S-A21突变型探针：5'-AAAATTCCTCCTACCCGCGGCAA-3'
所述23S-A21突变型探针的5'端标记荧光报告基团、3'端标记荧光淬灭基团；
所述16S rRNA基因的引物和探针组合物包括：
16S正向引物：5'-CAGCCATGTTGCGGTGAA-3'
16S反向引物：5'-AAACACAACTCCCATGGTGTGA-3'
16S探针：5'-ACGTTCCCGGGTCTTGTACTCACCG-3'
所述16S探针的5'端标记荧光报告基团、3'端标记荧光淬灭基团；
所述人源RNAse P基因的引物和探针组合物包括：
RNP正向引物：5'-AGATTTGGACCTGCGAGCG-3'
RNP反向引物：5'-GAGCGGCTGTCTCCACAAGT-3'
RNP探针：5'-TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG-3'
所述RNP探针的5'端标记荧光报告基团、3'端标记荧光淬灭基团；
所述封阻引物包括：
23S Blocker引物：5'-CCACGGGGTCTTTC-3'
所述23S Blocker引物的3'端标记MGB；
所述23S-A21突变型探针、所述16S探针和所述RNP探针的5'端标记荧光报告基团各不相同。
2.根据权利要求1所述的引物和探针组合物，其特征在于，所述23S-A21突变型探针的5'端标记荧光报告基团FAM、3'端标记荧光淬灭基团BHQ1。
3.根据权利要求1所述的引物和探针组合物，其特征在于，所述16S探针的5'端标记荧光报告基团VIC、3'端标记荧光淬灭基团BHQ1。
4.根据权利要求1所述的引物和探针组合物，其特征在于，所述内参基因探针的5'端标记荧光报告基团CY5、3'端标记荧光淬灭基团BHQ1。
5.如权利要求1至4中任意一项所述的引物和探针组合物在制备用于检测幽门螺旋杆菌23SrRNA基因突变的试剂或试剂盒的应用。
6.一种检测幽门螺旋杆菌23S rRNA基因突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1至4中任意一项所述引物和探针组合物。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括尿嘧啶-N-糖基化酶、缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶。
8.根据权利要求6或7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的使用方法包括如下步骤：
(1)提取待测样本DNA；
(2)单管多重荧光定量PCR反应：
以样本DNA为模板，利用如权利要求1至4中任意一项所述引物和探针组合物进行单管多重荧光定量PCR反应，得到实时荧光定量PCR扩增曲线；
(3)根据实时荧光定量PCR扩增曲线判断突变情况。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述突变情况的判断方法为：
①若待测样本的FAM荧光通道有明显扩增信号、或者FAM荧光通道的CtFAM值>37时，则为突变阴性；
②若待测样本的FAM荧光通道有明显扩增信号且FAM荧光通道的CtFAM值≤37时，则计算FAM荧光通道CtFAM值与HEX(VIC)荧光通道CtHEX(VIC)值的差值ΔCt，即ΔCt＝CtFAM值-CtHEX(VIC)值；
若ΔCt≥9，则为突变阴性；
若ΔCt<9，则为突变阳性。
10.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述单管多重荧光定量PCR反应的扩增程序为：37℃酶反应5min，进行1个循环；95℃预变性5min，进行1个循环；95℃变性15s，60℃退火与延伸40s，进行45个循环。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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