CN109576385B - 用于检测大肠埃希氏菌的核酸试剂、试剂盒及系统 - Google Patents

用于检测大肠埃希氏菌的核酸试剂、试剂盒及系统 Download PDF

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Abstract

本公开涉及一种用于检测大肠埃希氏菌的核酸试剂、试剂盒及系统，所述核酸试剂包括分别彼此独立存放或互相任意混合存放的SEQ ID NO.1‑24所示的引物和SEQ ID NO.27‑38所示的探针。本公开通过以上所述的引物和探针建立了检测5种易致病的大肠埃希氏菌的核酸试剂、试剂盒及系统，能够实现快速、全面、敏感、特异、自动的检测结果判定，显著提高了对多种大肠埃希氏菌同时进行检测的敏感性、特异性和简便性。

Description

用于检测大肠埃希氏菌的核酸试剂、试剂盒及系统
技术领域
本公开涉及大肠埃希氏菌的检测，具体地，涉及一种用于检测大肠埃希氏菌的核酸试剂、试剂盒及系统。
背景技术
大肠埃希氏菌是人类肠道中的正常菌群，但在一定条件下，这些细菌将会引起人类的腹泻病，甚至引起腹泻病的爆发。目前已知的能引起人类致病的大肠埃希氏菌主要包括五种，分别是肠致病性大肠埃希菌(EPEC)、肠出血性大肠埃希氏菌(EHEC，又称产志贺毒素大肠埃希氏菌)、肠产毒性大肠埃希氏菌(ETEC)、肠侵袭性大肠埃希氏菌(EIEC)、肠粘附性大肠埃希氏菌(EAEC)。这些致病性大肠埃希氏菌具有非常重要的病原学意义，把它们与非致病性大肠埃希氏菌、其他肠道致病菌相区分，对于判断疾病预后，分析肠道致病菌病原谱，评估人群肠道疾病负担具有重要的意义。
目前，五种致泻性大肠埃希氏菌主要通过血清分型的方法对致病菌株作出判断，这存在一定的误差，在某些致病型的判断上甚至不到10％。因此，建立快速、敏感、特异的五种致泻性大肠埃希氏菌的检测方法是迫在眉睫的事情，这将客观的诊断致病性大肠埃希氏菌引起的人类腹泻，评估致病性大肠埃希氏菌在人类腹泻病中的病原构成比例，进而对采取积极的预防控制策略提供科学的依据。
发明内容
本公开的目的是提供一种快速、准确、一体化的检测多种大肠埃希氏菌的核酸试剂、试剂盒及系统。
为了实现上述目的，本公开第一方面：提供一种用于检测大肠埃希氏菌的核酸试剂，其中，所述核酸试剂包括分别彼此独立存放或互相任意混合存放的SEQ ID NO.1-24所示的引物和SEQ ID NO.27-38所示的探针。
可选地，相对于0.5μM的SEQ ID NO.1所示的引物，分别由SEQ ID NO.2-24所示的引物的含量各自为0.9～1.1μM、0.4～0.6μM、0.9～1.1μM、0.4～0.6μM、0.9～1.1μM、0.4～0.6μM、0.9～1.1μM、0.4～0.6μM、0.9～1.1μM、0.4～0.6μM、0.9～1.1μM、0.4～0.6μM、0.9～1.1μM、0.4～0.6μM、0.9～1.1μM、0.4～0.6μM、0.9～1.1μM、0.4～0.6μM、0.9～1.1μM、0.4～0.6μM、0.9～1.1μM、0.4～0.6μM和0.9～1.1μM，分别由SEQ ID NO.27-38所示的探针的含量各自为0.1～0.3μM、0.1～0.3μM、0.1～0.3μM、0.1～0.3μM、0.1～0.3μM、0.1～0.3μM、0.1～0.3μM、0.1～0.3μM、0.1～0.3μM、0.1～0.3μM、0.1～0.3μM和0.1～0.3μM。
可选地，所述核酸试剂还包括阳性内质控；所述阳性内质控含有SEQ ID NO.25-26所示的引物、SEQ ID NO.39所示的探针和pET28a质粒。
可选地，SEQ ID NO.27-28所示的探针具有第一荧光标记；SEQ ID NO.29-31,36所示的探针具有第二荧光标记；SEQ ID NO.32-35所示的探针具有第三荧光标记；SEQ IDNO.37-39所示的探针具有第四荧光标记；所述第一荧光标记、所述第二荧光标记、所述第三荧光标记和所述第四荧光标记各不相同，且各自独立地选自FAM荧光标记、JOE荧光标记、HEX荧光标记、VIC荧光标记、TAMRA荧光标记、ROX荧光标记、CY5荧光标记和Quasar670荧光标记中的一种
本公开第二方面：提供一种用于检测大肠埃希氏菌的试剂盒，该试剂盒含有本公开第一方面所述的核酸试剂，并且可选地，所述试剂盒还含有反应体系缓冲液、DNA聚合酶、镁离子、dNTP和水中的至少一种。
本公开第三方面：提供本公开第一方面所述的核酸试剂在制备用于检测大肠埃希氏菌的试剂盒中的用途。
可选地，所述大肠埃希氏菌包括肠致病性大肠埃希菌EPEC、肠出血性大肠埃希氏菌EHEC、肠产毒性大肠埃希氏菌ETEC、肠侵袭性大肠埃希氏菌EIEC和肠粘附性大肠埃希氏菌EAEC。
本公开第四方面：提供一种用于检测大肠埃希氏菌的系统，该系统包括装载有本公开第一方面所述的核酸试剂的PCR仪、计算装置和输出装置，所述PCR仪包括第一荧光通道、第二荧光通道、第三荧光通道和第四荧光通道；所述第一荧光通道、所述第二荧光通道、所述第三荧光通道和所述第四荧光通道各不相同，且各自独立地选自FAM荧光通道、JOE荧光通道、HEX荧光通道、VIC荧光通道、TAMRA荧光通道、ROX荧光通道、CY5荧光通道和Quasar670荧光通道中的一种；所述计算装置包括存储器和处理器，所述存储器中存储有计算机程序，所述处理器被配置为执行所述存储器中存储的计算机程序，以实现如下的判别：
空白对照和阴阳性对照成立，则检测结果有效；
a)若第一荧光通道有Tm值为61℃或65℃对应的熔解峰曲线且第一荧光通道有Tm值为69℃对应的熔解峰曲线则判定为肠致病性大肠埃希菌EPEC阳性；
b)若第一荧光通道有Tm值为61℃或65℃对应的熔解峰曲线且第二荧光通道有Tm值为58℃和62℃对应的熔解峰曲线则判定为肠出血性大肠埃希氏菌EHEC阳性；
c)若第三荧光通道有Tm值为64.7℃或68.2℃对应的熔解峰曲线则判定为肠侵袭性大肠埃希氏菌EIEC阳性；
d)若第二荧光通道有Tm值为66℃对应的熔解峰曲线且第三荧光通道有Tm值为58℃和61.8℃对应的熔解峰曲线则判定为肠产毒性大肠埃希氏菌ETEC阳性；
e)若第二荧光通道有Tm值为68.9℃对应的熔解峰曲线且第四荧光通道有Tm值为65℃和70℃对应的熔解峰曲线则判定为肠粘附性大肠埃希氏菌EAEC阳性；
f)若第一荧光通道有Tm值为58℃对应的熔解峰曲线或第四荧光通道有Tm值为60℃对应的熔解峰曲线则判定为阳性内质控阳性。
本公开的有益效果在于：
本公开能够快速实现样本中五种致泻大肠EPEC、EIEC、ETEC、EHEC、EAEC的筛查与鉴别，避免血清学、病原培养学等方法的繁琐操作，达到如下的检测效果：
(一)单管检测
本公开能够在通过1管筛查五种致泻大肠EPEC、EIEC、ETEC、EHEC、EAEC等型别的15种基因。快速简便获得大肠埃希氏菌相关病原种类，节省时间、人力和试剂成本。
(二)灵敏度高
本公开能够实现15个基因的同时检测，反应体系中每个目标基因的检测灵敏度均可达到102CFU/ml，与单重实时荧光PCR检测敏感度相当。
(三)特异性高
本公开的特异性主要体现在一整套特异性引物探针的特异性，所有引物都经过BLAST比对分析，具有高度的保守性和特异性，不仅检测目标能够相互区分，而且还能与其他种属相近、生存环境相同的细菌区别开，这包括志贺氏菌、沙门、克雷伯菌、变形杆菌、沙雷氏菌、柠檬酸杆菌等。
本公开为食品中五种致泻大肠埃希氏菌EPEC、EIEC、ETEC、EHEC、EAEC的快速筛查提供了完备的解决方案，能够进一步提升腹泻病的应急处置和综合防控能力，为降低大肠埃希氏菌在食品安全中的风险提供必要的技术保障。
本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
具体实施方式
以下对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。
本公开第一方面：提供一种用于检测大肠埃希氏菌的核酸试剂，其中，所述核酸试剂包括分别彼此独立存放或互相任意混合存放的SEQ ID NO.1-24所示的引物和SEQ IDNO.27-38所示的探针。
本公开采用Hybeacon探针技术，能够快速、准确、一体化地检测多种大肠埃希氏菌。其中，所述大肠埃希氏菌可以包括肠致病性大肠埃希菌EPEC、肠出血性大肠埃希氏菌EHEC、肠产毒性大肠埃希氏菌ETEC、肠侵袭性大肠埃希氏菌EIEC和肠粘附性大肠埃希氏菌EAEC。
Hybeacon探针技术对探针的要求较高，探针的Tm值尤为重要；此外，探针与引物的组合效果对扩增效果也有重要的影响。上述引物和探针在设计过程中，不仅考虑到了不同目标基因的引物和探针在一个反应体系内共扩增的问题，即评估Tm值、目标对应探针的Tm值的差值、GC含量、避免出现发夹结构及二聚体等情况，而且要保证备选引物和探针区段分别能够全面覆盖上述多种大肠埃希氏菌，特异性良好并且覆盖度高。
进一步地，相对于0.5μM的SEQ ID NO.1所示的引物，分别由SEQ ID NO.2-24所示的引物的含量各自可以为0.9～1.1μM、0.4～0.6μM、0.9～1.1μM、0.4～0.6μM、0.9～1.1μM、0.4～0.6μM、0.9～1.1μM、0.4～0.6μM、0.9～1.1μM、0.4～0.6μM、0.9～1.1μM、0.4～0.6μM、0.9～1.1μM、0.4～0.6μM、0.9～1.1μM、0.4～0.6μM、0.9～1.1μM、0.4～0.6μM、0.9～1.1μM、0.4～0.6μM、0.9～1.1μM、0.4～0.6μM和0.9～1.1μM，分别由SEQ ID NO.27-38所示的探针的含量各自可以为0.1～0.3μM、0.1～0.3μM、0.1～0.3μM、0.1～0.3μM、0.1～0.3μM、0.1～0.3μM、0.1～0.3μM、0.1～0.3μM、0.1～0.3μM、0.1～0.3μM、0.1～0.3μM和0.1～0.3μM。
根据本公开，为做好质量控制，所述核酸试剂还可以包括阳性内质控。进一步地，所述的阳性内质控含有SEQ ID NO.25-26所示的引物、SEQ ID NO.39所示的探针和pET28a质粒(模板)。这时，相对于0.5μM的SEQ ID NO.1所示的引物，分别由SEQ ID NO.25-26所示的引物的含量各自可以为0.4～0.6μM和0.9～1.1μM，由SEQ ID NO.39所示的探针的含量可以为0.1～0.3μM。所述阳性内质控(Internal Amplification Control，IAC)可以有效提示因为操作失误、PCR抑制物等原因造成的假阴性检测结果。
进一步地，可以根据探针各自的Tm值进行荧光标记的排列组合，使得同一体系中的不同探针的扩增被分别识别。例如，作为一种实施方式，SEQ ID NO.27-28所示的探针具有第一荧光标记；SEQ ID NO.29-31,36所示的探针具有第二荧光标记；SEQ ID NO.32-35所示的探针具有第三荧光标记；SEQ ID NO.37-39所示的探针具有第四荧光标记；所述第一荧光标记、所述第二荧光标记、所述第三荧光标记和所述第四荧光标记各不相同，且各自独立地选自FAM荧光标记、JOE荧光标记、HEX荧光标记、VIC荧光标记、TAMRA荧光标记、ROX荧光标记、CY5荧光标记和Quasar670荧光标记中的一种。作为一种特别优选的实施方式，SEQ IDNO.27-28所示的探针具有FAM荧光标记；SEQ ID NO.29-31,36所示的探针具有JOE荧光标记；SEQ ID NO.32-35所示的探针具有CY5荧光标记；SEQ ID NO.37-39所示的探针具有ROX荧光标记。探针中FAM为6-羧基荧光素，JOE为2,7-二甲基-4,5二氯-6-羧基荧光素，TAMRA为6-羧基四甲基罗丹明，CY5为5H-吲哚菁，HEX为六氯-6-甲基荧光素，ROX为6-羧基-X-罗丹明，VIC为购自ABI公司的染料。
本公开第二方面：提供一种用于检测大肠埃希氏菌的试剂盒，该试剂盒含有本公开第一方面所述的核酸试剂，并且可选地，所述试剂盒还含有反应体系缓冲液、DNA聚合酶、镁离子、dNTP和水中的至少一种。
进一步地，所述试剂盒可以用于检测粪便等临床样本中的大肠埃希氏菌。其中，所述大肠埃希氏菌可以包括肠致病性大肠埃希菌EPEC、肠出血性大肠埃希氏菌EHEC、肠产毒性大肠埃希氏菌ETEC、肠侵袭性大肠埃希氏菌EIEC和肠粘附性大肠埃希氏菌EAEC。
本公开的试剂盒能够实现快速、全面、敏感、特异、自动的检测结果判定，显著提高了对5种大肠埃希氏菌同时进行检测的敏感性、特异性和简便性。
本公开第三方面：提供本公开第一方面所述的核酸试剂在制备用于检测大肠埃希氏菌的试剂盒中的用途。其中，所述大肠埃希氏菌可以包括肠致病性大肠埃希菌EPEC、肠出血性大肠埃希氏菌EHEC、肠产毒性大肠埃希氏菌ETEC、肠侵袭性大肠埃希氏菌EIEC和肠粘附性大肠埃希氏菌EAEC。
本公开第四方面：提供一种用于检测大肠埃希氏菌的系统，该系统包括装载有本公开第一方面所述的核酸试剂的PCR仪、计算装置和输出装置，所述PCR仪包括第一荧光通道、第二荧光通道、第三荧光通道和第四荧光通道；所述第一荧光通道、所述第二荧光通道、所述第三荧光通道和所述第四荧光通道各不相同，且各自独立地选自FAM荧光通道、JOE荧光通道、HEX荧光通道、VIC荧光通道、TAMRA荧光通道、ROX荧光通道、CY5荧光通道和Quasar670荧光通道中的一种；所述计算装置包括存储器和处理器，所述存储器中存储有计算机程序，所述处理器被配置为执行所述存储器中存储的计算机程序，以实现如下的判别：
空白对照和阴阳性对照成立，则检测结果有效；
a)若第一荧光通道有Tm值为61℃或65℃对应的熔解峰曲线且第一荧光通道有Tm值为69℃对应的熔解峰曲线则判定为肠致病性大肠埃希菌EPEC阳性；
b)若第一荧光通道有Tm值为61℃或65℃对应的熔解峰曲线且第二荧光通道有Tm值为58℃和62℃对应的熔解峰曲线则判定为肠出血性大肠埃希氏菌EHEC阳性；
c)若第三荧光通道有Tm值为64.7℃或68.5℃对应的熔解峰曲线则判定为肠侵袭性大肠埃希氏菌EIEC阳性；
d)若第二荧光通道有Tm值为66℃对应的熔解峰曲线且第三荧光通道有Tm值为58℃和61.8℃对应的熔解峰曲线则判定为肠产毒性大肠埃希氏菌ETEC阳性；
e)若第二荧光通道有Tm值为68.9℃对应的熔解峰曲线且第四荧光通道有Tm值为65℃和70℃对应的熔解峰曲线则判定为肠粘附性大肠埃希氏菌EAEC阳性；
f)若第一荧光通道有Tm值为58℃对应的熔解峰曲线或第四荧光通道有Tm值为60℃对应的熔解峰曲线则判定为阳性内质控阳性。
本公开建立了检测5种易致病的大肠埃希氏菌的核酸试剂、试剂盒及系统，能够实现快速、全面、敏感、特异、自动的检测结果判定，显著提高了对5种大肠埃希氏菌同时进行检测的敏感性、特异性和简便性。
以下通过实施例进行进一步详细说明本公开，但是本公开并不因此受到任何限制。
以下实施例中，大肠埃希氏菌EPEC、EIEC、ETEC、EHEC、EAEC样本来源于中国国家疾控中心的食品样本，样本采集后转运至实验室。其他肠道细菌如志贺氏菌、沙门、克雷伯菌、变形杆菌、沙雷氏菌、柠檬酸杆菌的阳性核酸由中国疾病预防控制中心细菌病预防控制所提供。试剂均为商购产品，引物、探针均在艾吉析科技(上海)有限公司合成。
实施例
1、引物、探针合成
按照表1和表2所示的引物、探针序列，进行序列合成。探针中FAM为6-羧基荧光素，JOE为2,7-二甲基-4,5二氯-6-羧基荧光素，ROX为6-羧基-X-罗丹明，CY5为5H-吲哚菁。表2的探针序列中的括号表示括号左侧的t具有荧光标记，括号中的内容表示荧光标记的选择。
表1
表2
2、模板提取
使用商品化提取试剂盒提取粪便等临床样本。
3、建立多重实时荧光PCR检测体系
多重PCR引物浓度及反应体系配置如下：
总体系15μL，缓冲液(13μL)，包括0.5-0.75U/μL的聚合酶，1mM的dNTP，10-105拷贝/μL的DNA模板，上游引物的最终使用浓度为500nM，下游引物使用浓度为1μM，每条探针的最终使用浓度各自为200nM。
HyBeaconTM Fluorogenic Probes反应的条件包括在98.0℃，1min(98.0℃，5s；58.0℃，5s；72.0℃，5s；49个循环)98.0℃，1min；35.0℃，1min；熔解曲线35.0至80.0℃，升率为0.5℃/s。
4、特异性验证
选择志贺氏菌、沙门、克雷伯菌、变形杆菌、沙雷氏菌、柠檬酸杆菌(中国疾病预防控制中心细菌病预防控制所提供)，与检测目标细菌种属相近，存在环境相似的细菌作为待检细菌样本。
按照如下操作配制反应体系：取200μL的PCR管配置1管15μL的反应体系，大肠埃希氏菌EPEC、EIEC、ETEC、EHEC、EAEC引物探针混合液,总体系15μL，缓冲液(13μL)，包括0.5-0.75U/μL的聚合酶，1mM的dNTP，10-105拷贝/μL的DNA模板，上游引物的最终使用浓度为500nM，下游引物使用浓度为1μM，每条探针的最终使用浓度各自为200nM。
阳性对照为大肠埃希氏菌EPEC、EIEC、ETEC、EHEC、EAEC的工程细菌混合液，每种浓度均为104CFU/ml；
阴性对照为高温高压灭菌的生理盐水。
将PCR管放入荧光定量PCR仪中，按照如下程序进行98.0℃，1min(98.0℃，5s；58.0℃，5s；72.0℃，5s；49个循环)98.0℃，1min；35.0℃，1min；熔解曲线35.0至80.0℃，升率为0.5℃/s。
反应结果判断：
1)质量控制：空白对照、阳性对照和阳性内对照成立，否则视实验无效。
2)每个荧光检测通道的判断与解释：
收集检测通道荧光信号对探针片段进行熔解曲线分析，得到检测结果；
a)若FAM荧光通道有Tm值为61℃或65℃对应的熔解峰曲线且FAM荧光通道有Tm值为69℃对应的熔解峰曲线则判定为肠致病性大肠埃希菌EPEC阳性；
b)若FAM荧光通道有Tm值为61℃或65℃对应的熔解峰曲线且JOE荧光通道有Tm值为58℃和62℃对应的熔解峰曲线则判定为肠出血性大肠埃希氏菌EHEC阳性；
c)若CY5荧光通道有Tm值为64.7℃或68.2℃对应的熔解峰曲线则判定为肠侵袭性大肠埃希氏菌EIEC阳性；
d)若JOE荧光通道有Tm值为66℃对应的熔解峰曲线且CY5荧光通道有Tm值为58℃和61.8℃对应的熔解峰曲线则判定为肠产毒性大肠埃希氏菌ETEC阳性；
e)若JOE荧光通道有Tm值为68.9℃对应的熔解峰曲线且ROX荧光通道有Tm值为65℃和70℃对应的熔解峰曲线则判定为肠粘附性大肠埃希氏菌EAEC阳性；
f)若FAM荧光通道有Tm值为58℃对应的熔解峰曲线或ROX荧光通道有Tm值为60℃对应的熔解峰曲线则判定为阳性内质控阳性。
结果显示在阴性对照、阳性对照和阳性内对照均为成立的条件下，待检目标均无特异性的溶解峰，表明本公开试剂盒能够有效区分检测目标与非检测目标，具有较好的特异性。
5、最低检出限验证
评估用检测样本：选择大肠埃希氏菌EPEC、EIEC、ETEC、EHEC、EAEC标准品为代表毒株，将5个毒株的细菌悬液分别调整至108CFU/mL，分别提取五种目标细菌基因组DNA。将5个模板分别梯度稀释成相当于107CFU/mL，106CFU/mL，105CFU/mL，104CFU/mL，103CFU/mL，102CFU/mL，10CFU/mL的检测样本。
使用本公开试剂盒分别检测大肠埃希氏菌EPEC、EIEC、ETEC、EHEC、EAEC标准品不同稀释度的模板，按照上述程序和结果判断，结果显示本公开试剂盒检测5种目标细菌的最低检出限均达到102CFU/mL，试剂盒总体的最低检出限为每个反应检测1拷贝的目标分子。
6、覆盖度验证
选择20种来源不同的大肠埃希氏菌EPEC、EIEC、ETEC、EHEC、EAEC的粪便样本核酸作为覆盖度评估用模板。按照以上所述反应体系及反应程序进行试验。
结果显示对上述所有大肠埃希氏菌均可覆盖检测出。
7、试剂盒的保存期试验
分别取强阳性105CFU/mL和弱阳性103CFU/mL的大肠埃希氏菌EPEC、EIEC、ETEC、EHEC、EAEC的模板为评估用检测样本，在第0天时，分装成9份冻存于-70℃冰箱中。将组建完毕的试剂盒放置于-20℃保存，分别取0、10、15、30、60、90、120、150、180和360天的试剂盒进行保存期试验。
结果显示本公开试剂盒保存在-20℃冰箱，在不同保存期检测均为阳性，表明该试剂盒的保存期至少为6个月。
对比例
1、引物、探针合成
按照表3和表4所示的引物、探针序列，进行序列合成。探针中FAM为6-羧基荧光素，JOE为2,7-二甲基-4,5二氯-6-羧基荧光素，ROX为6-羧基-X-罗丹明，CY5为5H-吲哚菁。表5中探针序列中的括号表示括号左侧的T具有荧光标记，括号中的内容表示荧光标记的选择。
表3
表4
2、特异性验证
按照实施例的方法进行特异性验证。结果显示，对比例的引物、探针的反应结果均为阴性。
3、最低检出限验证
按照实施例的方法进行最低检出限验证。实施例与对比例的最低检出限对比如下表5。
表5
检测目标 实施例 对比例
肠致病性大肠埃希菌EPEC 50cfu/ml 100cfu/ml
肠出血性大肠埃希氏菌EHEC 80cfu/ml 200cfu/ml
肠产毒性大肠埃希氏菌ETEC 120cfu/ml 500cfu/ml
肠侵袭性大肠埃希氏菌EIEC 50cfu/ml 200cfu/ml
肠粘附性大肠埃希氏菌EAEC 50cfu/ml 200cfu/ml
由上表可知，对于样本中痕量的大肠埃希氏菌EPEC、EIEC、ETEC、EHEC、EAEC，本公开试剂盒比对比例有更强的检测能力。
4、覆盖度验证
按照实施例的方法进行覆盖度验证。实施例与对比例的覆盖度对比如下表6。
表6
检测目标 实施例 对比例
肠致病性大肠埃希菌EPEC 120株全部阳性 118株阳性
肠出血性大肠埃希氏菌EHEC 80株全部阳性 77株全部阳性
肠产毒性大肠埃希氏菌ETEC 100株全部阳性 90株全部阳性
肠侵袭性大肠埃希氏菌EIEC 90株全部阳性 86株全部阳性
肠粘附性大肠埃希氏菌EAEC 80株全部阳性 74株全部阳性
由表6可知，本公开的试剂盒检测覆盖度远远大于对比例的检测覆盖度。
由实施例和对比例的对比可以看出，本公开可以一次性检测出包括大肠埃希氏菌EPEC、EIEC、ETEC、EHEC、EAEC在内的5种大肠埃希氏菌，探针特异性高，且最低检出限更低，覆盖度更广。
以上详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。
序列表
<110> 北京卓诚惠生生物科技股份有限公司
<120> 用于检测大肠埃希氏菌的核酸试剂、试剂盒及系统
<130> 11661ABT-R
<160> 80
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tttcaccgaa gttcatgcc 19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggaatttcgc cgattttgc 19
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cccacaatcc tgttgattac ga 22
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
taccgaagga gtaaataatg tcac 24
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gcagataaat cgccattcgt t 21
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aacatcgctc ttgccaca 18
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
acgatagact tttcgaccca ac 22
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
atccacagca aaataactgc c 21
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cagatatatg gatggtatcg tgtt 24
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tgggaaacct gctaatctgt 20
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ctgcactgga aaatacgaa 19
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ttatatgtcg aggtacact 19
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gctcaggatg ctaaaccagt 20
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gcaggattac aacacaattc aca 23
<210> 15
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
aagagcatag catccgag 18
<210> 16
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ttaaagttaa gttctgacgc gatt 24
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ttccagacca tgctcgcaga 20
<210> 18
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
agcttccgta cgcttcagt 19
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
aatgaaggac taccgttcgt g 21
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
ctggttgctt tccttgaccg 20
<210> 21
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
gcctgggaac gaaacactac aac 23
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
ggctcaatga acgtgtcctc 20
<210> 23
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
gccatcaaca cagtatatcc gaag 24
<210> 24
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
tgacggcttt gtagtcct 18
<210> 25
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
gattcatggc tcagaacgaa c 21
<210> 26
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
cgctttactc atcccgttg 19
<210> 27
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
ccctttctgt tactgccaa 19
<210> 28
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
cactgagtac caagggcat 19
<210> 29
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
ccactatgcg acattaaatc cag 23
<210> 30
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
acaccgatgt ggtcccct 18
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
accatcctct gccggagcta 20
<210> 32
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
aattgtctgg ctatctggtt t 21
<210> 33
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
actattcatg ctttcaggac cact 24
<210> 34
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
cctttcaggc agcaagcgtc c 21
<210> 35
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
aatgcgtttc tatggcgtgt cggga 25
<210> 36
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
ttcccgctgc tgtcgtgatg gtt 23
<210> 37
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
acccattcct ggtatgccgg tgct 24
<210> 38
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
ccatgacacg atgcgcagac t 21
<210> 39
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
ctttctcgct cgacttgcat 20
<210> 40
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
taatcaggaa gtgatggagc at 22
<210> 41
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
agttcagttc gttgttca 18
<210> 42
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
attctggctc tcttcttctt tatggctg 28
<210> 43
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
cgtccccttt tacaaacttc atcgc 25
<210> 44
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
attctggctc tcttcttctt tatggctg 28
<210> 45
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
cgtccccttt tacaaacttc atcgc 25
<210> 46
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
cgatgttacg gtttgttact gtgacagc 28
<210> 47
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
aatgccacgc ttcccagaat tg 22
<210> 48
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
gttttgacca tcttcgtctg attattgag 29
<210> 49
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
agcgtaaggc ttctgctgtg ac 22
<210> 50
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
gaacaggagg tttctgcgtt aggtg 25
<210> 51
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
ctttcaatgg cttttttttg ggagtc 26
<210> 52
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
cctcttttag ycagacarct gaatcasttg 30
<210> 53
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
caggcaggat tacaacaaag ttcacag 27
<210> 54
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
tgtctttttc acctttcgct c 21
<210> 55
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
cggtacaagc aggattacaa cac 23
<210> 56
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
cgatagatgg cgagaaatta tatcccg 27
<210> 57
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
cgatcaagaa tccctaacag aagaatcac 29
<210> 58
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
gaaaaccctc ctggtccatc agg 23
<210> 59
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
gccggtcagc caccctctga gagtac 26
<210> 60
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
acgcagagtt gcctgataaa g 21
<210> 61
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 61
aatacagaat cgtcagcatc agc 23
<210> 62
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
agccgtttcc gcagaagcc 19
<210> 63
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 63
aaatgtcagt gaaccgacga ttgg 24
<210> 64
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 64
tgccatcaac acagtatatc cg 22
<210> 65
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
acggctttgt agtccttcca t 21
<210> 66
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 66
gattcatggc tcagaacgaa c 21
<210> 67
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 67
cgctttactc atcccgttg 19
<210> 68
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 68
aaagtgtggg tcaataatca ggaagtg 27
<210> 69
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 69
cgtccccttt tacaaacttc atcgc 25
<210> 70
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 70
cgatgttacg gtttgttact gtgacagc 28
<210> 71
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 71
agcgtaaggc ttctgctgtg ac 22
<210> 72
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 72
ctttcaatgg cttttttttg ggagtc 26
<210> 73
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 73
cctcttttag tcagacatct gaatcagttg 30
<210> 74
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 74
actattcatg ctttcaggac cact 24
<210> 75
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 75
cgatcaagaa tccctaacag aagaatcac 29
<210> 76
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 76
gccggtcagc caccctctga gagtac 26
<210> 77
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 77
acgcagagtt gcctgataaa g 21
<210> 78
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 78
aaatgtcagt gaaccgacga ttgg 24
<210> 79
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 79
tgccatcaac acagtatatc cg 22
<210> 80
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 80
ctttctcgct cgacttgcat 20

Claims (8)

1.一种用于检测大肠埃希氏菌的核酸试剂，其中，所述核酸试剂包括分别彼此独立存放或互相任意混合存放的SEQ ID NO.1-24所示的引物和SEQ ID NO.27-38所示的探针；
其中，所述SEQ ID NO.27-38所示的探针具体如下：
SEQ ID NO.27：ccctttct-FAM-gttact-FAM-gccaa，
SEQ ID NO.28：cact-FAM-gagt-FAM-accaagggcat，
SEQ ID NO.29：ccactat-JOE-gcgacattaaat-JOE-ccag，
SEQ ID NO.30：acaccgat-JOE-gtggt-JOE-cccct，
SEQ ID NO.31：accat-JOE-cctct-JOE-gccggagcta，
SEQ ID NO.32：aatt-CY5-gtctggctatct-CY5-ggttt，
SEQ ID NO.33：actattcat-CY5-gcttt-CY5-caggaccact，
SEQ ID NO.34：ccttt-CY5-caggcagcaagcgt-CY5-cc，
SEQ ID NO.35：aatgcgt-CY5-ttctatggcgt-CY5-gtcggga，
SEQ ID NO.36：ttcccgct-JOE-gctgt-JOE-cgtgatggtt，
SEQ ID NO.37：acccattcct-ROX-ggtat-ROX-gccggtgct，
SEQ ID NO.38：ccat-ROX-gacacgat-ROX-gcgcagact。
2.根据权利要求1所述的核酸试剂，其中，SEQ ID NO.1所示的引物的含量为0.5μM，分别由SEQ ID NO.2-24所示的引物的含量各自为0.9～1.1μM、0.4～0.6μM、0.9～1.1μM、0.4～0.6μM、0.9～1.1μM、0.4～0.6μM、0.9～1.1μM、0.4～0.6μM、0.9～1.1μM、0.4～0.6μM、0.9～1.1μM、0.4～0.6μM、0.9～1.1μM、0.4～0.6μM、0.9～1.1μM、0.4～0.6μM、0.9～1.1μM、0.4～0.6μM、0.9～1.1μM、0.4～0.6μM、0.9～1.1μM、0.4～0.6μM和0.9～1.1μM，分别由SEQ IDNO.27-38所示的探针的含量各自为0.1～0.3μM、0.1～0.3μM、0.1～0.3μM、0.1～0.3μM、0.1～0.3μM、0.1～0.3μM、0.1～0.3μM、0.1～0.3μM、0.1～0.3μM、0.1～0.3μM、0.1～0.3μM和0.1～0.3μM。
3.根据权利要求1所述的核酸试剂，其中，所述核酸试剂还包括阳性内质控；所述阳性内质控含有SEQ ID NO.25-26所示的引物、SEQ ID NO.39所示的探针和pET28a质粒；
其中，所述SEQ ID NO.39所示的探针为ctttct-ROX-cgct-ROX-cgacttgcat。
4.一种用于检测大肠埃希氏菌的试剂盒，该试剂盒含有权利要求1～3中任意一项所述的核酸试剂。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还含有反应体系缓冲液、DNA聚合酶、镁离子、dNTP和水中的至少一种。
6.权利要求1～3中任意一项所述的核酸试剂在制备用于检测大肠埃希氏菌的试剂盒中的用途。
7.根据权利要求6所述的用途，其中，所述大肠埃希氏菌包括肠致病性大肠埃希菌EPEC、肠出血性大肠埃希氏菌EHEC、肠产毒性大肠埃希氏菌ETEC、肠侵袭性大肠埃希氏菌EIEC和肠粘附性大肠埃希氏菌EAEC。
8.一种用于检测大肠埃希氏菌的系统，该系统包括装载有权利要求1～3中任意一项所述的核酸试剂的PCR仪、计算装置和输出装置，所述PCR仪包括第一荧光通道、第二荧光通道、第三荧光通道和第四荧光通道；所述第一荧光通道为FAM荧光通道，所述第二荧光通道为JOE荧光通道，所述第三荧光通道为CY5荧光通道，所述第四荧光为ROX荧光通道；所述计算装置包括存储器和处理器，所述存储器中存储有计算机程序，所述处理器被配置为执行所述存储器中存储的计算机程序，以实现如下的判别：
空白对照和阴阳性对照成立，则检测结果有效；
a)若第一荧光通道有Tm值为61℃或65℃对应的熔解峰曲线且第一荧光通道有Tm值为69℃对应的熔解峰曲线则判定为肠致病性大肠埃希菌EPEC阳性；
b)若第一荧光通道有Tm值为61℃或65℃对应的熔解峰曲线且第二荧光通道有Tm值为58℃和62℃对应的熔解峰曲线则判定为肠出血性大肠埃希氏菌EHEC阳性；
c)若第三荧光通道有Tm值为64.7℃或68.2℃对应的熔解峰曲线则判定为肠侵袭性大肠埃希氏菌EIEC阳性；
d)若第二荧光通道有Tm值为66℃对应的熔解峰曲线且第三荧光通道有Tm值为58℃和61.8℃对应的熔解峰曲线则判定为肠产毒性大肠埃希氏菌ETEC阳性；
e)若第二荧光通道有Tm值为68.9℃对应的熔解峰曲线且第四荧光通道有Tm值为65℃和70℃对应的熔解峰曲线则判定为肠粘附性大肠埃希氏菌EAEC阳性；
f)若第一荧光通道有Tm值为58℃对应的熔解峰曲线或第四荧光通道有Tm值为60℃对应的熔解峰曲线则判定为阳性内质控阳性。
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