CN110438247B - 用于检测大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌及其毒性和耐药性的核酸试剂、试剂盒、系统及方法 - Google Patents

用于检测大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌及其毒性和耐药性的核酸试剂、试剂盒、系统及方法 Download PDF

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Abstract

本公开涉及一种用于检测大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌及其毒力因子和耐药基因的核酸试剂、试剂盒、系统及方法，所述核酸试剂包括分别彼此独立存放或互相任意混合存放的SEQIDNO.1‑26所示的引物和SEQIDNO.29‑41所示的探针。本公开通过以上所述的引物和探针建立了检测大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌及其携带的6种毒力因子和5种耐药基因的核酸试剂、试剂盒、系统及方法，能够实现快速、全面、敏感、特异、自动的检测结果判定，显著提高了对上述目标检测基因同时进行检测的敏感性、特异性和简便性。

Description

用于检测大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌及其毒性和耐药性的核 酸试剂、试剂盒、系统及方法
技术领域
本公开涉及生物技术领域，具体地，涉及一种用于检测大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌及其毒力因子和耐药基因的核酸试剂与试剂盒及方法。
背景技术
肺炎克雷伯菌是临床上常见的条件致病菌，具有高黏液表型、高度侵袭性和高致死性等特点，其致病性与多个毒力因子有关。产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)和碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌是具有耐药性的致病菌，我国CHINET细菌耐药性监测数据显示，肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌对抗生素的耐药率在逐年增加，从2005年的3％上升至2016年的19.2％，这两种耐药菌的出现和传播，给临床诊断和治疗带来了极大的挑战。
目前，临床上常用的细菌耐药性检测方法主要有药敏法、双纸片协同实验、纸片表型确证试验、琼脂稀释法确证试验、三维试验等。
然而，目前临床上常用的细菌耐药性检测方法中，检测标本送检率、用药情况、标本采集数量、培养基、培养方法等因素均会影响细菌耐药性的检测结果，因此检测准确性较差，同时这些检测方法还存在操作繁琐、费时费力、检测灵敏度较低等问题；而且，目前临床上肺炎克雷伯菌毒力因子的检测方法仍然较少。
发明内容
本公开的目的是提供一种快速、准确、灵敏度高的检测大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌及其毒性和耐药性的核酸试剂、试剂盒、系统及方法。
为了实现上述目的，本公开提供一种用于检测大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌及其毒力因子和耐药基因的核酸试剂，其中，所述核酸试剂包括分别彼此独立存放或互相任意混合存放的SEQ ID NO.1-26所示的引物和SEQ ID NO.29-41所示的探针。
可选地，相对于1μmol的SEQ ID NO.1所示的引物，分别由SEQ ID NO.2-26所示的引物的含量各自为0.3～0.5μmol、0.3～0.6μmol、0.4～0.8μmol、0.3～0.5μmol、0.3～0.5μmol、0.5～1μmol、0.4～0.8μmol、0.4～0.8μmol、0.3～0.5μmol、0.3～0.6μmol、0.4～0.8μmol、0.3～0.5μmol、0.3～0.5μmol、0.5～1μmol、0.4～0.8μmol、0.4～0.8μmol、0.3～0.5μmol、0.3～0.6μmol、0.4～0.8μmol、0.3～0.5μmol、0.3～0.5μmol、0.5～1μmol、0.4～0.8μmol、0.3～0.5μmol、0.3～0.5μmol，分别由SEQ ID NO.29-41所示的探针的含量各自为0.2～0.4μmol、0.3～0.6μmol、0.2～0.5μmol、0.2～0.5μmol、0.3～0.5μmol、0.3～0.6μmol、0.4～0.6μmol、0.2～0.5μmol、0.2～0.4μmol、0.3～0.6μmol、0.2～0.5μmol、0.2～0.5μmol、0.2～0.4μmol。
可选地，所述核酸试剂还包括阳性内质控；
所述阳性内质控含有SEQ ID NO.27-28所示的引物和SEQ ID NO.42所示的探针。
可选地，所述核酸试剂包括A管、B管、C管和D管；A管含有SEQ ID NO.1-2、5-10所示的引物和SEQ ID NO.29、31-33所示的探针；B管含有SEQ ID NO.11-16、27-28所示的引物和SEQ ID NO.34-36、42所示的探针；C管含有SEQ ID NO.1-2、17-20、25-26所示的引物和SEQID NO.29、37-38、41所示的探针；D管含有SEQ ID NO.3-4、21-24、27-28所示的引物和SEQID NO.30、39-40、42所示的探针。
可选地，SEQ ID NO.31、36-37、40所示的探针具有第一荧光标记；SEQ ID NO.32、35、38、39所示的探针具有第二荧光标记；SEQ ID NO.30、33-34、41所示的探针具有第三荧光标记；SEQ ID NO.29、42所示的探针具有第四荧光标记；所述第一荧光标记、所述第二荧光标记、所述第三荧光标记和所述第四荧光标记各不相同，且各自独立地选自FAM荧光标记、VIC荧光标记、HEX荧光标记、CY5荧光标记和ROX荧光标记中的一种。
可选地，所述肺炎克雷伯菌的毒力因子包括iroB、magA、peg344、iucA、rmpA和rmpA2中的至少一种；所述耐药基因包括KPC、NDM、OXA-48、IMP和VIM中的至少一种。
本公开还提供了一种用于检测大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌及其毒力因子和耐药基因的试剂盒，该试剂盒含有上述任意一项所述的核酸试剂，并且可选地，所述试剂盒还含有反应体系缓冲液、DNA聚合酶、Tween-20、钾离子、镁离子、dNTP、阳性对照和水中的至少一种。
本公开还提供了上述任意一项所述的核酸试剂在制备用于检测大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌及其毒力因子和耐药基因的试剂盒中的用途。
本公开还提供了一种用于检测大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌及其毒力因子和耐药基因的系统，该系统包括具有A管检测器、B管检测器、C管检测器和D管检测器的PCR仪、计算装置和输出装置；所述A管检测器、B管检测器、C管检测器和D管检测器分别为装载有权利要求4～6中任意一项所述的核酸试剂的核酸试剂储藏容器；所述PCR仪包括第一荧光通道、第二荧光通道、第三荧光通道和第四荧光通道；所述第一荧光通道、所述第二荧光通道、所述第三荧光通道和所述第四荧光通道各不相同，且各自独立地选自FAM荧光通道、VIC荧光通道、CY5荧光通道和ROX荧光通道中的一种；所述计算装置包括存储器和处理器，所述存储器中存储有计算机程序，所述处理器被配置为执行所述存储器中存储的计算机程序，以实现如下的判别：
若空白对照、阳性对照和阳性内对照成立，则检测结果有效；
若荧光通道检测到的扩增曲线呈S型，且CT值＜35，则判定检测结果为阳性；若荧光通道检测到的扩增曲线呈S型，且35≤CT值＜40，则重新提取样本并复检，若复检得到的扩增曲线呈S型，且CT值＜40，则判定检测结果为阳性，否则为阴性；
若A管第一荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中携带有iroB毒力因子；若A管第二荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中携带有magA毒力因子；若A管第三荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中携带有peg344毒力因子；若A管第四荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中含有肺炎克雷伯菌；
若B管第一荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中携带有rmpA2毒力因子；若B管第二荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中携带有rmpA毒力因子；若B管第三荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中携带有iucA毒力因子；若B管第四荧光通道的检测结果为阳性，则判定样本提取正常，检测结果正常；
若C管第一荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中携带有KPC耐药基因；若C管第二荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中携带有NDM耐药基因；若C管第三荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中携带有VIM耐药基因；若C管第四荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中含有肺炎克雷伯菌；
若D管第一荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中携带有IMP耐药基因；若D管第二荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中携带有OXA-48耐药基因；若D管第三荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中含有大肠埃希菌；若D管第四荧光通道的检测结果为阳性，则判定样本提取正常，检测结果正常。
本公开还提供了一种用于检测大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌及其毒力因子和耐药基因的方法，其中，该方法包括：采用权利要求4～6中任意一项所述的核酸试剂，对待测样本的核酸序列进行PCR扩增；进行所述PCR扩增的PCR仪包括第一荧光通道、第二荧光通道、第三荧光通道和第四荧光通道；所述第一荧光通道、所述第二荧光通道、所述第三荧光通道和所述第四荧光通道各不相同，且各自独立地选自FAM荧光通道、VIC荧光通道、CY5荧光通道或ROX荧光通道中的一种；并且进行如下的判别：
若空白对照、阳性对照和阳性内对照成立，则检测结果有效；
若荧光通道检测到的扩增曲线呈S型，且CT值＜35，则判定检测结果为阳性；若荧光通道检测到的扩增曲线呈S型，且35≤CT值＜40，则重新提取样本并复检，若复检得到的扩增曲线呈S型，且CT值＜40，则判定检测结果为阳性，否则为阴性；
若A管第一荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中携带有iroB毒力因子；若A管第二荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中携带有magA毒力因子；若A管第三荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中携带有peg344毒力因子；若A管第四荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中含有肺炎克雷伯菌；
若B管第一荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中携带有rmpA2毒力因子；若B管第二荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中携带有rmpA毒力因子；若B管第三荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中携带有iucA毒力因子；若B管第四荧光通道的检测结果为阳性，则判定样本提取正常，检测结果正常；
若C管第一荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中携带有KPC耐药基因；若C管第二荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中携带有NDM耐药基因；若C管第三荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中携带有VIM耐药基因；若C管第四荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中含有肺炎克雷伯菌；
若D管第一荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中携带有IMP耐药基因；若D管第二荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中携带有OXA-48耐药基因；若D管第三荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中含有大肠埃希菌；若D管第四荧光通道的检测结果为阳性，则判定样本提取正常，检测结果正常。
本公开的有益效果在于：
本公开能够快速实现待测样本中大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌及其6种毒力因子和5种耐药基因的筛查与鉴别，避免血清学、病原培养学等方法的繁琐操作，达到如下的检测效果：
(一)较高的多重检测能力
本公开所建立的检测方法，能够通过在4个反应体系中分别检测大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、6种肺炎克雷伯菌的毒力因子和5种耐药基因，快速简便地获得相关病原种类、肺炎克雷伯菌毒力因子及耐药基因的类型，节省时间、人力和试剂成本。
(二)灵敏度高
本公开所建立的检测方法能够实现13种基因的同时检测，反应体系中每个目标基因的检测灵敏度均可达到102copies/μL，与单重实时荧光PCR检测敏感度相当。
(三)特异性高
本公开所建立的检测方法中，所有引物都经过BLAST比对分析，具有高度的保守性和特异性，不仅能够将检测目标相互区分，而且还能与其他种属相近、生存环境相同的其他耐药菌区别开，这包括蕈状芽孢杆菌、韦氏芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、单核细胞增生性李斯特氏菌、霍乱弧菌、空肠弯曲菌、结肠弯曲菌、嗜水气单胞菌等。
(四)预防假阴性结果
本公开所建立的检测方法中，利用阳性内对照(IAC)，可以有效提示假阴性检测结果。
本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
具体实施方式
以下对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。
本公开的第一方面提供一种用于检测大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌及其毒力因子和耐药基因的核酸试剂，其中，所述核酸试剂包括分别彼此独立存放或互相任意混合存放的SEQ ID NO.1-26所示的引物和SEQ ID NO.29-41所示的探针。
本公开提供的核酸试剂，采用多重荧光PCR技术，能够快速、准确、简便地检测大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、肺炎克雷伯菌的6种毒力因子和5种耐药基因。精准地检测高致病性菌株，对监测和防治高致病性肺炎克雷伯菌的爆发流行具有重要意义。而且，同时检测肺炎克雷伯菌的高致病性毒力因子及耐药基因，能指导临床选择合适的辅助治疗方式，合理使用抗生素药物，对提高临床治疗效果具有重要意义。
多重荧光PCR技术中，探针与引物的组合效果对扩增效果有重要影响，上述引物和探针在设计过程中，不仅考虑到了不同目标基因的引物和探针在一个反应体系内共扩增的问题，即评估Tm值一致性、GC含量均一化、避免出现发夹结构及引物二聚体等情况，而且要保证备选引物和探针区段分别能够全面覆盖上述大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、肺炎克雷伯菌的6种毒力因子和5种耐药基因，特异性良好、覆盖度高并且灵敏度高。
根据本公开，上述核酸制剂中，各引物和/或探针的相对含量可以在较大的范围内变化。例如，相对于1μmol的SEQ ID NO.1所示的引物，分别由SEQ ID NO.2-26所示的引物的含量各自为0.3～0.5μmol、0.3～0.6μmol、0.4～0.8μmol、0.3～0.5μmol、0.3～0.5μmol、0.5～1μmol、0.4～0.8μmol、0.4～0.8μmol、0.3～0.5μmol、0.3～0.6μmol、0.4～0.8μmol、0.3～0.5μmol、0.3～0.5μmol、0.5～1μmol、0.4～0.8μmol、0.4～0.8μmol、0.3～0.5μmol、0.3～0.6μmol、0.4～0.8μmol、0.3～0.5μmol、0.3～0.5μmol、0.5～1μmol、0.4～0.8μmol、0.3～0.5μmol、0.3～0.5μmol，分别由SEQ ID NO.29-41所示的探针的含量各自为0.2～0.4μmol、0.3～0.6μmol、0.2～0.5μmol、0.2～0.5μmol、0.3～0.5μmol、0.3～0.6μmol、0.4～0.6μmol、0.2～0.5μmol、0.2～0.4μmol、0.3～0.6μmol、0.2～0.5μmol、0.2～0.5μmol、0.2～0.4μmol。
根据本公开，为控制反应体系的内部质量，更好地判断反应是否受到干扰，所述核酸试剂还可以包括阳性内质控(Internal Amplification Control，IAC)。进一步地，所述阳性内质控可以含有SEQ ID NO.27-28所示的引物和SEQ ID NO.42所示的探针。这时，相对于1μmol的SEQ ID NO.1所示的引物，分别由SEQ ID NO.27-28所示的引物的含量各自可以为0.2～0.5μmol和0.2～0.5μmol，由SEQ ID NO.42所示的探针的含量可以为0.1～0.3μmol。所述阳性内质控可以有效提示因为操作失误、PCR抑制物等原因造成的假阴性检测结果。其中，可以人RP基因为模板设计上述阳性内质控引物和探针。
根据本公开，为了增强检测结果的准确性，所述核酸试剂可以分为四管，即所述核酸试剂可以包括A管、B管、C管和D管；A管含有SEQ ID NO.1-2、5-10所示的引物和SEQ IDNO.29、31-33所示的探针；B管含有SEQ ID NO.11-16、27-28所示的引物和SEQ ID NO.34-36、42所示的探针；C管含有SEQ ID NO.1-2、17-20、25-26所示的引物和SEQ ID NO.29、37-38、41所示的探针；D管含有SEQ ID NO.3-4、21-24、27-28所示的引物和SEQ ID NO.30、39-40、42所示的探针。
进一步地，为使同一体系中的不同探针的扩增被分别识别，可以对探针分别进行荧光标记。例如，作为一种实施方式，SEQ ID NO.31、36-37、40所示的探针具有第一荧光标记；SEQ ID NO.32、35、38、39所示的探针具有第二荧光标记；SEQ ID NO.30、33-34、41所示的探针具有第三荧光标记；SEQ ID NO.29、42所示的探针具有第四荧光标记；所述第一荧光标记、所述第二荧光标记、所述第三荧光标记和所述第四荧光标记各不相同，且各自独立地选自FAM荧光标记、VIC荧光标记、HEX荧光标记、CY5荧光标记和ROX荧光标记中的一种。作为一种特别优选的实施方式，SEQ ID NO.31、36-37、40所示的探针具有FAM荧光标记；SEQ IDNO.32、35、38、39所示的探针具有VIC荧光标记；SEQID NO.30、33-34、41所示的探针具有CY5荧光标记；SEQ ID NO.29、42所示的探针具有ROX荧光标记。探针中FAM为6-羧基荧光素，VIC为购自ABI公司的染料，HEX为六氯-6-甲基荧光素，CY5为5H-吲哚菁，ROX为6-羧基-X-罗丹明。
根据本公开，所述肺炎克雷伯菌的毒力因子可以包括iroB、magA、peg344、iucA、rmpA和rmpA2中的至少一种；所述耐药基因可以包括KPC、NDM、OXA-48、IMP和VIM中的至少一种。其中，所述耐药基因的基因型别可在较大的范围内变化，例如，KPC耐药基因可以包含1～22种基因型别，NDM耐药基因可以包含1～12种基因型别，OXA-48类耐药基因可以包含46、162、163、181、204、232、244、245、247、370等10种基因型别，IMP耐药基因可以包含1～42中基因型别，VIM耐药基因可以包含1～40种基因型别。
本公开的第二方面提供了一种用于检测大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌及其毒力因子和耐药基因的试剂盒，该试剂盒含有上述任意一项所述的核酸试剂，并且可选地，所述试剂盒还含有反应体系缓冲液、DNA聚合酶、Tween-20、钾离子、镁离子、dNTP、阳性对照和水中的至少一种。
本公开的试剂盒能够实现快速、全面、准确、敏感、特异、自动的检测结果判定，显著提高了对大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、肺炎克雷伯菌的6种毒力因子和5种耐药基因同时进行检测的敏感性、特异性和简便性。
本公开的第三方面提供了上述任意一项所述的核酸试剂在制备用于检测大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌及其毒力因子和耐药基因的试剂盒中的用途。
本公开的第四方面提供了一种用于检测大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌及其毒力因子和耐药基因的系统，该系统包括具有A管检测器、B管检测器、C管检测器和D管检测器的PCR仪、计算装置和输出装置；所述A管检测器、B管检测器、C管检测器和D管检测器分别为装载有权利要求4～6中任意一项所述的核酸试剂的核酸试剂储藏容器；所述PCR仪包括第一荧光通道、第二荧光通道、第三荧光通道和第四荧光通道；所述第一荧光通道、所述第二荧光通道、所述第三荧光通道和所述第四荧光通道各不相同，且各自独立地选自FAM荧光通道、VIC荧光通道、CY5荧光通道和ROX荧光通道中的一种；所述计算装置包括存储器和处理器，所述存储器中存储有计算机程序，所述处理器被配置为执行所述存储器中存储的计算机程序，以实现如下的判别：
若空白对照、阳性对照和阳性内对照成立，则检测结果有效；
若荧光通道检测到的扩增曲线呈S型，且CT值＜35，则判定检测结果为阳性；若荧光通道检测到的扩增曲线呈S型，且35≤CT值＜40，则重新提取样本并复检，若复检得到的扩增曲线呈S型，且CT值＜40，则判定检测结果为阳性，否则为阴性；
若A管第一荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中携带有iroB毒力因子；若A管第二荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中携带有magA毒力因子；若A管第三荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中携带有peg344毒力因子；若A管第四荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中含有肺炎克雷伯菌；
若B管第一荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中携带有rmpA2毒力因子；若B管第二荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中携带有rmpA毒力因子；若B管第三荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中携带有iucA毒力因子；若B管第四荧光通道的检测结果为阳性，则判定样本提取正常，检测结果正常；
若C管第一荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中携带有KPC耐药基因；若C管第二荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中携带有NDM耐药基因；若C管第三荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中携带有VIM耐药基因；若C管第四荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中含有肺炎克雷伯菌；
若D管第一荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中携带有IMP耐药基因；若D管第二荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中携带有OXA-48耐药基因；若D管第三荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中含有大肠埃希菌；若D管第四荧光通道的检测结果为阳性，则判定样本提取正常，检测结果正常。
本公开的第五方面提供了一种用于检测大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌及其毒力因子和耐药基因的方法，其中，该方法包括：采用权利要求4～6中任意一项所述的核酸试剂，对待测样本的核酸序列进行PCR扩增；进行所述PCR扩增的PCR仪包括第一荧光通道、第二荧光通道、第三荧光通道和第四荧光通道；所述第一荧光通道、所述第二荧光通道、所述第三荧光通道和所述第四荧光通道各不相同，且各自独立地选自FAM荧光通道、VIC荧光通道、CY5荧光通道或ROX荧光通道中的一种；并且进行如下的判别：
若空白对照、阳性对照和阳性内对照成立，则检测结果有效；
若荧光通道检测到的扩增曲线呈S型，且CT值＜35，则判定检测结果为阳性；若荧光通道检测到的扩增曲线呈S型，且35≤CT值＜40，则重新提取样本并复检，若复检得到的扩增曲线呈S型，且CT值＜40，则判定检测结果为阳性，否则为阴性；
若A管第一荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中携带有iroB毒力因子；若A管第二荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中携带有magA毒力因子；若A管第三荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中携带有peg344毒力因子；若A管第四荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中含有肺炎克雷伯菌；
若B管第一荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中携带有rmpA2毒力因子；若B管第二荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中携带有rmpA毒力因子；若B管第三荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中携带有iucA毒力因子；若B管第四荧光通道的检测结果为阳性，则判定样本提取正常，检测结果正常；
若C管第一荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中携带有KPC耐药基因；若C管第二荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中携带有NDM耐药基因；若C管第三荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中携带有VIM耐药基因；若C管第四荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中含有肺炎克雷伯菌；
若D管第一荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中携带有IMP耐药基因；若D管第二荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中携带有OXA-48耐药基因；若D管第三荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中含有大肠埃希菌；若D管第四荧光通道的检测结果为阳性，则判定样本提取正常，检测结果正常。
其中，所述PCR扩增的条件可以为：
a：95℃，5min；
b：95℃，15s，
c：60℃，45s；b-c循环40个反应。
所述待测样本可以为临床患者的直肠拭子和/或鼻咽拭子，可采用煮沸法或者商品化试剂盒对所述待测样本进行处理，以得到待测DNA。
优选地，本公开的用于检测大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌及其毒力因子和耐药基因的方法不用于诊断，或者说大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌及其毒力因子和耐药基因的定性与定量结果与疾病是否发生没有一一对应的相关性，不属于诊断结果，但是大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌及其毒力因子和耐药基因的定性与定量的检测结构能够作为中间信息，供临床医生参考。
本公开的方法能快速敏感特异地实现大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、肺炎克雷伯菌的6种毒力因子和5种耐药基因的系统筛检，检测流程简单，结果自动判读且可靠，节省了时间、人力和试剂成本。
以下通过实施例进行进一步详细说明本公开，但是本公开并不因此受到任何限制。
以下实施例中试剂均为商购产品，引物、探针均在life公司合成。
实施例1检测方法及检测结果判定
1、引物、探针合成
按照表1所示的引物序列和表2所示的探针序列，进行序列合成。探针中FAM为6-羧基荧光素，HEX为六氯-6-甲基荧光素，CY5为5H-吲哚菁，ROX为6-羧基-X-罗丹明，VIC为购自ABI公司的染料，BHQ1、BHQ2和BHQ3为淬灭基团。
表1
Figure BDA0002173532860000071
Figure BDA0002173532860000081
表2
检测目标 探针序列 探针序列 SEQ ID NO
肺炎克雷伯菌 KP-P ROX-cctacaccagctccgaccgtaccaa-BHQ2 29
大肠埃希菌 uidA-P CY5-tcggcatccggtcagtggcagt-BHQ3 30
iroB iroB-P FAM-agtctcggcaccgtcaaacc-BHQ1 31
magA magA-P VIC-tcgccgcaaatacgagaagtgtagt-BHQ1 32
peg344 peg344-P CY5-cctccgtgatgaggatgaacgaaagtgaag-BHQ3 33
iucA iucA-P CY5-ctatactgcgccaccagccgcgacatgat-BHQ3 34
rmpA rmpA-P VIC-cagggaaatggggagggtacaaaat-BHQ1 35
rmpA2 rmpA2-P FAM-cagggaaatgggatggttataaaatgttaagga-BHQ1 36
KPC KPC-P FAM-cacccgggcgcctaacaaggatga-BHQ1 37
NDM NDM-P VIC-cgccagctcgcaccgaatgtct-BHQ1 38
OXA-48 OXA-48-P VIC-agggcgtagttgtgctctggaat-BHQ1 39
IMP IMP-P FAM-cacrggnggaatagagtggcttaattctc-BHQ1 40
VIM VIM-P CY5-ctcgcggagattgaraagcaaattgg-BHQ3 41
IAC IAC-P ROX-aatgccccagtctctgtcagcactccctt-BHQ2 42
2、样本处理
常规方法采集患者直肠拭子样本后，用商品化的提取试剂盒处理，得到待检目标菌DNA作为检测样本。
3、构建检测体系
SensiFASTTM Probe No-ROX One-Step Kit(货号F122L)，dNTPS购自ThermoFisher公司，其他生化试剂均为进口分装或国产分析纯；荧光检测仪为ABI7500。
按照如下操作配制反应体系：总体系20μL。2×PCRbuffer(Tris-HCl100mM(pH8.3)，KCl100mM，Tween-200.2％，dNTP5mM，MgCl220mM)10μL，10×引物探针混合物(包含阳性内对照在内的每条引物的浓度为200nM，每条探针的浓度为200nM)2μL，模板2μL，超纯水6μL。
试剂盒分为A管、B管、C管和D管4个反应管，A管含有上表1中SEQ ID NO.1-2、5-10所示的引物和上表2中SEQ ID NO.29、31-33所示的探针；B管含有上表1中SEQ IDNO.11-16、27-28所示的引物和上表2中SEQ ID NO.34-36、42所示的探针；C管含有上表1中SEQ IDNO.1-2、17-20、25-26所示的引物和上表2中SEQ ID NO.29、37-38、41所示的探针；D管含有上表1中SEQ ID NO.3-4、21-24、27-28所示的引物和上表2中SEQ ID NO.30、39-40、42所示的探针。
将PCR管放入荧光定量PCR仪中，选择FAM、VIC、CY5、ROX作为报告基团，反应程序如下：
a：95℃，5min；
b：95℃，15s，
c：60℃，45s；b-c循环40个反应，该阶段收集荧光。
检测结果判定：
若空白对照、阳性对照和阳性内对照成立，则检测结果有效，否则视为实验无效。
若荧光通道检测到的扩增曲线呈S型，且CT值＜35，则判定检测结果为阳性；若荧光通道检测到的扩增曲线呈S型，且35≤CT值＜40，则重新提取样本并复检，若复检得到的扩增曲线呈S型，且CT值＜40，则判定检测结果为阳性，否则为阴性；若荧光通道检测到的扩增曲线为非S型，但是报告有CT值，则判定该次检测发生非特异性扩增，收集到的荧光可能为探针降解所释放的非特异性荧光信号。
检测结果具体判定方式参照表3。
表3
Figure BDA0002173532860000091
Figure BDA0002173532860000101
若A管FAM荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中携带有iroB毒力因子；若A管VIC荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中携带有magA毒力因子；若A管CY5荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中携带有peg344毒力因子；若A管ROX荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中含有肺炎克雷伯菌；
若B管FAM荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中携带有rmpA2毒力因子；若B管VIC荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中携带有rmpA毒力因子；若B管CY5荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中携带有iucA毒力因子；若B管ROX荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品提取正常，检测结果正常；
若C管FAM荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中携带有KPC耐药基因；若C管VIC荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中携带有NDM耐药基因；若C管CY5荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中携带有VIM耐药基因；若C管ROX荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中含有肺炎克雷伯菌；
若D管FAM荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中携带有IMP耐药基因；若D管VIC荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中携带有OXA-48耐药基因；若D管CY5荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中含有大肠埃希菌；若D管ROX荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品提取正常，检测结果正常。
实施例2最低检出限验证
分别将大肠埃希菌种属基因、肺炎克雷伯菌种属基因、iroB毒力因子、magA毒力因子、peg344毒力因子、iucA毒力因子、rmpA毒力因子、rmpA2毒力因子、KPC耐药基因、NDM耐药基因、IMP耐药基因、VIM耐药基因、OXA-48耐药基因的基因片段连接到PUC57载体上，并测序校对，得到各重组质粒。上述重组质粒的构建以及测序校对工作由上海生工生物技术公司完成。
将含有上述各目标基因片段的重组质粒的浓度分别定量为1010拷贝/μL，并分别进行梯度稀释得到浓度为105拷贝/μL、104拷贝/μ、103拷贝/μL、102拷贝/μL、101拷贝/μL、100拷贝/μL的检测样本。
按照实施例1的检测方法分别对各浓度的检测样本进行检测。
结果显示本公开试剂盒检测目标细菌种属基因、毒力因子和耐药基因的最低检出限浓度均达到102拷贝/μL，本公开试剂盒检测灵敏度较高。
实施例3特异性验证
选择阴沟肠杆菌(购自中国医学菌种保藏中心，编号为45301)、黏质沙雷氏菌(购自中国医学菌种保藏中心，编号为41002)、甲型副伤寒沙门氏菌(购自中国医学菌种保藏中心，编号为50001)、乙型副伤寒沙门氏菌(购自中国医学菌种保藏中心，编号为50004)、蕈状芽孢杆菌(购自中国医学菌种保藏中心，编号为32012)、韦氏芽孢杆菌(购自中国医学菌种保藏中心，编号为32011)、枯草芽孢杆菌(购自中国医学菌种保藏中心，编号为32041)、金黄色葡萄球菌(购自中国医学菌种保藏中心，编号为26003)、副溶血性弧菌(购自中国医学菌种保藏中心，编号为21617)、单核细胞增生性李斯特氏菌(购自中国医学菌种保藏中心，编号为54002)、霍乱弧菌(购自中国医学菌种保藏中心，编号为1109)、空肠弯曲菌(购自中国医学菌种保藏中心，编号为1159)、结肠弯曲菌(购自中国医学菌种保藏中心，编号为1169)、嗜水气单胞菌(购自中国医学菌种保藏中心，编号为44016)等与检测目标菌种属相近，生存环境相似的细菌作为特异性评估样本。
应用本公开提供的试剂盒，按照实施例1的检测方法检测上述特异性评估样本，在阴性对照、阳性对照和阳性内对照均成立的条件下，待检目标均未出现非特异性的荧光信号，表明本公开的试剂盒能有效区分非检测目标细菌，具有较好的特异性。
实施例4试剂盒的保存期试验
分别以105CFU/mL的含有耐药基因及肺炎克雷伯菌种属基因的混合模板作为评估用检测样本，在第0天时，分装成9份冻存于-70℃冰箱中。将组建完毕的试剂盒放置于-20℃保存，分别取0、10、15、30、60、90、120、150、180和360天的试剂盒进行保存期试验。
结果显示本公开试剂盒保存在-20℃冰箱，在不同保存期检测均为阳性，表明该试剂盒的保存期至少为一年。
对比例
1、引物、探针合成
按照表4和表5所示的引物、探针序列，进行序列合成。
表4
Figure BDA0002173532860000111
Figure BDA0002173532860000121
表5
检测目标 探针序列 探针序列 SEQ ID NO
肺炎克雷伯菌 KP-P-D ROX-ccatacggccatcagaccgctg-BHQ2 71
大肠埃希菌 uidA-P-D CY5-tcggtttgcggtcgcgagtga-BHQ3 72
iroB iroB-P-D FAM-ctacacgccggtattccacagatcgt-BHQ1 73
magA magA-P-D VIC-tgggaatattcattcaaagattcaaca-BHQ1 74
peg344 peg344-P-D CY5-aaaaaatctcatcccggtagcaaaga-BHQ3 75
iucA iucA-P-D CY5-ccagccgcgacatgatcaaattct-BHQ3 76
rmpA rmpA-P-D VIC-attatccacggctaacaaaaaag-BHQ1 77
rmpA2 rmpA2-P-D FAM-caatgcttactctcc-BHQ1 78
KPC KPC-P-D FAM-caccaccgccgcccttgcgggcggca-BHQ1 79
NDM NDM-P-D VIC-aatctcggtgatgccgacactga-BHQ1 80
OXA-48 OXA-48-P-D VIC-aagaaaacaaaagttggaatgctca-BHQ1 81
IMP IMP-P-D FAM-atccccacgtatgcatctgaattaac-BHQ1 82
VIM VIM-P-D CY5-aaaacactacccggaagcag-BHQ3 83
IAC IAC-P-D ROX-ctccacaagtccgcgcagagccttc-BHQ2 84
2、最低检出限验证
按照实施例2的方法进行最低检出限验证。实施例2与对比例的最低检出限对比如下表6。
表6
Figure BDA0002173532860000122
Figure BDA0002173532860000131
由表6可知，对于样本中痕量的大肠埃希菌种属基因、肺炎克雷伯菌种属基因及其肺炎克雷伯菌携带的毒力因子和耐药基因，本公开试剂盒比对比例有更强的检测能力。
3、特异性验证
按照实施例3的方法进行特异性验证。结果显示，对比例的引物、探针对黏质沙雷氏菌的反应结果为阳性，对比例的引物和探针无法准确鉴别目标病原菌和黏质沙雷氏菌。说明本公开试剂盒相较于对比例具有更好的检测特异性。
由实施例和对比例的对比可以看出，本公开可以一次性检测出大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、肺炎克雷伯菌携带的6种毒力因子和5种耐药基因，而且最低检出限更低，特异性高。
以上详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，例如A管检测目标和B管检测目标的可以互换。为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。
序列表
<110> 中国医学科学院北京协和医院
北京卓诚惠生生物科技股份有限公司
<120> 用于检测大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌及其毒性和耐药性的核酸试剂、试剂盒、系统及方法
<130> 14002-K-ABT
<160> 84
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcacctcgtt aagctatga 19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gtcgccaggt agatattgt 19
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agagtgtgat atctacccgc t 21
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gtaaagtaga acggtttgtg gt 22
<210> 5
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atggtgggag aggaagc 17
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cttcactggc ggaatcca 18
<210> 7
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ccttatttaa tatcattcct tcctat 26
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gcaataaagc caaaataaat cca 23
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cgtccactgg ctttctgtcc tt 22
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
acaaactcaa tacagattac tgg 23
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cgcgccgtgg ctaccgacc 19
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
acgcttcact tctttcact 19
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
cacaaaagaa acataagagt at 22
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
catccattgr cttatcatat ttaat 25
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
tattggttga tagccggatt 20
<210> 16
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
tgtcaagcca catccatt 18
<210> 17
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
tcgtctggcc cactgggcgc gc 22
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
atccctcgag cgcgagtcta 20
<210> 19
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ccaacggttt ggcgatc 17
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
catgtcgaga taggaagtgt 20
<210> 21
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
cggtagcaaa ggaatggc 18
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
ttggtaaatc cttgctgctt a 21
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
cctcwcattt ncatagcgac a 21
<210> 24
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
gttaatwcag aygcatacgt ggg 23
<210> 25
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
atgagttgct tttgattgat aca 23
<210> 26
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
acgcgttacr ggaagtc 17
<210> 27
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
ccagcttcca agaaagccaa g 21
<210> 28
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
tttgttgtgg ctgatgaact at 22
<210> 29
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
cctacaccag ctccgaccgt accaa 25
<210> 30
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
tcggcatccg gtcagtggca gt 22
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
agtctcggca ccgtcaaacc 20
<210> 32
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
tcgccgcaaa tacgagaagt gtagt 25
<210> 33
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
cctccgtgat gaggatgaac gaaagtgaag 30
<210> 34
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
ctatactgcg ccaccagccg cgacatgat 29
<210> 35
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
cagggaaatg gggagggtac aaaat 25
<210> 36
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
cagggaaatg ggatggttat aaaatgttaa gga 33
<210> 37
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
cacccgggcg cctaacaagg atga 24
<210> 38
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
cgccagctcg caccgaatgt ct 22
<210> 39
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
agggcgtagt tgtgctctgg aat 23
<210> 40
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
cacrggngga atagagtggc ttaattctc 29
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ctcgcggaga ttgaraagca aattgg 26
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aatgccccag tctctgtcag cactccctt 29
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gcattaaaaa atgcggatgt cgtacgg 27
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ccggtccagc gtttttgcag c 21
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gcggcgcagg caatactctg acagcg 26
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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agccgaattg taaaccgaa 19
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
gcatacttaa agaaattacc cacaac 26
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aaggccaagt cgctcgg 17
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ggtgtttgca gatttggacc t 21
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tcggtttgcg gtcgcgagtg a 21
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<212> DNA
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tgggaatatt cattcaaaga ttcaaca 27
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ctccacaagt ccgcgcagag ccttc 25

Claims (5)

1.一种用于检测大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌及其毒力因子和耐药基因的核酸试剂，其中，所述核酸试剂包括按照如下组合存放的SEQ ID NO.1-26所示的引物和SEQ ID NO.29-41所示的探针；所述核酸试剂还包括阳性内质控；所述阳性内质控含有SEQ ID NO.27-28所示的引物和SEQ ID NO.42所示的探针；所述核酸试剂包括A管、B管、C管和D管；A管含有SEQID NO.1-2、5-10所示的引物和SEQ ID NO.29、31-33所示的探针；B管含有SEQ ID NO.11-16、27-28所示的引物和SEQ ID NO.34-36、42所示的探针；C管含有SEQ ID NO.1-2、17-20、25-26所示的引物和SEQ ID NO.29、37-38、41所示的探针；D管含有SEQ ID NO.3-4、21-24、27-28所示的引物和SEQ ID NO.30、39-40、42所示的探针；
其中，SEQ ID NO.31、36-37、40所示的探针具有第一荧光标记；SEQ ID NO.32、35、38、39所示的探针具有第二荧光标记；SEQ ID NO.30、33-34、41所示的探针具有第三荧光标记；SEQ ID NO.29、42所示的探针具有第四荧光标记；所述第一荧光标记、所述第二荧光标记、所述第三荧光标记和所述第四荧光标记各不相同，且各自独立地选自FAM荧光标记、VIC荧光标记、HEX荧光标记、CY5荧光标记和ROX荧光标记中的一种；
其中，所述肺炎克雷伯菌的毒力因子包括iroB、magA、peg344、iucA、rmpA和rmpA2中的至少一种；所述耐药基因包括KPC、NDM、OXA-48、IMP和VIM中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的核酸试剂，其中，相对于1μmol的SEQ ID NO.1所示的引物，分别由SEQ ID NO.2-26所示的引物的含量各自为0.3～0.5μmol、0.3～0.6μmol、0.4～0.8μmol、0.3～0.5μmol、0.3～0.5μmol、0.5～1μmol、0.4～0.8μmol、0.4～0.8μmol、0.3～0.5μmol、0.3～0.6μmol、0.4～0.8μmol、0.3～0.5μmol、0.3～0.5μmol、0.5～1μmol、0.4～0.8μmol、0.4～0.8μmol、0.3～0.5μmol、0.3～0.6μmol、0.4～0.8μmol、0.3～0.5μmol、0.3～0.5μmol、0.5～1μmol、0.4～0.8μmol、0.3～0.5μmol、0.3～0.5μmol，分别由SEQ ID NO.29-41所示的探针的含量各自为0.2～0.4μmol、0.3～0.6μmol、0.2～0.5μmol、0.2～0.5μmol、0.3～0.5μmol、0.3～0.6μmol、0.4～0.6μmol、0.2～0.5μmol、0.2～0.4μmol、0.3～0.6μmol、0.2～0.5μmol、0.2～0.5μmol、0.2～0.4μmol。
3.一种用于检测大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌及其毒力因子和耐药基因的试剂盒，该试剂盒含有权利要求1～2中任意一项所述的核酸试剂，并且可选地，所述试剂盒还含有反应体系缓冲液、DNA聚合酶、Tween-20、钾离子、镁离子、dNTP、阳性对照和水中的至少一种。
4.权利要求1～2中任意一项所述的核酸试剂在制备用于检测大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌及其毒力因子和耐药基因的试剂盒中的用途。
5.一种用于检测大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌及其毒力因子和耐药基因的系统，该系统包括具有A管检测器、B管检测器、C管检测器和D管检测器的PCR仪、计算装置和输出装置；所述A管检测器、B管检测器、C管检测器和D管检测器分别为装载有权利要求1～2中任意一项所述的A管、B管、C管和D管核酸试剂的核酸试剂储藏容器；所述PCR仪包括第一荧光通道、第二荧光通道、第三荧光通道和第四荧光通道；所述第一荧光通道、所述第二荧光通道、所述第三荧光通道和所述第四荧光通道各不相同，且各自独立地选自FAM荧光通道、VIC荧光通道、CY5荧光通道和ROX荧光通道中的一种；所述计算装置包括存储器和处理器，所述存储器中存储有计算机程序，所述处理器被配置为执行所述存储器中存储的计算机程序，以实现如下的判别：
若空白对照、阳性对照和阳性内对照成立，则检测结果有效；
若荧光通道检测到的扩增曲线呈S型，且CT值＜35，则判定检测结果为阳性；若荧光通道检测到的扩增曲线呈S型，且35≤CT值＜40，则重新提取样本并复检，若复检得到的扩增曲线呈S型，且CT值＜40，则判定检测结果为阳性，否则为阴性；
若A管第一荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中携带有iroB毒力因子；若A管第二荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中携带有magA毒力因子；若A管第三荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中携带有peg344毒力因子；若A管第四荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中含有肺炎克雷伯菌；
若B管第一荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中携带有rmpA2毒力因子；若B管第二荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中携带有rmpA毒力因子；若B管第三荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中携带有iucA毒力因子；若B管第四荧光通道的检测结果为阳性，则判定样本提取正常，检测结果正常；
若C管第一荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中携带有KPC耐药基因；若C管第二荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中携带有NDM耐药基因；若C管第三荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中携带有VIM耐药基因；若C管第四荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中含有肺炎克雷伯菌；
若D管第一荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中携带有IMP耐药基因；若D管第二荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中携带有OXA-48耐药基因；若D管第三荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中含有大肠埃希菌；若D管第四荧光通道的检测结果为阳性，则判定样本提取正常，检测结果正常。
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