CN116103411A - 一种用于检测样本中幽门螺杆菌耐药基因突变的引物探针组合物及试剂盒 - Google Patents
一种用于检测样本中幽门螺杆菌耐药基因突变的引物探针组合物及试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116103411A CN116103411A CN202310135604.6A CN202310135604A CN116103411A CN 116103411 A CN116103411 A CN 116103411A CN 202310135604 A CN202310135604 A CN 202310135604A CN 116103411 A CN116103411 A CN 116103411A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- helicobacter pylori
- sample
- detecting
- primer
- mutation
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 239000000523 sample Substances 0.000 title claims abstract description 124
- 241000590002 Helicobacter pylori Species 0.000 title claims abstract description 78
- 229940037467 helicobacter pylori Drugs 0.000 title claims abstract description 78
- 239000003814 drug Substances 0.000 title claims abstract description 36
- 229940079593 drug Drugs 0.000 title claims abstract description 35
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 title claims abstract description 29
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 24
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 55
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 51
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 45
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims abstract description 44
- 101150070420 gyrA gene Proteins 0.000 claims abstract description 30
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 22
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims abstract description 14
- 108700022487 rRNA Genes Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 claims description 23
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 16
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 16
- 230000002550 fecal effect Effects 0.000 claims description 13
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 12
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 9
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 9
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 9
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 9
- 102220546752 E3 ubiquitin-protein ligase TRIM8_C15S_mutation Human genes 0.000 claims description 7
- 102220546751 E3 ubiquitin-protein ligase TRIM8_C30S_mutation Human genes 0.000 claims description 7
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims description 6
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 6
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 5
- 238000011880 melting curve analysis Methods 0.000 claims description 5
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 claims description 5
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 4
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 claims description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 3
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 claims description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 2
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 claims description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 210000004051 gastric juice Anatomy 0.000 claims 1
- 238000005382 thermal cycling Methods 0.000 claims 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 abstract description 23
- 230000008018 melting Effects 0.000 abstract description 23
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 abstract description 10
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 abstract description 5
- LISFMEBWQUVKPJ-UHFFFAOYSA-N quinolin-2-ol Chemical compound C1=CC=C2NC(=O)C=CC2=C1 LISFMEBWQUVKPJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 5
- 229960002626 clarithromycin Drugs 0.000 abstract description 4
- AGOYDEPGAOXOCK-KCBOHYOISA-N clarithromycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@H](C)C[C@](C)([C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)OC)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 AGOYDEPGAOXOCK-KCBOHYOISA-N 0.000 abstract description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 abstract 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 abstract 1
- 239000012295 chemical reaction liquid Substances 0.000 description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 14
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 238000013461 design Methods 0.000 description 7
- 210000001156 gastric mucosa Anatomy 0.000 description 6
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 229940126409 proton pump inhibitor Drugs 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 208000007882 Gastritis Diseases 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 239000000612 proton pump inhibitor Substances 0.000 description 2
- 241000589989 Helicobacter Species 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000007107 Stomach Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 229960003022 amoxicillin Drugs 0.000 description 1
- LSQZJLSUYDQPKJ-NJBDSQKTSA-N amoxicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=C(O)C=C1 LSQZJLSUYDQPKJ-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000007846 asymmetric PCR Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000000711 cancerogenic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000315 carcinogenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 208000023652 chronic gastritis Diseases 0.000 description 1
- 229940121657 clinical drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 238000011284 combination treatment Methods 0.000 description 1
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 1
- 201000005917 gastric ulcer Diseases 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000036438 mutation frequency Effects 0.000 description 1
- LSQZJLSUYDQPKJ-UHFFFAOYSA-N p-Hydroxyampicillin Natural products O=C1N2C(C(O)=O)C(C)(C)SC2C1NC(=O)C(N)C1=CC=C(O)C=C1 LSQZJLSUYDQPKJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910001414 potassium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 150000007660 quinolones Chemical class 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012772 sequence design Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6858—Allele-specific amplification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种可用于检测样本中幽门螺杆菌耐药基因突变的引物探针组合物及试剂盒。本发明的组合物是指用于探针熔解曲线PCR反应、具有特殊设计核酸序列和特定组成比例的寡聚脱氧核糖核酸。以探针熔解曲线法为原理，利用所述组合物和PCR反应通用试剂检测生物样本中幽门螺杆菌克拉霉素耐药基因23S rRNA和喹诺酮耐药基因gyrA的多种耐药相关突变。所述的组合物及其使用方法的优点在于可以在同一反应体系中同时检测23S rRNA基因和gyrA基因的多种突变，有效提高了检测工作效率、降低了检测试剂和人工成本，同时具有高检测灵敏度的技术特点。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种可用于检测样本中幽门螺杆菌耐药基因突变的引物探针组合物及试剂盒。
背景技术
幽门螺杆菌(Helicobacter pylroi，简称H.pylori或HP)是一种螺旋形、微厌氧、对生长条件要求十分苛刻的细菌。1983年首次从慢性活动性胃炎患者的胃黏膜活检组织中分离成功。HP能够引起慢性胃炎、胃溃疡等消化道相关疾病，是WHO癌症协会规定的原核生物中唯一的I类致癌因子。全世界有超过半数的人感染HP，而在我国的感染率为59％，因此根除Hp可以减少Hp相关疾病的发生和发展。以质子泵抑制剂(proton pump inhibitor，PPI)结合阿莫西林和克拉霉素(或者喹诺酮)等抗生素的三联疗法或四联治疗等，是国内外公认的一线抗HP感染治疗组合。然而，由于克拉霉素和喹诺酮耐药率的不断上升，这种疗法的成功率正在逐渐下降。因此临床上很有必要对Hp耐药进行诊断。
目前临床上对Hp的耐药诊断均需要采集胃黏膜组织(例如中国专利CN202011013635.7，名称为多重荧光PCR熔解曲线法检测幽门螺杆菌耐药基因多态性的试剂盒)，采集组织后，或进行药敏培养或进行分子生物学检测。但是采集胃黏膜组织会对患者造成一定伤害，病人的依从性较差，因此需要一种无创快速的检测方法。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有检测幽门螺杆菌耐药突变位点时，患者依从性差，检测工作量大的问题，提供一种用于检测粪便中幽门螺杆菌耐药基因突变的组合物及试剂盒。
本发明中，发明人研发了一种新的检测粪便中幽门螺杆菌耐药基因突变的方法，该方法不仅可以通过粪便检测幽门螺杆菌的耐药基因突变，并且可以只通过单一一管PCR反应体系就检测克拉霉素和喹诺酮常见的所有突变，检测通量大。对比市面上的ARMS-PCR方法(扩增阻遏PCR)检测突变位点，该方法针对23S rRNA和gyrA基因的9种突变用一管PCR反应检测，比ARMS-PCR方法工作量大大降低。比起其他测序法或质谱法，成本更低，操作更简便。本发明通过精细的引物探针序列设计可检测胃黏膜、粪便、唾液和环境等多种样本。本发明通过对探针的特殊修饰可以提高不同碱基突变的Tm值之间的差异，从而可以区分出之前比较难区分的分型，首次将探针熔解曲线法与突变位点两端锁核酸修饰技术相结合。同时，ARMS-PCR方法的技术原理是在引物的3’端存在碱基错配，因此会影响引物的扩增效率。本发明的方法不存在引物碱基错配，因此扩增效率高，可达到1copy/反应的检测灵敏度。
本发明提供了如下的技术方案：
在本发明的第一方面，提供了一种可用于检测样本中幽门螺杆菌耐药基因突变的引物探针组合物，包括针对幽门螺杆菌的23S rRNA基因和gyrA基因分别设计的引物探针组合，
用于检测幽门螺杆菌23S rRNA基因突变的引物探针组合的序列如下：
正向引物SEQ ID NO1：5’-GCATGAATGGCGTAACGAGAT-3’，
反向引物SEQ ID NO2：5’-ATAAGAGCCAAAGCCCYTACTTCAAAG-3’，
检测探针序列为SEQ ID NO3：5’-ROX-GCAAGACGGAAAGACCCCGTG-BHQ2-3’；
用于检测幽门螺杆菌gyrA基因突变的引物探针组合的序列如下：
正向引物SEQ ID NO4：5’-GATCGTGGGTGATGTGATTGGTA-3’，
反向引物SEQ ID NO5：5’-AAAATCTTGYGCCATTCTCACTA-3，
检测探针序列为SEQ ID NO6：
5’-FAM-CGAT/iXNA_A/AT/iXNA_G/CGGTTTA/iXNA_T/GA/iXNA_T/GC-BHQ 1-3’，在要检测突变位点两侧碱基进行锁核酸修饰，其中，iXNA是指核酸序列中该位点的脱氧核糖核酸为锁核酸修饰。
其中，所述样本可以为任何含有幽门螺杆菌的样本，如：胃黏膜组织样本，胃液、唾液、粪便和环境样本等，优选为粪便样本。
在本发明的第二方面，提供了一种检测粪便中幽门螺杆菌耐药基因突变的试剂盒。
所述的试剂盒中，包括如第一方面所述检测粪便中幽门螺杆菌耐药基因突变的引物探针组合物。
进一步地，所述的试剂盒还包括PCR扩增的缓冲液，dNTP和DNA聚合酶等。
在本发明的第三方面，提供了一种用于检测样本中幽门螺杆菌耐药基因突变的反应体系。
所述的反应体系中，包括如第一方面所述检测粪便中幽门螺杆菌耐药基因突变的引物探针组合物、PCR扩增的缓冲液，dNTP和DNA聚合酶；
其中，
PCR扩增的缓冲液成分包括：浓度为10mM～40mM且pH为8.7的Tris-HCl，25mM～100mM的KCl，1.5mM～2.5mM的MgCl2，0.1～0.5mg/mL的BSA；
正向引物的浓度范围为50nM～150nM，反向引物的浓度范围为200nM～1000nM，探针的浓度范围为200nM～600nM；
正向引物与反向引物的摩尔比为1：3～10；探针与反向引物的摩尔比为0.6～1：1。
进一步地，
所述的反应体系中，
PCR扩增的缓冲液成分如下：浓度为20mM且pH为8.7的Tris-HCl，50mM的KCl，2mM的MgCl2，0.2mg/mL的BSA；
正向引物的浓度为100nM，反向引物的浓度为500nM，探针的浓度为400nM；
正向引物、反向引物、探针的摩尔比为1：5：4。即：用于检测幽门螺杆菌23S rRNA基因突变的正向引物、反向引物、探针的摩尔比为1：5：4；用于检测幽门螺杆菌gyrA基因突变的正向引物、反向引物、探针的摩尔比为1：5：4。
更进一步地，
所述的反应体系，以50μL计，组分和含量如下：
在本发明的第四方面，提供了利用如第一方面所述的引物探针组合物、如第二方面所述试剂盒或如第三方面所述的反应体系检测样本中幽门螺杆菌耐药基因突变的检测方法，具体过程为，以PCR反应进行扩增；PCR反应的热循环条件为94℃～98℃1min～10min；94℃～98℃10S～30S，58℃～62℃30S～1min，45～75个循环；PCR扩增完成后94℃30S，在45℃～75℃范围内进行熔解曲线分析。
进一步地，所述的方法中，PCR反应的热循环条件为94℃1min；94℃15S，60℃30S，55个循环；PCR扩增完成后94℃30S，在45℃～75℃范围内进行熔解曲线分析。
本发明的引物探针序列针对幽门螺杆菌是保守的序列，但是针对粪便中的其他微生物是特异性的序列。
本发明用单一的反应体系可以同时检测23S rRNA基因的A2142C、A2142G、A2143G突变和gyrA基因的A260T、T261A、C261G、G271A、G271T、T272G突变中的一个、多个或全部。反应是基于荧光PCR的探针熔解曲线法，此方法对比检测基因突变常用的ARMS-PCR法，工作量明显降低。ARMS-PCR法一般针对每一种突变位点要单独进行一管反应体系，所以检测上述位点ARMS-PCR法至少要9管反应，而本发明只需要1管反应体系。并且检测灵敏度高于ARMS-PCR法。
本发明的设计是基于不对称PCR扩增，反向引物的浓度是正向引物浓度的数倍，正向引物与探针浓度之和等于反向引物的浓度。本发明中设计的正向引物、反向引物、探针的比例为1：5：4。反应过程中通过94℃1min；94℃15S，60℃30S，55个循环的PCR扩增，反向引物生成与荧光探针杂交的单链寡核苷酸序列；PCR扩增完成后，94℃30S，在45℃～75℃熔解曲线分析过程中探针与单链寡核苷酸杂交，随着熔解温度升高探针由结合状态变为游离状态，产生荧光差值，即可绘制出熔解曲线。对比常见的荧光PCR探针熔解曲线法，本方法在探针上进行了特殊设计，采用锁核酸修饰突变位点两侧的碱基，此方法可以提高探针对于不同突变碱基模板的Tm值的差异，从而可以区分出不同的基因型，如果不以此方法修饰探针，则Tm值差值过小，不能区分出野生型和突变型。以gyrA基因举例，自然界中幽门螺杆菌gyrA基因261位点有四种碱基，C和T碱基是野生型，编码的氨基酸都是天冬氨酸，对喹诺酮药物敏感；G和A碱基是突变型，编码的氨基酸都是赖氨酸，对喹诺酮药物耐药。如果不对探针进行特殊修饰，则四种碱基的Tm值很接近，不能区分基因是野生型还是突变型。而本发明有效解决了上述问题。
本发明根据熔解曲线产生的熔解峰Tm值的大小判断检测位点是否存在突变。判断依据是检测样本的Tm值与每次实验同时检测的野生型对照Tm值进行对比，本发明在结果判读上的特点是每次实验引入一个野生型对照，将检测样本的Tm值与野生型对照Tm值进行对比，当“检测样本Tm值”在“野生型对照Tm值±3℃”以内时检测样本为野生型，当“检测样本Tm值”小于“野生型对照Tm值－3℃”时检测样本为突变型。
本发明具有如下有益效果：
1)本发明可以通过单一PCR反应检测粪便中幽门螺杆菌的23S rRNA基因的A2142C、A2142G、A2143G突变和gyrA基因的A260T、T261A、C261G、G271A、G271T、T272G突变。可以从粪便样本中检测出低至1拷贝每反应的幽门螺杆菌上述基因突变。
2)本发明将锁核酸修饰技术用在了探针法熔解曲线技术中，为首次应用。在突变位点两侧的碱基进行锁核酸修饰，可以将ATCG四种碱基序列的Tm值区分开。
3)本发明引物探针序列的设计是针对幽门螺杆菌是保守的序列，但是针对粪便和环境中的其他微生物是特异性的序列，因此本发明可以检测胃黏膜、粪便、唾液、环境等多种样本。
4)与中国专利CN202011013635.7，名称为多重荧光PCR熔解曲线法检测幽门螺杆菌耐药基因多态性的试剂盒相比，现有专利的申请人上海芯超生物科技有限公司虽然也是采用了探针熔解曲线法检测幽门螺杆菌耐药基因突变。但与本发明相比在序列设计上存在着不同，尤其是在探针的修饰上存在着很大差异。本发明除了扩增引物与芯超不同外，在探针修饰上在突变位点两侧引入了锁核酸修饰，这种修饰可以扩大不同突变的Tm值差异，从而可以区分出不同的基因型，如果不以此方法修饰探针，则Tm值差值过小，不能很好区分出野生型和突变型。本发明弥补了现有专利的不足。而且本发明检测的样本类型与现有专利不同，现有专利只检测胃黏膜组织，本发明通过特定的引物设计，不仅可以检测胃黏膜样本，还可以检测更为复杂的粪便、唾液和环境样本。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1是本发明的检测原理图；
图2是幽门螺杆菌的23S rRNA序列的分析图
图3是幽门螺杆菌的23S rRNA位点突变比例图
图4是幽门螺杆菌的gyrA序列的分析图
图5是幽门螺杆菌的gyrA位点突变比例图
图6是本发明检测各种粪便样本23S rRNA基因型的ROX荧光熔解曲线峰图；
图7是本发明检测各种粪便样本gyrA基因型的FAM荧光熔解曲线峰图；
图8是本发明检测幽门螺杆菌阳性粪便样本J1时ROX荧光通道的熔解曲线峰图和检测孔位；
图9是本发明检测幽门螺杆菌阳性粪便样本J1时FAM荧光通道的熔解曲线峰图和检测孔位；
图10是ARMS-PCR法检测幽门螺杆菌阳性粪便样本J1时荧光PCR曲线图和检测孔位；
图11是经特殊修饰后的taqman探针检测gyrA不同基因型的熔解曲线峰图；
图12是未经特殊修饰后的taqman探针检测gyrA不同基因型的熔解曲线峰图；
图13是不同引物探针浓度，不同引物探针比例的试剂检测gyrA基因的峰图对比图；
图14是不同引物探针浓度，不同引物探针比例的试剂检测23S rRNA基因的峰图对比图。
具体实施方式
下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明的检测效果；对比本发明与ARMS-PCR法检测幽门螺杆菌耐药的工作量；对比本发明与未特殊修饰探针的熔解曲线法检测粪便中幽门螺杆菌耐药基因突变的效果。
实施例1
引物探针的设计
我们通过NCBI数据库收集了351株中国人群的幽门螺杆菌23S rRNA基因核酸序列，以幽门螺杆菌标准菌株26695作为对照，对序列进行Blast分析，寻找较为保守的区域设计引物探针。对351株幽门螺杆菌的23S rRNA序列的分析见图2所示，每一个突变位点的比例见图3所示，根据图2和图3的分析，并且通过引物二级结构分析我们设计了23S rRNA扩增引物和检测探针，引物探针序列如下：
正向引物SEQ ID NO1：5’-GCATGAATGGCGTAACGAGAT-3’，
反向引物SEQ ID NO2：5’-ATAAGAGCCAAAGCCCYTACTTCAAAG-3，
检测探针序列为SEQ ID NO3：5’-ROX-GCAAGACGGAAAGACCCCGTG-BHQ2-3’
将设计序列与NCBI数据库中其他菌株的序列进行对比无较高同源性，说明序列特异性很好。
我们通过NCBI数据库收集了408株中国人群的幽门螺杆菌gyrA基因核酸序列，以幽门螺杆菌标准菌株26695作为对照，对序列进行Blast分析，寻找较为保守的区域设计引物探针。对408株幽门螺杆菌的gyrA序列的分析见图4所示，在图中碱基从1号到252号依次排列，通过不同颜色代表碱基的突变频率，每一个突变位点的比例见图5所示。根据图4和图5的分析，并且通过引物二级结构分析我们设计了gyrA扩增引物和检测探针，引物探针序列如下：
正向引物SEQ ID NO4：5’-GATCGTGGGTGATGTGATTGGTA-3’，
反向引物SEQ ID NO5：5’-AAAATCTTGYGCCATTCTCACTA-3，
检测探针序列为SEQ ID NO6：
5’-FAM-CGAT/iXNA_A/AT/iXNA_G/CGGTTTA/iXNA_T/GA/iXNA_T/GC-BHQ 1-3’，在要检测突变位点两侧碱基进行锁核酸修饰。其中，iXNA是指核酸序列中该位点的脱氧核糖核酸为锁核酸修饰。
将设计序列与NCBI数据库中其他菌株的序列进行对比无较高同源性，说明序列特异性很好。
实施例2
配制本发明的粪便幽门螺杆菌耐药基因突变检测反应液1，配制方法如表1。检测不同基因型的粪便幽门螺杆菌耐药基因。
用商品化的粪便DNA提取试剂盒提取不同基因型的幽门螺杆菌阳性患者的粪便。对提取的各种粪便模板进行检测。
表1幽门螺杆菌耐药基因突变检测反应液1的配制
| 组成成分 | 用量 |
| <![CDATA[5×缓冲液(Mg<sup>2+</sup>离子、K<sup>+</sup>离子、Tris-盐酸缓冲溶液等)]]> | 10μL |
| dNTP(10mM) | 1μL |
| SEQ ID NO1(10μM) | 0.5μL |
| SEQ ID NO2(10μM) | 2.5μL |
| SEQ ID NO3(10μM) | 2μL |
| SEQ ID NO4(10μM) | 0.5μL |
| SEQ ID NO5(10μM) | 2.5μL |
| SEQ ID NO6(10μM) | 2μL |
| DNA聚合酶(5U/μL) | 1μL |
| 水 | 8μL |
| 模板 | 20μL |
将配制好的PCR检测反应液1在ABI 7500仪器进行荧光PCR反应，程序为94℃1min；94℃15S，60℃30S，55个循环；94℃30S，melt curve(45℃～75℃)；结果如图6和图7所示，本发明可检测23S rRNA基因和gyrA基因突变。
根据ROX荧光熔解曲线Tm值与野生型对照Tm值的对比可以确定检测样本23SrRNA基因是野生型还是突变型，当“检测样本ROX荧光Tm值”在“野生型对照ROX荧光Tm值±3℃”以内时检测样本为野生型，当“检测样本ROX荧光Tm值”小于“野生型对照ROX荧光Tm值－3℃”时检测样本为突变型。从图中可知野生型对照峰的Tm值为65.52℃，其余四个峰图的Tm值分别为54.85℃、55.61℃、60.18℃和65.51℃，可知4个检测样本23S rNRA基因型分别为三个突变型和一个野生型基因。
根据FAM荧光熔解曲线Tm值与野生型对照Tm值的对比可以确定检测样本gyrA基因是野生型还是突变型，当“检测样本FAM荧光Tm值”在“野生型对照FAM荧光Tm值±3℃”以内时检测样本为野生型，当“检测样本FAM荧光Tm值”小于“野生型对照FAM荧光Tm值－3℃”时检测样本为突变型。从图中可知野生型对照峰的Tm值为64.02℃，其余八个峰图的Tm值分别为52.55℃、56.69℃、56.88℃、56.98℃、58.01℃、58.10℃、63.10℃、63.84℃，可知8个检测样本gyrA基因型分别为六个突变型和两个野生型基因。
实施例3
配制本发明的粪便幽门螺杆菌耐药基因突变检测反应液1，配制方法如表1。采购ARMS-PCR法的幽门螺杆菌耐药基因突变检测试剂，对比两试剂盒的检测工作量。
用商品化的粪便DNA提取试剂盒提取幽门螺杆菌阳性患者的粪便。对提取的粪便模板进行检测。
将配制好的PCR检测反应液1在ABI 7500仪器进行荧光PCR反应，程序为94℃1min；94℃15S，60℃30S，55个循环；94℃30S，melt curve(45℃～75℃)；结果如图8和图9所示。ARMS-PCR法的幽门螺杆菌耐药基因突变检测结果如图10所示，从图可以看出反应液1检测幽门螺杆菌耐药基因只需要一管反应体系，而ARMS-PCR法检测幽门螺杆菌耐药基因需要9管反应体系。
实施例4
配制本发明的粪便幽门螺杆菌耐药基因突变检测反应液1，和没有特殊修饰探针的幽门螺杆菌耐药基因突变检测反应液2，配制方法如表2。对比两种方法检测效果的差异。
用商品化的粪便DNA提取试剂盒提取不同突变类型的幽门螺杆菌阳性患者的粪便。对提取的粪便模板进行检测。
表2反应液1和反应液2的配制
将配制好的PCR检测反应液1和PCR检测反应液2在ABI 7500仪器上进行荧光PCR反应，程序为94℃1min；94℃15S，60℃30S，55个循环；94℃30S，melt curve(45℃～75℃)；结果如图11和图12所示。反应液1检测gyrA基因261位点野生型T模板的Tm值为63.0℃，检测261位点野生型C模板的Tm值为60.8℃，检测261位点突变型A模板的Tm值为56.4℃，检测261位点突变型G模板的Tm值为55.0℃(gyrA其他突变型峰图与上述峰图类似，由于峰图过多不一一列举)；反应液2检测gyrA基因261位点野生型T模板的Tm值为60.7℃，检测261位点野生型C模板的Tm值为59.7℃，检测261位点突变型A模板的Tm值为58.6℃，检测261位点突变型G模板的Tm值56.2℃。
对比图11和图12可知，探针经过修饰后检测不同基因型的Tm值差异增大，可以明显区分出野生型和突变型碱基，尤其是野生型C模板Tm值60.8℃与突变型A模板Tm值56.4℃可以明显区分开。而未经过修饰的探针检测不同基因型的Tm值差异较小，不容易区分野生型和突变型，比如野生型C模板Tm值59.7℃与突变型A模板Tm值58.6℃相差较小，容易受到实验波动影响而不能区分野生型与突变型。
由于检测23S rRNA基因两中反应液所用引物探针相同，因此熔解峰的Tm值相同，在此不再展示。
实施例5
配制本发明的粪便幽门螺杆菌耐药基因突变检测反应液1，和引物探针不同比例不同浓度的幽门螺杆菌耐药基因突变检测反应液3和反应液4，配制方法如表3。对比引物探针不同比例，不同浓度检测效果的差异。
用商品化的粪便DNA提取试剂盒提取不同突变类型的幽门螺杆菌阳性患者的粪便。对提取的粪便模板进行检测。
表3反应液1、反应液3和反应液4的配制
将配制好的PCR检测反应液在ABI 7500仪器上进行荧光PCR反应，程序为94℃1min；94℃15S，60℃30S，55个循环；94℃30S，melt curve(45℃～75℃)；结果如图13和图14所示。在图13中反应液1检测gyrA基因峰图的效果要好于反应液3和反应液4，其中反应液3检测效果较差，反应液4已不能检测出扩增峰图。在图14中反应液1检测23S rRNA基因峰图的效果要好于反应液3和反应液4，其中反应液3检测效果较差，反应液4峰图纵坐标数值很低，已算不能检测出扩增峰图。
综上实施例可以看出，本发明可以通过单一反应体系检测出幽门螺杆菌耐药基因23S rRNA和gyrA基因的多种突变。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种用于检测样本中幽门螺杆菌耐药基因突变的引物探针组合物，其特征在于，包括针对幽门螺杆菌的23S rRNA基因和gyrA基因分别设计的引物探针组合，
用于检测幽门螺杆菌23S rRNA基因突变的引物探针组合的序列如下：
正向引物SEQ ID NO1：5’-GCATGAATGGCGTAACGAGAT-3’，
反向引物SEQ ID NO2：5’-ATAAGAGCCAAAGCCCYTACTTCAAAG-3，
检测探针序列为SEQ ID NO3：5’-ROX-GCAAGACGGAAAGACCCCGTG-BHQ2-3’；
用于检测幽门螺杆菌gyrA基因突变的引物探针组合的序列如下：
正向引物SEQ ID NO4：5’-GATCGTGGGTGATGTGATTGGTA-3’，
反向引物SEQ ID NO5：5’-AAAATCTTGYGCCATTCTCACTA-3’，
检测探针序列为SEQ ID NO6：
5’-FAM-CGAT/iXNA_A/AT/iXNA_G/CGGTTTA/iXNA_T/GA/iXNA_T/GC-BHQ 1-3’，
在要检测突变位点两侧碱基进行锁核酸修饰，其中，iXNA是指核酸序列中该位点的脱氧核糖核酸为锁核酸修饰；
所述样本为含有幽门螺杆菌的样本。
2.根据权利要求1所述的一种用于检测样本中幽门螺杆菌耐药基因突变的引物探针组合物，其特征在于，所述的样本为胃黏膜组织样本、胃液、唾液、粪便或环境样本。
3.根据权利要求2所述的一种用于检测样本中幽门螺杆菌耐药基因突变的引物探针组合物，其特征在于，所述的样本为粪便样本。
4.一种用于检测样本中幽门螺杆菌耐药基因突变的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中，包括如权利要求1所述检测粪便中幽门螺杆菌耐药基因突变的引物探针组合物。
5.根据权利要求4所述的用于检测样本中幽门螺杆菌耐药基因突变的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒，还包括PCR扩增的缓冲液，dNTP和DNA聚合酶。
6.一种用于检测样本中幽门螺杆菌耐药基因突变的反应体系，其特征在于，所述的反应体系中，包括如权利要求1所述检测粪便中幽门螺杆菌耐药基因突变的引物探针组合物、PCR扩增的缓冲液，dNTP和DNA聚合酶；
其中，
PCR扩增的缓冲液成分包括：浓度为10mM～40mM且pH为8.7的Tris-HCl，25mM～100mM的KCl，1.5mM～2.5mM的MgCl2，0.1～0.5mg/mL的BSA；
正向引物的浓度范围为50nM～150nM，反向引物的浓度范围为200nM～1000nM，探针的浓度范围为200nM～600nM；
正向引物与反向引物的摩尔比为1：3～10；探针与反向引物的摩尔比为0.6～1：1。
7.根据权利要求6所述的用于检测样本中幽门螺杆菌耐药基因突变的反应体系，其特征在于，所述的反应体系中，
PCR扩增的缓冲液成分如下：浓度为20mM且pH为8.7的Tris-HCl，50mM的KCl，2mM的MgCl2，0.2mg/mL的BSA；
正向引物的浓度为100nM，反向引物的浓度为500nM，探针的浓度为400nM；
正向引物、反向引物、探针的摩尔比为1：5：4。
8.根据权利要求7所述的用于检测样本中幽门螺杆菌耐药基因突变的反应体系，其特征在于，所述的反应体系，以50μL计，组分和含量如下：
。
9.利用如权利要求1-3任意一项所述的引物探针组合物、如权利要求4-5任意一项所述试剂盒或如权利要求6-8任意一项所述的反应体系检测样本中幽门螺杆菌耐药基因突变的检测方法，其特征在于，以PCR反应进行扩增；PCR反应的热循环条件为94℃～98℃1min～10min；94℃～98℃10S～30S，58℃～62℃30S～1min，45～75个循环；PCR扩增完成后94℃30S，在45℃～75℃范围内进行熔解曲线分析。
10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，PCR反应的热循环条件为94℃1min；94℃15S，60℃30S，55个循环；PCR扩增完成后94℃30S，在45℃～75℃范围内进行熔解曲线分析。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310135604.6A CN116103411A (zh) | 2023-02-20 | 2023-02-20 | 一种用于检测样本中幽门螺杆菌耐药基因突变的引物探针组合物及试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310135604.6A CN116103411A (zh) | 2023-02-20 | 2023-02-20 | 一种用于检测样本中幽门螺杆菌耐药基因突变的引物探针组合物及试剂盒 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116103411A true CN116103411A (zh) | 2023-05-12 |
Family
ID=86263682
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310135604.6A Pending CN116103411A (zh) | 2023-02-20 | 2023-02-20 | 一种用于检测样本中幽门螺杆菌耐药基因突变的引物探针组合物及试剂盒 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116103411A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116970722A (zh) * | 2023-07-03 | 2023-10-31 | 重庆新赛亚生物科技有限公司 | 同时鉴定幽门螺杆菌感染和检测耐药基因突变位点的方法、引物探针组合物、应用和试剂盒 |
-
2023
- 2023-02-20 CN CN202310135604.6A patent/CN116103411A/zh active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116970722A (zh) * | 2023-07-03 | 2023-10-31 | 重庆新赛亚生物科技有限公司 | 同时鉴定幽门螺杆菌感染和检测耐药基因突变位点的方法、引物探针组合物、应用和试剂盒 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN111304372B (zh) | 检测2019新型冠状病毒突变的组合物、用途及试剂盒 | |
| CN107034277A (zh) | 一种检测低丰度基因突变的方法 | |
| JP2014507950A (ja) | 混合個体群における標的ｄｎａを配列決定するためのキットおよび方法 | |
| CN114410811A (zh) | 检测或鉴定幽门螺杆菌耐药基因突变的方法、引物探针组合物、应用、试剂盒及使用方法 | |
| CN116103411A (zh) | 一种用于检测样本中幽门螺杆菌耐药基因突变的引物探针组合物及试剂盒 | |
| CN114574601B (zh) | 一种检测幽门螺旋杆菌23SrRNA基因突变的引物和探针组合物及其应用、试剂盒 | |
| CN116769939A (zh) | 检测结核分枝杆菌氟喹诺酮耐药突变的引物组合 | |
| CN110592215A (zh) | 检测核酸序列的组合物及检测方法 | |
| CN106282176A (zh) | 一种用于鉴定AGA926-928突变的ARMS-qPCR的引物组合及其应用 | |
| KR102683325B1 (ko) | 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori) 유전형 판별용 PNA 프로브 및 이를 이용한 헬리코박터 파일로리 유전형 판별방법 | |
| CN116694786B (zh) | 一种用于检测幽门螺旋杆菌耐药突变基因的引物探针组合 | |
| CN110819725B (zh) | 一种基于人工模拟核酸分子信标的检测幽门螺杆菌克拉霉素耐药位点的方法与试剂盒 | |
| CN116254371A (zh) | 一种用于猴痘病毒野生型和突变型分子分型的引物分子信标组合及其应用 | |
| CN112795677B (zh) | 一种皮肤利什曼原虫虫种鉴定的试剂盒 | |
| CN114250273B (zh) | 用于核酸检测的组合物 | |
| CN111378771B (zh) | 一种用于检测幽门螺杆菌毒力基因的核酸组合物及其试剂、试剂盒和应用 | |
| CN113151599A (zh) | 用于检测新型冠状病毒的引物组、试剂、试剂盒及检测方法 | |
| CN106367489A (zh) | 一种nat2基因多态性荧光pcr熔解曲线检测试剂盒 | |
| CN113881759A (zh) | Egfr基因突变检测试剂盒及其检测方法 | |
| CN112458194A (zh) | 一种肺炎支原体及其耐药突变的引物探针组合及检测试剂盒 | |
| CN116426617B (zh) | 一种基于发卡结构和酶切机制的高灵敏突变检测体系和应用 | |
| CN114008217B (zh) | 检测核酸的组合、方法及试剂盒 | |
| CN117448448B (zh) | Il-1b基因检测引物探针组合、试剂盒及其应用 | |
| CN117487921B (zh) | Casp3基因检测引物探针组合、试剂盒及其应用 | |
| CN117448447B (zh) | Itpkc基因检测引物探针组合、试剂盒及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |