CN106367489A - 一种nat2基因多态性荧光pcr熔解曲线检测试剂盒 - Google Patents

一种nat2基因多态性荧光pcr熔解曲线检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种NAT2基因多态性荧光PCR熔解曲线检测试剂盒，包括一第一探针、一第二探针、一第三探针、一第四探针、一正向引物和一反向引物，第一探针、第二探针、第三探针和第四探针的5’端分别标记有不同的荧光基团，3’端均标记有相应的淬灭基团。本发明在单管PCR体系中即可完成4个位点4个单核苷酸多态性的检测，PCR扩增结束经一次荧光PCR熔解曲线分析就可知道样本基因型，整个操作在3小时即可完成，耗时短。

Description

一种NAT2基因多态性荧光PCR熔解曲线检测试剂盒
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种NAT2基因多态性荧光PCR熔解曲线检测试剂盒。
背景技术
结核病是由于结核分枝杆菌感染引起的疾病，在全世界范围内都是困扰着人类健康的严重问题。结核分枝杆菌可以通过空气传播，目前全球约有20亿人感染了结核分枝杆菌，若不及时治疗，平均每例结核病患者每年可传染10～15人。结核病是导致死亡人数最多的感染性疾病之一，全球每年新出现的肺结核患者约800～1000万例，每年因肺结核死亡的人数约200～300万例，其中95％的结核病患者及98％的结核病死亡患者发生在发展中国家。异烟肼(isoniazid，INH)自1952年被用于临床治疗以来，因其成本低廉且具有强大的杀菌能力，一直被广泛用作抗结核治疗的一线药物，但由其引发的不良反应也不可忽视。INH可引发的严重不良反应包括高烧、外周神经炎和肝毒性反应等，其中肝毒性反应最常发生，发生率在1～36％之间不等，且有一定的致死率。在所有的一线抗结核药物中，异烟肼是引发肝毒性不良反应的主要药物。
INH在人体内主要存在两条代谢通路，其大部分(50～90％)在N-乙酰基转移酶2(N-acetyltransferase-2，NAT2)的作用下乙酰化为乙酰异烟肼(AcINH)，之后在酰胺酶(amidase)的作用下生成乙酰烟肼(acetyl hydrazine，AcHz)，另外一小部分直接由酰胺酶催化水解为酰肼(hydrazine，Hz)，Hz是构成INH肝毒性的主要物质。N-乙酰基转移酶2由NAT2基因编码，其基因的多态性会造成个体间N-乙酰基转移酶2活性的差异，由此可将人群的乙酰化代谢表型分为快代谢(rapid metabolizer，RM)、中间代谢(intermediatemetabolizer，IM)和慢代谢(slow metabolizer，SM)三种类型。对于IM和SM的结核病患者，由于INH的乙酰化作用减弱，水解作用反而加强，导致大量Hz积累，最终引起肝功能受损。
NAT2基因定位于人类8号染色体8p22，编码区全长820bp，共编码290个氨基酸，研究证实NAT2基因突变可影响NAT2酶的表达、稳定性以及催化活性。NAT2基因主要存在7个常见的单核苷酸多态性位点，分别是191G＞A、282C＞T、341T＞C、481C＞T、590G＞A、803G＞A、857G＞A，可组成27个以上的等位基因型，其中*4型为野生型，为正常的快代谢等位基因。481位点单独突变时不会导致氨基酸的变化，形成快代谢等位基因*11；282位点通常与590或857位点联合突变，形成等位基因*6A和*7B；341、481、803位点联合突变形成等位基因*5B。*5B、*6A、*7B是中国和高加索人中最常见的慢乙酰化表型突变，占所有突变的90％以上，它们是造成NAT2基因多态性的主要原因，可解释98％以上的SA，其乙酰化活性顺序为*4＞*7B＞*6A＞*5B。中国人群中*5B、*6A、*7B的基因频率分别为3.3％、21.2％、11.7％(合计36.2％)，突变纯合子的发生率为15.8％。根据携带的等位基因型对乙酰化表型进行划分，携带两个快代谢等位基因为快代谢型RM，携带一个快代谢等位基因和一个慢代谢等位基因为中间代谢型IM，携带任意两个慢代谢等位基因为慢代谢型SM。据文献报道，SM与INH引发的肝毒性不良反应密切相关。Meta-分析数据显示，SM患者发生肝毒性不良反应的总体OR值为3.10(95％CI：2.47-3.88，P＜10-5)，但不同种族间差异较大，如在东亚人群(OR＝3.24，95％CI：2.38-4.41，P＜10-5)、南亚人群(OR＝2.96，95％CI：1.83-4.76，P＜10-5)、亚洲中部人群(OR＝6.20，95％CI：3.11-12.33，P＜10-5)和巴西人群(OR＝3.52，95％CI：1.99-6.24，P＜10-5)中，SM和肝毒性不良反应存在强烈的相关性，而在高加索人群中(OR＝1.44，95％CI：0.82-2.52，P＝0.20)，则未发现二者之间的关联。目前有大量基于NAT2基因型的INH剂量研究[19，20，21]，大多建议IM患者使用标准剂量；RM患者使用1.5倍的标准剂量，因为RM患者体内血药浓度降低，有发生INH抵抗的风险，导致治疗无效；而对于SM患者，则应使用一半的标准剂量以防止不良反应的发生。
在中国大陆、中国台湾、南非以及许多其它国家和地区，INH是最常引发药物导致肝毒性的药物。我国是结核病高发的国家，大约有450万人患有结核病，因此十分有必要在INH用药之前对NAT2基因的多态性进行检测，帮助临床医生判断患者的乙酰化代谢类型，从而个体化制定用药剂量，以避免不良反应的发生。
目前国内尚没有通过CFDA获批上市的NAT2基因多态性检测试剂盒，现有的研究方法主要为限制性片段长度多态性分析法、基因芯片法、ARMS-PCR法、测序法等。这些研究方法因其自身的局限性，不适用于临床样本的大规模应用。制性片段长度多态性分析法需要对PCR产物进行酶切、电泳，操作步骤繁琐，容易引起污染。基因芯片技术成本高、操作复杂，结果也会存在不同程度的假阳性。ARMS-PCR法检测的通量十分有限，而且需要PCR后处理，容易出现污染造成假阳性结果的发生。测序法检测周期较长，不适用于临床样本的快速分析。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种NAT2基因多态性荧光PCR熔解曲线检测试剂盒
本发明的具体技术方案如下：
一种NAT2基因多态性荧光PCR熔解曲线检测试剂盒，包括一第一探针、一第二探针、一第三探针、一第四探针、一正向引物和一反向引物，其中，第一探针包含如SEQ ID NO01所示的序列，第二探针包含如SEQ ID NO 02所示的序列，第三探针包含如SEQ ID NO 03所示的序列，第四探针包含如SEQ ID NO 04所示的序列，正向引物包含如SEQ ID NO 05所示的序列，反向引物包含如SEQ ID NO 06所示的序列，第一探针、第二探针、第三探针和第四探针的5’端分别标记有不同的荧光基团，3’端均标记有相应的淬灭基团。
在本发明的一个优选实施方案中，所述荧光基团为CY5、HEX、ROX或FAM，所述淬灭基团为BHQ1或BHQ2。
进一步优选的，所述第一探针的荧光基团为CY5，淬灭基团为BHQ2。
进一步优选的，所述第二探针的荧光基团为HEX，淬灭基团为BHQ1。
进一步优选的，所述第三探针的荧光基团为ROX，淬灭基团为BHQ2。
进一步优选的，所述第四探针的荧光基团为FAM，淬灭基团为BHQ1。
在本发明的一个优选实施方案中，其单管的反应体系包括：1×PCR buffer、2UTaq DNA聚合酶、200μM dNTP、4.5mM MgCl2、正向引物4pmol、反向引物40pmol、第一探针2.5pmol、第二探针5pmol、第三探针7.5pmol和第四探针8.75pmol。
进一步优选的，所述1×PCR buffer中包括：Tris-HCl pH8.5 67mM、(NH4)2SO416mM和0.1％(w/v)Tween。
在本发明的一个优选实施方案中，其反应程序如下：
(1)50℃2min，
(2)95℃10min；
(3)95℃15s→70℃～60℃15s→76℃20s，10个循环，其中70℃～60℃15s每个循环下降1℃；
(4)95℃15s→60℃26s→76℃20s，50个循环，在60℃的退火阶段采集荧光信号；
(5)95℃1min→37℃3min→45℃～83.5℃，其中45℃～83.5℃以0.04℃/s的升温速率进行熔解曲线分析，同时采集荧光信号。
本发明的有益效果是：
1、本发明的试剂盒的检测耗时短：在单管PCR体系中即可完成4个位点4个单核苷酸多态性的检测，PCR扩增结束经一次荧光PCR熔解曲线分析就可知道样本基因型，整个操作在3小时即可完成，耗时短；
2、本发明的试剂盒采用均相检测、闭管操作：本发明为均相检测体系，PCR及熔解曲线分析都在同一封闭的反应管中完成，无需PCR后处理，减少了PCR产物污染的可能性；
3、本发明的试剂盒的检测通量高：本发明基于荧光PCR熔解曲线分析技术，PCR之后只需运行一个简单的熔解曲线分析步骤(在荧光PCR仪上40min以内完成)即可完成，而PCR可以在普通仪器上运行，一台荧光PCR仪可配合多台普通PCR仪完成熔解曲线分析，故可以大大提高检测通量，提高荧光PCR仪的利用率；
4、本发明的试剂盒的检测特异性高、结果容易判读：本发明是通过熔解峰的熔点来判定突变与否，结果易于判读，且不易出错，故检测特异性高；
5、本发明的试剂盒可采用干试剂形式，操作简便：试剂储存条件为2～8℃，避免反复冻融，且检测时只需添加模板，不需配液、分装。
附图说明
图1为本发明的实施例1的试剂盒对多态性位点c.341T＞C的熔解曲线检测结果图。
图2为本发明的实施例1的试剂盒对多态性位点c.481C＞T的熔解曲线检测结果图。
图3为本发明的实施例1的试剂盒对多态性位点c.590G＞A的熔解曲线检测结果图。
图4为本发明的实施例1的试剂盒对多态性位点c.857G＞A的熔解曲线检测结果图。
具体实施方式
以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。
实施例1
一种NAT2基因多态性荧光PCR熔解曲线检测试剂盒，为干式试剂盒(无溶剂存在，各试剂和核苷酸均为干粉)，包括一第一探针、一第二探针、一第三探针、一第四探针、一正向引物和一反向引物，具体的，其单管的反应体系包括：1×PCR buffer、2U Taq DNA聚合酶、200μM dNTP、4.5mM MgCl2、正向引物4pmol、反向引物40pmol、第一探针2.5pmol、第二探针5pmol、第三探针7.5pmol和第四探针8.75pmol；其中，1×PCR buffer中包括：Tris-HClpH8.5 67mM、(NH4)2SO4 16mM和0.1％(w/v)Tween。
第一探针如SEQ ID NO 01所示，其5’端分别标记有荧光基团CY5，3’端均标记有淬灭基团BHQ2。
第二探针如SEQ ID NO 02所示，其5’端分别标记有荧光基团HEX，3’端均标记有淬灭基团BHQ1。
第三探针如SEQ ID NO 03所示，其5’端分别标记有荧光基团ROX，3’端均标记有淬灭基团BHQ2。
第四探针如SEQ ID NO 04所示，其5’端分别标记有荧光基团FAM，3’端均标记有淬灭基团BHQ1。
正向引物如SEQ ID NO 05所示，
反向引物如SEQ ID NO 06所示，
上述各探针和引物的具体序列如下表：
本实施例的检测试剂盒的反应程序如下：
(1)50℃2min，
(2)95℃10min；
(3)95℃15s→70℃～60℃15s→76℃20s，10个循环，其中70℃～60℃15s每个循环下降1℃；
(4)95℃15s→60℃26s→76℃20s，50个循环，在60℃的退火阶段采集荧光信号；
(5)95℃1min→37℃3min→45℃～83.5℃，其中45℃～83.5℃以0.04℃/s的升温速率进行熔解曲线分析，同时采集荧光信号。
具体应用如下：
(1)试剂盒分型能力考察
制备1个野生型标准品和4个突变阳性标准品用于试剂盒分型能力考察。
制备野生型标准品时，首先用所述正向引物和所述反向引物扩增野生型基因组模板，对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳纯化并切胶回收，与PMD18-T载体连接，随后将连接成功的质粒转化到DH5α感受态细胞中，平板培养，挑出成功转化的大肠杆菌测序验证，即得到野生型质粒，即为野生型标准品。
制备突变阳性标准品时，首先用所述正向引物和所述反向引物分别扩增各多态性位点的突变型基因组模板，对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳纯化并切胶回收，与PMD18-T载体连接，随后将连接成功的质粒转化到DH5α感受态细胞中，平板培养，挑出成功转化的大肠杆菌测序验证，即得到相应位点的突变型质粒，即为突变阳性标准品。
实验时，将制备的4个突变阳性标准品、1个野生型标准品和阴性对照(NTC)分别加入到试剂盒的检测体系中，并按2.3的荧光PCR熔解曲线检测程序进行检测，每个样本的模板加入量均为25uL，每uL1×103拷贝；阴性对照(NTC)为1×TE Buffer(包括10mM Tris-HCl和1mM EDTA)，pH8.0，加入量为25uL。
(2)参考值确定
对厦门大学分子诊断工程中心提供的253份已知基因型(各多态性位点已通过测序验证)的人类基因组DNA样本进行检测，并对检测结果进行分析，分别统计各样本各位点的基因型，从而确定样本在各个检测通道的野生型熔解峰Tm值波动范围以及多态性熔解峰与野生型熔解峰的差异(ΔTm)值的波动范围。
(3)样本检测
以基因测序法为对照，共检测700份随机人群的基因组DNA，比较二者之间的符合率。
(4)结果
1)试剂盒分型能力考察
分型典型结果如图1至图4所示，本发明的试剂盒对目标检测的4种N-乙酰转移酶2基因突变类型都可检测出特异的熔解曲线信号，突变型峰和野生型峰(Wt)均能明显区分，而且各个基因型间不存在交叉检出的现象。
2)参考值确定结果
本实施例的试剂盒通过比较待测样本与野生型对照之间熔点的差异(ΔTm值)判断样本是否含有相应的基因多态性。当样本在四个检测通道中的熔点峰与野生型对照熔解峰的熔点均一致时判定为野生型，样本的NAT2基因不含有待检测的4种多态性位点；当样本在某一或几个检测通道中的熔点峰的熔点与野生型对照相应熔解峰的熔点存在1.5℃以上差异时判定为多态性基因型，并根据熔点的差值(ΔTm值)大小，确定样本含有的多态性基因型。
经过统计，最终确定野生型对照在反应体系的各通道中的熔点(Tm)值范围为：FAM通道60.29℃±1.5℃；HEX通道63.07℃±1.5℃；ROX通道60.13℃±1.5℃；Cy5通道63.72℃±1.5℃。本试剂盒可以检测的突变类型及各突变型在对应通道的ΔTm值[ΔTm＝Tm(野生)-Tm(突变)]波动范围如表1所示。需注意，若样本在某个通道的熔解峰与野生型对照的ΔTm值超出附表1给出的波动范围，则样本可能携带本试剂盒探针覆盖区域以外的序列变异，建议采用测序或其它方法进一步验证。
表1
荧光集团 突变位点 探针名称 ΔTm值(℃)
CY5 c.341T＞C P1 -5.83±1.5
HEX c.481C＞T P2 8.61±1.5
ROX c.590G＞A P3 6.54±1.5
FAM c.857G＞A P4 6.05±1.5
3)样本检测结果
通过检测700例随机人群DNA，使用致善试剂盒的检测结果与基因测序法检测结果的符合率为100％，各多态性类型样本统计结果详见表2。
表2各多态性类型样本统计结果
对试剂盒所涵盖的各个多态性位点(分别为c.341＞C、c.481C＞T、c.590G＞A、c.857G＞A)的检测情况分别统计结果，其各型的灵敏度、特异性、阳性预测值、阴性预测值、约登指数及总符合率见表3～表7。
表3基因测序法与致善试剂盒检测c.341T＞C多态性结果比较
临床灵敏度＝52/(52+0)×100％＝100％
临床特异性＝648/(0+648)×100％＝100％
阳性预测值＝52/(52+0)×100％＝100％
阴性预测值＝648/(0+648)×100％＝100％
约登指数＝52/(52+0)+648/(0+648)-1＝1
总符合率＝(52+648)/700×100％＝100％
表4基因测序法与致善试剂盒检测c.481C＞T多态性结果比较
表5基因测序法与致善试剂盒检测c.590G＞A多态性结果比较
表6基因测序法与致善试剂盒检测c.857G＞A多态性结果比较
表7基因测序法与致善试剂盒检测4个多态性位点比较结果汇总表
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。

Claims (9)

1.一种NAT2基因多态性荧光PCR熔解曲线检测试剂盒，其特征在于：，包括一第一探针、一第二探针、一第三探针、一第四探针、一正向引物和一反向引物，其中，第一探针包含如SEQ ID NO 01所示的序列，第二探针包含如SEQ ID NO 02所示的序列，第三探针包含如SEQID NO 03所示的序列，第四探针包含如SEQ ID NO 04所示的序列，正向引物包含如SEQ IDNO 05所示的序列，反向引物包含如SEQ ID NO 06所示的序列，第一探针、第二探针、第三探针和第四探针的5’端分别标记有不同的荧光基团，3’端均标记有相应的淬灭基团。
2.如权利要求1所述的一种NAT2基因多态性荧光PCR熔解曲线检测试剂盒，其特征在于：所述荧光基团为CY5、HEX、ROX或FAM，所述淬灭基团为BHQ1或BHQ2。
3.如权利要求2所述的一种NAT2基因多态性荧光PCR熔解曲线检测试剂盒，其特征在于：所述第一探针的荧光基团为CY5，淬灭基团为BHQ2。
4.如权利要求2所述的一种NAT2基因多态性荧光PCR熔解曲线检测试剂盒，其特征在于：所述第二探针的荧光基团为HEX，淬灭基团为BHQ1。
5.如权利要求2所述的一种NAT2基因多态性荧光PCR熔解曲线检测试剂盒，其特征在于：所述第三探针的荧光基团为ROX，淬灭基团为BHQ2。
6.如权利要求2所述的一种NAT2基因多态性荧光PCR熔解曲线检测试剂盒，其特征在于：所述第四探针的荧光基团为FAM，淬灭基团为BHQ1。
7.如权利要求1所述的一种NAT2基因多态性荧光PCR熔解曲线检测试剂盒，其特征在于：其单管的反应体系包括：1×PCRbuffer、2UTaqDNA聚合酶、200μM dNTP、4.5mMMgCl2、正向引物4pmol、反向引物40pmol、第一探针2.5pmol、第二探针5pmol、第三探针7.5pmol和第四探针8.75pmol。
8.如权利要求7所述的一种NAT2基因多态性荧光PCR熔解曲线检测试剂盒，其特征在于：所述1×PCR buffer中包括：Tris-HCl pH8.567mM、(NH4)2SO416mM和0.1％Tween。
9.如权利要求1所述的一种NAT2基因多态性荧光PCR熔解曲线检测试剂盒，其特征在于：其反应程序如下：
(1)50℃ 2min，
(2)95℃10min；
(3)95℃15s→70℃～60℃ 15s→76℃ 20s，10个循环，其中70℃～60℃ 15s每个循环下降1℃；
(4)95℃15s→60℃26s→76℃20s，50个循环，在60℃的退火阶段采集荧光信号；
(5)95℃1min→37℃3min→45℃～83.5℃，其中45℃～83.5℃以0.04℃/s的升温速率进行熔解曲线分析，同时采集荧光信号。
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