CN107653316B - 用于检测奶牛三种隐性遗传缺陷病的引物对及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了用于检测奶牛三种隐性遗传缺陷病的引物对及其应用，其中，第一对引物由序列表中SEQ NO.1和SEQ NO.2所示的寡核苷酸序列组成，第二对引物由序列表中SEQ NO.3和SEQ NO.4所示的寡核苷酸序列组成，第二对引物由序列表中SEQ NO.3和SEQ NO.4所示的寡核苷酸序列组成；前述的三对引物可以应用在制备用于诊断CVM、BLAD、DUMPS这三种隐性遗传缺陷病的试剂盒中。本发明的有益之处在于：应用高分辨率熔解曲线技术和本发明提供的三对引物可实现对奶牛的CVM、BLAD、DUMPS这三种隐性遗传缺陷病的基因突变位点进行检测，检测结果与测序法结果一致，并且具有操作简单、快速、高通量的优点。

Description

用于检测奶牛三种隐性遗传缺陷病的引物对及其应用

技术领域

本发明涉及用于检测疾病的引物对及其应用，具体涉及用于检测奶牛脊椎畸形综合征(CVM)、白细胞粘附缺陷病(BLAD)、尿苷酸合酶缺乏症(DUMPS)这三种隐性遗传缺陷病的引物对及其在制备用于诊断奶牛脊椎畸形综合征(CVM)、白细胞粘附缺陷病(BLAD)、尿苷酸合酶缺乏症(DUMPS)这三种隐性遗传缺陷病的试剂盒中的应用，属于分子生物学技术领域。

背景技术

遗传缺陷多数是由缺陷基因引起的，具有先天性和家族性特征。遗传缺陷会使发育个体出现生理功能的损害，可以致畸、半致死或致死，从而影响家畜的生活力，降低经济价值，给畜牧生产带来了损失。美国荷斯坦牛协会公牛系谱记录的遗传疾病共有13类，其中奶牛脊椎畸形综合征(CVM)、白细胞粘附缺陷病(BLAD)、尿苷酸合酶缺乏症(DUMPS)是最常见的三种常染色体隐性遗传疾病。

脊椎畸形综合征(Complex Vertebral Malformation，CVM)是荷斯坦牛的一种由常染色体单基因控制的隐性遗传病。该病的发生是由于编码UDP-N-乙酰葡糖胺载体的溶质转运家族35-3(SLC35A3)基因第4外显子559处发生G→T突变，导致180处缬氨酸置换为苯丙氨酸，致使异常的核苷酸糖转运到高尔基体。其主要症状为早期流产、早产和死胎，出生的患病犊牛体型较小、体重偏轻、颈部较短、颈部胸部脊椎骨或肋骨出现各式各样的病变、同时四肢关节僵直、呈现对称的向后方翻转弯曲。另外，脊椎畸形综合征对奶牛的繁殖性状也有很大的影响，母牛的不返情率提高，产犊间隔大大延长，流产比例增加。

白细胞粘附缺陷病(Bovine Leukocyte Adhesion Deficiency，BLAD)是一种牛的造血系统遗传性疾病。本病病因与人的白细胞粘附缺陷病相同，为白细胞表面的粘附分子(整合素)CDl8亚单位编码序列383位碱基由A突变为G所致，相应的位于胞外高度保守区的128位天门冬氨酸变成了甘氨酸，致使白细胞表面的CDl8整合素亚单位表达明显减少或缺乏，导致机体在炎症反应时外周血液中的白细胞不能通过自身整合素与血管内皮粘附分子相互作用而黏附到血管内皮上，最终无法穿过血管壁到达病原侵入部位和对病原体直接做出反应,进而导致机体发病。患牛常发生口腔粘膜及舌粘膜溃疡，牙龈萎缩，病程长者前臼齿脱落。粘膜和肠道等软组织发生反复性感染，泛发性淋巴样增生；胃肠粘膜溃疡、慢性腹泻，生长发育受阻，最终导致早期死亡。

尿苷酸合酶缺乏症(Deficiency of uridine monophophate synthase，DUMPS)又称单谱症，是导致荷斯坦牛胚胎早期死亡的一种遗传缺陷。其遗传学基础是奶牛1号染色体q31区(BTAI)上的UMPS基因C-末端密码子405处存在着一个C/T点突变，可导致原来编码精氨酸的“CGA”转变为编码终止密码子的“TGA”，导致基因编码产物催化亚基C-末端缺失76个氨基酸。其主要症状为血液中瓜氨酸含量升高，尿素循环受阻引起高氨血症，从而导致犊牛在出生一周内死亡，或者母牛怀孕约40天左右时流产。

目前，针对这三种遗传缺陷病已经建立了一些分子检测技术，如等位基因特异性PCR技术(AS-PCR)、单链构象多态性分析法(SSCP)、SNP芯片检测法等等。

高分辨率熔解曲线技术(HRM)是近年兴起的一种SNP基因分型及突变检测新技术。该新技术是基于成熟的PCR技术，在PCR体系中加入饱和荧光染料，在扩增结束后监测核酸分子的熔解情况，根据熔解曲线的特征和溶解温度的差异实现基因分型、突变检测等。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供应用在高分辨率熔解曲线技术中的、用于检测奶牛脊椎畸形综合征、牛白细胞粘附缺陷病、牛尿苷酸合酶缺乏症这三种隐性遗传缺陷病的三对引物。

为了实现第一个目的，本发明采用如下的技术方案：

用于检测奶牛脊椎畸形综合征、牛白细胞粘附缺陷病、牛尿苷酸合酶缺乏症这三种隐性遗传缺陷病的三对引物，其特征在于，

第一对引物由序列表中SEQ NO.1和SEQ NO.2所示的寡核苷酸序列组成；

第二对引物由序列表中SEQ NO.3和SEQ NO.4所示的寡核苷酸序列组成；

第三对引物由序列表中SEQ NO.5和SEQ NO.6所示的寡核苷酸序列组成。

本发明的第二个目的在于提供前述的三对引物在制备用于诊断奶牛脊椎畸形综合征、牛白细胞粘附缺陷病、牛尿苷酸合酶缺乏症这三种隐性遗传缺陷病的试剂盒中的应用。

为了实现第二个目的，本发明采用如下的技术方案：

前述的三对引物在制备用于诊断奶牛脊椎畸形综合征、牛白细胞粘附缺陷病、牛尿苷酸合酶缺乏症这三种隐性遗传缺陷病的试剂盒中的应用，其特征在于，以含有脊椎畸形综合征、牛白细胞粘附缺陷病和牛尿苷酸合酶缺乏症突变位点的标准质粒DNA为模板，利用三对引物对奶牛的血样和冻精样品进行扩增，三对引物对应的扩增产物的大小如下：

第一对引物对应的扩增产物的大小为64bp；

第二对引物对应的扩增产物的大小为59bp；

第三对引物对应的扩增产物的大小为64bp。

前述的应用，其特征在于，三对引物利用不对称PCR对脊椎畸形综合征、牛白细胞粘附缺陷病和牛尿苷酸合酶缺乏症进行检测，PCR反应程序为：

95℃5min，95℃10s，64℃20s，72℃25s，8个循环，每个循环降低0.5℃。

本发明的第三个目的在于提供用于检测奶牛脊椎畸形综合征、牛白细胞粘附缺陷病、牛尿苷酸合酶缺乏症这三种隐性遗传缺陷病的试剂盒。

为了实现第三个目的，本发明采用如下的技术方案：

一种用于检测奶牛脊椎畸形综合征、牛白细胞粘附缺陷病、牛尿苷酸合酶缺乏症这三种隐性遗传缺陷病的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含：

前述的三对引物；

序列表中SEQ NO.7、SEQ NO.8和SEQ NO.9所示的三条非标记探针；

含有脊椎畸形综合征、牛白细胞粘附缺陷病和牛尿苷酸合酶缺乏症突变位点的标准质粒；

耐高温的聚合酶；

以及，反应缓冲液。

前述的试剂盒，其特征在于，每对引物的上游引物与下游引物的浓度比为1:10。

前述的试剂盒，其特征在于，扩增反应的体系以10μL计，标准质粒的用量为2μL。

本发明的有益之处在于：

(1)应用高分辨率熔解曲线技术和本发明提供的三对引物，可以同时对奶牛的脊椎畸形综合征、白细胞粘附缺陷病、尿苷酸合酶缺乏症这三种隐性遗传缺陷病的基因突变位点进行检测，检测结果与测序法结果一致；

(2)应用高分辨率熔解曲线技术和本发明提供的三对引物对奶牛的脊椎畸形综合征、白细胞粘附缺陷病、尿苷酸合酶缺乏症这三种隐性遗传缺陷病的基因突变位点进行检测具有操作简单、快速、高通量的特点，适合于进口荷斯坦奶牛的口岸检测，对于剔除隐性遗传缺陷病基因、保持奶牛育种体系的健康发展具有重要意义。

附图说明

图1是以野生型质粒为模板扩增SLC35A3目标产物的熔解曲线图；

图2是以突变杂合型质粒为模板扩增SLC35A3目标产物的熔解曲线图；

图3是以突变纯合型质粒为模板扩增SLC35A3目标产物的熔解曲线图；

图4是以野生型质粒为模板扩增CD18目标产物的熔解曲线图；

图5是以突变杂合型质粒为模板扩增CD18目标产物的熔解曲线图；

图6是以突变纯合型质粒为模板扩增CD18目标产物的熔解曲线图；

图7是以野生型质粒为模板扩增UMPS目标产物的熔解曲线图；

图8是以突变杂合型质粒为模板扩增UMPS目标产物的熔解曲线图；

图9是以突变纯合型质粒为模板扩增UMPS目标产物的熔解曲线图；

图10是样本中SLC35A3基因突变位点GG型(反向测序结果CC对应GG，即反向互补)测序结果图；

图11是样本中SLC35A3基因突变位点GT型(反向测序结果CA对应GT，即反向互补)测序结果图；

图12是样本中CD18基因突变位点AA型(反向测序结果TT对应AA，即反向互补)测序结果图；

图13是样本中DUMPS基因突变位点CC型(反向测序结果GG对应CC，即反向互补)测序结果图。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。

在此特别指出，下述实施例中，如未特别注明，则所用试剂均为分析纯，均可从商业渠道获得。

第一部分、引物对的设计与合成

根据NCBI(National Center for Biotechnology Information)数据库中已发表的SLC35A3、CDl8、UMPS基因的序列(Gen Bank：AY160683.1、Y12672、X65125)，利用Primer5.0软件自行设计了含有目的基因靶向区域中至少15个连续核苷酸序列的若干对引物，按照设计原则、标准质粒以及样本DNA体系质量情况筛选引物对，利用集成化体系反应条件，从若干对引物中筛选出适合本检测体系的最优引物对，最终我们筛选出了三对引物，其中：

第一对引物由序列表中SEQ NO.1和SEQ NO.2所示的寡核苷酸序列组成；

第二对引物由序列表中SEQ NO.3和SEQ NO.4所示的寡核苷酸序列组成；

第三对引物由序列表中SEQ NO.5和SEQ NO.6所示的寡核苷酸序列组成。

我们对三对引物的信息进行了整理，具体如下：

第二部分、探针的设计与合成

本发明中所应用的检测方法是高分辨率熔解曲线技术(HRM)中的非标记探针法，所以我们有针对性的设计了三条非标记探针。本发明中提供的三对引物以及三条非标记探针均应用于高分辨率熔解曲线技术-中。

探针的序列是根据标准质粒的DNA片段来设计的，是与检测片段互补配对的一段核苷酸单链。我们根据NCBI(National Center forBiotechnology Information)数据库中已发表的SLC35A3、CDl8、UMPS基因的序列(Gen Bank：AY160683.1、Y12672、X65125)，利用Primer5.0软件自行设计了一些非标记探针，其中，SLC35A3及UMPS基因根据检测位点野生型设计，CD18基因根据突变型设计，最终设计优化的探针的序列如序列表中SEQ NO.7、SEQNO.8和SEQ NO.9所示。

我们对三条探针的信息进行了整理，具体如下：

探针的3’端采用C-3spacer法封闭，在不对称PCR之前被加入，小片段探针可以和不对称PCR中扩增出的单链DNA结合。

第三部分、标准质粒的构建

由于奶牛脊椎畸形综合征(CVM)、白细胞粘附缺陷病(BLAD)、尿苷酸合酶缺乏症(DUMPS)这三种隐性遗传缺陷病的阳性样本较难获得，所以我们首先构建了含有这三种隐性遗传缺陷病突变位点的标准质粒。

该标准质粒的构建方法具体如下：

第1步：设计突变片段序列

根据3个检测位点检测引物信息及数据库基因信息，设计含有SLC35A3基因外显子4的第559位G→T突变、CDl8(β)亚单位编码序列383位碱基A→G突变、UMPS基因C-末端密码子405的C→T突变片段序列。

HD-BT-1对应的核苷酸序列见序列表中SEQ NO.10。

HD-BT-2对应的核苷酸序列见序列表中SEQ NO.11。

第2步：全基因合成序列的PCR扩增

全基因合成引物PCR扩增程序，反应体系(100uL)如下：

PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性15sec，55℃退火15sec，72℃延伸lmin，25个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存。

第3步：胶回收目的条带

采用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(DP209)回收目的条带。

第4步：目的条带与载体pUC57连接

将载体pUC57与胶回收的产物酶切，酶切体系为50μL，依次加入以下试剂：带酶切样品10μL，Buffer 5μL，BamHI 1μL，SmaI1μL，H₂O33μL。过夜酶切后先纯化目的片段，再将目的片段连接在载体上，依次加入以下试剂连接(20μL)，置于16℃恒温水浴箱连接过夜。

第5步：连接产物的转化

将连接产物10μL与大肠杆菌感受态细胞80μL混匀，冰浴30min；42℃条件下热激40s；加入1000μL LB液体培养基，于37℃，200rpm培养1h；将EP管内全部液体涂布于加了X-Gal、IPTG和amp抗生素的LB平板，37℃倒置培养过夜。

第6步：重组质粒的筛选鉴定

将挑选的白色菌斑放入到含有X-Gal、IPTG和amp抗生素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。挑取培养后菌鉴定，剩余菌液进行质粒提取。

采用PUC57载体通用引物PCR进行重组质粒的鉴定，反应体系如下：

反应程序如下：95℃预变性5min；95℃变性15sec，55℃退火30sec，72℃延伸lmin，25个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存。

对PCR产物进行纯化，后用1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，能看到约300bp的光亮条带。

第7步：鉴定阳性菌液质粒的提取

剩余菌液移入两个1.5mL菌液于离心管中，标记名称，10000rpm常温离心2min，取出离心管，倒掉上清，将离心管轻轻倒置于吸水纸上。每管加入200μL溶液Ⅰ，用枪头吸打均匀，使菌体充分悬浮，冰上放置5min。加入400μL溶液Ⅱ，轻轻倒转混匀，冰上静置5min。加入300μL溶液Ⅲ，充分混匀，冰浴15min。12000rpm，4℃离心15min。小心吸取上清至新的1.5mL离心管，加入等体积异丙醇，充分混匀，室温放置10min，12000rpm，4℃离心10min。吸掉上清，在吸水纸上空干液体，加1mL70％乙醇，轻弹管壁，使沉淀悬浮并反复颠倒几次，之后，12000rpm，4℃离心4min。吸掉上清，在吸水纸上空干液体，每管加入20μL纯化水溶解沉淀(水中加Rnase，终浓度10ng/μL)，用手轻弹管壁，4℃溶解过夜。

第8步：重组质粒的鉴定

将提取的质粒进行酶切鉴定及测序确定其基因型，测序由华大基因测序部完成。

第9步：杂合型质粒的构建

将得到的两种类型质粒等比例混匀，获得杂合型质粒。

我们将用构建得到的标准质粒作为后续样品检测的阳性模板。

第四部分、设计试剂盒

1、引物

以第一部分合成得到的三对引物作为本发明试剂盒中的引物，三对引物的信息具体如下：

扩增反应的体系以10μL计，每对引物在体系中的总用量均为0.8μL，上游引物与下游引物的用量各为0.4μL，每对引物的上游引物与下游引物的浓度分别为1μM和10μM，浓度比为1:10。

2、探针

以第二部分合成得到的三条非标记探针作为本发明试剂盒中的探针，三条探针的信息具体如下：

扩增反应的体系以10μL计，每条探针在体系中的用量分别为0.5μL、0.2μL、0.5μL。

3、标准质粒

以第三部分构建得到的标准质粒作为本发明试剂盒中的标准质粒，该标准质粒含有脊椎畸形综合征(CVM)、白细胞粘附缺陷病(BLAD)、尿苷酸合酶缺乏症(DUMPS)这三种隐性遗传缺陷病突变位点，包括CVM SLC35A3基因外显子4的第559位G→T突变、BLAD CDl8(β)亚单位编码序列383位碱基A→G突变、DUMPSUMPS基因C-末端密码子405的C→T突变。

扩增反应的体系以10μL计，标准质粒的用量为2μL。

5、聚合酶

采用PCR反应常用的耐高温聚合酶。

6、缓冲液

采用PCR反应常用的缓冲液。

第五部分、样本DNA的提取

采用商业化的DNA提取试剂盒，如天根血液组织细胞基因组提取试剂盒(DP304)。

提取后的基因组在-80℃保存，应避免反复冻融。

1、奶牛血样DNA的提取

提取过程具体如下：

(1)剪取血块至1.5mL的离心管中，用研磨器将其打碎，加入1mL的红细胞裂解液(天根：RT122)，颠倒混匀，室温放置5min(期间再颠倒混匀几次)。10000rpm离心1min，吸去上清，加200μL缓冲液GA，振荡至彻底混匀。

(2)加入20μLProteinase K溶液，混匀，在56℃放置，直至组织溶解。

(3)加入200μL缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10min，溶液应变清亮。

(4)加人200μL无水乙醇，充分振荡混匀15s，此时出现絮状沉淀。

(5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm离心30s，倒掉废液。

(6)向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

(7)向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW，12000pm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

(8)重复操作步骤(7)。

(9)将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

(10)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μL洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中。

2、奶牛精液DNA的提取

提取过程具体如下：

(1)首先将冻精样本解冻，加入1.5mL离心管中，并加入1mL去离子水，震荡15s，12000rpm离心20min，除去上清液后加入1mL去离子水(震荡混匀)，再12000rpm离心20min，多次以除去精液中的精胺和亚精胺。

(2)在步骤(1)得到沉淀中加入200μL GA缓冲液，加入10μLDTT(2mol/L)和50μLSDS(10％)，加入20μL Proteinase K溶液，震荡15s混匀，在56℃放置5-8h，期间颠倒混匀几次。

(3)将步骤(2)得到液体离心10s，加入200μL GB缓冲液，震荡15s，充分颠倒混匀，70℃放置10min，再离心15s，加入预冷的无水乙醇，震荡15s，室温下放置3min，后转移至吸附柱CB3，12000rpm离心30s，去废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

(4)向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD，12000rpm离心30s，去废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

(5)向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW，12000rpm离心30s，去废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

(6)重复步骤(5)。

(7)12000rpm离心2min，去废液，将吸附柱CB3放入收集管中，室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

(8)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μL洗脱缓冲液TE(56℃)，室温放置2-5min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中。

3、提取DNA浓度检测

用微量分光光度计测定基因组DNA浓度和纯度。取1μL DNA样品检测并记录数据。检测完成后将DNA样品-20℃保存(如长期不用-80℃保存)备用。

第六部分、检测方法的建立及应用

提取血液及冻精样本DNA后，利用第四部分设计得到的试剂盒中的引物对及探针进行非标记探针PCR扩增。

首先，以标准质粒DNA为模板，利用三对引物以及三条探针对模板中靶向基因序列进行扩增，并优化HRM检测体系及各参数。

然后，采集荷斯坦奶牛的冻精样品、血液样品、毛发样品或乳液样品，提取样品DNA，采用优化后的HRM检测体系对样品基因序列进行突变位点检测。

最后，根据模板以及样品的高温熔解曲线图的分析结果，判定样品的基因型。

以标准质粒DNA为模板，利用三对引物以及三条探针对模板和样品进行扩增时，三对引物对应的扩增产物的大小如下：

第一对引物对应的扩增产物的大小为64bp；

第二对引物对应的扩增产物的大小为59bp；

第三对引物对应的扩增产物的大小为64bp。

扩增条件具体如下：

(1)分别取浓度为10ng/μL的基因型为GG、GT、TT的标准质粒2μL作为模板，按照如下检测体系扩增SLC35A3目标产物并进行HRM检测。

HRM检测的结果如图1、图2和图3所示。

(2)分别取浓度为10ng/μL的基因型为AA、AG、GG的标准质粒2μL作为模板，按照如下检测体系扩增CDl8目标产物并进行HRM检测。

HRM检测的结果如图4、图5和图6所示。

(3)分别取浓度为10ng/μL的基因型为CC、CT、TT的标准质粒2μL作为模板，按照如下检测体系扩增UMPS目标产物并进行HRM检测。

HRM检测的结果如图7、图8和图9所示。

以上三项HRM测试均用如下所述同一程序进行：

95℃预变性5min；95℃变性10s；64℃退火20s；72℃延伸25s，进行8个循环的降落PCR(每个循环降低0.5℃)；然后进行95℃变性10s；62℃退火15s；72℃延伸25s，进行32个循环；50℃到90℃以0.03℃/s的溶解速率进行溶解曲线分析。

应用带HRM模块的荧光定量PCR仪对扩增产物进行HRM分析，确定标准质粒不同基因型的探针峰的温度，结果如表1所示。

表1不同基因型探针峰Tm

在以上条件下对102份奶牛血液样本、37份奶牛精液样本采用已建立的HRM方法检测SLC35A3、CD18、UMPS三种基因，可以得出待检样本的Tm值和基因型。

将HRM的检测结果和Sanger测序方法得到的结果进行对比。

Sanger测序方法得到的结果如图10、图11、图12和图13所示。，其中，图10和图11为SLC35A3基因突变位点GG型、GT型，图12为CDl8基因突变位点AA型，图13为UMPS基因突变位点CC型。

可见，Sanger测序结果验证了本发明所建立的基于非标记探针HRM技术的基因型检测方法具有较好的准确性与可靠性。

血液样本的HRM分型及测序检测结果见表2。

表2血液样本的HRM分型及测序检测结果

精液样本的HRM分型及测序检测结果见表3。

表3精液样本的HRM分型及测序检测结果

三对引物利用不对称PCR对奶牛脊椎畸形综合征、白细胞粘附缺陷病和尿苷酸合酶缺乏症进行检测，PCR反应程序为：

95℃5min，95℃10s，64℃20s，72℃25s，8个循环，每个循环降低0.5℃。

非标记探针HRM分析条件为：

95℃10s，60℃15s，72℃25s，32个循环；

初始熔解温度50℃升温溶解至90℃，以0.03℃/s的熔解速率实时检测荧光信号，通过HRM分析软件获得溶解曲线及Tm值。

综上所述，本发明提供的检测方法主要应用于奶牛冻精、血液、毛发和乳液的筛查，先采用三对引物对样品进行扩增，再对扩增产物进行检测，可以同时对奶牛的脊椎畸形综合征、白细胞粘附缺陷病、尿苷酸合酶缺乏症这三种隐性遗传缺陷病的基因突变位点进行检测，经验证，其检测结果与测序法结果一致。

第六部分、其他

本发明提供的试剂盒以及检测方法与已有检测技术相比，具有如下一些优势：

1、灵敏、特异

本发明提供的检测方法结合了PCR技术、荧光定量技术的优势，利用PCR产物依赖于序列的熔解温度而对PCR产物进行基因分型及鉴定；同时，由于探针片段较小，会在温度较低时解链，所以本发明采用非标记探针HRM法，可以放大不同基因型Tm的差异，避免假阳性结果，可以在很大程度上提高HRM检测的灵敏度。

2、简单、高效

采用本发明提供的试剂盒以及检测方法对样品进行检测时，无需特殊仪器设备，只要具有带HRM模块的荧光定量PCR仪即可完成测试，并且具有分析时间短、高通量的优势，在1小时内即可完成对96孔板的检测。

3、稳定、准确

从PCR到检测荧光信号，整个过程在同一个管中闭管进行，最大程度的避免了污染，受环境影响小，使结果稳定。

经验证，采用本发明提供的试剂盒以及检测方法对样品进行检测时，检测结果随机抽样与测序法检测结果一致，结果准确可靠。

需要说明的是，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。

Claims (3)

1.一种用于检测奶牛脊椎畸形综合征、白细胞粘附缺陷病、尿苷酸合酶缺乏症这三种隐性遗传缺陷病的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含：

第一对引物由序列表中SEQ NO.1和SEQ NO.2所示的寡核苷酸序列组成；

第二对引物由序列表中SEQ NO.3和SEQ NO.4所示的寡核苷酸序列组成；

第三对引物由序列表中SEQ NO.5和SEQ NO.6所示的寡核苷酸序列组成；

序列表中SEQ NO.7、SEQ NO.8和SEQ NO.9所示的三条非标记探针；

含有奶牛脊椎畸形综合征、白细胞粘附缺陷病和尿苷酸合酶缺乏症突变位点的标准质粒；

耐高温的聚合酶；

以及，反应缓冲液。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，每对引物的上游引物与下游引物的浓度比为1:10。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，扩增反应的体系以10μL计，标准质粒的用量为2μL。

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