CN102465123B - 一种核酸探针、含有该核酸探针的组合物及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子生物学领域，涉及一种核酸探针、含有该核酸探针的组合物及其用途。具体而言，涉及一种用于检测8号染色体数目的核酸探针；该核酸探针的核苷酸序列可以为SEQ ID NO：1或者其互补序列或者其具有序列同一性的变体。本发明还涉及用于检测8号染色体数目的检测剂、用于检测8号染色体数目的试剂盒、一种原位杂交方法、一种检测8号染色体数目的方法、所述核酸探针在制备检测8号染色体数目的试剂中的用途、以及所述核酸探针在制备检测8号染色体数目异常相关疾病的试剂或辅助试剂中的用途。本发明的核酸探针信号强度高，并且特异性高。

Description

一种核酸探针、含有该核酸探针的组合物及其用途

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及一种核酸探针，具体地，涉及一种用于检测8号染色体数目的核酸探针。本发明还涉及含有该核酸探针的组合物、用于检测8号染色体数目的检测剂、用于检测8号染色体数目的试剂盒、一种原位杂交方法、一种检测8号染色体数目的方法、所述核酸探针在制备检测8号染色体数目的试剂中的用途、以及所述核酸探针在制备检测8号染色体数目异常相关疾病的试剂或辅助试剂中的用途。

背景技术

研究发现，很多疾病都伴有8号染色体的数目异常，例如骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndromes，MDS)以及癌症如急性白血病(acute leukemia，AL)、卵巢癌(ovarian carcinoma)、和前列腺癌(prostatic adenocarcinoma)等(FRANCESC SOLEA，etal.Incidence，characterization and prognostic significance ofchromosomal abnormalities in 640 patients with primarymyelodysplastic syndromes.British Journal of Haematology，2000，108，346-356；刘琼等，伴复杂核型异常的髓系恶性血液病8号染色体异常分析，中国实验血液学杂志200816(5)：993-996；姬宏飞等，应用着丝粒探针检测40例卵巢癌患者8号染色体数目的异常增多，国际遗传学杂志，Dec 15，2007，Vol 30，No.6；以及曾碹等，前列腺癌8号染色体改变与Gleason评分之间的相关性，中华病理学杂志，September 2006，Vol 35，No.9)。

目前用于检测8号染色体数目是否异常的方法有核型分析和荧光原位杂交(FISH)等。核型分析的结果较为准确，但是对操作人员的经验要求较高。因此，最好方法是荧光原位杂交，而8号染色体特异的着丝粒探针是该检测成败的关键。目前已有相关的检测8号染色体的探针(Heinz-Ulrich G.Weier，Hans-Dieter Kleine，and Joe W.Gray.Labeling of the centromeric region on human chromosome 8 by insitu hybridization[J].Hum Genet(1991)87：489-494.)，但是该探针实际上是包含多个序列的混合物，信号特异性并不理想。

发明内容

本发明人经过大量的实验和不懈的努力，发现了一种信号强度高并且特异性高的核酸探针，可以有效地检测人的8号染色体的数目，并且判读8号染色体的数目是否异常。由此提供了下述发明：

本发明的一个方面涉及一种核酸探针，其带有可检测的标记，所述核酸探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

GCTGCAGATCACAAAGAAGTTTCTGAGAATGCTGCTGTCTAATTTTTACATGTAAGCCCGTTTCCAACGAAATCCTCAAAGCTATCCAAATATCCGCATGCAGAATCTTCAAAAAGAGTGTTCCAGAAGTACTGCATGAAACGAAAGGTTCAAGTCCGTTTGTTGAGGACACACATCACAAATAAGTTTCTCAGAATGCTTCTGTCTTGTTTTCATTGGAAGATATTTCCTTTTTCACCATAGTTCAGAAAGCGCTCCAAATGTCCACTTCCAGATACTACAATAGGAGTGTTTCCAACCTGCTCTATGAAACGGAAGGTTCAACTCTGTGAGTTAAGCTTC(SEQ IDNO：1)

本发明还涉及一种核酸探针，其核苷酸序列与上述的核酸探针的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)互补，或者其核苷酸序列为选自如下的变体：

1)在高等严紧条件下与上述的核酸探针的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)杂交的核苷酸序列，

2)对上述的核酸探针的核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列，和

3)与上述的核酸探针的核苷酸序列具有至少90％的序列同一性的核苷酸序列。

典型地，“杂交条件”根据测量杂交时所用条件的“严紧性”程度来分类。严紧性程度可以以例如核酸结合复合物或探针的解链温度(Tm)为依据。例如，“最大严紧性”典型地发生在约Tm-5℃(低于探针Tm 5℃)；“高等严紧性”发生在Tm以下约5-10℃；“中等严紧性”发生在探针Tm以下约10-20℃；“低严紧性”发生在Tm以下约20-25℃。作为替代，或者进一步地，杂交条件可以以杂交的盐或离子强度条件和/或一或多次的严紧性洗涤为依据。例如，6×SSC＝极低严紧性；3×S SC＝低至中等严紧性；1×SSC＝中等严紧性；0.5×SSC＝高等严紧性。从功能上说，可以采用最大严紧性条件确定与杂交探针严紧同一或近严紧同一的核酸序列；而采用高等严紧性条件确定与该探针有约80％或更多序列同一性的核酸序列。

对于要求高选择性的应用，典型地期望采用相对严紧的条件来形成杂交体，例如，选择相对低的盐和/或高温度条件。Sambrook等(Sambrook，J.等(1989)分子克隆，实验室手册，Cold Spring HarborPress，Plainview，N.Y.)提供了包括中等严紧性和高等严紧性在内的杂交条件。

为便于说明，用于检测本发明的多核苷酸与其它多核苷酸杂交的合适的中度严紧条件包括：用5SSC、0.5％SDS、1.0mM EDTA(pH8.0)溶液预洗；在50-65℃下在5SSC中杂交过夜；随后用含0.1％SDS的2×、0.5×和0.2×SSC在65℃下各洗涤两次20分钟。本领域技术人员应当理解，能容易地操作杂交严紧性，如改变杂交溶液的含盐量和/或杂交温度。例如，在另一个实施方案中，合适的高度严紧杂交条件包括上述条件，不同之处在于杂交温度升高到例如60-65℃或65-70℃。

在本发明中，所述对SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列，是指分别或同时在所述核苷酸序列的5’端和/或3’端，和/或序列内部进行例如不超过2-45个，或者不超过2-30个，或者不超过3-20个，或者不超过4-15个，或者不超过5-10个，或者不超过6-8个的分别用逐个连续整数表示的碱基的取代、缺失、添加修饰。

通过一种多核苷酸进行说明，其所具有的核苷酸序列例如与SEQID NO：1的参考核苷酸序列至少具95％的“同一性”是指：在SEQ IDNO：1的参考核苷酸序列之每100个核苷酸中，该多核苷酸的核苷酸序列除了含有多达5个核苷酸的不同外，该多核苷酸之核苷酸序列与参考序列相同。换句话说，为了获得核苷酸序列与参考核苷酸序列至少95％相同的多核苷酸，参考序列中多达5％的核苷酸可被删除或被另一核苷酸替代；或可将一些核苷酸插入参考序列中，其中插入的核苷酸可多达参考序列之总核苷酸的5％；或在一些核苷酸中，存在删除、插入和替换的组合，其中所述核苷酸多达参考序列之总核苷酸的5％。参考序列的这些突变可发生在参考核苷酸序列的5’或3’末端位置，或在这些末端位置之间的任意地方，它们或单独散在于参考序列的核苷酸中，或以一个或多个邻近的组存在于参考序列中。

在本发明中，用于确定序列同一性和序列相似性百分数的算法是例如BLAST和BLAST 2.0算法，它们分别描述在Altschul等(1977)Nucl.Acid.Res.25：3389-3402和Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403-410。采用例如文献中所述或者默认参数，BLAST和BLAST 2.0可以用于确定本发明的核苷酸序列同一性百分数。执行BLAST分析的软件可以通过国立生物技术信息中心(NCBI)为公众所获得。

在本发明中，所述与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列具有至少90％的序列同一性的核苷酸序列包括与SEQ ID NO：1所公开序列基本同一的多核苷酸序列，例如当采用本文所述方法(例如采用标准参数的BLAST分析)时，与本发明多核苷酸序列相比含有至少90％序列同一性、优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的序列同一性的那些序列。

本发明人经过比对，发现8号染色体中存在与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列具有高度序列同一性的序列，其高达95％、96％、97％、98％或99％。另外，由于人的个体之间的差异，不同个体之间的8号染色体中也存在与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列具有一个和几个碱基差异的情况，但是与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列具有高度序列同一性的序列，其高达95％、96％、97％、98％或99％。因此，这些序列也可以作为本发明的核酸探针的序列。

本发明的核酸探针的核苷酸序列可以人工方法合成(化学合成DNA)，也可以设计特异性引物通过PCR扩增的方法制备，例如可以参考实施例1中的方法制备。

本发明的核酸探针带有可检测的标记，具体地，为荧光标记，包括但不限于，例如四甲基罗丹明(Tetramthylrhodamine-5-dUTP)、异硫氰酸(FITC)、DEAC、TAMRA、Cy3，等等。所述标记可以根据现有技术进行，例如采用切口平移法、随机引物法等。

本发明的另一方面涉及一种组合物，其含有本发明的核酸探针。

本发明的还一方面涉及一种用于检测8号染色体数目的检测剂，其含有本发明的核酸探针。

本发明的还一方面涉及一种用于检测8号染色体数目的试剂盒，其含有本发明的核酸探针。具体地，所述试剂盒以10人份计，包括如下组分：

核酸探针                 7μl

Human cot-1DNA           5μl

鲑鱼精DNA                2μl

TE工作液                 6μl

。其中，核酸探针的浓度可以是0.1μg/μl。

本发明的还一方面涉及一种原位杂交方法，包括使用本发明的核酸探针的步骤；具体地，所述原位杂交为荧光原位杂交(FISH)。

本发明的还一方面涉及一种检测8号染色体数目的方法，包括使用本发明的核酸探针的步骤。例如使用荧光原位杂交。本发明的探针的序列位于8号染色体的着丝粒区域，因此，根据观察到单个细胞中的信号的数目，即为8号染色体的数目。如果信号数目是2，8号染色体数目正常；否则判断为异常。所述信号为可检测的标记产生的信号，包括但不限于荧光信号。

本发明的还一方面涉及本发明的核酸探针在制备检测8号染色体数目的试剂中的用途。

本发明的还一方面涉及本发明的核酸探针在制备检测8号染色体数目异常相关疾病的试剂或辅助试剂中的用途；具体地，所述8号染色体数目异常相关疾病为癌症或骨髓增生异常综合征；更具体地，所述癌症为急性白血病、卵巢癌、或前列腺癌。

由于上述病症的发生通常伴随着8号染色体数目的异常(FRANCESC SOLEA，et al.Incidence，characterization andprognostic significance of chromosomal abnormalities in 640patients with primary myelodysplastic syndromes.BritishJournal of Haematology，2000，108，346-356；刘琼等，伴复杂核型异常的髓系恶性血液病8号染色体异常分析，中国实验血液学杂志200816(5)：993-996；姬宏飞等，应用着丝粒探针检测40例卵巢癌患者8号染色体数目的异常增多，国际遗传学杂志，Dec 15，2007，Vol30，No.6；以及曾碹等，前列腺癌8号染色体改变与Gleason评分之间的相关性，中华病理学杂志，September 2006，Vol 35，No.9)，因此，本发明的核酸探针可以用于制备检测癌症的辅助试剂。

在本发明中，所述8号染色体为人的8号染色体。

发明的有益效果

本发明的核酸探针信号强度高，并且特异性高。

附图说明

图1：DOP-PCR扩增8号染色体产物的凝胶电泳图(两个平行的样品)。

图2：PCR扩增8号染色体α-卫星DNA产物的凝胶电泳图(两个平行的样品)。

图3：TA克隆菌落的PCR产物的凝胶电泳图(5个平行的样品)。

图4：阳性克隆标记探针的凝胶电泳图(4个平行的样品)。

图5：实施例1制备的核酸探针1进行FISH检测正常人外周血培养的淋巴细胞样本的结果(10×100)。

图6：对照探针1进行FISH检测正常人外周血培养的淋巴细胞样本的结果(10×100)。

图7：对照探针2进行FISH检测正常人外周血培养的淋巴细胞样本的结果(10×100)。

图8：实施例1制备的核酸探针1进行FISH检测骨髓增生异常综合征患者骨髓样本的结果(8号染色体数目异常)(10×100)，其中CSP8表示实施例1制备的探针或者该探针的信号。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：本发明核酸探针样品1的制备

试剂和材料：

TaKaRa Taq^TM Hot Start Version，DNase I，DNA polymerase I均购自大连TaKaRa公司；FITC-dUTP购自Roche；Human Cot-1DNA购自Invitrogen；QIAprep Spin Miniprep Kit购自QIAGEN。

实验方法：

1.探针序列的获得

1)DOP-PCR扩增8号染色体DNA

以正常人的8号染色体DNA(显微切割)为模板，DOP-PCR扩增8号染色体DNA，所用简并引物的序列如下：

5-CCGACTCGAGNNNNNNATGTGG-3(SEQ ID NO：2)(TaKaRa公司合成)，其中N表示随机地选自ATCG四种碱基。

反应体系如下：

H₂O                           30.5μl

PCR Buffer                    5μl

Mg2⁺                          4μl

dNTP-mix                      4μl

简并引物                      4μl

模板DNA                       2μl

Taq Hot Start(TaKaRa)         0.5μl

总体积                        50μl

反应条件如下：

预变性                        96℃3′00″

变性                          94℃1′00″

退火                          30℃1′30″

                              以14℃/min的速度升温至

延伸

                              72℃延伸2′00″

以上程序运行10个循环

变性                          94℃1′00″

退火                          56℃1′00″

延伸                          72℃2′00″

以上程序运行20个循环

最后延伸                      72℃5′00″

也可以参考，例如Fiegler H，et al.DNA microarrays forcomparative genomic hybridization based on DOP-PCRamplification of BAC and PAC clones.Genes ChromosomesCancer.2003Apr；36(4)：361-74。

DOP-PCR结束后取2μl产物，用1％琼脂糖胶电泳检测，检测结果如图1所示，片段大小在2000bp-100bp之间。

2)PCR扩增8号染色体着丝粒α-卫星DNA

以步骤1)中的DOP-PCR扩增产物为模板，PCR扩增8号染色体着丝粒α-卫星DNA，做两个平行，所用引物为特异性引物，如下：

primer1：5-GAAGCTTAACTCACAGAGTTGAA-3(SEQ ID NO：3)(TaKaRa公司合成)，以及

primer2：5-GCTGCAGATCCCAAAGAAGTTTC-3(SEQ ID NO：4)(TaKaRa公司合成)

反应体系如下：

H₂O                       31.5μl

PCR Buffer                5μl

Mg2⁺                      3μl

dNTP-mix                  4μl

primerl                   2μl

primer2                   2μl

模板DNA                   2μl

Taq Hot Start(TaKaRa)     0.5μl

总体积                    50μl

反应条件如下：

预变性                    96℃3′00″

变性                      94℃1′00″

退火                      45℃1′00″

延伸                      72℃2′00″

以上程序运行30个循环

最后延伸                  72℃7′00″

也可以参考，例如，Heinz-Ulrich G.Weier，et al.Labeling ofthe centromeric region on human chromosome 8 by in situhybridization.Hum Genet(1991)87：489-494。

PCR结束后取2μl产物，用1％琼脂糖胶电泳检测，结果如图2所示，产物主要是α-卫星DNA的单拷贝(171bp)和双拷贝(342bp)，本发明人选择双拷贝做为探针序列。

3)8号染色体着丝粒α-卫星DNA构建TA克隆

回收步骤2)中PCR产物中的电泳大约为342bp的片段，插入20-T Vector(TaKaRa)中，并转化入E.coli Competent CellsJM109(TaKaRa)中，蓝白斑筛选阳性克隆，选取5个白色菌落PCR鉴定阳性克隆，反应体系如下：

H₂O                       15.6μl

PCR Buffer                2.5μl

Mg2⁺                      1.5μl

dNTP-mix                  2μl

primerl                   1μl

primer2                   1μl

菌落                      1μl

Taq Hot Start(TaKaRa)     0.4μl

总体积                    25μl

反应条件如下：

预变性                    96℃3′00″

变性                      94℃1′00″

退火                      45℃1′00″

延伸                      72℃2′00″

以上程序运行30个循环

最后延伸                  72℃7′00″

PCR结束后取2μl产物，用1％琼脂糖胶电泳检测，结果如图3所示，产物主要是α-卫星DNA的双拷贝，说明载体构建成功。并且经测序证明，核酸探针的序列与SEQ ID NO：1完全一致。

4)筛选阳性克隆并切口平移直标法进行探针标记

筛选的阳性克隆进一步培养提取质粒DNA，并用切口平移直标法进行探针标记，成品探针的制备包括了探针标记、探针纯化、探针混合三个步骤。例如，可以参考《荧光原位杂交技术》，Barbara Beatty等著，王瑛主译，天津科技翻译出版公司，2003，也可以参考下面的步骤：

2.探针标记

1)从冰箱中取出10×buffer、dNTP工作液、DNA、荧光素工作液置于冰盒上待用。

2)DNase I工作液的配制：现配现用。用ddH2O稀释DNase I 1000倍待用，注意要在冰盒上操作，以防DNase I失活。

3)向每个1.5ml EP管中依次加入以下试剂(冰盒中操作、避光)：

标记体系如下：

标记反应体系组成用量

10×buffer                20μl

dNTP工作液                20μl

阳性克隆DNA               4μg

DNase I工作液(1∶1000)    10μl

DNA Poly I                40U

FITC工作液                8μl

dd H₂O                    补足至200μl

Total                     200μl

充分混匀、离心，置于生化培养箱中的VSN-5摇床上，打开摇床，转速调至3档，培养温度为15±1℃，反应2小时。2小时后拿出EP管，加入8μl EDTA工作液终止反应，混匀。

4)阳性克隆质粒切口平移直标法进行探针标记，做了4个平行，标记产物电泳结果如图(图4)，片段大小在1000bp-250bp之间。

3.探针纯化

用NucleoSpin Extract II试剂盒(MN)纯化，纯化方法如下：

1)探针混合：标记探针取600μl体系纯化。

2)在混合好的探针中加入2倍体积NT和ddH2O混合液(NT∶ddH2O＝1∶3)，充分混匀。

3)将样品转移入纯化柱中，11000g离心1min，弃废液。

4)在纯化柱中加入600μl的NT3(乙醇稀释后的)，11000g离心1min，弃废液。

5)11000g继续空转2min，除去管壁上剩余的液体及纯化柱中剩余的酒精。

6)室温敞口放置5min，进一步使残留的酒精挥发。

7)将纯化柱置于新的1.5mLEP管中，探针加入100μlNE，11000g离心1min。

由此制得核酸探针样品1。

实施例2：含有核酸探针样品1的检测剂1的制备

按照下面的比例(以10人份为例)配制探针混和液，即得到检测剂1，其含有实施例1制备的核酸探针样品1。

检测剂1各组分        各组分体积

核酸探针样品         17μl

Human cot-1DNA       5μl

鲑鱼精DNA            2μl

TE工作液             6μl

合计                 20μl(10人份)

核酸探针样品1的浓度并不特别限定，例如为0.1μg/μl。

尽管上面按照10人份对各组分的体积给出了具体的数值，但是本领域技术人员可以理解，各组分的体积主要满足上面的比例就可以。也可以照此配制1人份、多人份的检测剂。

为了实验操作的简便和表述的简洁清楚，下面的实施例5和实施例7中，如果没有特别说明，所用探针均为按照实施例2制得的检测剂1。

实施例3：对照探针1和对照探针2的制备

按照与实施例1中类似的方法制备对照探针1，除了在探针序列的获得的步骤2)中，选用α-卫星DNA的单拷贝(171bp)为探针序列。

按照背景技术中的文献中的方法制备对照探针2(实际上是多种序列的混合物)。

实施例4：正常人外周血培养的淋巴细胞样本的制备

1.试剂：

秋水仙碱、培养基、低渗液、冰醋酸、100％乙醇。

2.实验操作

(1)将72小时内采集的人外周血，用注射针直接穿过培养瓶的橡胶塞，向培养基中注入30-40滴，轻摇匀后置37℃恒温箱培养；

(2)培养：时间为70±2小时。培养期间，定期轻摇匀，使细胞充分接触培养基；

(3)终止培养前2-4小时，在培养液中加入秋水仙碱(用5ml注射器加四滴，使终浓度为0.07-0.08μg/ml)；

(4)将培养物完全转入清洁的离心管中，以1000rpm离心8分钟，弃上清液；

(5)向刻度离心管中加入预温的37℃的低渗液5ml，用滴管混匀，置37℃恒温水浴中低渗30分钟。温度计需要定期校正；

(6)低渗后加入1毫升固定液，轻轻混匀后1000rpm离心8分钟；

(7)弃上清，加入4ml固定液，轻轻混匀，在4℃冰箱静置20分钟，1000rpm离心8分钟，弃上清液；

(8)重复步骤(7)一遍；

(9)弃上清液后，视细胞数量多少加入适量固定液制成细胞(正常人外周血培养的淋巴细胞)悬液；

(10)吸取细胞悬液自70-80cm高滴在一张干燥清洁的载波片上，吹干；

(11)低倍镜下寻找分散良好，染色适中的分裂相，油镜下观察染色体形态；

(12)56℃烤片半小时，室温下放置2天。-20℃保存备用；

如此制得正常人外周血培养的淋巴细胞样本。

实施例5：使用检测剂1进行荧光原位杂交检测正常人外周血培养的淋巴细胞样本

使用实施例2中制备的检测剂1和实施例4制备的正常人外周血培养的淋巴细胞样本进行荧光原位杂交(FISH)。

步骤包括：变性杂交、玻片洗涤、复染三个步骤。其中变性杂交有甲酰胺变性杂交和杂交仪变性杂交两种方法。前者是样本和探针分别变性，后者是用杂交仪对样本和探针进行共变性，减少了人为因素的影响。具体地，可以参考下面的步骤：

一、标本准备及变性

注意：使用前将盛有变性液的容器置于73℃±1℃水浴箱中约30分钟，使溶液达到所需温度。

1.将玻片在73℃±1℃的变性液中浸泡5分钟。注意：考普林瓶中最多可同时浸入4张玻片。

2.将玻片依次置于预冷的70％乙醇、85％乙醇和100％乙醇中各3分钟进行梯度脱水。玻片自然干燥后，可置于45-50℃烤片机上预热2-5分钟后与探针杂交。若以下探针混合物尚未完成变性，玻片可置于45-50℃烤片机上较长时间预热。

二、检测剂1准备及变性

1.室温下将如下液体加入到微量离心管中：

名称          体积(μl)

杂交缓冲液    7.0

去离子水      1.0

检测剂        12.0

∑            10.0

2.离心1-3秒。

3.涡旋混匀后再次短暂离心。

4.将装有以上探针混合物的试管置于73±1℃水浴箱中变性5分钟之后，将该试管置于45-50℃水浴箱中，杂交前取出。

三、探针与样本杂交

1.将10μl变性后的探针混合物滴于玻片杂交区域，立即加盖盖玻片，用橡皮胶封边。

2.避免盖玻片与玻片之间产生气泡。

3.将玻片置于预热的湿盒中，42℃保温箱中过夜杂交。

注意：将浸湿的纸巾置于密封容器中，制备湿盒。

*使用杂交仪变性杂交(可选择方法)

(1)探针配制。室温下将如下液体加入到微量离心管中。

名称          体积(μl)

杂交缓冲液    7.0

去离子水      1.0

检测剂        12.0

∑            10.0

(2)离心1-3秒，涡旋混匀后再次短暂离心。

(3)将10μl探针混合物滴直接加到经过预处理玻片的杂交区域，立即加盖盖玻片，用橡皮胶封边。

(4)准备杂交仪器，共变性条件：83℃-85℃，5分钟，杂交条件：42℃，16小时。

特别说明：42℃过夜杂交可在杂交仪中进行，也可在共变性之后将玻片置于湿盒中，于42℃恒温孵箱中过夜杂交。

注意：将浸湿的纱布置于密封容器中，制备湿盒。

四、玻片洗涤

杂交后洗涤包括一系列不同浓度、不同温度的盐溶液的漂洗，由于有非特异性的探针片段的结合会增强背景，需要通过杂交后洗涤降低背景。杂交后洗涤有慢洗和快洗两种方法，前者用时大约50分钟，后者约5分钟。

1.慢速洗涤方案：

试剂：50％甲酰胺/2XSSC(3瓶)，2XSSC，0.1％NP-40/2XSSC，70％乙醇。

洗涤步骤：

注：使用前将除70％乙醇外的溶液置于46±1℃水浴箱中至少30分钟，使溶液达到所需温度。

(1)移去盖玻片，立即将玻片置于3瓶50％甲酰胺/2X SSC溶液中各漂洗10分钟，振荡1-3秒；将玻片置于2XSSC中，漂洗10分钟，振荡1-3秒；

(2)将玻片置于0.1％NP-40/2XSSC中，漂洗5分钟，振荡1-3秒；

(3)将玻片室温浸泡在70％乙醇中，漂洗3分钟。

2.快速洗涤方案：

试剂：0.3％NP-40/0.4×SSC，0.1％NP-40/2×SSC，70％乙醇。

洗涤程序：

(1)移去盖玻片，将玻片置于0.3％NP-40/0.4×SSC溶液中，振荡1-3秒，漂洗2分钟；

(2)特别说明：快速洗涤方案中0.3％NP-40/0.4×SSC洗涤液的温度和时间需要根据样本差异进行调节，73±1℃使推荐的使用温度。

(3)室温下将玻片置于0.1％NP-40/2×SSC洗涤液中，振荡1-3秒，漂洗30秒；

(4)室温下将玻片置于70％乙醇中，漂洗3分钟。

(五)检测

(1)暗处自然干燥玻片。

(2)将15μl DAPI复染剂滴加于杂交区域位置，立即盖上盖玻片。暗处放置10-20分钟后，在荧光显微镜下选用合适的滤光片组观察玻片。

五.实验结果

结果如图5所示。

结果显示：单个间期细胞中可以观测到2个绿色信号，单个中期分裂相中可以看到2个8号染色体着丝粒显示绿色信号。

结果说明：样本的8号染色体数目正常。结果显示信号强并且没有交叉，因此该探针的信号强度和特异性都很好。

实施例6：使用对照探针1进行荧光原位杂交

实验操作步骤与实施例5中类似，除了所用探针为实施例3中制备的对照探针1。

结果如图6所示。

结果显示：肉眼观察不到绿色信号。

结果说明：肉眼观察不到绿色信号，因此该探针无法使用。

实施例7：使用对照探针2进行荧光原位杂交

实验操作步骤与实施例5中类似，除了所用探针为实施例3中制备的对照探针2。

结果如图7所示。

结果显示：单个间期细胞中可以观测到2个绿色主信号以及多个特异性交叉的较弱的绿色信号，单个中期分裂相中可以看到2个8号染色体着丝粒显示绿色信号，但其他染色体着丝粒区可有较弱的绿色信号。

结果说明：样本的8号染色体数目正常。结果显示主信号强，但有轻微的特异性交叉。

实施例8：使用检测剂1进行荧光原位杂交检测骨髓增生异常综合征患者骨髓样本

使用实施例2制备的检测剂1，实验操作步骤与实施例5中类似，除了所用样本为骨髓增生异常综合征患者骨髓样本(北大人民医院提供)，并且该样本处理不需要细胞培养做中期染色体。所用样本实验前已经通过核型分析，确认其8号染色体为3体。

结果如图8所示。

结果显示：单个间期细胞中可以观测到3个绿色信号。

注：由于实验中同时加有含有检测其它染色体的探针，所以还有2各红色的信号，不影响本实施例的结果。

结果说明：样本的8号染色体数目异常，出现8号染色体3体。与核型分析的结果一致。并且结果显示信号强并且没有交叉，因此该探针的信号强度和特异性都很好。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims (8)

1.一种核酸探针，其带有可检测的标记，其特征在于，所述核酸探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，或者其核苷酸序列与SEQ IDNO：1所示的核苷酸序列互补。

2.一种组合物，其含有权利要求1所述的核酸探针。

3.一种用于检测8号染色体数目的检测剂，其含有权利要求1所述的核酸探针。

4.一种用于检测8号染色体数目的试剂盒，其含有权利要求1所述的核酸探针。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，以10人份计，包括如下组分：

6.权利要求1所述的核酸探针在制备检测8号染色体数目的试剂中的用途。

7.权利要求1所述的核酸探针在制备检测8号染色体数目异常相关疾病的试剂或辅助试剂中的用途，其中，所述8号染色体数目异常相关疾病为癌症或骨髓增生异常综合征。

8.根据权利要求7所述的用途，其中，所述癌症为急性白血病、卵巢癌、或前列腺癌。

Images