CN108967180A - 一种不育系突变体获取方法 - Google Patents

Abstract

本申请公开了一种不育系突变体获取方法，利用现有的突变体，与其它品种进行杂交，以不育基因作为标记，进行后代的筛选，后代同时进行回交。每次回交均经过所述不育基因的检测。本发明方法解决了以往获取育性突变体时，创制周期长，无法批量的，同时获得多个不同品种类型的突变体的限制。本发明法简单，易操作，避免了EMS诱变的不确定性，也省去了基因编辑过程的繁琐，而且可以同时对多个水稻品种进行回交转育，极大的提高的育性突变体的获取效率，有利于第三代智能不育系的创制，加速第三代杂交水稻育种的应用。

Description

一种不育系突变体获取方法

技术领域

本发明涉及生物工程分子遗传育种技术领域，特别涉及一种不育系突变体获取方法。

背景技术

稻米是中国一半以上人口的主食，因此水稻的稳产性、丰产性高低严重影响着我国的粮食供给安全。随着杂交水稻的大面积推广，为保障我国粮食供给安全，保证稻谷总产量不变或进一步提高，做出了巨大贡献。

中国的第一代杂交水稻是以细胞质雄性不育系为遗传工具的三系法杂交水稻；第二代杂交水稻是以光温敏雄性不育系为遗传工具的两系法杂交水稻；而目前，中国杂交水稻的研究已进入第三代的研究，即以遗传工程雄性不育系为遗传工具的杂交水稻.第一代杂交水稻即三系法杂交水稻是杂交水稻育种的经典方法，其不育性表现较为稳定，但其育性受恢复系和保持系关系的制约，筛选到优良组合的几率较低；第二代杂交水稻即两系法杂交水稻，它在配组方面自由度较高，几乎大部分常规水稻品种都能恢复其育性，但其育性受环境影响较大，而天气因素非人力所能控制，若遇到极端天气如异常低温或异常高温都会使研究结果失败。

第三代杂交水稻技术是将传统育种方法与现代生物技术的成功结合，这将提高水稻雄性隐性核不育基因的利用率。该技术中的智能不育源可将优良常规稻、“三系”以及“两系”的不育系(或父本)快速改造成智能不育系。智能不育系配组自由，杂交制种安全。

“第三代杂交技术”和常规转基因育种、常规杂交育种相比，智能不育系不育性较稳定，遗传背景和环境因素对其影响较小，其克服了两系不育系因高温诱导花粉可育以及两系核不育系因低温诱导可育的育性不稳定而造成的安全风险。

此外，该不育系不育性状遗传行为简单，且不受遗传背景影响，便于开展优良性状的聚合育种，从而快速选育出优质、高产、多抗且适于各种生态条件的杂交组合，扩大杂交水稻的适应区域；第三，由于育性恢复基因与花粉败育基因在转基因过程中紧密连锁，从而阻断了转基因成分通过花粉方式漂移，进而实现利用转基因手段生产非转基因的不育系种子和杂交稻种子。

目前，第三代智能不育系的创制大多是利用基因工程的方法实现的，其主要技术流程如下：首先利用EMS诱变或者基因编辑等技术获得一个育性突变体，然后将含有育性恢复基因在内的一个外源三连锁基因导入突变体后即可得到第三代智能不育系。在实际操作中我们发现，能否获得育性突变体是基因工程创制第三代智能不育系的最大制约因素，EMS诱变和基因编辑在创制育性突变体时均存在不足，比如利用EMS诱导时，不同的水稻品种，其诱导剂量可能不同，在诱导后筛选时，往往需要多代筛选才能获得一个稳定的不育突变体，基因编辑获得育性突变体时也存在类似的问题。

现有技术并不能克服育性突变体创制过程中存在的种种问题，这些缺陷会拉长第三代智能不育系的创制周期，从而影响第三代杂交水稻育种进程。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于，提供了一种本发明旨在克服现有不足，提供的一种水稻雄性不育突变体的获取方法。为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为；

为解决上述技术问题，本发明提供了一种不育系突变体获取方法，利用现有的突变体，与其它品种进行杂交，以不育基因作为标记，进行后代的筛选，后代同时进行回交。

每次回交均经过所述不育基因的检测。

为解决上述技术问题，本发明又提供了一种不育系突变体获取方法，包括以下步骤：使用一个或多个EAT1基因突变的普通核不育系水稻材料为母本，待改造品系为父本进行杂交获得F1代，然后以待改造品系为轮回亲本进行回交转育，每一个回交世代均选择含有EAT1突变基因的个体作为下一代亲本，回交2-6代。

每一个回交世代均选择含有EAT1突变基因的个体作为下一代亲本，且前述作为下一代亲本的个体为在遗传背景及田间表现都偏向轮回亲本的单株。

本发明有益效果包括：本发明方法解决了以往获取育性突变体时，创制周期长，无法批量的，同时获得多个不同品种类型的突变体的限制。本发明法简单，易操作，避免了EMS诱变的不确定性，也省去了基因编辑过程的繁琐，而且可以同时对多个水稻品种进行回交转育，极大的提高的育性突变体的获取效率，有利于第三代智能不育系的创制，加速第三代杂交水稻育种的应用。

具体实施方式

下面结合实施例详述本发明。为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明，但本发明并不局限于这些实施例。

在本发明一实施例中，本发明不育系突变体获取方法为：利用现有的突变体，与其他品种进行杂交，以不育基因作为标记，进行后代的筛选，后代同时进行回交实验，每次回交均经过不育基因的检测。

在本发明一实施例中，本发明不育系突变体获取方法为：使用一个EAT1基因突变的普通核不育系水稻材料为母本，待改造的品系为父本进行杂交获得F1代，然后以待改良材料为轮回亲本进行回交转育，每一个回交世代均选择含有EAT1突变基因，且在遗传背景及田间表现都偏向轮回亲本的单株进行回交转育，通常回交2-4代就能将普通常规稻品系改造成EAT基因突变的雄性不育系。

本发明原理如下：

水稻EAT1基因是bHLH转录因子中的一员。bHLH(basic Helix-Loop-Helix，碱性螺旋-环-螺旋)转录因子构成了真核生物蛋白质中的一个大家族，其成员在生物的生长发育调控过程中起着极为重要的作用，它们参与调控神经元发生、肌细胞生成、血细胞生成、性别决定和肠组织发育等。bHLH转录因子的名称来自其结构中的bHLH基序。bHLH基序约含60个氨基酸，由一个能与DNA结合的碱性区域(Basic region)和α螺旋1-环-α螺旋2(Helix 1-Loop-Helix 2)组成，其中环的长度在不同bHLH蛋白中会有差异。

bHLH转录因子大部分参与花药绒毡层的发育或小孢子发育。花药绒毡层对花粉的生长发育至关重要，绒毡层分泌的胼胝质酶能够适时地分解花粉母细胞和四分体的胼胝质壁，以保证小孢子彼此分离。而水稻EAT1基因突变后会导致绒毡层细胞不能及时降解，程序性死亡延迟，从而绒毡层分泌的胼胝质酶影响到小孢子的发育和分离，最终表现为不育。且这种育性的变化是有EAT1基因单基因控制的，因此，利用回交转育的方式将不育基因转入待改造的水稻品系即可获得新的育性突变体。

实施例1：稻花香不育突变体的获得

我们以EAT1突变雄性不育系武运粳7号为供体亲本，稻花香为受体亲本，通过1次杂交，2次回交，辅以表型筛选，在一年时间内，只花费了少量的人力成本即获得了稻花香雄性不育突变体。田间鉴定，雄性不育率高达99.5％以上。

实施例2：日本晴不育突变体的获得

我们以EAT1突变雄性不育系武运粳7号为供体亲本，日本晴为受体亲本，通过1次杂交，2次回交，辅以表型筛选，在一年时间内，只花费了少量的人力成本即获得了日本晴雄性不育突变体。田间鉴定，雄性不育率高达99.5％以上。

DNA提取

1.每株BC1植株取0.5g水稻叶片放于-20℃低温冷冻的研体内。加入液氮研磨成白色粉末状，放入2mL的离心管中。研磨的同时，打开水浴锅开关加热至65℃。

2.向离心管中加入700μL65℃预热1h的CTAB裂解液，翻转摇晃几次，再放入65℃恒温水浴锅中40min(每隔20min，翻转摇晃几次)

3.将样品放到室温下冷却5min，加入700μL酚-氯仿-异戊醇(25∶24∶1)，贴着壁加入，翻转摇晃几次，并检查是否漏液

4.用手压住管盖，慢慢翻转几次，之后在摇床上放一张报纸，摆好各管，在室温下30rpm摇动5～10分钟。

5.放到冷冻离心机中，4℃下12000rpm离心5min。

6.贴壁吸取上清液，再次加入700μL酚-氯仿-异戊醇(25∶24∶1)，重新抽提一次，抽提上清液加入10μL Rnase(10mg/mL)，室温放置30min，不可倒放。若上清液澄清，则直接跳过本步，进行下一步操作。

7.贴壁加入等体积700μL(-20℃)异丙醇，慢慢翻转15次，出现絮状沉淀，放入-20℃冰箱中，30min后取出，用冷冻离心机配平离心(4℃，12000rpm，10min)

8.倒去上清液，加入700μL预冷70％乙醇，用200μL枪头吹打，清洗DNA，在吸干净乙醇后，放入无菌操作台中开盖吹干。

9.加入50μL ddH₂O。

DNA检测

1.称取琼脂糖1.4g(50孔胶槽)，加入140mL(70/35mL)的1×TAE，放到微波炉中高温加热至沸腾，瓶中无絮状浑浊，清澈通明最好。

2.放到冷水中浸泡或在水龙头冲刷1min，然后加溴化乙锭(100mL TAE加6μL)，缓缓倒入胶槽中，插入梳子，放置20min凝胶。

TAE配方：使用液(1倍)0.04mol/L Tris-乙酸+0.001mol/L EDTA

储存液(50倍)Tris-碱242.2g，冰乙酸57.1ml，0.5mol/L EDTA(PH＝8.0)加水定容至1L。

3.用PCR板加入6×Loading Buffer 3μL，加入提取好的DNA 3μL，用枪点到叫胶孔中，12个空一格，好区分，也可以在区分的空白格点DNA Marker，将电压设置到140V左右，开始电泳。

6×Loading Buffer配方：溴芬兰0.015g+二甲苯氰FF 0.015g+0.5M/L EDTA 100μL+聚蔗糖4g，加水定容至10ml)

4.看指示剂的位置，跑到1.5cm左右就可以取出胶，放到照胶成像仪中拍照。

适合PCR的DNA浓度为50ng/M1

PCR扩增

1.引物母液：干粉加入ddH2O，OD值后的数字乘以OD值就是所加的水的毫克。干粉引物用之前13000rpm离心一下，让干粉都沉底。Tap酶也要离心。

2.引物mix：使用时，上下游引物各取10μl，加入480μl去离子水混匀。(此为引物母液的稀释液)

3.PCR反应体系：PCR专用板每个板孔点入如下体系

一共20μl，一个PCR孔，所有的东西都要在冰上加样，因为酶易失活。

4.PCR扩增反应程序：

提前混合好PCR体系：Buffer 200μl，d NTP 30μl，Tap酶20μl，ddH2O 1ml，上下游引物1∶1混合好加300μl，DNA另加。反应混合体系如下：

Buffer 200μl+dNTP 30μl+Tap酶20μl+ddH2O 1ml+上下游引物各6μl(6μl是引物母液)、ddH2O 288μl

PCR板加好所有的反应体系后，要加一滴石蜡(20μl)封存。加引物混合体系是PCR板要放到冰上。

加好的PCR样板放到-20℃保存等待PCR。否则酶容易失活。

5.PCR扩增反应程序：

扩增后加入8ml loading buffer(此步骤完成后可以进行琼脂糖检测DNA是否PCR出来条带)，94℃变性10min，再放到4℃冰箱里保存，下一步进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。

聚丙烯酰胺凝胶电泳

1.首先在玻璃耳板上喷洒酒精，再用纸巾擦洗干净，保证上面无纸屑，然后放到通风厨里，用2％的剥离硅烷(溶剂是氯仿，配方：加10mL剥离硅烷，加490mL氯仿混匀)涂抹均匀，用量大概是10mL，擦过后手感光滑为适宜，这一步很重要，直接影响以后是否粘胶，然后放置10min左右。

2.放置耳板的期间，底板用酒精喷洒一遍，用纸巾擦洗干净，保证上面没有灰尘，然后用亲和硅烷(亲和硅烷50μL，乙酸50μL)，加酒精至5mL(5mL小瓶加满)，倒在底板上涂抹均匀。(注意涂抹时手套不可以碰到玻璃板，要挽上袖子，否则废胶)。

3.将边条从清水中浸泡后，用纸巾擦干净，底板左右两边各放一条，(边条的厚度大概就是胶的厚度)，对准底板的两边的底边贴好。

4.将晾干的耳板从通风厨中取出，涂剥离硅烷的一面，对准底板涂亲和硅烷的一面，板与板对齐压好，再将对好的大板左右两边各夹上两个夹子，夹子要夹在边条上，一共4个夹子，夹牢固。

5.用灌胶瓶装好6％的PA胶，一个大板大约用70mL(用量筒称量)，里面先加10％的APS400μL，TEMED 40μL。然后再灌入胶，在耳板缺口处离板稍微有一点距离开始撒胶，一边灌胶一边敲大板，保证胶匀速前进，轻轻拍打以除去气泡。灌胶到玻璃板底部时用力敲打几下底部玻璃板，直到胶冒出但不滴下为好。灌胶结束，检察灌胶口处是否有气泡，若有可用齿钩钩出，也可以拍打挤出，再补一下胶。

6.齿梳也用水浸泡一下，清洗干净擦干，没有齿的平头一段放到耳板缺口处，先浸入胶中，用巧力插入大板中，一定保证没有气泡，插入的深度到过大板上横线一点点最好(大约1cm)，插入齿梳后再补一次胶，然后夹好两个大夹子，用水平尺调水平，(底座可用插入枪头垫水平)

7.放置等待凝胶(大约2h)

8.凝胶后将所有的夹子先去掉，将板上的齿梳去掉，放到水槽上，将上下两个板的表面残胶液刷掉。

9.将大板上耳板的凹槽处也刷一下，这一步重要，关系到是否跑胶成功。

10.将大板放到电泳架，耳板那面朝向墙摆放，将下面3个纽扣同时拧紧(先同时拧两边的两个，再拧中间的纽扣，不要拧得太紧，否则会漏上槽液，也不要宁太紧，会炸板)然后大板两边也用纽扣夹固定好，两边的纽扣夹的纽扣向墙，并拧紧固定。

11.将上槽液倒入上槽，上槽液没过胶表面，用吸管催一下凹槽里的胶孔，将碎胶吹走，防止堵胶，将Loading-Buffer水平加入，先进行预电泳20min。

(上槽液配制：上槽液为0.33倍TBE，取30ml的10倍TBE加水至900ml)

(下槽液配制：下槽液为1倍TBE，取1000ml的10倍TBE加水至1000ml)

12.Loading-Buffer跑到一定位置后(大概5cm处)，暂停电泳，再将齿梳带锯齿的那面缓慢插入胶缝中，注意齿梳要留一点在玻璃板外，否则那样无法点样，但是齿梳也要扎入胶内，好能分隔开各个DNA样品。

13.将外表面的玻璃板擦干净，再用红笔画好线。

14.PCR后的样本(4℃保存)取出，每个孔6μL点入电泳齿梳的孔内。

15.点完后，打开电泳仪，可设置自己所需电压，电流，功率(一般电压稳定，选择1500V～1800V)进行电泳，大概第一个跑电泳大约8cm(三个手指宽)，可再点第二层DNA样本，总共电泳大概1h左右。

16.正确地跑胶：指示剂下降整齐，呈直线条带状向下走。跑胶结束：跑胶的第二条的蓝条带(走得慢的那条)走到板底为宜，可视为跑电泳结束。(跑的快蓝带----溴酚蓝，跑得慢的带----二甲苯蓝)

17.关闭电泳仪，卸下大板，下一步，银染，显影。

18.凝胶电泳撤板，银染，显影步骤：

(1)先将上槽液导出，再去掉侧面固定的夹子，再去掉底座的固定，取板，放到水槽中浸泡一下。

(2)用扁铲将两个玻璃板分撬开来(正确地跑胶，胶样应该在底板上，准备银染)

充分振荡摇匀。将大板放入其中避光银染10min，不可以银染太久，否则脱胶。

银染后大板取出用蒸馏水涮洗一下，显影

显影液配置：NaOH 30g (NaOH瓶一瓶盖足可以)

甲醛 6ml (甲醛瓶两瓶盖足可以，注意气味很大，最后加)

蒸馏水 1500ml

充分振荡均匀，将银染好的大板在显影液中充分显影，显影后在水中洗去碱味。

在发光板中观测DNA条带，拍照。

EAT1核酸序列

EAT1突变不育基因eat选择

eat引物

Primer

上游引物TACAGGAGTAGCAGCGGTTC

下游引物TGGTACCTAACTGGAGAGCTGA

产物大小：78bp

野生型序列

突变株序列

(附表1)背景选择SSR引物序列

以上所述，仅是本发明的几个实施例，并非对本发明做任何形式的限制，虽然本发明以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限制本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于本发明技术方案保护范围内。

Claims (10)

1.一种不育系突变体获取方法，其特征在于，利用现有的突变体，与其它品种进行杂交，以不育基因作为标记，进行后代的筛选，后代同时进行回交。

2.根据权利要求1所述不育系突变体获取方法，其特征在于，每次回交均经过所述不育基因的检测。

3.一种不育系突变体获取方法，其特征在于，包括以下步骤：使用一个或多个EAT1基因突变的普通核不育系水稻材料为母本，待改造品系为父本进行杂交获得F1代，然后以待改造品系为轮回亲本进行回交转育，每一个回交世代均选择含有EAT1突变基因的个体作为下一代亲本，回交2-6代。

4.根据权利要求3所述不育系突变体获取方法，其特征在于，每一个回交世代均选择含有EAT1突变基因的个体作为下一代亲本，且前述作为下一代亲本的个体为在遗传背景及田间表现都偏向轮回亲本的单株。

5.根据权利要求3所述不育系突变体获取方法，其特征在于，进一步包括以下步骤：

DNA提取的步骤；

DNA检测的步骤；

PCR扩增的步骤；

聚丙烯酰胺凝胶电泳的步骤。

6.根据权利要求5所述不育系突变体获取方法，其特征在于，所述DNA提取的步骤，进一步包括：每株BC1植株取0.5g水稻叶片放于-20℃低温冷冻的研体内；加入液氮研磨成白色粉末状，放入2mL的离心管中。研磨的同时，打开水浴锅开关加热至65℃。

7.根据权利要求5所述不育系突变体获取方法，其特征在于，所述DNA提取的步骤，进一步包括：向离心管中加入700μL 65℃预热1h的CTAB裂解液，翻转摇晃几次，再放入65℃恒温水浴锅中40min，每隔20min，翻转摇晃多次。

8.根据权利要求5所述不育系突变体获取方法，其特征在于，所述DNA提取的步骤，进一步包括：将样品放到室温下冷却5min，加入700μL酚-氯仿-异戊醇(25∶24∶1)，贴着壁加入，翻转摇晃几次，并检查是否漏液。

9.根据权利要求5所述不育系突变体获取方法，其特征在于，所述DNA提取的步骤，进一步包括：用手压住管盖，慢慢翻转几次，之后在摇床上放一张报纸，摆好各管，在室温下30rpm摇动5～10分钟。

10.根据权利要求5所述不育系突变体获取方法，其特征在于，所述DNA提取的步骤，进一步包括：放到冷冻离心机中，4℃下12000rpm离心5min。