CN108165662B - 与亚洲棉dpl972光籽性状紧密连锁的分子标记及应用 - Google Patents

与亚洲棉dpl972光籽性状紧密连锁的分子标记及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种与亚洲棉DPL972光籽性状紧密连锁的分子标记及应用，该分子标记位于6号染色体A08上，该分子标记正向引物序列如SEQ ID No.1所示，反向引物序列如SEQ ID No.2所示。本发明找到了鉴定亚洲棉光籽材料的一对引物。在亚洲棉自然群体中能解释80‑90％的表型变异。可用于光籽性状的分子标记辅助选择以及光籽基因精细定位和图位克隆，为棉花纤维起始研究、纤维品质改良以及棉花遗传育种提供一定的理论依据。

Description

与亚洲棉DPL972光籽性状紧密连锁的分子标记及应用
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种与亚洲棉光籽性状紧密连锁的分子标记。
背景技术
棉花纤维是单细胞毛状体，起始于胚珠表皮外层细胞。它们可以每年为世界提供价值500亿美元的天然纺织材料。棉花纤维在形态学上可以分为长纤维和短绒。经济学上重要的长纤维起始于开花前期，并且经历伸长期、纤维素合成期、成熟期，最终形成成熟的长纤维。从种子上收获下来应用于纺织产品中。
棉花纤维可以分为两种类型：长纤维和短绒。长纤维起始于开花当天，纤维长度能伸长到3cm，然而短绒起始于开花后4-5天(DPA)(Stewart,1975)。大部分棉花品种都有短纤维，主要是附着在种子上帮助成熟棉花种子的传播。它们的长度不到5mm，当长纤维通过轧花从种皮上移除后，短绒紧紧依附在种皮上。任何残留在种皮上的短绒都会使萌发率降低，增加下一季度种子处理费用。因此光籽表型被认为是轧花的优良性状。
后来育种家逐渐注意到短绒突变表型与种子无长纤维或者长纤维稀少有关。棉花种皮上仅有20–30％的细胞产生纤维，目前还不知道产生这种现象的原因。然而，研究认为在长纤维和短绒调控上存在基因交叉。两个光籽突变体N1和n2，短纤维的伸长受到了抑制，发育成‘naked seed’(Kearney&Harrison,1927；Kohel,1973)。显性光籽突变体为有长纤维而没有短绒，受单基因N1显性控制。在陆地棉标准系TM-1开花后1天，纤维细胞由种皮伸长到纤维形态，但是在N1植株中，纤维细胞的伸长明显收到了抑制，在1DPA时只有很少的纤维细胞。
在起始时间上短绒要晚于长纤维，胚珠上共同存在的短绒和长纤维细胞在很长一段时间内吸引研究者的兴趣，并且为植物细胞分化提供了独特的模式系统.
亚洲棉三代基因组已经组装好，根据新的亚洲棉基因组注释，对控制光籽性状的相关基因进行克隆以及功能解析，可以很大程度上有助于阐明棉花纤维的发育原理。为通过分子育种提高纤维品质提供了帮助。
通过比较发现，野生型DPL971的花为黄色，突变体DPL972花为红色，DPL972的花色因表皮细胞内花青素较多而呈现紫色，而其它农艺性状非常的接近。最大的差异存在于两者在短纤维上的差异，在子棉和脱绒后的照片中，可以清楚地看到野生型上密布短绒，而突变体则表面非常光滑。这两个材料由于干扰因素较少，可以作为短绒起始分化研究分析的首选材料。
发明内容
本发明所要解决的技术问题为：如何提供一种与亚洲棉光籽性状紧密连锁的分子标记。
本发明的技术方案为：与亚洲棉DPL972光籽性状紧密连锁的分子标记，该分子标记位于6号染色体A08上，
该分子标记正向引物序列为：5'-GAGATGTTGTGTCCTAACTCACTGTAT-3'(SEQ IDNo.1)；反向引物序列为：5'-AGTCTGTATGATGATGAAAGTCTGTTG-3'(SEQ ID No.2)。
与亚洲棉DPL972光籽性状紧密连锁的分子标记在亚洲棉短绒性状鉴定上的应用。
上述应用的具体方法为：提取待鉴定棉花基因DNA，用序列如SEQ ID No.1和SEQID No.2所示的引物对提取的DNA进行PCR扩增，如果能得到长度为7.5kb的DNA片段，则为光籽型。
上述应用中，PCR扩增体系为：
PCR-Grade Water:39μl
10X Advantage 2PCR Buffer5μl
Template1.5μl
Primer Mix(10μl ea.)2μl
50X dNTP Mix(10mM ea.)1μl
50X Advantage 2Polymerase Mix1.5μl；
PCR扩增参数为
95℃ for 1min
30cycles
95℃ for 15sec
68℃ for 4min 30sec。
本发明的亚洲棉DPL972光籽性状紧密连锁的分子标记的引物是通过以下方法获得的。
(1)将毛籽材料亚洲棉DPL971作为父本，光籽突变体材料亚洲棉DPL972作为母本，用这两个材料进行杂交，获得F1代，自交产生F2代单株，同时选用亚洲棉自然群体材料作为实验材料。
(2)提取亲本、F1及F2群体、亚洲棉自然群体单株幼苗DNA。
(3)用设计引物对DPL971、DPL972进行PCR扩增，得到在两个材料中有差别的引物对(序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示)，用该对引物分别在亚洲棉自然群体和DPL971/972F2群体中进行扩增，然后琼脂糖电泳，用Image Lab软件进行分析。
本发明得到的与亚洲棉DPL972光籽性状紧密连锁的分子标记引物对(序列如SEQIDNo.1和SEQ ID No.2)当延伸时间为1min 30sec时，只在毛籽材料DPL971中能扩增出来，而在DPL972中扩增不出来，而当延伸时间延长至4min时，在DPL971和DPL972中都能扩增出来，并且发现在DPL972中的条带大小为7.5kb，而DPL971的条带大小为1390bp，说明DPL972中有大片段的插入。其他引物在两个材料中片段大小没有区别，一代测序后发现序列也并没有区别。当把6号引物在215分自然群体中扩增时，并且延伸时间为1min30sec，发现大部分光籽材料没有1390bp的条带，而毛籽材料中有。同时在DPL971/972F1以及1200个F2群体中扩增时，能区分出纯合的光籽。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明找到了鉴定亚洲棉光籽材料的一对引物。在亚洲棉自然群体中能解释80-90％的表型变异。可用于光籽性状的分子标记辅助选择以及光籽基因精细定位和图位克隆，为棉花纤维起始研究、纤维品质改良以及棉花遗传育种提供一定的理论依据。
附图说明
图1为19对引物在染色体的位置；
图2为19对引物在DPL971/972的扩增结果；
图3为SV11941-6引物在DPL971/972的扩增结果；
图4为SV11941-6引物在亚洲棉自然群体的扩增结果；
图5为SV11941-6引物在DPL971/972亲本、DPL971/972F1和DPL971/972F2的扩增结果。
具体实施方式
实施例1
(1)将亚洲棉野生型毛籽971作为父本，将亚洲棉光籽突变体972作为母本，对这两个材料进行杂交获得F1代，自交产生F2代1218株，同时采用215份亚洲棉自然群体构建作图群体。
(2)用CTAB法提取亲本，F1及F2群体及215份亚洲棉自然群体单株幼苗的DNA。
(3)用设计好的19对引物(如表1所示)对两亲本毛籽971和光籽972进行扩增，所用的DNA聚合酶为
Figure BDA0001601424660000031
Max Super-FidelityDNA Polymerase，延伸时间为1min30sec。扩增结果如图1和图2所示，6号引物在DPL971中能扩增出来，而在DPL972中没有条带。当用扩增长片段DNA聚合酶(Advantage 2PCR Enzyme)，并且延伸时间改为4min3sec时，对扩增结果用1.5％的琼脂糖进行电泳，扫胶，对结果进行分析，发现DPL971的条带大小为1290bp，DPL972的条带大小为7.5Kb，说明在DPL972基因组中有大片段的插入，结果如图3所示。同时在亚洲棉自然群体中验证，能解释80-90％的表型变异(如图4所示)。在F2群体中扩增，能验证出纯合的光籽(如图5所示)。
(4)实验过程中所用的DNA聚合酶为
Figure BDA0001601424660000041
Max Super-Fidelity DNAPolymerase和
Figure BDA0001601424660000042
2PCREnzyme。
(5)实验过程的反应体系：
Figure BDA0001601424660000043
40μl PCR-Grade Water
5μl 10X Advantage 2PCR Buffer
1μl DNA Template(100ng/μl)
2μl Primer Mix(10μl ea.)
1μl 50X dNTP Mix(10mM ea.)
1μl 50X Advantage 2Polymerase Mix
50μl Total volume
Figure BDA0001601424660000044
Max Super-Fidelity DNA Polymerase反应参数
Figure BDA0001601424660000045
Figure BDA0001601424660000046
2PCREnzyme扩增参数为
95℃ for 1min
30cycles
95℃ for 15sec
68℃ for 4min 30sec。
上述结果说明本发明筛选的引物对：SV11941-6(见表一)可作为与光籽性状紧密连锁的分子标记，用于光籽性状的分子标记辅助选择以及棉花纤维改良的分子育种。
表119对紧密连锁的分子标记信息
Figure BDA0001601424660000051
Figure BDA0001601424660000061
以上所述实施例仅表达了本申请的具体实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本申请保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请技术方案构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。
序列表
<110> 中国农业科学院棉花研究所
<120> 与亚洲棉DPL972光籽性状紧密连锁的分子标记及应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gagatgttgt gtcctaactc actgtat 27
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agtctgtatg atgatgaaag tctgttg 27

Claims (4)

1.与亚洲棉DPL972光籽性状紧密连锁的分子标记，其特征在于，该分子标记位于6号染色体A08上，所述分子标记是由SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示引物对扩增得到的DNA片段。
2.根据权利要求1所述的与亚洲棉DPL972光籽性状紧密连锁的分子标记在亚洲棉短绒性状鉴定上的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，提取待鉴定棉花基因DNA，用序列如SEQ IDNo.1和SEQ ID No.2所示的引物对提取的DNA进行PCR扩增，如果能得到长度为7.5kb的DNA片段，则为光籽型。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，
PCR扩增体系为：
PCR-Grade Water:39μl
10X Advantage 2PCR Buffer5μl
Template1.5μl
Primer Mix(10μl ea.)2μl
50X dNTP Mix(10mM ea.)1μl
50X Advantage 2Polymerase Mix1.5μl；
PCR扩增参数为
95℃for 1min
30cycles
95℃for 15sec
68℃for 4min 30sec。
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与亚洲棉光籽突变体 DPL972中光籽基因紧密连锁的SSR分子标记的开发与应用;冯晓旭等;《棉花学报》;20161231;第28卷(第4期);392-398 *

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