CN111549168B - 鉴定与纤维强度有关的瑟伯氏棉渐渗片段的成套引物及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种鉴定与纤维强度有关的瑟伯氏棉渐渗片段的成套引物及应用，该瑟伯氏棉渐渗片段位于陆地棉染色体D08上，与陆地棉纤维强度QTL位点qFS‑D08紧密相关，位于染色体D08上7.073‑60.027Mb范围内，该QTL区段内瑟伯氏棉渐渗片段显著提升纤维强度。本发明所述的成套引物由2F/2R，3F/3R，42F/47R和5F/5R组成。本发明的4对引物可以用来鉴定陆地棉中是否含有瑟伯氏棉渐渗片段，且具有快速、操作简单、低成本等特点。本发明所公开的这些成套引物可用于分子标记辅助选择育种，可有针对地选择含有纤维强度改良有关的瑟伯氏棉渐渗片段的品系，缩短育种周期，加快优质新品种的培育进程。

Description

鉴定与纤维强度有关的瑟伯氏棉渐渗片段的成套引物及应用
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种与纤维强度有关的瑟伯氏棉渐渗片段的成套引物和应用。
背景技术
棉花是常异花授粉植物，在植物学分类中属于锦葵科(Malvaceae)、棉族(Gossypieae)、棉属(Gossypium)。目前为止，棉属共包含有7个四倍体种，47个二倍体种。这54个棉种中有四个栽培种，包括二倍体种草棉(Gossypium herbaceum L.，A1)和亚洲棉(Gossypium arboreum L.，A2)，四倍体种陆地棉(Gossypium hirsutum L.，AD1)和海岛棉(Gossypium barbadense L.，AD2)；其余为野生棉种(祝水金,汪若海,季道藩.棉属分类及其染色体组研究进展.棉花学报,1995,7:1–7.)。棉花作为世界上最重要的天然纤维作物之一，在我国国民经济中占据着重要的地位。近年来，随着人民生活水平的提高和纺织技术的发展，人们对棉纤维品质的要求越来越高。现有陆地棉品种遗传基础比较狭窄，限制了其纤维品质的进一步改良。棉属中丰富的品种资源为陆地棉育种和遗传改良提供了遗传物质基础，种间杂交策略在棉花育种过程中得到了广泛应用。
在棉花育种上，利用野生棉与陆地棉进行种间杂交改良纤维品质已经取得了显著的成绩。例如，在Pee Dee系近30年的育种过程中，通过陆地棉与瑟伯氏棉、亚洲棉和海岛棉的杂交及不断选育，最终打破了纤维产量和强度之间显著的负相关(Culp TW,Harrell DC,Kerr T.Some genetic implications in the transfer of high fiber strength genesto upland cotton.Crop Science,1979,19:481–484.)。棉花育种中常用作亲本材料的另一纤维品质优良的Acala棉也是通过亚洲棉、海岛棉、陆地棉和瑟伯氏棉的种间杂交获得的(Zhang JF,Lu Y,Cantrell RG,et al.Molecular marker diversity and fieldperformance in commercial cotton cultivars evaluated in the southwesternUSA.Crop Science,2005,45:1483–1490.)。钱思颖等通过将陆地棉与异常棉杂交，再与其他优质品系回交，获得了一系列纤维长度和强度都较高的品系(钱思颖,黄骏麒,彭跃进,etal.陆地棉(G.hirsutum L.)与异常棉(G.anomalumWawr.&Peyr.)种间杂种的研究及其在育种上的应用.中国农业科学,1992,25:44–51.)。周宝良等将陆地棉分别与异常棉、辣根棉、雷蒙德氏棉等杂交，经过多年回交与选育获得了一系列超强的细长绒种质系，为高纤维品质育种提供重要的基础材料(周宝良,陈松,沈新莲,张香桂,张震陵.陆地棉高品质纤维种质基因库的拓建.作物学报,2003,29(4):514–19.)。
然而前人的研究中多数是根据育种记录推测育成品系中的外源渐渗片段，对于外源材料具体品种、渐渗片段在陆地棉中的位置以及渐渗片段验证等方面研究较欠缺。
发明内容
本发明所要解决的技术问题为：如何提供一种鉴定与纤维强度有关的瑟伯氏棉渐渗片段的成套引物。另一方面，如何应用成套引物对渐渗片段进行鉴定。
本发明的技术方案为：
一种与纤维强度有关的瑟伯氏棉渐渗片段，该瑟伯氏棉渐渗片段与陆地棉纤维强度QTL位点qFS-D08紧密相关，位于染色体D08上7.073-60.027Mb范围内，该QTL区段内瑟伯氏棉渐渗片段显著提升纤维强度。
鉴定与纤维强度有关的瑟伯氏棉渐渗片段的成套引物，所述成套引物由4对引物组成，分别为2F/2R，3F/3R，42F/47R和5F/5R：
2F/2R的正向引物序列如SEQ ID No.1所示，反向引物序列如SEQ ID No.2所示；
3F/3R的正向引物序列如SEQ ID No.3所示，反向引物序列如SEQ ID No.4所示；
42F/47R的正向引物序列如SEQ ID No.5所示，反向引物序列如SEQ ID No.6所示；
5F/5R的正向引物序列如SEQ ID No.7所示，反向引物序列如SEQ ID No.8所示。
本发明提供的鉴定陆地棉是否含有与纤维强度有关的瑟伯氏棉渐渗片段的方法，包括包括以下步骤：
提取待鉴定陆地棉基因组DNA，用成套引物2F/2R，3F/3R，42F/47R和5F/5R分别对待鉴定陆地棉基因组DNA进行PCR扩增，如果引物对2F/2R，3F/3R扩增产物分别含有大小为1442bp、1472bp的片段，且42F/47R和5F/5R无扩增产物时，则所述待鉴定陆地棉含有瑟伯氏棉渐渗片段；如果引物对2F/2R，3F/3R扩增产物分别含有大小为1442bp、1472bp的片段，且42F/47R和5F/5R扩增产物分别含有大小为1893bp、1823bp的片段，则所述待鉴定陆地棉不含有瑟伯氏棉渐渗片段。
本发明的成套引物可应用于陆地棉辅助育种上。具体地，利用染色体D08中qFS-D08区段内含有瑟伯氏棉渐渗片段的材料为亲本，组配分离群体，在苗期提取待检测单株DNA，用成套引物对2F/2R，3F/3R，42F/47R和5F/5R分别进行PCR扩增，选择2F/2R，3F/3R含有1442bp、1472bp目标扩增产物且42F/47R和5F/5R无扩增产物的植株，获得纤维强度得到提高的单株。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明涉及的与纤维强度有关的渐渗片段来自野生棉瑟伯氏棉，该瑟伯氏棉渐渗片段位于陆地棉染色体D08上7.073-60.027Mb范围内，该区段内瑟伯氏棉渐渗片段显著提升纤维强度。本发明所述的4对引物可以用来鉴定陆地棉中是否含有瑟伯氏棉渐渗片段，可用于分子标记辅助选择育种，可有针对地选择含有纤维强度改良有关的瑟伯氏棉渐渗片段的品系，缩短育种周期，加快优质新品种的培育进程。
附图说明
图1-图3为本发明的4对引物在重组自交系群体中的扩增结果。“+”代表含有目标扩增产物，“-”代表不含有目标扩增产物。
图4为本发明的4对引物在重组自交系群体中两种扩增类型的单株纤维强度表型差异性分析结果。
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为从商业渠道购买得到的。
下述实施例中的陆地棉优异品质系J02-508和陆地棉品系中RI015均在文献“MaZY,He SP,Wang XF,et al.Resequencing a core collection of upland cottonidentifies genomic variation and loci influencing fiber quality andyield.Nature Genetic,2018,50:803–813.”中公开过，公众可从中国农业科学院棉花研究所国家棉花种质中期库(安阳)获得。
实施例1：
(1)本发明所采用四种供试材料分别代表不同类型：TM-1为陆地棉标准系材料，属于异源四倍体棉种(AD1)，仅含有陆地棉血缘；瑟伯氏棉为野生棉材料，属于二倍体D1基因组棉种；J02-508为陆地棉优异品质系，基因组中含有瑟伯氏棉渐渗片段；中RI015为陆地棉品系，仅含有陆地棉血缘。
(2)用CTAB法提取TM-1、J02-508、中RI015、和瑟伯氏棉单株嫩叶的DNA，用于基因组重测序和引物验证，参考基因组为高质量陆地棉基因组(Yang ZE,Ge XY,Yang ZR,etal.Extensive intraspecific gene order and gene structural variations inupland cotton cultivars,Nature Communications,2019,10:1-13)。
(3)依据基因组重测序结果设计4对引物(如表1所示)分别对J02-508、中RI015、TM-1和瑟伯氏棉四个材料进行PCR扩增。4对引物均可在陆地棉标准系TM-1和陆地棉材料中RI015中检测到相应的扩增产物，而引物42F/47R和5F/5R在瑟伯氏棉和含有瑟伯氏棉渐渗片段的陆地棉优异品质系J02-508检测不出相应的扩增产物。
(4)上述试验结果表明：本发明的4对引物对可按照如下方法检测陆地棉中是否含有瑟伯氏棉渐渗片段：
用成套引物对2F/2R，3F/3R，42F/47R和5F/5R分别对待测陆地棉进行PCR扩增，如果引物对2F/2R，3F/3R扩增产物分别含有大小为1442bp、1472bp的片段，且42F/47R和5F/5R无扩增产物时，则所述待测陆地棉含有瑟伯氏棉渐渗片段；如果引物对2F/2R，3F/3R扩增产物分别含有大小为1442bp、1472bp的片段，且42F/47R和5F/5R扩增产物分别含有大小为1893bp、1823bp的片段，则所述待测陆地棉不含有瑟伯氏棉渐渗片段。
上述结果说明本发明筛选的引物对可用于分子标记辅助选择育种，可有针对地选择含有纤维强度改良有关的瑟伯氏棉渐渗片段的品系，缩短育种周期，加快优质新品种的培育进程。
表1、本发明中4对引物的详细信息
Figure GDA0003678625980000041
Figure GDA0003678625980000051
实施例2
(1)在河南省安阳市中国农业科学院棉花研究所实验基地，利用高产陆地棉品系中RI015为母本和陆地棉高强纤维优质品种J02-508为父本配制杂交组合获得F1种子，在安阳实验基地种植自交获得F2种子。随后每世代均自交，家系内每单株各选一个自交铃，构建F2:5代重组自交系，9月中下旬进行田间取样，按家系收花，随机收获30个正常吐絮棉铃，取15g左右的纤维样品进行纤维品质的测定。
(2)提取亲本和重组自交系群体的DNA。
(3)用成套引物对2F/2R，3F/3R，42F/47R和5F/5R分别对重组自交系群体进行PCR扩增，所用的DNA聚合酶为KODFX(TOYOBO，Code No.：KFX-101)，对扩增结果用1.5％的琼脂糖进行电泳，扫胶，对结果进行分析，结果如图1-图3所示。对比重组自交系纤维强度表型结果，2F/2R，3F/3R含有1442bp、1472bp目标扩增产物且42F/47R和5F/5R无扩增产物的植株纤维强度较高，平均值为34.65cN/tex；2F/2R，3F/3R，42F/47R和5F/5R引物对均含有目标扩增产物的植物纤维强度平均值为30.09cN/tex；两种类型植株间纤维强度性状差异极显著(如图4所示)。
上述结果表明，本发明的成套引物能够鉴别纤维强度，得到提高的单株，可应用于陆地棉辅助育种上。具体地，利用染色体D08中qFS-D08区段内含有瑟伯氏棉渐渗片段的材料为亲本，组配分离群体，在苗期提取待检测单株DNA，用成套引物对2F/2R，3F/3R，42F/47R和5F/5R分别进行PCR扩增，选择2F/2R，3F/3R含有1442bp、1472bp目标扩增产物且42F/47R和5F/5R无扩增产物的植株，获得纤维强度得到提高的单株。”
以上所述实施例仅表达了本申请的具体实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本申请保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请技术方案构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。
序列表
<110> 中国农业科学院棉花研究所
<120> 鉴定与纤维强度有关的瑟伯氏棉渐渗片段的成套引物及应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgaagtggat tgggcaaaaa aacgagg 27
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cacatgggat ggggtctatt agtaag 26
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tttcgtagca aaagcaaaga catccc 26
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctcactctat aaacaacgtg tggattctc 29
<210> 5
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gtgttaaaca accgaagcag gccaga 26
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
taacgtattg ggctgcgatt tcttc 25
<210> 7
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gtatcttggc acttggcagg tctttg 26
<210> 8
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cgacttcatt tatttgctga tttaggc 27

Claims (4)

1.一种鉴定与纤维强度有关的瑟伯氏棉渐渗片段的成套引物，其特征在于，所述成套引物由4对引物组成，分别为2F/2R，3F/3R，42F/47R和5F/5R：
2F/2R的正向引物序列如SEQ ID No.1所示，反向引物序列如SEQ ID No.2所示；
3F/3R的正向引物序列如SEQ ID No.3所示，反向引物序列如SEQ ID No.4所示；
42F/47R的正向引物序列如SEQ ID No.5所示，反向引物序列如SEQ ID No.6所示；
5F/5R的正向引物序列如SEQ ID No.7所示，反向引物序列如SEQ ID No.8所示。
2.鉴定陆地棉是否含有与纤维强度有关的瑟伯氏棉渐渗片段的方法，其特征在于，提取待鉴定陆地棉基因组DNA，用权利要求1所述的成套引物2F/2R，3F/3R，42F/47R和5F/5R分别对待鉴定陆地棉因组DNA进行PCR扩增，如果引物对2F/2R，3F/3R扩增产物分别含有大小为1442bp、1472bp的片段，且42F/47R和5F/5R无扩增产物时，则所述待鉴定陆地棉含有瑟伯氏棉渐渗片段；如果引物对2F/2R，3F/3R扩增产物分别含有大小为1442bp、1472bp的片段，且42F/47R和5F/5R扩增产物分别含有大小为1893bp、1823bp的片段，则所述待鉴定陆地棉不含有瑟伯氏棉渐渗片段。
3.权利要求1所述的成套引物在陆地棉辅助育种上的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，利用染色体含有瑟伯氏棉渐渗片段的材料为亲本，组配分离群体，在苗期提取待检测单株DNA，用成套引物对2F/2R，3F/3R，42F/47R和5F/5R分别进行PCR扩增，选择2F/2R、3F/3R含有1442bp、1472bp目标扩增产物且42F/47R和5F/5R无扩增产物的植株，获得纤维强度得到提高的单株。
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