CN101333556B - 检测牛羊感染细菌的基因芯片、制备及检测方法、试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种检测牛羊感染细菌病原体的基因芯片，其中基因芯片包括固相载体和固定在该载体上的寡聚核苷酸探针，所述寡聚核苷酸探针包括检测探针和质量控制探针，检测探针是从牛布鲁氏杆菌、山羊布鲁氏杆菌、绵羊布鲁氏杆菌、牛结核分枝杆菌和人结核分枝杆菌基因组的核苷酸序列中选取的DNA片段。本发明还涉及该芯片的制备方法、利用该芯片检测牛羊五种感染细菌病原体的方法，包括合成探针，制备芯片，与处理标记好的待测样品进行杂交的过程。本发明还进一步涉及由上述芯片和样品处理试剂、杂交和显色试剂，以及说明书组成的牛羊感染细菌病原体的检测试剂盒。利用本发明的基因芯片可达到同时检测五种细菌的目的，操作简便、准确性高、重复性强，对于实验室研究和生产实践都具有重要的意义。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及检测牛羊感染细菌病原体的基因芯片、芯片的制备方法、检测方法和检测用试剂盒。
背景技术
牛布氏病、绵羊布氏病、山羊布氏病、牛结核病、人结核病是世界各国动物检疫部门重点防范的动物传染病及人畜共患病，我国质量监督检验检疫局也将其列为牛羊属动物出入境检验检疫的必检疫病。随着大型动物及相关制品的国际贸易日益频繁，相应的病原微生物检测技术应运而生。常规技术包括微生物培养技术、免疫技术、PCR技术等，尽管这些检测技术已发挥了巨大的作用，但仍存在如下缺陷：微生物培养技术繁琐而费时；免疫技术要有特异性强的抗血清；PCR技术本身的优越性无可厚非，但反应条件控制不当很容易引起交叉污染，出现假阳性。这些缺陷的存在使得常规的检测方法无法适应动物疫病检测快速、准确、高通量的要求，新的动物疫病检测方法的开发已迫在眉睫。
病原微生物基因组计划的突破性进展使得从基因水平检测病原微生物感染成为可能，近几年发展起来的生物芯片技术更是为病原微生物的基因检测提供了强有力的手段。生物芯片技术是具有微型化、高通量、并行处理及易于自动化等优势的前沿生物技术，它将大量的靶基因片段高密度、有序地排列在玻片、硅片等载体上，用相应的检测手段检测后，通过计算机软件进行数据比较和分析，一次试验就可对上万种基因进行快速、准确、高效的检测。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测牛羊感染细菌病原体的基因芯片，以弥补传统的检测方法技术存在的不足。
本发明的另一个目的是提供检测牛羊感染细菌病原体的基因芯片的制备方法。
本发明的更进一步的目的是提供一种利用上述基因芯片来快速、准确、灵敏地检测牛羊感染细菌病原体的方法。
本发明还有一个目的是提供用于检测牛羊感染细菌病原体的试剂盒。
为达到上述的目的，本发明的技术方案如下：本发明的检测牛羊感染细菌病原体的基因芯片，包括固相载体和固定在该载体上的寡聚核苷酸探针，其中寡聚核苷酸探针包括检测探针和质量控制探针，芯片样品点的布局为低密度布局，样品点少于200个；所述的寡聚核苷酸检测探针是从牛布鲁氏杆菌、山羊布鲁氏杆菌、绵羊布鲁氏杆菌、牛结核分枝杆菌和人结核分枝杆菌中的至少一种细菌基因组对应的核苷酸序列中选取的DNA片段。
其中一个优选的技术方案是所述的寡聚核苷酸检测探针包括从牛布鲁氏杆菌、山羊布鲁氏杆菌、绵羊布鲁氏杆菌、牛结核分枝杆菌和人结核分枝杆菌基因组对应的核苷酸序列中选取的DNA片段。
本发明技术方案中所述的检测探针分别具有以下序列：从牛布鲁氏杆菌基因组的核苷酸序列中选取的DNA片段具有如序列表中SEQ ID NO：6所示的碱基序列；从山羊布鲁氏杆菌基因组的核苷酸序列中选取的DNA片段具有如序列表中SEQ ID NO：7所示的碱基序列；从绵羊布鲁氏杆菌基因组的核苷酸序列中选取的DNA片段具有如序列表中的SEQ ID NO：8所示的碱基序列；从牛结核分枝杆菌基因组的核苷酸序列中选取的DNA片段具有如序列表中SEQ ID NO：9所示的碱基序列；从人结核分枝杆菌基因组的核苷酸序列中选取的DNA片段具有如序列表中SEQ ID NO：10所示的碱基序列。
本发明制备检测牛羊传染病细菌的基因芯片的方法，包括以下的步骤：
(1)探针的设计：经Genbank检索，BLAST序列比对分别得到牛布鲁氏杆菌、山羊布鲁氏杆菌、绵羊布鲁氏杆菌、牛结核分枝杆菌和人结核分枝杆菌基因组对应的核苷酸序列中的相对保守区，作为靶序列，依据探针设计原则，采用Primer Premier5.0和Oligo6.0软件，在此保守区内分别设计针对病原体的特异性的检测探针；
(2)检测探针的合成：由专门的生物公司合成上述设计好的探针片段序列；
(3)芯片的制备：包括切膜、贴膜，然后将上述得到的检测探针点膜，紫外交联10分钟，再经存膜即得芯片。其中点膜后得样品点直径在200μm-1000μm。
上述基因芯片的制备方法中，所述的相对保守区的序列如下：牛布鲁氏杆菌基因组核苷酸序列中的相对保守区具有如序列表中SEQ ID NO：1所示的碱基序列；山羊布鲁氏杆菌 基因组核苷酸序列中的相对保守区具有如序列表中SEQ ID NO：2所示的碱基序列；绵羊布鲁氏杆菌基因组核苷酸序列中的相对保守区具有如序列表中SEQ ID NO：3所示的碱基序列；牛结核分枝杆菌基因组核苷酸序列中的相对保守区具有如序列表中SEQ ID NO：4所示的碱基序列；人结核分枝杆菌基因组核苷酸序列中的相对保守区具有如序列表中SEQ IDNO：5所示的碱基序列。所述检测探针即为上述牛布鲁氏杆菌、山羊布鲁氏杆菌、绵羊布鲁氏杆菌、牛结核分枝杆菌和人结核分枝杆菌基因组对应的核苷酸序列中选取的DNA片段。其序列分别如下：从牛布鲁氏杆菌基因组的核苷酸序列中选取的DNA片段具有如序列表中SEQ ID NO：6所示的碱基序列；从山羊布鲁氏杆菌基因组的核苷酸序列中选取的DNA片段具有如序列表中SEQ ID NO：7所示的碱基序列；从绵羊布鲁氏杆菌基因组的核苷酸序列中选取的DNA片段具有如序列表中SEQ ID NO：8所示的碱基序列；从牛结核分枝杆菌基因组的核苷酸序列中选取的DNA片段具有如序列表中SEQ ID NO：9所示的碱基序列；从人结核分枝杆菌基因组的核苷酸序列中选取的DNA片段具有如序列表中SEQ ID NO：10所示的碱基序列。
本发明牛羊感染细菌病原体的检测方法包括以下的步骤：
(1)待测样本处理：采用常规方法提取待测样品的DNA，进行标记PCR扩增；
(2)杂交显色；将步骤(1)得到的标记后的PCR产物和权利要求1、2或3所述的基因芯片进行杂交，然后显色；
(3)结果阅读与分析：利用生物芯片阅读仪获取杂交信号并分析鉴定杂交结果。
由于步骤(1)中提取的待测样品的DNA含量较低，必须针对其靶序列进行标记PCR扩增，然后进行杂交。根据上述相对保守区的序列，即靶序列，设计以下引物用于标记PCR扩增：扩增SEQ ID NO：1所用的一对引物的序列如序列表中的SEQ ID NO：11和NO：12所示；扩增SEQID NO：2所用的一对引物的序列如序列表中的SEQ ID NO：13和NO：14所示；扩增SEQ IDNO：3所用的一对引物的序列如序列表中的SEQ ID NO：15和NO：16所示；扩增SEQ ID NO：4所用的一对引物的序列如序列表中的SEQ ID NO：17和NO：18所示；扩增SEQ ID NO：5所用的一对引物的序列如序列表中的SEQ ID NO：19和NO：20所示。
本发明的用于检测牛羊感染细菌病原体的试剂盒，包括：上述基因芯片、待测样品处理试剂、杂交和显色试剂，以及说明书。
本发明具体的实施方案如下：
一、基因芯片的制备
1、检测探针的设计和合成
(1)检测探针的设计：经Genbank检索，BLAST序列比对分别得到牛布鲁氏杆菌、山羊布鲁氏杆菌、绵羊布鲁氏杆菌、牛结核分枝杆菌和人结核分枝杆菌基因组对应的核苷酸序列中的相对保守区，作为靶序列，依据探针设计原则，采用Primer Premier5.0和Oligo6.0软件，在此保守区内分别设计针对病原体的特异性的检测探针，所述的检测探针分别具有如下所述的序列：牛布鲁氏杆菌的检测探针为序列表中SEQ ID NO：6所示的碱基序列，山羊布鲁氏杆菌的检测探针为序列表中SEQ ID NO：7所示的碱基序列，绵羊布鲁氏杆菌的检测探针为序列表中SEQ ID NO：8所示的碱基序列，牛结核分枝杆菌的检测探针为序列表中SEQ ID NO：9所示的碱基序列，人结核分枝杆菌的检测探针为序列表中SEQ IDNO：10所示的碱基序列；
(2)检测探针的合成：由专门的生物公司合成上述设计好的探针片段序列。
得到探针片段后，配置探针溶液，准备芯片点样。
2、芯片的制备
(1)切膜：选用合适的硝酸纤维素膜，于切膜机中准确裁剪成方形芯片。规格1.5cm×1.5cm。
(2)贴膜：将芯片用胶固定于1.5cm×1.5cm芯片方皿中，使之紧贴芯片方皿底部，放置2分钟，胶凝固后，芯片平整地贴于芯片方皿底部，在芯片方皿的边框上作一定向标志或编号。
(3)点膜：对探针分布进行合理布局，设质控点。再将已配制好的探针溶液逐个加入与已布局好的点样针相应位置的探针盘孔中。每种探针点两针，点样时将点样仪推拉杆推到吸样位置，点样针与探针盘孔对准，按下顶部按钮，吸取探针(样品)液，停留3-5秒，吸样完毕，放松按钮，点样针架自动弹起。然后将点样仪推拉杆推到点样位置，此时已吸液的点样针对准芯片方皿中的膜片，按下按钮，停留3-5秒，放松按钮，点样针架自动弹起。重复此操作1-3次，点样完毕。
(4)存膜：点样完毕，待芯片自然干燥，将芯片方皿放置紫外灯下照射10分钟，封装4℃保存。
(5)芯片布局如图1
质控主要指从芯片制备到样本处理，到杂交扫描各环节的监控，目前主要的控制包括：
1)点样过程质控：用于监控点样过程，采用有色染料，该染料在芯片杂交过程中将被洗掉，因而不会对芯片检测结果造成影响；
2)杂交质控：用生物素点于芯片上，监控显色过程；
3)空白对照：是不含任何基因片段的空白点样液，作为芯片制备过程中的污染监控指标。本实验中采用1倍的点样缓冲液；
4)阴性内参(质控探针)：是一段与检测基因没有同源性的其他基因片段，作为杂交过程中非特异性杂交的监控指标；阴性内参探针序列为：
5′-CTGGCGAATCTGAATGCAGTTTAACGGCTCAACCAAGTTGAACTCAGACGC-3′(序列表中的SEQ IDNO：22)，由专门的生物公司合成上述探针片段序列。
5)阳性内参(质控探针)：是一段与检测基因没有同源性的其他基因片段，在5种常见病原体引物扩增的同时可以扩增该序列片段，作为PCR扩增过程中的对照，主要用于PCR扩增标记过程的监控。本发明的基因芯片所需的阳性内参探针序列为：
5′-TTTGGGGTGCTTGATGAACAATTACATCGTAATAGGGGCTACAGAGATAGA-3′(序列表中的SEQ ID NO：21)，由专门的生物公司合成上述探针片段序列。
二、芯片的使用方法
以下，通过基因芯片在检测牛羊感染细菌病原体的试剂盒中的使用，进一步详细说明牛羊感染细菌病原体的检测方法。
1、试剂盒组成
(1)样本处理试剂
细菌处理液1：4％NaOH 302ml；
细菌处理液2：灭菌生理盐水25ml；
细菌处理液3：DNA提取液1.26ml；
(2)PCR体系组分
PCR反应液1：PCRMIX 1100μL，包括引物、生物素、dATP、dTTP、dCTP、dGTP、dUTP、10×PCR buffer、无菌纯水
酶1：Taq酶4μL+UNG酶(尿嘧啶DNA糖基化酶)24μL
PCR阴性对照(超纯水，用MilliQ纯水仪制备)：1ml×3管；
PCR阳性对照(牛布鲁氏杆菌、山羊布鲁氏杆菌、绵羊布鲁氏杆菌、牛结核分枝杆菌、
人结核分枝杆菌五种细菌质粒的混合物)：1ml×3管。
阳性对照制备的方法如下：
牛肉汤培养基的准备：将10g蛋白胨、5g氯化钠、3g牛肉膏溶解在1升水中，用10％氢氧化钠将其pH调至7.0，分装，121℃灭菌20分钟，备用。
以下，以牛布鲁氏杆菌为例说明阳性对照制备的过程：牛布鲁氏杆菌样品进行PCR扩增，所得的PCR产物(靶序列)采用市售的多功能DNA纯化试剂盒进行纯化，纯化的靶序列经克隆试剂盒转化进大肠杆菌内，其它细菌也采用上述方法转化进大肠杆菌内，就得到了五种含有靶序列质粒的大肠杆菌。
在预先用紫外灯照射30分钟的生物安全柜中，用接种环将大肠杆菌接种在无菌的牛肉汤培养基中，220转/分钟，37℃，培养过夜。
将培养过夜的菌液收集后，采用质粒提取试剂盒进行质粒提取。将所得各质粒分别用紫外分光光度计定量，计算拷贝数，稀释成表1中记录的浓度后，分装，备用。
将五种质粒等体积混合，即得阳性对照。
表1五种质粒各自稀释后的浓度
| 细菌名称 | 质粒浓度(copies/μl) |
| 牛布鲁氏杆菌 | 5×106 |
| 山羊布鲁氏杆菌 | 5×106 |
| 绵羊布鲁氏杆菌 | 5×106 |
| 牛结核分枝杆菌 | 5×106 |
| 人结核分枝杆菌 | 5×106 |
(3)杂交、显色试剂
预杂交液：12ml，含有甲酰胺(DMF)50％(体积比)，20×SSC 25％(体积比)，50×Denhartds 10％(体积比)，鱼精DNA(10mg/ml)5％(体积比)，1M PBS(pH 6.4)5％(体积比)，0.1M EDTA5％(体积比)；
杂交液；12ml，含有甲酰胺(DMF)45％(体积比)，20×SSC 25％(体积比)，50×Denhartds2％(体积比)，鱼精DNA(10mg/ml)2％(体积比)，1M PBS(pH 6.4)2％(体积比)，20％硫酸葡聚糖钠24％(体积比)；
洗液1：2×SSC 20ml，含有20×SSC 10％(体积比)，10％SDS 1％(体积比)，蒸馏水89％(体积比)；
洗液2：0.1×SSC 20ml，含有20×SSC 0.5％(体积比)，10％SDS 1％(体积比)，蒸馏水98.5％(体积比)；
封闭液：20ml，0.75g BSA溶于17.5ml蒸馏水中，加入2.5ml1M Tris-HCl pH 7.5；
酶联缓冲液：40ml，含有Tris-HCl 0.1M pH 7.5，MgCl22mM，Triton X-1000.05％(体积比)，NaCl 1.0M；
酶2：亲和素-碱性磷酸酶(SAv-AP)0.01ml；
终止液：12ml，0.5M EDTA；
底物缓冲液：10ml，含有Tris-HCl 0.1M pH 9.5，MgCl25mM，NaCl 0.1M；
底物1：5-溴-4-氮-3-吲哚磷酸(BCIP)0.05ml，2.5mg BCIP溶于0.05ml DMF中；
底物2：氮蓝四唑(NBT)0.05ml，3.75mg NBT溶于0.05ml 70％DMF中。
注：20×SSC：NaCl 17.55％，二水合柠檬酸三钠8.82％，pH 7.0；
1M PBS：NaCl 0.8％，KCl 0.02％，Na2HPO4·12H2O 0.144％，KH2PO4·12H2O0.024％，pH 6.4；
0.1M EDTA：EDTA 3.72％，pH 8.0；
1M Tris-HCl pH 7.5：Tris 12.1％，MgCl20.19％，Triton X-1000.05％(体积比)，NaCl 5.8％；
EDTA：乙二胺四乙酸；
SDS：十二烷基磺酸钠(Sodium dodecyl sulfate，SDS)；
PBS：一种磷酸盐缓冲液；
BSA：牛血清白蛋白；
Triton X-100：聚乙二醇辛基苯基醚。
(4)采样工具：无菌试管。
(5)点好探针的芯片18张。
2、样本处理
(1)取家畜的唾液或粪便，用无菌5mL试管收集1～3ml；
(2)向试管中加入4倍体积的4％的NaOH，摇匀，室温放置15～30分钟待液化；
(3)取液化后标本1.0ml至1.5ml离心管，12,000转/分钟离心5分钟；
(4)去上清，沉淀加灭菌生理盐水1ml混匀，12,000转/分钟离心5分钟；
(5)去上清，沉淀加灭菌生理盐水1ml混匀，12,000转/分钟离心5分钟；
(6)去上清，沉淀中加入50μlDNA提取液(市售试剂盒，150ml DNA提取液：1M Tris 15ml，0.5M EDTA 6ml，5M NaCl42ml，CTAB 4.5g，PVP3g，硫代硫酸钠0.3g，巯基乙醇4ml)；
充分混匀，100℃恒温处理10分钟；
(7)2,000转/分钟离心5分钟，上清即为样本DNA，取上清至0.2ml离心管，备用。
样品存放：制备的样品在2℃-8℃条件下保存不超过24小时，若需长期保存应置-70℃以下，但应避免反复冻融。
3、样本扩增标记
依据下表所示的PCR体系，加入各种组分，同时配制阴、阳性对照质控体系，然后在漩涡振荡器上振荡混匀，接着在离心机上快速离心10秒，最后放入PCR仪中按表3所述反应程序进行扩增。
注：阳性对照反应体系中的模板为2μl阳性对照品，其他组分不变；检测反应体系中的模板为2μl待检样品DNA，其他组分不变；阴性对照反应体系中的模板为2μl阴性对照，其他组分不变。
表2扩增反应体系
| 组分 | 体积(μl) | 浓度 |
| 10×PCR缓冲液 | 6 | 1× |
| 10mM d(A+G+C)TPs | 0.6 | 0.1mM |
| 2mM dTTP | 1.5 | 0.05mM |
| 2mM dUTP | 1.5 | 0.05mM |
| UNG酶(1U/μl) | 0.1 | 0.1U/60μl |
| 1mMBiotin-11-dUTP | 1.5 | 0.025mM |
| 5μM牛布鲁氏杆菌引物(SEQ ID NO：11、12) | 2.4 | 0.2μM |
| 5μM山羊布鲁氏杆菌引物(SEQ ID NO：13、14) | 2.4 | 0.2μM |
| 5μM绵羊布鲁氏杆菌引物(SEQ ID NO：15、16) | 2.4 | 0.2μM |
| 5μM牛结核分枝杆菌引物(SEQ ID NO：17、18) | 2.4 | 0.2μM |
| 5μM人结核分枝杆菌引物(SEQ ID NO：19、20) | 2.4 | 0.2μM |
| 5μM阳性内参引物 | 2.4 | 0.2μM |
| 模板 | 2.0 | |
| Taq DNA聚合酶(5U/μl) | 0.6 | 3U/60μl |
| ddH20 | 31.8 | |
| 总计 | 60 |
表中阳性内参引物的序列为：上游引物5′-GGCATACAGTCCTCATCCAG-3′
(序列表中的SEQ ID NO：23)，
下游引物5′-ACGGCTCTTCCCTCCAAG-3′
(序列表中的SEQ ID NO：24)，
表3PCR反应程序
4.杂交、显色
(1)预杂交：在装有基因芯片的方形小皿上写上样品编号(包括待测样品和阴、阳性对照样品)，向小皿中加入450μl预杂交液，置杂交仪上40℃预杂交30分钟；
(2)杂交：在预杂交过程中，将PCR产物置于PCR仪中变性10分钟，然后立刻置于冰水浴10分钟，在杂交小皿中加450μl杂交液，将PCR产物加入杂交小皿中于46℃杂交90分钟；
(3)洗涤：分别用2×SSC洗涤液450μl将杂交芯片洗涤两次，再用0.1×SSC洗涤液450μl将杂交芯片洗涤两次，每次各3分钟；
(4)封闭：向杂交芯片中加入400μl封闭液，置杂交仪上于40℃封闭20分钟；
(5)酶联：取适量的酶联缓冲液，按SAv-AP∶酶联缓冲液＝1∶1200比例加入SAv-AP，振荡混匀，取混和液400μl加入杂交芯片中，置杂交仪上于40℃酶联反应20分钟；
(6)洗涤：取400μl的酶联缓冲液将杂交芯片洗涤3次，每次3分钟；
(7)显色：配制显色液(400μl底物缓冲液+2μlBCIP+2μl-NBT)，在小皿中加入400μl显色液，40℃显色3分钟，随时观察杂交芯片上的显色情况及本底深浅；
(8)终止显色：用终止液终止显色，然后用蒸馏水反复冲洗数次；
(9)放于芯片阅读仪上阅读结果。
5、结果阅读
(1)适用于和利时全自动芯片成像分析仪；
(2)杂交完毕后，将需要阅读的芯片连同芯片载盘一起取出，放入芯片分析仪中，并固定载盘；
(3)打开分析仪开关，登录实验员帐号进入主界面，选择“芯片分析”，进入芯片选择界面，选取待分析芯片所对应的载盘位号；
(4)点击“下一步”进入芯片预处理和条形码读取界面，若有仪器无法识别的条形码需在条形码输入界面中手动输入条形码编号；(输入条形码号时注意芯片类型是否正确)
(5)输入完成后点击“保存”，然后“开始分析”，分析所得结果可于“结果处理”选项中查询，也可直接生成报告单打印或传输到与此成像分析仪相连的PC机上的配套管理软件中；
(6)分析仪会经过阅读和计算得出各点检测值，并与参考值(Cut off值)进行比较得检测结果。结果类型如下：
+：阳性
-：阴性
芯片污染：空白对照点检测值高于参考值，该样本需重新检测。
非特异：阴性内参点的检测值高于参考值，该样本需重新检测。
实验失败：阳性内参点的检测值低于参考值，该样本需重新检测。
注：推荐使用软件进行结果分析，可减少人为误差影响。
本发明方法能在短时间内检测5种牛羊感染细菌病原体，快速准确地获取样品中的信息，检测效率是传统检测手段的数十倍。
本发明提供了一整套芯片的制备杂交显色过程。
本发明提供了完整的探针排布，优化方案。此方案依据实例调整，具有合理性。
芯片可大规模生产，无污染。此发明质量、精度、效率比传统细菌检测方法均有提高，易于加工操作，使用简便。
图1牛羊感染细菌病原体检测芯片设计模式图；质控点：★点样过程质控；■阳性内参；◆杂交质控；□阴性内参；☆空白对照；检测探针：①山羊布氏②牛布氏③人结核④绵羊布氏⑤牛结核。
附图说明
图为2牛羊感染细菌病原体检测阳性结果。
为进一步说明本发明用于检测牛羊感染细菌病原体的基因芯片及其检测方法，特举以下的实施例进行说明，该实施例是为了解释而不是以任何方式限制本发明。
实施例1
具体实施方式
牛布鲁氏杆菌(Brucella abortus)DEFINITION Brucella abortus strain 544uracilpermease homolog(bme16)and Bme11(bme11)genes，partial cds.检测探针的设计与合成
一、设计
通过文献检索及美国国家生物信息中心(NCBI)的比对获得该细菌病原体的检测探针。第一步，根据大量的前期文献调研，确定了该病原体的目标基因。经Genbank检索，BLAST序列比对得到相对保守区(靶序列)；
第二步，依据探针设计原则，采用Primer Premier5.0和Oligo6.0软件，在此保守区内设计针对病原体的检测探针；
得到检测探针的序列后，由专门的生物公司去合成相应的探针片段。相应的核酸序列如下：
以下是选取的牛布鲁氏杆菌基因组核酸序列中的相对保守区(靶序列)：
片段1(SEQ ID NO：1)
GATCAGATGCAGAAGCGTACCGCCGCAACCGATCTCGATATCGTCGGAATGTGCCTGCATCTCCTGCGCTTTTATAATGGCATCGAGCCGGTGAATATCG
将上述细菌片段1输入软件Primo Multiplex3.4Multiplex PCR Primer Design，设定好参数，运行程序，(5′PRIMER 0-2003’PRIMER-200-0TM：57℃TM Formula NearestN％GC 50ANYCheck primer-primer dimmer Avoid backgroung priming Multiplex PCR5Specificity Medium其余参数为默认值。)
选取长度合适的计算结果，最终作为细菌的检测探针片段。
该检测探针为：GTCGGAATGTGCCTGCATCTCCTGCGCTTTTATAATGGCATCGAGCCGGTG(SEQ ID NO：6)。
二、合成
探针的合成：将设计好的探针交给专门的生物公司去合成。
实施例2
山羊布鲁氏杆菌(Brucella.Melitensis)DEFINITION Brucella melitensis insertionsequence IS711，partial sequence.检测探针的设计与合成方法同实施例1，选取的山羊布鲁氏杆菌基因组核酸序列的相对保守区(靶序列)为：
片段2(SEQ ID NO：2)
TCGGCTCAGAATAATCCACAGAAGGTAGAGCAGTAATATCCAATAGACGCCATTAACAATAGCGAGATTGGAATAGCTTACCCGCCAATCTTCGCCCTGCCACCAGCCAATAACGGCAATTATCGCTGTCACTGTTGCAAGTATGGCAGCGAGCGCTCTAGCGTGACGAAGCACTGTCTTTCTGACAATTTCCAGATTCACCCCTAGGGCGTGTCTGCATTCAACGTAACCAGATCATAGCGCATGCGAGATGGACGAAGCCCATGAATGCGGTCAATGTTTTCTCGCATCG
检测探针为：ACCCGCCAATCTTCGCCCTGCCACCAGCCAATAACGGCAATTATCGCT(SEQ ID NO：7)。
实施例3
绵羊布鲁氏杆菌(Brucella.Ovis)DEFINITION Brucella melitensis biovar Ovis63/290site of large deletion involving omp25b and wboA.检测探针的设计与合成方法同实施例1，选取的绵羊布鲁氏杆菌基因组核酸序列的相对保守区(靶序列)为：片段3(SEQ ID NO：3)
TTAAGAGTGGAGCGGGTAGCGGGAATCGAACCCGCGCGTTCAGCTTGGGAAGCTGACAGGCTACCATTACATCATACCCGCACCGCATAAGCGCTTCGCACTTTTGCTGGTAAA
根据片段3设计的检测探针：GCTTGGGAAGCTGACAGGCTACCATTACATCATACCCGCACCGCATA(SEQ ID NO：8)。
实施例4
牛结核分枝杆菌(Mycobacterium bovis)DEFINITION Mycobacterium bovis BCG Pasteur1173P2，complete genome.检测探针的设计与合成
方法同实施例1，选取的牛结核分枝杆菌基因组核酸序列的相对保守区(靶序列)为：片段4(SEQ ID NO：4)：
GCCGCAAAACTCGGACACGCTTGCATAGTCTCGGTCGACTGTGAACGCGACGACCTCATATTCCGAATCCCTTGTGAAGTAGTAATGTGCGAGCTGAGCGATGTCGCCGCTCCCAAAAATTACCAATGGTTTGGTCATGACGCCTTCCTAACCAGAATTGTGAATTCATACAAGCCGTAGTCGTGCAGAAGCGCAACACTCTTGGAGTGGCCTACAACGGCGCTCTCCGCGGCGCGGGCGTACCGGATATCTTAGCTGGTCAATAGCCATTTTTCAGCAATTTCTCAGTAACGCTACGGGGCGCGCCGTGCCGTAGTAGCGTCCCCACTGATGTGGACGATGGTGCTCCTTTTGGGGTTGG
检测探针：CAAGGGATTCGGAATATGAGGTCGTCGCGTTCACAGTCGACCGAGACTA(SEQ ID NO：9)。
实施例5
人结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosi s)DEFINITION Mycobacteriumtuberculosis H37Rv complete genome；segment 5/13.检测探针的设计与合成方法同实施例1，选取的人结核分枝杆菌基因组核酸序列的相对保守区(靶序列)为：片段5(SEQ ID NO：5)：
GAAATTGCGTGTGCATCATCTGGCAGGCTATGTTCCCGCTACGCTGCAGCCCATCATGGATGTGCGGCTAACGAAGAGGTAATGACATGGCGCAAGCGACATCGGGCATTCGCGCGGCACTTTCGCAACCTGCTGTGTATGAGGCGTATCAGCGGATTGCGGGCGCTAAAAGCGGGCTTGCGTGGATCACAACCGACCCCATCCAGTCGTTGCCAGGCATGCGTACTCTCGACCTCGGTTGCT
检测探针：GCGGCACTTTCGCAACCTGCTGTGTATGAGGCGTATCAGCGG(SEQ ID NO：10)。
实施例6
检测牛羊感染细菌病原体的基因芯片的制备
1、探针定量
用紫外分光光度计定量实施例1-5合成的检测探针以及合成的阴、阳性内参质控探针，然后将探针稀释成50ng/μl，准备芯片点样，探针的点样量为50nl。
2、切膜：选用合适的硝酸纤维素膜，于切膜机中准确裁剪成方形芯片，规格为1.5cm×1.5cm。
3、贴膜：将芯片用胶固定于1.5cm×1.5cm芯片方血中，使之紧贴芯片方皿底部，放置2分钟，胶凝固后，芯片平整地贴于芯片方皿底部，在芯片方皿的边框上作一定向标志或编号。
4、点膜：按下列芯片布局对探针进行点样。点样时将已配制好的探针溶液逐个加入与已布局好的点样针相应位置的探针盘孔中。每种探针点两针，点样时将点样仪推拉杆推到吸样位置，点样针与探针盘孔对准，按下顶部按钮，吸取探针(样品)液，停留3-5秒，吸样完毕，放松按钮，点样针架自动弹起。然后将点样仪推拉杆推到点样位置，此时已吸液的点样针对准芯片方皿中的膜片，按下按钮，停留3-5秒，放松按钮，点样针架自动弹起。重复此操作1-3次，点样完毕。
芯片布局如图1所示
点样过程质控所用试剂为有色染料；
杂交质控所用试剂为生物素；
空白对照所用试剂为1倍的点样缓冲液(10％海藻糖溶液)；
阴、阳性内参质控探针的序列及合成如以上本发明具体的实施方案的“基因芯片制备”一节中所述。
5、交联
把点好样的芯片放入在紫外灯下照射10分钟，封装后4℃保存。
实施例7
试剂盒在五种细菌检测中的应用
1、样本的处理过程：
(1)取病畜的唾液，用无菌5mL试管收集1～3mL；
(2)向玻璃管中加入4倍体积的4％的NaOH，摇匀，室温放置15～30分钟待液化；
(3)取液化后标本1.0mL至1.5mL离心管，12,000转/分钟离心5分钟；
(4)去上清，沉淀加灭菌生理盐水1mL混匀，12,000转/分钟离心5分钟；
(5)去上清，沉淀加灭菌生理盐水1mL混匀，12,000转/分钟离心5分钟；
(6)去上清，沉淀中加入50μlDNA提取液充分混匀，100℃恒温处理10分钟；
(7)2,000转/分钟离心5分钟，上清即为样本DNA，取上清至0.2ml离心管，备用；
2、5种细菌病原体DNA的PCR扩增标记
标记PCR扩增的反应体系和程序按本说明书的具体实施方案中所述进行，循环条件和 次数如下：
37℃10min
94℃3min
72℃10min
3.PCR标记产物变性：
PCR循环后的产物置PCR仪中99℃加热变性10分钟，然后迅速放入冰上骤冷10分钟。
4.杂交、显色：
(1)预杂交：在装有基因芯片的方形小皿上写上样品编号(包括待测样品和阴、阳性对照样品)，向小皿中加入450μl预杂交液，置杂交仪上40℃预杂交30分钟；
(2)杂交：在预杂交过程中，将PCR产物置于PCR仪中变性10分钟，然后立刻置于冰水浴10分钟，在杂交小皿中加450μl杂交液，将PCR产物加入杂交小皿中于46℃杂交90分钟；
(3)洗涤：分别用2×SSC洗涤液450μl将杂交芯片洗涤两次，再用0.1×SSC洗涤液450μl将杂交芯片洗涤两次，每次各3分钟；
(4)封闭：向杂交芯片中加入400μl封闭液，置杂交仪上于40℃封闭20分钟；
(5)酶联：取适量的酶联缓冲液，按SAv-AP∶酶联缓冲液＝1∶1200比例加入SAv-AP，振荡混匀，取混和液400μl加入杂交芯片中，置杂交仪上于40℃酶联反应20分钟；
(6)洗涤：取400μl的酶联缓冲液将杂交芯片洗涤3次，每次3分钟；
(7)显色：配制显色液(400μl底物液+2μl BCIP+2μl NBT)，在小皿中加入400μl显色液，40℃显色3分钟，随时观察杂交芯片上的显色情况及本底深浅；
(8)终止显色：用终止液终止显色，然后用蒸馏水反复冲洗数次；
(9)放于芯片阅读仪上阅读结果。
5.结果观察
结果见图2
按照本试剂盒的检测方法操作，芯片杂交后各点的显色情况较好。
芯片阅读结果：
牛羊细菌病原体基因芯片检测结果
SEQUENCE LISTING
<110>北京爱普益生物科技有限公司
<120>检测牛羊感染细菌病原体的基因芯片、试剂盒及其制备方法、检测方法
<130>SGF
<160>24
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>166
<212>DNA
<213>牛布鲁氏杆菌
<400>1
gatcagatgc agaagcgtac cgccgcaacc gatctcgata tcgtcggaat gtgcctgcat 60
ctcctgcgct tttataatgg catcgagccg gtgaatatcg gcagcggaga agaaatctcg 120
atcaaggaac tggcactcac cgttgcacgt atcgttggct atgaag 166
<210>2
<211>292
<212>DNA
<213>山羊布鲁氏杆菌
<400>2
tcggctcaga ataatccaca gaaggtagag cagtaatatc caatagacgc cattaacaat 60
agcgagattg gaatagctta cccgccaatc ttcgccctgc caccagccaa taacggcaat 120
tatcgctgtc actgttgcaa gtatggcagc gagcgctcta gcgtgacgaa gcactgtctt 180
tctgacaatt tccagattca cccctagggc gtgtctgcat tcaacgtaac cagatcatag 240
cgcatgcgag atggacgaag cccatgaatg cggtcaatgt tttctcgcat cg 292
<210>3
<211>114
<212>DNA
<213>绵羊布鲁氏杆菌
<400>3
ttaagagtgg agcgggtagc gggaatcgaa cccgcgcgtt cagcttggga agctgacagg 60
ctaccattac atcatacccg caccgcataa gcgcttcgca cttttgctgg taaa 114
<210>4
<211>361
<212>DNA
<213>牛结核分枝杆菌
<400>4
gccgcaaaac tcggacacgc ttgcatagtc tcggtcgact gtgaacgcga cgacctcata 60
ttccgaatcc cttgtgaagt agtaatgtgc gagctgagcg atgtcgccgc tcccaaaaat 120
taccaatggt ttggtcatga cgccttccta accagaattg tgaattcata caagccgtag 180
tcgtgcagaa gcgcaacact cttggagtgg cctacaacgg cgctctccgc ggcgcgggcg 240
taccggatat cttagctggt caatagccat ttttcagcaa tttctcagta acgctacggg 300
gcgcgccgtg ccgtagtagc gtccccactg atgtggacga tggtgctcct tttggggttg 360
g 361
<210>5
<211>243
<212>DNA
<213>人结核分枝杆菌
<400>5
gaaattgcgt gtgcatcatc tggcaggcta tgttcccgct acgctgcagc ccatcatgga 60
tgtgcggcta acgaagaggt aatgacatgg cgcaagcgac atcgggcatt cgcgcggcac 120
tttcgcaacc tgctgtgtat gaggcgtatc agcggattgc gggcgctaaa agcgggcttg 180
cgtggatcac aaccgacccc atccagtcgt tgccaggcat gcgtactctc gacctcggtt 240
gct 243
<210>6
<211>51
<212>DNA
<213>牛布鲁氏杆菌
<400>6
gtcggaatgt gcctgcatct cctgcgcttt tataatggca tcgagccggt g 51
<210>7
<211>48
<212>DNA
<213>山羊布鲁氏杆菌
<400>7
acccgccaat cttcgccctg ccaccagcca ataacggcaa ttatcgct 48
<210>8
<211>47
<212>DNA
<213>绵羊布鲁氏杆菌
<400>8
gcttgggaag ctgacaggct accattacat catacccgca ccgcata 47
<210>9
<211>49
<212>DNA
<213>牛结核分枝杆菌
<400>9
caagggattc ggaatatgag gtcgtcgcgt tcacagtcga ccgagacta 49
<210>10
<211>42
<212>DNA
<213>人结核分枝杆菌探针
<400>10
gcggcacttt cgcaacctgc tgtgtatgag gcgtatcagc gg 42
<210>11
<211>19
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>primer
<400>11
gatcagatgc agaagcgta 19
<210>12
<211>19
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>primer
<400>12
cttcatagcc aacgatacg 19
<210>13
<211>18
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>primer
<400>13
tcggctcaga ataatcca 18
<210>14
<211>18
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>primer
<400>14
cgatgcgaga aaacattg 18
<210>15
<211>19
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>primer
<400>15
tttaccagca aaagtgcga 19
<210>16
<211>18
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>primer
<400>16
ttaagag tgg agcgggta 18
<210>17
<211>16
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>primer
<400>17
gccgcaaaac tcggac 16
<210>18
<211>16
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>primer
<400>18
ccaaccccaa aaggag 16
<210>19
<211>16
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>primer
<400>19
gccgcaaaac t cggac 16
<210>20
<211>16
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>primer
<400>20
ccaaccccaa aaggag 16
<210>21
<211>51
<212>DNA
<213>阳性内参
<400>21
5′-tttggggtgc ttgatgaaca attacatcgt aataggggct acagagatag a-3′
<210>22
<211>51
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>阴性内参
<400>22
ctggcgaatc tgaatgcagt ttaacggctc aaccaagttg aactcagacg c 51
<210>23
<211>20
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>primer
<400>23
ggcatacagt cctcatccag 20
<210>24
<211>18
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>primer
<400>24
acggctcttc cctccaag 18
Claims (4)
1.一种检测牛羊感染细菌病原体的基因芯片，包括固相载体硝酸纤维素膜和固定在该载体上的寡聚核苷酸探针，其中寡聚核苷酸探针包括检测探针和质量控制探针，其特征在于：芯片样品点的布局为低密度布局，样品点少于200个；所述的寡聚核苷酸检测探针是从牛布鲁氏杆菌、山羊布鲁氏杆菌、绵羊布鲁氏杆菌、牛结核分枝杆菌和人结核分枝杆菌细菌基因组对应的核苷酸序列中选取的DNA片段，其序列分别为序列表中的SEQ ID NO：6、SEQ IDNO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10。
2.制备权利要求1所述的检测牛羊感染细菌病原体的基因芯片的方法，其特征是包括以下的步骤：
(1)检测探针的设计：经Genbank检索，BLAST序列比对分别得到牛布鲁氏杆菌、山羊布鲁氏杆菌、绵羊布鲁氏杆菌、牛结核分枝杆菌和人结核分枝杆菌基因组对应的核苷酸序列中的相对保守区，作为靶序列，依据探针设计原则，采用Primer Premier5.0和Oligo6.0软件，在此保守区内分别设计针对病原体的特异性的检测探针；
(2)检测探针的合成：由专门的生物公司合成上述设计好的探针片段序列；
(3)芯片的制备：包括切膜、贴膜，然后将上述得到的检测探针点膜，紫外交联10分钟，再经存膜即得芯片，其中点膜后所得样品点的直径在200μm-1000μm。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述的相对保守区的序列如下：牛布鲁氏杆菌基因组核苷酸序列中的相对保守区的序列为序列表中SEQID NO：1所示的碱基序列；山羊布鲁氏杆菌基因组核苷酸序列中的相对保守区的序列为序列表中SEQ ID NO：2所示的碱基序列；绵羊布鲁氏杆菌基因组核苷酸序列中的相对保守区的序列为序列表中SEQ ID NO：3所示的碱基序列；牛结核分枝杆菌基因组核苷酸序列中的相对保守区的序列为序列表中SEQ IDNO：4所示的碱基序列；人结核分枝杆菌基因组核苷酸序列中的相对保守区的序列为序列表中SEQ ID NO：5所示的碱基序列。
4.用于检测牛羊感染细菌病原体的试剂盒，其特征是包括：权利要求1所述的基因芯片、待测样品处理试剂、杂交和显色试剂，以及说明书。
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