CN105112532A - 一种检测vhl基因大片段缺失的杂交探针及检测方法与试剂盒 - Google Patents
一种检测vhl基因大片段缺失的杂交探针及检测方法与试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种检测VHL基因大片段缺失的杂交探针及检测方法与试剂盒,涉及基因检测领域。本发明公开的杂交探针上标有荧光信号,由具有SEQ?ID?NO.1~6所示的碱基序列的探针引物制备得到。本发明检测方法包括:利用已采集的待测样本制备细胞涂片;将所述杂交探针置于杂交液中与所述细胞发生杂交反应,获得杂交产物;洗涤所述杂交产物,并进行细胞核染色处理,获得核染色后的细胞涂片;通过荧光显微镜观察所述核染色后的细胞涂片,判断待测样本的DNA是否发生了VHL基因大片段缺失。本发明的试剂盒,包括杂交探针。本发明提供的杂交探针特异性强,灵敏度高,检测方法简单,试剂盒成本低,可以快速、准确的检测VHL基因大片段的缺失。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测领域,尤其涉及一种用于检测VHL基因大片段缺失的杂交探针及检测方法与试剂盒。
背景技术
VHL基因(MIM编号608537)定位于3p25-26,全长10KD,包含三个外显子和两个内含子,可转录形成两种mRNA。包含三个外显子转录产物的mRNA翻译出p30(213个氨基酸)和p19(159个氨基酸)蛋白。p19是VHL基因第二转录起始位点(54号密码子)转录形成的异构体,与p30功能相似。
VHL基因突变方式多样,包括点突变、大片段缺失、小片段缺失或插入、剪切位点突变等。目前检测VHL基因突变最常用的方法是PCR直接测序,确诊率为38%~80%,但PCR测序检测技术只能检测点突变、小片段缺失或插入、剪切位点突变,不能检测VHL基因大片段缺失。
近年来,国内外用于VHL基因大片段缺失检测的方法包括SoμthernBlot、MLPA、RT-PCR及ΜPQFM-PCR等。SoμthernBlot和MLPA具有检测方法操作繁琐,价格昂贵,不适于临床推广应用的缺陷。RT-PCR、ΜPQFM-PCR虽操作简单,但诊断效率却有限。而荧光原位杂交在诊断基因大片段缺失上,兼有诊断效率高且适合临床推广的特点,因此,我们可利用荧光原位杂交来诊断VHL基因大片段缺失,解决现有VHL基因大片段缺失检测效率有限和推广困难的问题。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的问题,提供了可用于VHL基因大片段缺失检测的杂交探针、检测试剂盒和检测方法。
为实现本发明的目的,本发明一方面提供一种用于快速检测VHL基因大片段缺失的杂交探针,其上标有荧光信号,由具有SEQIDNO.1~6所示的碱基序列的探针引物进行PCR制备得到。
其中,所述由具有SEQIDNO.1~6所示的碱基序列的探针引物进行PCR制备得到的杂交探针的大小为300-1000bp。
进一步优选地,所述由具有SEQIDNO.1~6所示的碱基序列的探针引物进行PCR制备得到的杂交探针的大小为300-800bp。
进一步优选地,所述由具有SEQIDNO.1~6所示的碱基序列的探针引物进行PCR制备得到的杂交探针的大小为300-500bp。
为实现本发明的目的,本发明再一方面提供一种应用如SEQIDNO.1~6所示的碱基序列的杂交探针引物合成的杂交探针检测VHL基因大片段缺失的方法,包括:利用已采集的待测样本制备细胞涂片;将所述杂交探针置于杂交液中与所述细胞发生杂交反应,获得杂交产物;洗涤所述杂交产物,并进行细胞核染色处理,获得核染色后的细胞涂片;通过荧光显微镜观察所述核染色后的细胞涂片,判断待测样本的DNA是否发生了VHL基因大片段缺失。
其中,所述待测样本是具有细胞核的细胞,可以是外周血、组织标本、尿液、脊髓及其他含有VHL基因的具有细胞核的样本。
其中,所述荧光原位杂交探针的浓度是约8-20ng/μl。
优选的,所述荧光原位杂交探针的浓度是约10-15ng/μl。
其中,所述杂交反应的共变性温度是70-80℃,共变性反应时间是5-10min。
优选地,所述杂交反应的共变性温度是73-76℃,共变性反应时间是7-8min。
其中,所述杂交反应的杂交温度是40-46℃,杂交时间是14-18h。
进一步优选地,所述杂交反应的杂交温度是42-44℃,杂交时间是16h。
其中,所述应用如SEQIDNO.1~6所示的碱基序列的杂交探针引物对1-3检测VHL基因大片段缺失的方法还包括制备荧光原位杂交探针。
其中,所述制备荧光原位杂交探针包括:在人类基因组中筛选用作FISH探针的VHL基因序列,通过克隆引物对4-6获得目的基因片段;将得到的基因片段连接到质粒中,获得含有目的基因片段的质粒;将所述质粒在大肠杆菌中进行扩增,提取质粒后,得到质粒溶液;利用探针引物、荧光原料和所述质粒溶液制备具有荧光染料标记的荧光原位杂交探针。
其中,所述制备细胞涂片过程包括:分离待测样本中的细胞,经磷酸盐缓冲液洗涤和KCl低渗处理后,用固定液固定所述细胞的形态,制成细胞涂片;将所述细胞涂片进行老化处理,经胃蛋白酶消化处理后,进行酒精梯度脱水,得到细胞涂片。
其中,所述克隆引物对4-6如SEQIDNO.7-12所示的碱基序列,包括:
克隆引物对4F:5’-aaccttagaggggcgaaaaa
R:5’-gcttcagaccgtgctatcgt
克隆引物对5F:5’-aacctttgcttgtcccgata
R:5’-ttatcagagtgggtggcaca
克隆引物对6F:5’-gcaaagcctcttgttcgttc
R:5’-cagtcttcccaaagcaggag。
其中,所述通过克隆引物对4-6获得目的基因片段的反应体系是
其中,反应体系中所述的引物包括克隆引物4、克隆引物5、克隆引物6。
其中,所述通过克隆引物对4-6获得目的基因片段反应条件是:94℃预变性10min,94℃变性30s,58℃退火30s,72℃延伸60s,30个循环,72℃复性7min,4℃保存。
其中,所述将得到的基因片段连接到质粒中的反应体系是:T-vector0.7μl,PCR产物5μl,T4连接酶1μl,T4Bμffer1μl,ddH2O余量,总体积10μl。其中,所述将得到的基因片段连接到质粒中的反应条件是:在室温条件下反应2h。
其中,所述探针引物对1-3如SEQIDNO.1-6所示的碱基序列,包括:
探针引物15’-agtaacgagttggcctagcctcg
5’-cgtcttcttcagggccgtactc
探针引物25’-gtactgacgttttactttttaaaaagataagg
5’-catgctctacacattgttctcctgg
探针引物35’-gcattgcacatcaacggat
5’-cagtcttcccaaagcaggag
其中,所述利用探针引物、荧光原料和所述质粒溶液制备具有荧光染料标记的荧光原位杂交探针的反应体系为:
其中,所述利用探针引物、荧光原料和所述质粒溶液制备具有荧光染料标记的荧光原位杂交探针的反应条件为:94℃预变性2min,94℃变性30s,58℃退火30s,72℃延伸45s,30个循环,72℃复性10min,4℃保存。
其中,所述固定液是由体积比为3:1的甲醇和冰醋酸配制而成。
其中,所述杂交液是是由体积比为5:1:1:3的甲酰胺、20xSSC、硫酸葡聚糖和水配制而成。
其中,所述老化处理是将所述细胞涂片在56℃条件下在烤片机上处理20min。
其中,所述老化处理还可以是在15-30℃的室温条件下过夜放置12-16h。
为实现本发明的目的,本发明再一方面提供一种用于检测VHL基因大片段缺失的试剂盒,包括具有如SEQIDNO.1-6所示的碱基序列的杂交探针引物制备得到的杂交探针,还包括:用于将待测样本制备成细胞涂片的试剂I;用于使所述荧光原位杂交探针与所述细胞发生杂交反应,获得杂交产物的试剂II;用于洗涤所述杂交产物,并进行细胞核染色处理,获得核染色的细胞涂片的试剂III。
其中,所述将待测样本制备细胞涂片的试剂I包括:由体积比为3:1的甲醇和冰醋酸配制而成的固定液。
其中,所述用于使所述荧光原位杂交探针与所述细胞发生杂交反应,获得杂交产物的试剂II包括:由体积比为5:1:1:3的甲酰胺、20×SSC、硫酸葡聚糖和水配制而成的杂交液。
其中,所述用于洗涤所述杂交产物,并进行细胞核染色处理,获得核染色的细胞涂片的试剂III包括:洗涤杂交产物的0.4×SSC溶液制备的0.3%的NP40、2×SSC溶液制备的0.1%的NP40、70%的酒精溶液及对细胞核染色的DAPI。
本发明的有益效果体现在以下方面:
1、本发明提供的杂交探针较短,分子量仅为300-1000bp,探针易于进入细胞核与靶基因杂交结合,且探针序列与除了VHL基因外的其他基因序列拥有极少的重复序列,因此能特异的与VHL基因结合,因此本发明提供的杂交探针具有特异性强、灵敏度高的优点,可以快速检测VHL基因的大片段缺失,检测效果好。
2、本发明提供的VHL基因大片段缺失的检测方法是利用了杂交探针的特异性和灵敏度,操作方法简单,操作流程简便快速,检测结果易于观察,且可以直观的反映待测样本是否发生了VHL基因的大片段缺失。
3、本发明提供的用于检测VHL基因大片段缺失的试剂盒可以对待测样本进行快速准确的检测,适用性广,成本低,便于推广。
附图说明
图1是本发明的待测样本的荧光杂交信号图,图中的白点是荧光亮点;
图2是本发明的阳性对照样本的荧光杂交信号图,图中的白点是荧光亮点;
图3是本发明的阴性对照样本的荧光杂交信号图,图中的白点是荧光亮点。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明,本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的,并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是,在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换,但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1杂交探针的制备
1、杂交探针基因序列的筛选
在人类基因组中筛选用作FISH探针的VHL基因序列,选择兼顾特异性和可行性的探针序列。
VHL基因定位于常染色体3p25-26区,包含三个外显子,检索ΜCSCgenomebrowser、NCBICloneRegistry、EnsemblGenomeBrowser数据库所有含有VHL基因的序列,筛选针对上述外显子的最优杂交探针序列,并编号为1号外显子VHL-Exon1、2号外显子VHL-Exon2、3号外显子VHL-Exon3。
2、杂交探针的制备
2.1制备扩增反应模板。
采集健康者的血样3ml,使用血液基因组DNA提取试剂盒(购自TIANGEN公司,货号DP304)提取血液中的DNA,操作流程按试剂盒的说明书进行,其他公司的DNA提取试剂盒同样适用于本发明。
2.2目的基因的克隆:根据编号VHL-Exon1、VHL-Exon2、VHL-Exon3的基因序列,分别设计克隆引物对4-6:
克隆引物对4F:5’-aaccttagaggggcgaaaaa
R:5’-gcttcagaccgtgctatcgt
克隆引物对5F:5’-aacctttgcttgtcccgata
R:5’-ttatcagagtgggtggcaca
克隆引物对6F:5’-gcaaagcctcttgttcgttc
R:5’-cagtcttcccaaagcaggag。
以步骤2.1提取的DNA为扩增反应模板,以克隆引物对4-6为引物,利用PCR反应分别扩增目的基因片段,反应体系是:总体积50μl,PCRmix25μl,DNA模板100ng,克隆引物各2μl,ddH2O余量,其反应条件是:94℃预变性10min,94℃变性30s,58℃退火30s,72℃延伸60s,30个循环,72℃复性7min,4℃保存,得到目的基因片段。
2.3构建含有目的基因的质粒
将步骤2.2得到的目的基因片段连接到pBlμescript质粒中,其中连接反应的反应体系如表1所示。
表1构建质粒的反应体系
将上述反应体系在室温条件下反应2h,得到含有目的基因片段的质粒。
2.4质粒的转化、培养与提取
将预先培养在LB培养基上的大肠杆菌换至新的LB培养基上进行培养,培养条件为28℃,所述LB培养基由胰蛋白胨10g/L,酵母提取物5g/L,氯化钠10g/L,琼脂粉15g/L组成,备用;再将含有目的基因的质粒采用电转的方式(将该大肠杆菌通过氯化钙处理制备感受态细胞采用热激发进行转化同样适用于本发明)转化到大肠杆菌中,将大肠杆菌涂布接种于LB固体培养基上培养,挑单菌落并接种于10mlLB液体培养基中进行摇菌培养,所述LB液体培养基成分由胰蛋白胨10g/L,酵母提取物5g/L,氯化钠10g/L组成,其中,培养温度是37℃,转速是220r/min,摇床培养8~16h,随后采用质粒纯化试剂盒对该质粒进行提取,操作流程按试剂盒的说明书进行。
需要说明的是,所述质粒纯化试剂盒可以是任意一种可以对质粒进行提取和纯化的试剂盒,根据本发明的实施例,本发明所使用的质粒纯化试剂盒使用GeneMark公司生产的质粒纯化试剂盒。
2.5质粒中目的基因的鉴定
通过PCR的方法扩增质粒,再对扩增产物进行电泳,判断扩增产物的大小是否正确。其中,扩增反应体系是:
反应条件是:
将获得的PCR产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳,在紫外灯下观察电泳结果,判断扩增产物大小是否正确,从而验证目的基因是否在大肠杆菌中正确表达。
经验证,发现扩增产物在600-700bp之间,与预期扩增产物大小一致,因此可知该目的基因已经在大肠杆菌中正确表达。挑取步骤2.4中正确表达目的基因的单菌落大肠杆菌,并接种于2mlLB培养液中,37℃温度条件下,以220r/min的转速进行摇床培养8~16h,取100μl大肠杆菌菌液送至北京诺塞基因组研究中心有限公司测序,从而进一步验证质粒中是否含有完全正确的目的基因序列片段。
2.6荧光杂交探针溶液的制作
验证后,将步骤2.5得到的含有完全正确的目的基因的质粒,用超纯水稀释1000倍后作为制备荧光探针的模板,使用荧光dUTP试剂,通过PCR法制备荧光探针。
其中,设计的探针引物对1-3为:
探针引物15’-agtaacgagttggcctagcctcg
5’-cgtcttcttcagggccgtactc
探针引物25’-gtactgacgttttactttttaaaaagataagg
5’-catgctctacacattgttctcctgg
探针引物35’-gcattgcacatcaacggat
5’-cagtcttcccaaagcaggag
反应体系是:
反应条件是:
2.7测定荧光探针的含量
制备不带荧光的FISH探针作为标准品,采用聚丙烯酰胺胶垂直电泳技术定量荧光探针的含量。
标准品的制备采用步骤2.6的反应体系进行PCR,其中反应体系中不含有荧光dUTP试剂,将获得的PCR产物进行纯化处理后,制备分别含DNA量为100ng、50ng、25ng、12.5ng的探针标准品,取步骤2.6得到的PCR产物5μl,与探针标准品进行丙烯酰胺胶垂直电泳,通过测定电泳产物的光密度值计算步骤2.6得到的5μlPCR产物中含有的荧光探针的量,推知剩余的45μ的PCR产物溶液中荧光探针的含量。
2.8荧光杂交探针的纯化与杂交探针溶液的制备
向剩余的45μl经步骤2.6得到的PCR产物中加入100μlTE,混匀后加15μl乙酸钠、410μl无水乙醇,混匀后在-20℃的温度条件下避光放置30min,4℃13500r/min离心15min,弃上清,再加入500μl、75%乙醇,颠倒数次后离心2min,弃上清,开盖避光放置晾干,加入以体积比为5:1:1:3的甲酰胺、20×SSC、硫酸葡聚糖和水配制而成的杂交液使探针浓度达8-20ng/μl,并于-20℃的温度条件下保存,得到荧光杂交探针溶液。
需要说明的是,该步骤也可以使探针浓度达到在10~15ng/μl的浓度范围。
实施例2血液样本的检测
使用实施例1制得的杂交探针检测血液样本。
1、细胞涂片的制作
抽取外周血3ml,用淋巴细胞分离液处理外周血,得到细胞层,将细胞层进行漂洗处理和低渗处理后,用固定液固定,滴片制成细胞涂片,具体操作步骤如下:
1.1细胞悬浮液的制备
取3ml淋巴细胞分离液至15ml塑胶管中,将3ml的外周血与1.5mlPBS缓冲液混匀后沿所述塑胶管管壁缓慢加于淋巴细胞分离液之上,以2500r/min的速率离心处理30min后,吸出位于中间部分的絮状悬浮细胞,得到细胞悬浮液。
1.2细胞的处理与滴片
将获得的细胞悬浮液置于新的15ml塑胶管中,并向其中加入3倍体积的PBS,混匀后,以1800r/min的速率离心处理10min,弃上清,再加入5mlPBS,混匀,以1500r/min的速率离心处理10min后,弃尽上清。再加入预温至37℃的0.075M的KCl6-8ml进行低渗处理,在37℃温度条件下吹打混匀20min后,再加入2ml由甲醇和冰醋酸按3:1体积比配制而成的固定液,再混匀、以1000r/min的转速离心10min,弃上清,再加入5-8ml同样的固定液(先少量加入,吹匀后再全量加入),混匀,以1000r/min的速率离心10min,弃上清,并重复加固定液和离心步骤2-3次,至细胞呈白色,最后再加入少量的固定液,混匀,当管内物质呈稀米汤样时,将其滴于乙醇浸泡过的洁净无脂载玻片上。
需说明的是,本实施例中为验证检测结果的准确性,在抽取待测患者血液样本进行检测的同时,我们抽取了已确诊为VHL基因大片段缺失患者的外周血3ml作为阳性对照,抽取正常人的外周血3ml作为阴性对照,与待测样本同时进行检测,以验证试验结果的准确性。
1.3老化和透化处理
将上述玻片在烤片机上56℃烤片20min(将该玻片在室温条件下过夜老化同样适用于本发明)后,再依次置于预温为37℃的2×SSC10min、预温至37℃的胃酶中2min,最后在2×SSC中涮一下,倒立在卫生纸上吸干,再分别放入70%、85%、100%酒精中各脱水3min,倒立在卫生纸上晾干,得到老化和透化处理的细胞涂片。
2、FISH荧光探针与细胞的杂交
取10ul的荧光探针溶液,滴加于细胞涂片上,并立即盖上盖玻片,用封片胶封边,放置于杂交仪中杂交,杂交反应的共变性温度是70-80℃,共变性反应时间是5-10min,杂交温度是40-46℃,杂交时间是14-18h。
需要说明的是,杂交反应条件的共变性温度还可以是73-76℃,共变性时间还可以是7-8min;杂交温度还可以是42-44℃,杂交时间还可以是16h。
3、杂交后的洗片处理
小心揭去封片胶和盖玻片后,将载玻片依次置于已经预热为68℃的用0.4×SSC配制的0.3%的NP40溶液中漂洗1.5~2min分钟(同样的,将其置于预热温度为46℃的0.4×SSC配制的0.3%的NP40溶液中漂洗3min依然适用于本发明),室温条件下的2×SSC配制的0.1%的NP40溶液中漂洗30s,最后在70%的酒精中漂洗3min,洗去未结合的荧光探针后,将载玻片晾干,得到纯净的与荧光探针结合的细胞玻片。
4、观察细胞与荧光探针结合情况
向上述细胞玻片中加入3μlDAPI,立即盖上盖玻片,用荧光显微镜观察细胞核内的荧光杂交信号情况,并计200个细胞中异常细胞所占的百分比,得到异常细胞的百分比。细胞核内的荧光杂交信号如图所示,图1为待测样本的荧光杂交信号图,具有两个荧光亮点,图2为阳性对照样本的荧光杂交信号图,只有一个荧光亮点,图3为阴性对照样本的荧光杂交信号图,具有两个荧光亮点。
5、标准阈值建立和结果判读
5.1标准阈值的建立
依照常规的标准阈值检测建立方法,采集健康者的血液样本20例,每份样本观察200个细胞,统计异常细胞的数量和百分比;显示两个荧光信号的为正常细胞,显示小于两个荧光信号的为异常细胞;计算20份样本中异常细胞百分比的平均值和标准差,进而计算阈值(阈值=平均值+3×标准差)。
5.2样本检测结果的判断
计数200个杂交信号清晰可判读的细胞,将异常细胞比例与阈值进行比较,判断VHL基因异常情况,如果等于阈值,需加大细胞计数。
若待测样本观察得到的异常细胞所占总细胞的百分比小于阈值,则表明待测样本细胞没有发生基因大片段缺失;反之,若待测样本观察得到的异常细胞所占总细胞的百分比大于阈值,则表明待测样本细胞发生基因大片段缺失。
根据本发明计算得到的待测样本异常细胞所占总细胞的百分比为4.8%,标准阈值是5.6%,因此待测样本的异常细胞所占百分比小于标准阈值,判定待测样本没有发生VHL基因大片段缺失。
尽管上述对本发明做了详细说明,但不限于此,本技术领域的技术人员可以根据本发明的原理进行修改,因此,凡按照本发明的原理进行的各种修改都应当理解为落入本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种用于快速检测VHL基因大片段缺失的杂交探针,其特征在于,杂交探针上标有荧光信号,由具有SEQIDNO.1~6所示的碱基序列的探针引物进行PCR制备得到。
2.如权利要求1所述的杂交探针,其特征在于,所述杂交探针的大小为300-1000bp。
3.一种使用权利要求1所述的杂交探针检测VHL基因大片段缺失的方法,其特征在于,包括:
利用已采集的待测样本制备细胞涂片;
将所述杂交探针置于杂交液中与所述细胞发生杂交反应,获得杂交产物;
洗涤所述杂交产物,进行细胞核染色处理,获得核染色后的细胞涂片;
通过荧光显微镜观察所述核染色后的细胞涂片,判断待测样本的DNA是否发生了VHL基因大片段缺失。
4.如权利要求3所述的方法,其特征在于,所述荧光原位杂交探针的浓度是8-20ng/μl。
5.如权利要求3所述的方法,其特征在于,所述杂交反应的条件是:共变性温度为73-76℃,共变性时间为5-10min;杂交温度是42-44℃,杂交时间为14-18h。
6.如权利要求3所述的方法,其特征在于,还包括杂交探针的制备,具体包括以下步骤:
在人类基因组中筛选用作FISH探针的VHL基因序列,通过克隆引物获得目的基因片段;
将得到的基因片段连接到质粒中,获得含有目的基因片段的质粒;
将所述质粒在大肠杆菌中进行扩增,提取质粒后,得质粒溶液;
利用探针引物、荧光原料和所述质粒溶液制备具有荧光染料标记的荧光原位杂交探针。
7.如权利要求3所述的方法,其特征在于,所述制备细胞涂片,具体包括以下步骤:
分离所述样本中的细胞,经磷酸盐缓冲液洗涤和KCl低渗处理后,用固定液固定所述细胞的形态,制成细胞涂片;
将所述细胞涂片进行老化处理,经胃蛋白酶消化处理后,进行酒精梯度脱水,得到细胞涂片。
8.一种用于检测VHL基因大片段缺失的试剂盒,其特征在于,包括如权利要求1所述的杂交探针。
9.如权利要求8所述的试剂盒,其特征在于,还包括:
用于将待测样本制备成细胞涂片的试剂;
用于使所述荧光原位杂交探针与所述细胞发生杂交反应,获得杂交产物的试剂;
用于洗涤所述杂交产物,进行细胞核染色处理,获得核染色的细胞涂片的试剂。
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Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN107385092A (zh) * | 2017-09-08 | 2017-11-24 | 银川安龙基因科技有限公司 | 一种检测vhl基因突变的固相pcr试剂盒 |
CN112837746A (zh) * | 2019-11-22 | 2021-05-25 | 成都天成未来科技有限公司 | 用于小麦外显子测序基因定位的探针设计方法及定位方法 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6312890B1 (en) * | 1993-05-14 | 2001-11-06 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Partial intron sequence of von hippel-lindau (VHL) disease gene and its use in diagnosis of disease |
CN104388551A (zh) * | 2014-11-05 | 2015-03-04 | 百世诺(北京)医疗科技有限公司 | 一种检测Von Hippel-Lindau综合征相关基因突变的试剂盒 |
-
2015
- 2015-09-15 CN CN201510586599.6A patent/CN105112532A/zh active Pending
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6312890B1 (en) * | 1993-05-14 | 2001-11-06 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Partial intron sequence of von hippel-lindau (VHL) disease gene and its use in diagnosis of disease |
CN104388551A (zh) * | 2014-11-05 | 2015-03-04 | 百世诺(北京)医疗科技有限公司 | 一种检测Von Hippel-Lindau综合征相关基因突变的试剂盒 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
PACK ET AL: "Constitutional von Hippel-Lindau(VHL)Gene Deletions Detected in VHL Families by Fluorescence in Situ Hybridization", 《CANCER RESEARCH》 * |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN107385092A (zh) * | 2017-09-08 | 2017-11-24 | 银川安龙基因科技有限公司 | 一种检测vhl基因突变的固相pcr试剂盒 |
CN112837746A (zh) * | 2019-11-22 | 2021-05-25 | 成都天成未来科技有限公司 | 用于小麦外显子测序基因定位的探针设计方法及定位方法 |
CN112837746B (zh) * | 2019-11-22 | 2022-11-15 | 成都天成未来科技有限公司 | 用于小麦外显子测序基因定位的探针设计方法及定位方法 |
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