JP2002502615A5

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Publication number: JP2002502615A5
Application number: JP2000530635A
Authority: JP
Filing date: 1999-01-08
Publication date: 2006-02-16
Anticipated expiration: 2019-01-08

Description

【特許請求の範囲】
【請求項１】 DNAサンプル中に、実質的に相同な配列の２以上のセットのどのメンバーが存在しているかを同定する方法であって、
実質的に相同な配列の第1のセット、および、実質的に相同な配列の第２の別のセットを含むDNAサンプルに対して、5'->3'ヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼおよび前記DNAサンプルにハイブリダイズすることのできるフォワードおよびリバースプライマーの１以上のセットを用いて、オリゴヌクレオチドプローブの２以上のセットの存在下で核酸増幅を行ない、実質的に相同な配列のセットの増幅を行なうことであって、
実質的に相同な配列の各セットが、互いに少なくとも１つの塩基位置で異なっている２以上のメンバーを含み、
前記オリゴヌクレオチドプローブの各セットが、実質的に相同な配列のセットの１つに属するメンバーを検出するためのものであり、
前記オリゴヌクレオチドプローブの各セットが、実質的に相同な配列のセットの異なるメンバーに相補的である２以上のプローブを含み、前記メンバーが前記プライマーのハイブリダイズするDNAサンプルの配列に対して5'にあり、
前記オリゴヌクレオチドプローブは、少なくとも、１つを除いて他のプローブと異なる蛍光因子、および前記蛍光因子の蛍光を消光するために前記プローブ上に設けられた消光因子を含むものである、前記増幅を行なうこと；
標的配列にハイブリダイズするこれらのオリゴヌクレオチドプローブをポリメラーゼのヌクレアーゼ活性によって増幅中に消化すること；
前記増幅の蛍光スペクトルを検出すること；
前記蛍光スペクトルに対する前記各蛍光因子の蛍光の寄与を計算すること；および、
前記蛍光スペクトルに対する前記各蛍光因子の寄与に基づいて、実質的に相同な配列の異なるメンバーが存在することまたは存在しないことを決定すること；
を含む、前記方法。
【請求項２】核酸増幅が受動的内部標準の存在下で行なわれる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】受動的内部標準がROXである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】全てのオリゴヌクレオチドプローブが異なる蛍光因子を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】核酸増幅が、約４〜6mM MgCl₂を含む反応混合物中で行なわれる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】核酸増幅が、グリセロールを含む反応混合物中で行なわれる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】核酸増幅がゼラチンおよびTWEEN20からなる群のメンバーの少なくとも１つを含む反応混合物中で行なわれる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】核酸増幅が、約７〜９％グリセロール、0.04〜0.06％ゼラチン、および0.005〜0.015％TWEEN20を含む反応混合物中で行なわれる、請求項１に記載の方法。
【請求項９】核酸増幅が、約７〜９％グリセロール、0.04〜0.06％ゼラチン、0.005〜0.015％TWEEN20および25-75mMトリスバッファーを含む反応混合物中で行なわれる、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】核酸増幅が、約７〜９％グリセロール、0.04〜0.06％ゼラチン、0.005〜0.015％TWEEN20、25〜75mMトリスバッファー、pH8.0、４〜６mM MgCl₂、175〜225μM dATP、175〜225μM dCTP、175〜225μM デアザdGTP、350〜450μM dUTP、0.045〜0.055U/μl AMPLITAQ^TM Gold、0.5〜0.015U/μl AmpErase UNG、および57〜63nMの受動的リファレンスを含む反応混合物中で行なわれる、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】フォワードおよびリバースプライマーの１以上のセットが約50〜150塩基長のアンプリコンを規定する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】フォワードおよびリバースプライマーの１以上のセットが約100塩基長未満のアンプリコンを規定する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】全てのプローブの％GCが少なくとも約20％、かつ約80％未満である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】いずれのプローブも４以上の隣接するグアニンを有していない、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】全てのプローブが増幅に使用するアニーリング温度よりも３〜５℃高い融解温度を有し、プライマー融解温度が前記アニーリング温度よりも約２〜４℃低い、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】アニーリング温度が約60〜64℃である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】全てのプローブが約65〜67℃の融解温度を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】プライマー融解温度が約58〜60℃である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】全てのプローブが、プライマーの融解温度よりも約５〜10℃高い融解温度を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】全てのプローブがプライマーの融解温度よりも約７℃高い融解温度を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】いずれのプローブも5'末端にグアニンを有しない、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】 3'末端の５つのヌクレオチドがグアニンまたはシトシンを２以下しか有しない、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】プローブの少なくとも１つがそれ自身にハイブリダイズしてヘアピンを形成する、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】少なくとも１つのプローブ上の蛍光因子が、配列にハイブリダイズした場合に、ハイブリダイズしない場合および非-ヘアピン状態の１本鎖形態にある場合よりも強い蛍光を放射する、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】少なくとも１つの蛍光因子がエネルギー転移色素である、請求項１に記載の方法。

これらの結果は、本アッセイが一連のサンプルについてapoEゲノム型を迅速かつ正確に決定することができることを示すものである。本アッセイは冠動脈疾患および／または晩発性アルツハイマー疾患のリスクを評価するための診断ツールとして使用することができる。

本発明のいくつかの実施態様を例示すれば以下のとおりである。

（１） DNAサンプル中に、実質的に相同な配列の２以上のセットのどのメンバーが存在しているかを同定する方法であって、
実質的に相同な配列の第1のセット、および、実質的に相同な配列の第２の別のセットを含むDNAサンプルに対して、5'->3'ヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼおよび前記DNAサンプルにハイブリダイズすることのできるフォワードおよびリバースプライマーの１以上のセットを用いて、オリゴヌクレオチドプローブの２以上のセットの存在下で核酸増幅を行ない、実質的に相同な配列のセットの増幅を行なうことであって、
実質的に相同な配列の各セットが、互いに少なくとも１つの塩基位置で異なっている２以上のメンバーを含み、
前記オリゴヌクレオチドプローブの各セットが、実質的に相同な配列のセットの１つに属するメンバーを検出するためのものであり、
前記オリゴヌクレオチドプローブの各セットが、実質的に相同な配列のセットの異なるメンバーに相補的である２以上のプローブを含み、前記メンバーが前記プライマーのハイブリダイズするDNAサンプルの配列に対して5'にあり、
前記オリゴヌクレオチドプローブは、少なくとも、１つを除いて他のプローブと異なる蛍光因子、および前記蛍光因子の蛍光を消光するために前記プローブ上に設けられた消光因子を含むものである、前記増幅を行なうこと；
標的配列にハイブリダイズするこれらのオリゴヌクレオチドプローブをポリメラーゼのヌクレアーゼ活性によって増幅中に消化すること；
前記増幅の蛍光スペクトルを検出すること；
前記蛍光スペクトルに対する前記各蛍光因子の蛍光の寄与を計算すること；および、
前記蛍光スペクトルに対する前記各蛍光因子の寄与に基づいて、実質的に相同な配列の異なるメンバーが存在することまたは存在しないことを決定すること；
を含む、前記方法。
（２）核酸増幅が受動的内部標準の存在下で行なわれる、（１）に記載の方法。
（３）受動的内部標準がROXである、（２）に記載の方法。
（４）全てのオリゴヌクレオチドプローブが異なる蛍光因子を有する、（１）に記載の方法。
（５）核酸増幅が、約４〜6mM MgCl₂を含む反応混合物中で行なわれる、（１）に記載の方法。
（６）核酸増幅が、グリセロールを含む反応混合物中で行なわれる、（１）に記載の方法。
（７）核酸増幅がゼラチンおよびTWEEN20からなる群のメンバーの少なくとも１つを含む反応混合物中で行なわれる、（１）に記載の方法。
（８）核酸増幅が、約７〜９％グリセロール、0.04〜0.06％ゼラチン、および0.005〜0.015％TWEEN20を含む反応混合物中で行なわれる、（１）に記載の方法。
（９）核酸増幅が、約７〜９％グリセロール、0.04〜0.06％ゼラチン、0.005〜0.015％TWEEN20および25-75mMトリスバッファーを含む反応混合物中で行なわれる、（１）に記載の方法。
（１０）核酸増幅が、約７〜９％グリセロール、0.04〜0.06％ゼラチン、0.005〜0.015％TWEEN20、25〜75mMトリスバッファー、pH8.0、４〜６mM MgCl₂、175〜225μM dATP、175〜225μM dCTP、175〜225μM デアザdGTP、350〜450μM dUTP、0.045〜0.055U/μl AMPLITAQ^TM Gold、0.5〜0.015U/μl AmpErase UNG、および57〜63nMの受動的リファレンスを含む反応混合物中で行なわれる、（１）に記載の方法。
（１１）フォワードおよびリバースプライマーの１以上のセットが約50〜150塩基長のアンプリコンを規定する、（１）に記載の方法。
（１２）フォワードおよびリバースプライマーの１以上のセットが約100塩基長未満のアンプリコンを規定する、（１）に記載の方法。
（１３）全てのプローブの％GCが少なくとも約20％、かつ約80％未満である、（１）に記載の方法。
（１４）いずれのプローブも４以上の隣接するグアニンを有していない、（１）に記載の方法。
（１５）全てのプローブが増幅に使用するアニーリング温度よりも３〜５℃高い融解温度を有し、プライマー融解温度が前記アニーリング温度よりも約２〜４℃低い、（１）に記載の方法。
（１６）アニーリング温度が約60〜64℃である、（１５）に記載の方法。
（１７）全てのプローブが約65〜67℃の融解温度を有する、（１）に記載の方法。
（１８）プライマー融解温度が約58〜60℃である、（１７）に記載の方法。
（１９）全てのプローブが、プライマーの融解温度よりも約５〜10℃高い融解温度を有する、（１）に記載の方法。
（２０）全てのプローブがプライマーの融解温度よりも約７℃高い融解温度を有する、（１）に記載の方法。
（２１）いずれのプローブも5'末端にグアニンを有しない、（１）に記載の方法。
（２２） 3'末端の５つのヌクレオチドがグアニンまたはシトシンを２以下しか有しない、（１）に記載の方法。
（２３）プローブの少なくとも１つがそれ自身にハイブリダイズしてヘアピンを形成する、（１）に記載の方法。
（２４）少なくとも１つのプローブ上の蛍光因子が、配列にハイブリダイズした場合に、ハイブリダイズしない場合および非-ヘアピン状態の1本鎖形態にある場合よりも強い蛍光を放射する、（１）に記載の方法。
（２５）少なくとも１つの蛍光因子がエネルギー転移色素である、（１）に記載の方法。
（２６）少なくとも２つのアレル部位において、5'ヌクレアーゼ増幅反応によってDNAサンプルのゲノム型を決定する方法であって、
少なくとも２つの異なるアレル部位を有するDNAサンプルについて、5'->3'ヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼおよび前記DNAサンプルにハイブリダイズすることのできるフォワードおよびリバースプライマーの少なくとも１つのセットを用いて、アレルオリゴヌクレオチドプローブの２以上のセットの存在下で核酸増幅を行ない、前記少なくとも２つの異なるアレル部位を増幅することであって、
前記アレルオリゴヌクレオチドプローブの各セットは、異なるアレル部位を検出するためのものであり、
前記アレルオリゴヌクレオチドプローブの各セットは、前記プローブセットによって検出されるアレル部位において異なるアレル変異体に相補的である２以上のプローブを含み、前記アレル部位は前記プライマーがハイブリダイズするサンプルDNA配列に対して5'にあり、
少なくとも、１つを除いて全てのアレルオリゴヌクレオチドプローブが他のプローブと異なる蛍光因子、および前記蛍光因子の蛍光を消光すべく前記プローブ上に置かれた消光因子を有するものである、前記増幅を行なうこと；
標的配列にハイブリダイズするアレルオリゴヌクレオチドをポリメラーゼのヌクレアーゼ活性によって増幅中に消化すること；
前記増幅の蛍光スペクトルを検出すること；
前記蛍光スペクトルに対する前記各蛍光因子の蛍光寄与を計算すること；および、
前記蛍光スペクトルに対する前記各蛍光因子の蛍光寄与に基づいて、２以上の異なるアレル部位において、異なるアレル変異が存在するか、または存在しないかを決定すること、
を含む、前記方法。
（２７）少なくとも２つの異なるアレル部位がDNAの単一鎖上にあり、フォワードおよびリバースプライマーの単一セットによって増幅される、（２６）に記載の方法。
（２８）少なくとも２つの異なるアレル部位がDNAの単一鎖上にあり、各アレル部位がフォワードおよびリバースプライマーの異なるセットによって増幅される、（２６）に記載の方法。
（２９）少なくとも２つの異なるアレル部位がDNAの別々の鎖上にあり、各アレル部位がフォワードおよびリバースプライマーの異なるセットによって増幅される、（２６）に記載の方法。
（３０）核酸増幅が受動的内部標準の存在下に行なわれる、（２６）に記載の方法。
（３１）受動的内部標準がROXである、（３０）に記載の方法。
（３２）全てのオリゴヌクレオチドプローブが異なる蛍光因子を有する、（２６）に記載の方法。
（３３）核酸増幅が約４〜６m MgCl₂を含む反応混合物中で行なわれる、（２６）に記載の方法。
（３４）核酸増幅がグリセロールを含む反応混合物中で行なわれる、（２６）に記載の方法。
（３５）核酸増幅がゼラチンおよびTWEEN20からなる群の少なくとも１つのメンバーを含む反応混合物中で行なわれる、（２６）に記載の方法。
（３６）核酸増幅が、約７〜９％グリセロール、0.04〜0.06％ゼラチン、および0.005〜0.015％ TWEEN20を含む反応混合物中で行なわれる、（２６）に記載の方法。
（３７）核酸増幅が、約７〜９％グリセロール、0.04〜0.06％ゼラチン、0.005〜0.015％TWEEN20および25〜75mMトリスバッファーpH8.0を含む反応混合物中で行なわれる、（２６）に記載の方法。
（３８）核酸増幅が、約７〜９％グリセロール、0.04〜0.06％ゼラチン、0.005〜0.015％TWEEN20、25〜75mMトリスバッファーpH8.0、４〜６mM MgCl₂、175〜225μM dATP、175〜225μM dCTP、175〜225μM dGTP、350〜450μM dUTP、0.045〜0.055U/μl AMPLITAQ^TM Gold、0.5〜0.015U/μl AmpErase UNGおよび57〜63nMの受動的リファレンスを含む反応混合物中で行なわれる、（２６）に記載の方法。
（３９）フォワードおよびリバースプライマーが約50〜150塩基長のアンプリコンを規定する、（２６）に記載の方法。
（４０）フォワードおよびリバースプライマーの１以上のセットが約100塩基長未満のアンプリコンを規定する、（２６）に記載の方法。
（４１）全てのプローブの％GCが約20％であり、かつ約80％未満である、（２６）に記載の方法。
（４２）４以上の隣接グアニン（２６）に記載の方法。
（４３）全てのプローブが、増幅に用いられるアニーリング温度よりも３〜５℃高い融解温度を有し、プライマーの融解温度が前記アニーリング温度よりも約２〜４℃低い、（２６）に記載の方法。
（４４）アニーリング温度が約60〜64℃である、（４３）に記載の方法。
（４５）融解温度が約65〜67℃である、（２６）に記載の方法。
（４６）プライマー融解温度が約58〜60℃である、（４５）に記載の方法。
（４７）融解温度がプライマーの融解温度よりも５〜10℃高い、（２６）に記載の方法。
（４８）全てのプローブがプライマーの融解温度よりも約７℃高い融解温度を有する、（２６）に記載の方法。
（４９） 5'末端にグアニンの、（２６）に記載の方法。
（５０）プライマーの3'末端の５つのヌクレオチドがグアニンまたはシトシンを２以下しか含まない、（２６）に記載の方法。
（５１）プローブの少なくとも一つがそれ自身とハイブリダイズしてヘアピンを形成する、（２６）に記載の方法。
（５２）プローブの一つが、配列にハイブリダイズしない場合および非ヘアピン形の一本鎖形態にある場合よりも、配列にハイブリダイズした場合の方が強い蛍光シグナルを放射する、（２６）に記載の方法。
（５３）少なくとも一つの蛍光因子がエネルギー転移色素である、（２６）に記載の方法。
（５４） 5'ヌクレアーゼ増幅反応によって２つのアレル部位においてDNAサンプルのゲノム型決定を行なうための方法であって、
少なくとも２つの異なるアレル部位を有するサンプルDNAについて、5'->3'ヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼ、および前記サンプルDNAにハイブリダイズし得るフォワードおよびリバースプライマーの少なくとも１つのセットを用いて、アレルオリゴヌクレオチドプローブの２以上のセットの存在下で核酸増幅を行ない、前記少なくとも２つのアレル部位を増幅することであって、
前記アレルオリゴヌクレオチドプローブの各セットは、異なるアレル部位を検出するためのものであり、
前記アレルオリゴヌクレオチドプローブの各セットは、前記プローブセットによって検出されるアレル部位において異なるアレル変異体に相補的である２以上のプローブを含み、前記アレル部位は前記プライマーがハイブリダイズする配列の5'にあり、
少なくとも、１つを除いて全てのアレルオリゴヌクレオチドプローブは他のプローブと異なる蛍光因子、および前記蛍光因子の蛍光を消光するために前記プローブ上に置かれた消光因子を含むものである、前記増幅を行なうこと；
前記サンプルDNAにハイブリダイズしているこれらのアレルオリゴヌクレオチドプローブを増幅中にポリメラーゼのヌクレアーゼ活性によって消化すること；
前記増幅の蛍光スペクトルを検出すること；
前記蛍光スペクトルに対する前記各蛍光因子の蛍光寄与を計算すること；
前記蛍光スペクトルに対する前記異なる蛍光因子の蛍光寄与に基づいて、少なくとも２つの異なるアレル部位におて標的配列のゲノム型を決定すること、
を含む、前記方法。
（５５）少なくとも２つのアレル部位においてDNAサンプルのゲノム型を決定するための蛍光スペクトルであって、
少なくとも２つの異なるアレル部位を有するDNAについて、5'->3'ヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼおよび前記DNAサンプルにハイブリダイズすることができるプライマーを用いて、アレルオリゴヌクレオチドプローブの２以上のセットの存在下で核酸増幅を行なったことから導かれる蛍光スペクトルであって、
前記アレルオリゴヌクレオチドプローブの各セットが異なるアレル部位を検出するためのものであり、
前記アレルオリゴヌクレオチドプローブの各セットが、前記プローブセットにより検出されるアレル部位において異なるアレル変異体に相補的である２以上のプローブを含み、前記アレル部位は前記プライマーがハイブリダイズする配列の5'にあり、
少なくとも、１つを除いて全てのプローブが他のプローブと異なる蛍光因子、および前記蛍光因子の蛍光を消光するために前記プローブ上に置かれた消光因子を含むものである、
前記蛍光スペクトル。
（５６）少なくとも２つの異なるアレル部位が単一のDNA鎖上に存在し、フォワードおよびリバースプライマーの単一セットによって増幅される、（５５）に記載のスペクトル。
（５７）少なくとも２つの異なるアレル部位が単一のDNA鎖上に存在し、各アレル部位がフォワードおよびリバースプライマーの異なるセットによって増幅される、（５５）に記載の蛍光スペクトル。
（５８）少なくとも２つの異なるアレル部位が別々のDNA鎖上にあり、各アレル部位がフォワードおよびリバースプライマーの異なるセットによって増幅される、（５５）に記載の蛍光スペクトル。
（５９）核酸増幅が受動的内部標準の存在下で行なわれる、（５５）に記載の蛍光スペクトル。
（６０）受動的内部標準がROXである、（５９）に記載の蛍光スペクトル。
（６１）全てのオリゴヌクレオチドプローブが異なる蛍光因子を含む、（５５）に記載のスペクトル。
（６２）フォワードおよびリバースプライマーが約50〜150塩基長のアンプリコンを規定する、（５５）に記載のスペクトル。
（６３）フォワードおよびリバースプライマーの１以上のセットが約100塩基長未満のアンプリコンを規定する、（５５）に記載のスペクトル。
（６４）蛍光因子の少なくとも１つがエネルギー転移色素である、（５５）に記載のスペクトル。
（６５）少なくとも２つのアレル部位においてDNAサンプルのゲノム型を決定するための蛍光シグネチャーであって、
5'->3'ヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼおよび前記DNAサンプルにハイブリダイズすることのできるフォワードおよびリバースプライマーを用いて、アレルオリゴヌクレオチドプローブの２以上のセットの存在下でDNAサンプルについて核酸増幅を行ない、前記少なくとも２つの異なるアレル部位を増幅したことから導かれる蛍光スペクトルに対する少なくとも３種の蛍光因子の蛍光シグナル寄与を含み、
前記アレルオリゴヌクレオチドプローブの各セットが異なるアレル部位を検出するためのものであり、
前記アレルオリゴヌクレオチドプローブの各セットは、前記プローブセットによって検出されるアレル部位において異なるアレル変異体に相補的である２以上のプローブを含み、前記アレル部位は前記プライマーがハイブリダイズする配列に対して5'にあり、
少なくとも、１つを除いて全てのオリゴヌクレオチドプローブが他のプローブと異なる蛍光因子、および前記蛍光因子の蛍光を消光するために前記プローブ上におかれた消光因子を含むものである、
前記蛍光シグネチャー。
（６６）少なくとも２つの異なるアレル部位がDNAの単一鎖上にあり、フォワードおよびリバースプライマーの単一セットによって増幅される、（６５）に記載の蛍光シグネチャー。
（６７）少なくとも２つの異なるアレル部位がDNAの単一鎖上にあり、各アレル部位がフォワードおよびリバースプライマーの異なるセットによって増幅される、（６５）に記載の蛍光シグネチャー。
（６８）少なくとも２つの異なるアレル部位がDNAの別々の鎖上に存在し、各アレル部位がフォワードおよびリバースプライマーの異なるセットによって増幅される、（６５）に記載の蛍光シグネチャー。
（６９）核酸増幅が受動的内部標準の存在下で行なわれる、（６５）に記載の蛍光シグネチャー。
（７０）受動的内部標準がROXである、（６９）に記載の蛍光シグネチャー。
（７１）全てのオリゴヌクレオチドプローブが異なる蛍光因子を有する、（６５）に記載の蛍光シグネチャー。
（７２）フォワードおよびリバースプライマーが約50〜150塩基長のアンプリコンを規定するものである、（６５）に記載の蛍光シグネチャー。
（７３）フォワードおよびリバースプライマーの１以上のセットが約100塩基長未満のアンプリコンを規定するものである、（６５）に記載の蛍光シグネチャー。
（７４）蛍光因子の少なくとも一つがエネルギー転移色素である、（６５）に記載の蛍光シグネチャー。
（７５）少なくとも２つのアレル部位においてDNAサンプルのゲノム型を決定するための蛍光シグネチャーのライブラリーであって、
少なくとも２つの異なるアレル部位において既知のアレル変異体を有する一連のコントロール配列について、5'->3'ヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼおよび前記DNAサンプルにハイブリダイズすることのできるフォワードおよびリバースプライマーを用いて、アレルオリゴヌクレオチドプローブの２以上のセットの存在下で核酸増幅を行ない、前記少なくとも２つの異なるアレル部位を増幅したことから導かれる一連の蛍光スペクトルに対する少なくとも３種の蛍光因子の蛍光シグナル寄与を含み、
前記アレルオリゴヌクレオチドプローブの各セットは異なるアレル部位を検出するためのものであり、
前記アレルオリゴヌクレオチドプローブの各セットは、前記プローブセットによって検出されるアレル部位において異なるアレル変異体に相補的である２以上のプローブを含み、前記アレル部位は前記プライマーがハイブリダイズする配列に対して5'にあり、
少なくとも、１つを除いて全てのオリゴヌクレオチドプローブが他のプローブと異なる蛍光因子、および前記蛍光因子の蛍光を消光するために前記プローブ上におかれた消光因子を含むものである、
前記ライブラリー。
（７６） DNAサンプルの蛍光シグネチャーを決定する方法であって、
少なくとも２つの異なるアレル部位を有するDNAサンプルについて、5'->3'ヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼおよび前記DNAサンプルにハイブリダイズすることのできるプライマーを用いて、アレルオリゴヌクレオチドプローブの２以上のセットおよび内部標準の存在下で核酸増幅を行ない、前記少なくとも２つの異なるアレル部位を増幅することから得られる蛍光スペクトルに対する少なくとも３種の蛍光因子の蛍光寄与を計算することであって、
前記アレルオリゴヌクレオチドプローブの各セットは異なるアレル部位を検出するためのものであり、
前記アレルオリゴヌクレオチドプローブの各セットは、前記プローブセットによって検出されるアレル部位において異なるアレル変異体に相補的である２以上のプローブを含み、前記アレル部位はプライマーがハイブリダイズする配列に対して5'にあり、
少なくとも、１つを除いて全てのオリゴヌクレオチドプローブが他のプローブと異なる蛍光因子、および前記蛍光因子の蛍光を消光するために前記プローブ上におかれた消光因子を含むものである、前記計算を行なうこと；および、
各蛍光因子の前記蛍光寄与を内部標準に対して正規化すること、
を含み、前記正規化蛍光寄与が前記少なくとも２つの異なるアレル部位に関するDNAサンプルの蛍光シグネチャーに対応するものである、前記方法。
（７７）２以上の異なるアレル部位にてDNAサンプルのゲノム型を決定する方法であって、
少なくとも２つの異なるアレル部位を有する標的配列について、5'->3'ヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼおよび前記DNAサンプルにハイブリダイズすることのできるプライマーを用いて、アレルオリゴヌクレオチドプローブの２以上のセットおよび内部標準の存在下で核酸増幅を行ない、前記２以上の異なるアレル部位を増幅することから得られる蛍光スペクトルに対する少なくとも３種の蛍光因子の蛍光寄与を計算することであって、
前記アレルオリゴヌクレオチドプローブの各セットが異なるアレル部位を検出するためのものであり、
前記アレルオリゴヌクレオチドプローブの各セットは、前記プローブセットによって検出されるアレル部位において異なるアレル変異体に相補的である２以上のプローブを含み、前記アレル部位はプライマーがハイブリダイズする配列に対して5'にあり、
少なくとも、１つを除いて全てのオリゴヌクレオチドプローブが他のプローブと異なる蛍光因子、および前記蛍光因子の蛍光を消光するために前記プローブ上におかれた消光因子を含むものである、前記計算を行なうこと；
各蛍光因子の前記蛍光寄与を内部標準に対して正規化することであって、前記正規化蛍光寄与が前記少なくとも２つの異なるアレル部位に関するDNAサンプルの蛍光シグネチャーに対応するものとなる、前記正規化を行なうこと；および、
前記DNAサンプルの前記正規化蛍光寄与を少なくとも２つのアレル部位にて既知のゲノム型を有するコントロール配列の正規化蛍光寄与と比較することにより、少なくとも２つのアレル部位にてDNAサンプルのゲノム型を決定することを含む、前記方法。
（７８）少なくとも２つの異なるアレル部位にて5'ヌクレアーゼアッセイを用いてDNAサンプルのゲノム型を決定する処理装置であって、
少なくとも２つのアレル部位に対するアレルプローブの存在下で5'ヌクレアーゼアッセイを行ったコントロールサンプルおよび少なくとも１つの未知サンプルの蛍光スペクトル、および前記5'ヌクレアーゼアッセイで使用された少なくとも３種の蛍光因子の蛍光スペクトルをとり、前記スペクトルを用いて、前記少なくとも３種の蛍光因子の前記未知サンプルの蛍光スペクトルおよびコントロール蛍光スペクトルに対する正規化蛍光寄与を計算するためのロジック；および、
前記少なくとも３種の蛍光因子の前記未知サンプルおよび前記コントロールサンプルのスペクトルに対する前記正規化蛍光寄与の比較に基づいて、２以上の異なるアレル部位において少なくとも１つの未知サンプルのゲノム型を決定するためのロジック、
を備えた前記処理装置。
（７９）実質的に相同な配列の２以上のセットのどのメンバーがDNAサンプル中に存在しているかを同定するためのキットであって、
オリゴヌクレオチドプローブの２以上のセットを含み、
前記オリゴヌクレオチドプローブの各セットは実質的に相同な配列のセットの１つに属するメンバーを検出するためのものであり、
前記オリゴヌクレオチドプローブの各セットは、実質的に相同な配列のセットの異なるメンバーに相補的である２以上のプローブを含み、各メンバーはそのセット中の他のメンバーと少なくとも一つの塩基位置で異なっており、
少なくとも、一つを除いてオリゴヌクレオチドプローブは他のプローブと異なる蛍光因子および前記蛍光因子の蛍光を消光するために前記プローブ上におかれた消光因子を有するものである、
前記キット。
（８０）更にフォワードおよびリバースプライマーの１以上のセットを含む、（７９）に記載のキット。
（８１）フォワードおよびリバースプライマーの各セットが約50〜150塩基長のアンプリコンを規定するものである、（８０）に記載のキット。
（８２）フォワードおよびリバースプライマーの各セットが約100塩基長未満のアンプリコンを規定するものである、（８０）に記載のキット。
（８３）全てのプローブが増幅に使用するアニーリング温度よりも３〜５℃高い融解温度を有し、プライマーの融解温度が前記アニーリング温度よりも２〜４℃低い、（８０）記載のキット。
（８４）プライマーが約58〜60℃の融解温度を有する、（８０）記載のキット。
（８５）全てのプローブがプライマーの融解温度よりも約５〜10℃高い融解温度を有する、（８０）に記載のキット。
（８６）全てのプローブがプライマーの融解温度よりも約７℃高い融解温度を有する、（８０）に記載のキット。
（８７）すべてのプローブの％GCが少なくとも約20％、かつ約80％未満である、（７９）に記載のキット。
（８８）いずれのプローブも４つ以上の隣接グアニンを有しない、（７９）に記載のキット。
（８９）全てのプローブが約65〜67℃の融解温度を有する、（７９）に記載のキット。
（９０）いずれのプローブも5'末端にグアニンを有しない、（７９）に記載のキット。
（９１）蛍光因子の少なくとも１つがエネルギー転移色素である、（７９）に記載のキット。
（９２）少なくとも２つのアレル部位でDNAサンプルのゲノム型を決定するためのキットであって、
アレルオリゴヌクレオチドプローブの２以上のセットを含み、
前記アレルオリゴヌクレオチドプローブの各セットは異なるアレル部位を検出するためのものであって、
前記アレルオリゴヌクレオチドプローブの各セットは前記プローブセットによって検出されるアレル部位における異なるアレル変異体に相補的である２以上のプローブを含み、前記アレル部位は前記プライマーがハイブリダイズする配列に対して5'にあり、
少なくとも、１つを除いて全てのアレルオリゴヌクレオチドプローブが他のプローブと異なる蛍光因子、および前記蛍光因子の蛍光を消光するために前記プローブ上におかれた消光因子を有しているものである、
前記キット。
（９３）さらにフォワードおよびリバースプライマーの1以上のセットを含む、（９２）記載のキット。
（９４）フォワードおよびリバースプライマーの各セットは約50〜150塩基長のアンプリコンを規定するものである、（９３）に記載のキット。
（９５）フォワードおよびリバースプライマーの各セットは約100塩基長未満のアンプリコンを規定するものである（９３）に記載のキット。
（９６）全てのプローブが増幅に使用するアニーリング温度よりも約３〜５℃高い融解温度を有し、プライマー融解温度が前記アニーリング温度よりも約２〜４℃低い、（９３）に記載のキット。
（９７）プライマーが約58〜60℃の融解温度を有する、（９３）に記載のキット。
（９８）全てのプローブがプライマーの融解温度よりも約５〜10℃低い融解温度を有している、（９３）に記載のキット。
（９９）全てのプローブがプライマーの融解温度よりも７℃高い融解温度を有している、（９３）に記載のキット。
（１００）全てのプローブの％GCが少なくとも約20％であり、かつ、約80％未満である、（９２）に記載のキット。
（１０１）いずれのプローブも４以上の隣接するグアニンを有しない、（９２）に記載のキット。
（１０２）全てのプローブが約65〜67℃の融解温度を有する、（９２）に記載のキット。
（１０３） 5'末端にグアニンを有するプローブが存在しない、（９２）に記載のキット。
（１０４）蛍光因子の少なくとも１つがエネルギー転移色素である、（９２）に記載のキット。
（１０５） 14〜18％グリセロール、0.04〜0.06％ゼラチン、および0.01〜0.03％ TWEEN20を含む反応混合物を含む、5'ヌクレアーゼアッセイを行なうためのキット。
（１０６）更に25〜75mMのトリスバッファーを含む、（１０５）に記載のキット。
（１０７）さらに、４〜６mM MgCl₂、175〜225μM dATP、175〜225μM dCTP、175〜225μMデアザdGTP、350〜450μM dUTP、0.045〜0.055U/μl AMPLITAQ^TM GOld、0.5〜0.015U/μl AmpErase UNG、および57〜63nMの受動的レファレンスを含む、（１０６）に記載のキット。

本発明は、上記で詳述した好ましい実施態様および実施例を参照して開示されているが、これらの実施例は説明のためのものであって、限定の意味はない。なぜならば、当業者は容易に改変を思いつくことが予想され、それらの改変は本発明の精神および付属する請求の範囲の範囲内にあるものだからである。