CN116981781A - 用于高度多重定量pcr的循环多重分析 - Google Patents

用于高度多重定量pcr的循环多重分析 Download PDF

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CN116981781A CN202280021648.XA CN202280021648A CN116981781A CN 116981781 A CN116981781 A CN 116981781A CN 202280021648 A CN202280021648 A CN 202280021648A CN 116981781 A CN116981781 A CN 116981781A
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nucleotides
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D·Y·张
张克柔
L·罗德里格斯
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Yeer Gene Usa
William Marsh Rice University
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Yeer Gene Usa
William Marsh Rice University
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Abstract

本发明描述了通过使用循环多重分析允许对样品中的DNA序列进行高度多重定量PCR(qPCR)检测的混合物和方法，其中在qPCR反应过程中增加的不同荧光信号的排列被用于识别DNA分析物的存在。

Description

用于高度多重定量PCR的循环多重分析
相关申请的交叉引用和序列表的并入
本申请要求于2021年1月15日提交的美国临时专利申请No.63/138,307的权益，其通过引用整体并入本文。本申请包含以ASCII格式以电子方式提交的序列表，并且其通过引用整体并入本文。所述ASCII副本创建于2022年1月13日，命名为P35047WO00_SL.txt，在Microsoft中测量的大小为1,945字节。
关于联邦资助研究的声明
本发明获得美国国立卫生研究院授予的第R01CA203964号拨款并在美国政府的支持下完成。美国政府对本发明拥有一定的权利。
技术领域
本公开涉及分子生物学领域。更具体地，本发明涉及可用于检测、扩增和定量核酸分子的方法和组合物。
序列表的并入
表1提供了本申请中使用的核酸序列。
表1.核酸序列
背景技术
多重定量聚合酶链反应(多重qPCR)是一种广泛接受的分子诊断技术，其用于检测和定量多个不同的DNA靶标序列。在多重qPCR中，包含全部、部分或不含一组DNA靶标的单个DNA样品与一组PCR引物、一组荧光探针、DNA聚合酶以及DNA聚合酶发挥作用所需的缓冲剂和试剂混合。
在多重qPCR的众多实施方案中，所用的DNA聚合酶具有5’至3’核酸外切酶活性，并且DNA探针是探针的一端用荧光团功能化且探针的另一端用荧光猝灭剂功能化的TaqManTM探针。在PCR扩增过程中，如果样品中最初存在DNA靶标，则与DNA靶标序列相对应的PCR扩增子的浓度将会增加。随着PCR扩增子的积累，扩增子与TaqManTM探针结合，并导致探针上的磷酸二酯骨架水解。这种结合导致荧光团与荧光猝灭剂的离域，从而导致溶液荧光增强。
在多重qPCR中，通常，对应于不同DNA靶标的TaqManTM探针将使用光谱上不同的荧光团进行功能化，以便检测对应于特定DNA靶标的存在的特定荧光信号。由于物理和化学性质的限制，光谱上能够被区分的荧光团数量有限；根据具体的荧光团和使用的仪器，该限制在5至10个荧光团之间。
对于肿瘤学和传染病综合症检测中的应用，存在超过20个相关的DNA靶标序列。虽然在某些情况下可以将DNA样品分成多个等分试样，每个等分试样经历不同的多重qPCR反应以检测一组不同的DNA靶标，但实践中，这需要额外劳动力和更高的样品量要求，使得这种解决方案不受欢迎。因此，需要可以将可检测的DNA靶标数量增加至超过光谱上不同的荧光团数量的方法。
发明内容
在一个方面，本公开提供了一种混合物或试剂盒，其包含：(a)任选地，具有5’至3’核酸外切酶活性的DNA聚合酶；(b)任选地，所述DNA聚合酶发挥作用所需的试剂和缓冲剂；(c)任选地，至少一个DNA模板分子；(d)第一正向引物(FP1)，其包含与所述至少一个DNA模板分子的第一区域互补的序列；(e)第一探针(TP1)，其包含与所述至少一个DNA模板分子的第二区域互补或同源的序列；(f)第一反向引物(RP1)，其包含与所述至少一个DNA模板分子的第三区域同源的序列；(g)第二正向引物(FP2)，其包含与所述至少一个DNA模板分子的第四区域互补的序列；(h)第二封阻引物(B2)，其包含与所述至少一个DNA模板分子的所述第四区域部分互补并且与位于所述至少一个DNA模板分子的所述第四区域5’侧的模板子序列部分互补的序列；(i)第二探针(TP2)，其包含与所述至少一个DNA模板分子的第五区域互补或同源的序列；(j)第二反向引物(RP2)，其包含与所述至少一个DNA模板分子的第六区域同源的序列，其中所述第一区域、所述第二区域、所述第三区域、所述第四区域、所述第五区域和所述第六区域不重叠；其中所述第一区域、所述第二区域、所述第三区域、所述第四区域、所述第五区域和所述第六区域各自包含12至50个核苷酸；其中0至5000个核苷酸位于任意两个区域之间；其中所述TP1包含荧光团(TP1荧光团)和荧光猝灭部分；其中所述TP2包含荧光团(TP2荧光团)和荧光猝灭部分；并且其中所述TP1荧光团和所述TP2荧光团在光谱上彼此不同。
在一个方面，本公开提供了一种混合物或试剂盒，其包含：(a)任选地，具有5’至3’核酸外切酶活性的DNA聚合酶；(b)任选地，所述DNA聚合酶发挥作用所需的试剂和缓冲剂；(c)任选地，至少一个DNA模板分子；(d)第一正向引物(FP1)，其包含与所述至少一个DNA模板分子的第三区域互补的序列；(e)第一探针(TP1)，其包含与所述至少一个DNA模板分子的第二区域互补或同源的序列；(f)第一反向引物(RP1)，其包含与所述至少一个DNA模板分子的第一区域同源的序列；(g)第二正向引物(FP2)，其包含与所述至少一个DNA模板分子的第五区域互补的序列；(h)第二封阻引物(B2)，其包含与所述至少一个DNA模板分子的所述第五区域部分互补并且与位于所述至少一个DNA模板分子的所述第五区域5’侧的所述至少一个DNA模板分子的子序列部分互补的序列；(i)第二探针(TP2)，其包含与所述至少一个DNA模板分子的第四区域互补或同源的序列；其中所述至少一个DNA模板分子按从5’至3’的顺序包含所述第一区域、所述第二区域、所述第三区域、所述第四区域和所述第五区域；其中所述第一区域、所述第二区域、所述第三区域、所述第四区域和所述第五区域不重叠；其中所述第一区域、所述第二区域、所述第三区域、所述第四区域和所述第五区域各自包含12至50个核苷酸；其中所述第一区域的最5’端核苷酸与所述第五区域的最3’端核苷酸之间的距离在100至3000个核苷酸之间；其中所述TP1包含荧光团(TP1荧光团)和荧光猝灭部分；其中所述TP2包含荧光团(TP2荧光团)和荧光猝灭部分；并且其中所述TP1荧光团和所述TP2荧光团在光谱上彼此不同。
在一个方面，本公开提供了一种在水性溶液中产生荧光信号的方法，该方法包含：(a)将包含DNA模板分子的样品与以下混合以产生溶液：(i)具有5’至3’核酸外切酶活性的DNA聚合酶；(ii)所述DNA聚合酶发挥作用所需的试剂和缓冲剂；(iii)第一正向引物(FP1)，其包含与所述DNA模板分子的第一区域互补的序列；(iv)第一探针(TP1)，其包含与所述DNA模板分子的第二区域互补或同源的序列；(v)第一反向引物(RP1)，其包含与所述DNA模板分子的第三区域同源的序列；(vi)第二正向引物(FP2)，其包含与所述DNA模板分子的第四区域互补的序列；(vii)第二封阻引物(B2)，其包含与所述DNA模板分子的所述第四区域部分互补并且与位于所述DNA模板分子的所述第四区域5’侧的所述DNA模板分子的子序列部分互补的序列；(viii)第二探针(TP2)，其包含与所述DNA模板分子的第五区域互补或同源的序列；和(ix)第二反向引物(RP2)，其包含与所述DNA模板分子的第六区域同源的序列；其中所述第一区域、所述第二区域、所述第三区域、所述第四区域、所述第五区域和所述第六区域不重叠；其中所述第一区域、所述第二区域、所述第三区域、所述第四区域、所述第五区域和所述第六区域各自包含12至50个核苷酸；其中0至5000个核苷酸位于任意两个区域之间；其中所述TP1包含荧光团(TP1荧光团)和荧光猝灭部分；其中所述TP2包含荧光团(TP2荧光团)和荧光猝灭部分；并且其中所述TP1荧光团和所述TP2荧光团在光谱上彼此不同；和(b)使步骤(a)中的样品经历至少7轮热循环，其中，任选地，每轮包括在等于或大于78℃的温度持续1秒至30分钟与低于75℃的温度持续1秒至4小时之间交替。
在一个方面，本公开提供了一种在水性溶液中产生荧光信号的方法，该方法包含：(a)将包含DNA模板分子的样品与以下混合以产生溶液：(i)具有5’至3’核酸外切酶活性的DNA聚合酶；(ii)所述DNA聚合酶发挥作用所需的试剂和缓冲剂；(iii)第一正向引物(FP1)，其包含与所述DNA模板分子的第三区域互补的序列；(iv)第一探针(TP1)，其包含与所述DNA模板分子的第二区域互补或同源的序列；(v)第一反向引物(RP1)，其包含与所述DNA模板分子的第一区域同源的序列；(vi)第二正向引物(FP2)，其包含与所述DNA模板分子的第五区域互补的序列；(vii)第二封阻引物(B2)，其包含与所述DNA模板分子的所述第五区域部分互补并且与位于所述DNA模板分子的所述第五区域5’侧的所述DNA模板分子的子序列部分互补的序列；和(viii)第二探针(TP2)，其包含与所述DNA模板分子的第四区域互补或同源的序列；其中所述至少一个DNA模板分子按从5’至3’的顺序包含所述第一区域、所述第二区域、所述第三区域、所述第四区域和所述第五区域；其中所述第一区域、所述第二区域、所述第三区域、所述第四区域和所述第五区域不重叠；其中所述第一区域、所述第二区域、所述第三区域、所述第四区域和所述第五区域各自包含12至50个核苷酸；其中所述第一区域的最5’端核苷酸与所述第五区域的最3’端核苷酸之间的距离在100至3000个核苷酸之间；其中所述TP1包含荧光团(TP1荧光团)和荧光猝灭部分；其中所述TP2包含荧光团(TP2荧光团)和荧光猝灭部分；并且其中所述TP1荧光团和所述TP2荧光团在光谱上彼此不同；和(b)使步骤(a)中的样品经历至少7轮热循环，其中，任选地，每轮包括在等于或大于78℃的温度持续1秒至30分钟与低于75℃的温度持续1秒至4小时之间交替。
在一个方面，本公开提供了一种检测样品中的DNA模板序列的方法，该方法包含：(a)将样品与以下混合以产生溶液：(i)具有5’至3’核酸外切酶活性的DNA聚合酶；(ii)所述DNA聚合酶发挥作用所需的试剂和缓冲剂；(iii)第一正向引物(FP1)，其包含与所述DNA模板分子的第一区域互补的序列；(iv)第一探针(TP1)，其包含与所述DNA模板分子的第二区域互补或同源的序列；(v)第一反向引物(RP1)，其包含与所述DNA模板分子的第三区域同源的序列；(vi)第二正向引物(FP2)，其包含与所述DNA模板分子的第四区域互补的序列；(vii)第二封阻引物(B2)，其包含与所述DNA模板分子的所述第四区域部分互补并且与位于所述DNA模板分子的所述第四区域5’侧的所述DNA模板分子的子序列部分互补的序列；(viii)第二探针(TP2)，其包含与所述DNA模板分子的第五区域互补或同源的序列；(ix)第二反向引物(RP2)，其包含与所述DNA模板分子的第六区域同源的序列；其中所述第一区域、所述第二区域、所述第三区域、所述第四区域、所述第五区域和所述第六区域不重叠；其中所述第一区域、所述第二区域、所述第三区域、所述第四区域、所述第五区域和所述第六区域各自包含12至50个核苷酸；其中0至5000个核苷酸位于任意两个区域之间；其中所述TP1包含荧光团(TP1荧光团)和荧光猝灭部分；其中所述TP2包含荧光团(TP2荧光团)和荧光猝灭部分；并且其中所述TP1荧光团和所述TP2荧光团在光谱上彼此不同；(b)使步骤(a)中的溶液经受至少7轮热循环，其中，任选地，每轮包括在等于或大于78℃的温度持续1秒至30分钟与低于75℃的温度持续1秒至4小时之间交替；(c)在TP1和TP2对应的荧光通道中测量步骤(b)中每轮热循环后所述溶液的荧光值；(d)确定TP1(Ct1)和TP2(Ct2)的循环阈值(Ct)；(e)如果Ct1小于35个循环，Ct2小于50个循环，并且[Ct2–Ct1]的值在1个循环和12个循环之间，则正向判定所述样品中存在所述DNA模板。
在一个方面，本公开提供了一种检测样品中的DNA模板序列的方法，该方法包含：(a)将样品与以下混合以产生溶液：(i)具有5’至3’核酸外切酶活性的DNA聚合酶；(ii)所述DNA聚合酶发挥作用所需的试剂和缓冲剂；(iii)第一正向引物(FP1)，其包含与所述DNA模板分子的第三区域互补的序列；(iv)第一探针(TP1)，其包含与所述DNA模板分子的第二区域互补或同源的序列；(v)第一反向引物(RP1)，其包含与所述DNA模板分子的第一区域同源的序列；(vi)第二正向引物(FP2)，其包含与所述DNA模板分子的第五区域互补的序列；(vii)第二封阻引物(B2)，其包含与所述DNA模板分子的所述第五区域部分互补并且与位于所述DNA模板分子的所述第五区域5’侧的所述DNA模板分子的子序列部分互补的序列；和(viii)第二探针(TP2)，其包含与所述DNA模板分子的第四区域互补或同源的序列；其中所述至少一个DNA模板分子按从5’至3’的顺序包含所述第一区域、所述第二区域、所述第三区域、所述第四区域和所述第五区域；其中所述第一区域、所述第二区域、所述第三区域、所述第四区域和所述第五区域不重叠；其中所述第一区域、所述第二区域、所述第三区域、所述第四区域和所述第五区域各自包含12至50个核苷酸；其中所述第一区域的最5’端核苷酸与所述第五区域的最3’端核苷酸之间的距离在100至3000个核苷酸之间；其中所述TP1包含荧光团(TP1荧光团)和荧光猝灭部分；其中所述TP2包含荧光团(TP2荧光团)和荧光猝灭部分；并且其中所述TP1荧光团和所述TP2荧光团在光谱上彼此不同；(b)使步骤(a)中的溶液经历至少7轮热循环，其中，任选地，每轮包括在等于或大于78℃的温度持续1秒至30分钟与低于75℃的温度持续1秒至4小时之间交替；(c)在TP1和TP2对应的荧光通道中测量步骤(b)中每轮热循环后所述溶液的荧光值；(d)确定TP1(Ct1)和TP2(Ct2)的循环阈值(Ct)；和(e)如果Ct1小于35个循环，Ct2小于50个循环，并且[Ct2–Ct1]的值在1个循环和12个循环之间，则正向判定所述样品中存在所述DNA模板。
在一个方面，本公开提供了一种用于检测分析物中的多个DNA靶标的方法，该方法包含：(a)将分析物与以下混合以产生溶液：(i)具5’至3’核酸外切酶活性的DNA聚合酶；(ii)所述DNA聚合酶发挥作用所需的试剂和缓冲剂；(iii)多个PCR引物；(iv)包含荧光团和荧光猝灭部分的多个探针；(b)使步骤(a)中的溶液经历至少7轮热循环，其中，任选地，每轮包括在等于或大于78℃的温度持续1秒至30分钟与低于75℃的温度持续1秒至4小时之间交替；(c)在至少两个荧光通道中测量步骤(b)中每轮热循环后所述溶液的荧光值；(d)确定所述至少两个荧光通道中每一个的循环阈值(Ct)；(e)确定荧光信号增强的时间顺序；(f)将荧光信号增强的顺序映射到所述多个DNA靶标的存在、不存在或数量。
在一个方面，本公开提供了一种混合物或试剂盒，其包含：(a)任选地，具有5’至3’核酸外切酶活性的DNA聚合酶；(b)任选地，所述DNA聚合酶发挥作用所需的试剂和缓冲剂；(c)任选地，DNA模板分子；(d)第一正向引物(FP1)，其包含与所述DNA模板分子的第一区域互补的序列；(e)第一探针(TP1)，其包含与所述DNA模板分子的第二区域互补或同源的序列；(f)第一反向引物(RP1)，其包含与所述DNA模板分子的第三区域同源的序列；(g)第二正向引物(FP2)，其包含与所述DNA模板分子的第四区域互补的序列，其中所述FP2在其3’端处或3’端附近包含与所述DNA模板分子不互补的一个或多个核苷酸；(h)第二探针(TP2)，其包含与所述DNA模板分子的第五区域互补或同源的序列；(i)第二反向引物(RP2)，其包含与所述DNA模板分子的第六区域同源的序列；其中所述第一区域、所述第二区域、所述第三区域、所述第四区域、所述第五区域和所述第六区域不重叠；其中所述第一区域、所述第二区域、所述第三区域、所述第四区域、所述第五区域和所述第六区域各自包含12至50个核苷酸；其中0至5000个核苷酸位于任意两个区域之间；其中所述TP1包含荧光团(TP1荧光团)和荧光猝灭部分；其中所述TP2包含荧光团(TP2荧光团)和荧光猝灭部分；并且其中所述TP1荧光团和所述TP2荧光团在光谱上彼此不同。
在一个方面，本公开提供了一种混合物或试剂盒，其包含：(a)任选地，具有5’至3’核酸外切酶活性的DNA聚合酶；(b)任选地，所述DNA聚合酶发挥作用所需的试剂和缓冲剂；(c)任选地，DNA模板分子；(d)第一正向引物(FP1)，其包含与所述DNA模板分子的第三区域互补的序列；(e)第一探针(TP1)，其包含与所述DNA模板分子的第二区域互补或同源的序列；(f)第一反向引物(RP1)，其包含与所述DNA模板分子的第一区域同源的序列；(g)第二正向引物(FP2)，其包含与所述DNA模板分子的第五区域互补的序列，其中所述FP2在其3’端处或3’端附近包含与所述DNA模板分子不互补的一个或多个核苷酸；和(h)第二探针(TP2)，其包含与所述DNA模板分子的第四区域互补或同源的序列；其中所述至少一个DNA模板分子按从5’至3’的顺序包含所述第一区域、所述第二区域、所述第三区域、所述第四区域和所述第五区域；其中所述第一区域、所述第二区域、所述第三区域、所述第四区域和所述第五区域不重叠；其中所述第一区域、所述第二区域、所述第三区域、所述第四区域和所述第五区域各自包含12至50个核苷酸；其中所述第一区域的最5’端核苷酸与所述第五区域的最3’端核苷酸之间的距离在100至3000个核苷酸之间；其中所述TP1包含荧光团(TP1荧光团)和荧光猝灭部分；其中所述TP2包含荧光团(TP2荧光团)和荧光猝灭部分；其中所述TP1荧光团和所述TP2荧光团在光谱上彼此不同。
附图说明
图1描绘了循环多重分析系统的选定组件和试剂。模板从5’至3’具有6个非重叠区域(编号为1、2、3、4、5和6)。模板、第一反向引物(RP1)和第二反向引物(RP2)左侧、以及第一正向引物(FP1)和第二正向引物(FP2)右侧的黑色箭头表示寡核苷酸的3’端。FP1、第一探针(TP1)、FP2和第二探针(TP2)分别与模板上的第一区域、第二区域、第四区域和第五区域大部分或完全反向互补。RP1和RP2分别与第三区域和第六区域大部分或完全同源。第二封阻引物(B2)与第四区域部分反向互补并且与第四区域5’端紧邻的区域部分反向互补。TP1和TP2有两个不同的5’荧光团修饰。该系统还包含DNA聚合酶。
图2描绘了循环多重分析系统的两个实施方案。在上方图片中，第一正向引物(FP1)、第二正向引物(FP2)和第二探针(TP2)分别与模板上的第一区域、第四区域和第五区域大部分或完全反向互补。第一探针(TP1)、第一反向引物(RP1)和第二反向引物(RP2)分别与第二区域、第三区域和第六区域大部分或完全同源。TP1具有3’荧光团修饰且TP2具有5’荧光团修饰。在下方图片中，模板从5’至3’具有6个非重叠区域：第三区域(3)、第二区域(2)、第一区域(1)、第六区域(6)、第五区域区域(5)和第四区域(4)。FP1、TP1和FP2分别与模板上的第一区域、第二区域和第四区域大部分或完全反向互补。TP2和RP2与第五区域和第六区域大部分或完全同源。两个实施方案都包含DNA聚合酶。
图3描绘了循环多重分析系统的示意图。在具有两个TaqManTM探针(TP1和TP2)的循环多重分析系统中，在qPCR的第一阶段中，第一正向引物(FP1)和第一反向引物(RP1)将充当正常的引物对并有效产生扩增子1。第二正向引物(FP2)和第二反向引物(RP2)无法有效扩增扩增子2，因为与FP2结合的模板序列的部分也是与第二封阻引物(B2)结合的子序列。因此，B2的存在会导致FP2和RP2的效率降低，从而导致扩增子2扩增和荧光产生的延迟。随着反应的进行，两个引物对都可以在qPCR的最后阶段达到扩增平台阶段。
图4描绘了循环多重分析的示例。在具有两个带有不同荧光团修饰的TaqManTM探针的循环多重分析系统中，一个荧光信号会正常发出荧光，而另一个会在qPCR中相对较晚地发出荧光。不同的颜色排列用于指示不同模板的存在。例如，如果有4个荧光通道仪器可用，则可以同时检测的靶标数量多达4×(4-1)＝12。
图5描绘了两级循环多重分析的示例。在具有三个TaqManTM探针(TP1、TP2和TP3)的循环多重分析系统中，第一正向引物(FP1)和第一反向引物(RP1)将充当标准引物对，以产生扩增子并产生早期荧光。引物对第二正向引物(FP2)和第二反向引物(RP2)与第二封阻引物(B2)在扩增中引物效率较低，导致较晚的荧光。由于第三封阻引物(B3)更强，另一个引物对第三正向引物(FP3)和第三反向引物(RP3)的功能效率要低得多，从而产生非常晚的荧光。当使用两级循环多重分析系统时，如果有4个荧光通道仪器可用，则可以同时检测的靶标数量多达4×(4-1)×(4-2)＝24。注意：一级和二级循环多重分析可以同时使用。
图6描绘了循环多重分析系统的实验演示。使用PowerUpTM SYBRTM Green DNAPolymerase Master Mix将qPCR应用于NA18537人类基因组DNA模板。如上方图片所示的实验示意图，第一探针(TP1)的5’端包含Cy5荧光团，且第二探针(TP2)的5’端包含ROX荧光团。两组引物(FP1和RP1；FP2和RP2)间隔12个核苷酸(nt)。FP1和RP1产生的扩增子长度为121个核苷酸，FP2和RP2产生的扩增子长度为98个核苷酸。实验结果显示在下方图片中，不同条件下所有图表间的Cy5曲线的循环阈值(Ct)一致，这表明引物对的效率不受系统内其他寡核苷酸的影响。ROX通道的Ct值随着第二阻滞剂(B2)浓度的增加而增加，ROX通道和Cy5通道之间的ΔCt也是如此，这证明了循环多重分析系统的成功。
图7描述了循环多重分析系统的选定试剂和组件。在上方图片中，模板从5’至3’具有五个非重叠区域(1、2、3、4、5)。第一正向引物(FP1)、第一探针(TP1)、第二正向引物(FP2)和第二探针(TP2)分别与模板上的第三区域、第二区域、第五区域和第四区域大部分或完全反向互补。第一反向引物(RP1)与第一区域大部分或完全同源。第二封阻引物(B2)与第五区域部分反向互补并且与第五区域5’端相邻的区域部分反向互补。TP1和TP2各自具有不同的5’荧光团修饰。在下方图片中，模板从5’至3’具有七个非重叠区域(1、2、3、4、5、6、7)。FP1、TP1、FP2、TP2、第三正向引物(FP3)和第三探针(TP3)分别与模板上的第三区域、第二区域、第五区域、第四区域、第七区域和第六区域大部分或完全反向互补。RP1与第一区域大部分或完全同源。B2和第三封阻引物(B3)分别与第五区域和第七区域部分反向互补，并且分别与第五区域和第七区域5’端相邻的区域部分反向互补。TP1、TP2和TP3各自具有3’荧光团修饰。两个图片均也都包含DNA聚合酶。
图8描绘了使用第二正向引物(FP2)的3’端错配引物的循环多重分析的替代实施方案。FP2与FP2的3’端处或3’端附近的模板之间的错配会显着降低PCR扩增效率，导致循环阈值(Ct)延迟。错配的数量、错配的核苷酸特性以及错配与FP2的3’端的接近程度会影响Ct延迟的定量。更多的失配、具有较大ΔΔG°值的失配(例如，C-C错配)以及靠近FP2的3’端的错配预计会产生更大的Ct延迟。
具体实施方式
除非另外定义，否则所使用的所有技术术语和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。在以单数形式提供术语的情况下，发明人还设想了以所述术语的复数形式描述的本公开的各个方面。在通过引用并入的参考文献中所使用的术语和定义存在差异的情况下，本申请中使用的术语应具有本文给出的定义。所使用的其它技术术语在其被使用的领域中具有其普通含义，如各种领域特定词典所例示的，例如“《American 科学词典》)”(《美国传统词典(American HeritageDictionaries)》的编辑,2011,波士顿和纽约霍顿米夫林出版公司(Houghton MifflinHarcourt,Boston and New York))、“《麦格劳-希尔科学技术术语词典(McGraw-HillDictionary of Scientific and Technical Terms)》”(第6版,2002,纽约麦格劳-希尔出版公司(McGraw-Hill,New York))或“《牛津生物学词典(Oxford Dictionary ofBiology)》”(第6版,2008,牛津和纽约牛津大学出版社(Oxford University Press,Oxfordand New York))。
包含例如所有专利、公开的专利申请和非专利出版物的本文引用的任何参考文献以全文引用的方式并入本文中。
本文所提供的任何组合物被具体地设想用于本文所提供的任何适用方法。
当呈现一组替代方案时，具体地设想了构成所述组替代方案的成员的任何和所有组合。例如，如果项选自由A、B、C和D组成的组，则发明人将单独地具体地设想每个替代方案(例如，单独的A、单独的B等)以及如A、B和D；A和C；B和C等组合。
当本文中提供数字范围时，所述范围应被理解为包含所述范围的边缘以及所述范围的限定边缘之间的任何数字。例如，“1与10之间”包含1与10之间的任何数字以及数字1和数字10。
如本文所用，除非上下文另有明确说明，单数形式“一个(a)”、“一种(an)”以及“所述(the)”包含复数指示物。例如，术语“化合物”或“至少一种化合物”可以包含多种化合物，包含其混合物。如本文所用，术语“多个”是指大于一个的任何数量。
如本文所用，术语“多个”是指至少两个。在一个方面，本文提供的方法、试剂盒或混合物包含多个引物。在一个方面，本文提供的方法、试剂盒或混合物包含多个探针。在一个方面，本文提供的方法、试剂盒或混合物包含多种封阻引物。
在一个方面，多个引物包含至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9或至少10组正向和反向引物。在一个方面，多个探针包含至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9或至少10个探针。在一个方面，多个封阻引物包含至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9或至少10个探针。
在一个方面，引物、探针或封阻引物与DNA模板分子100％互补。在一个方面，引物、探针或封阻引物与DNA模板分子至少99.5％互补。在一个方面，引物、探针或封阻引物与DNA模板分子至少99％互补。在一个方面，引物、探针或封阻引物与DNA模板分子至少98％互补。在一个方面，引物、探针或封阻引物与DNA模板分子至少97％互补。在一个方面，引物、探针或封阻引物与DNA模板分子至少96％互补。在一个方面，引物、探针或封阻引物与DNA模板分子至少95％互补。在一个方面，引物、探针或封阻引物与DNA模板分子至少90％互补。在一个方面，引物、探针或封阻引物与DNA模板分子至少85％互补。
除非另有明确说明，应当理解，“互补”或“同源”引物、探针或封阻引物可以在引物、探针或封阻引物和与其杂交的DNA模板分子之间包含0、1或2个错配。
如本文所用，“部分互补”序列是指引物、探针或封阻引物与DNA模板分子85％至99.9％、90％至99.9％、91％至99.9％、92％至99.9％、93％至99.9％、94％至99.9％、95％至99.9％、96％至99.9％、97％至99.9％、98％至99.9％、99％至99.9％、或99.5％至99.9％互补。
在一个方面，部分互补序列在引物、探针或封阻引物和DNA模板分子之间包含一个错配。在一个方面，部分互补序列在引物、探针或封阻引物和DNA模板分子之间包含两个错配。在一个方面，部分互补序列在引物、探针或封阻引物和DNA模板分子之间包含三个错配。在一个方面，部分互补序列在引物、探针或封阻引物和DNA模板分子之间包含四个错配。在一个方面，部分互补序列在引物、探针或封阻引物和DNA模板分子之间包含五个错配。在一个方面，部分互补序列在引物、探针或封阻引物和DNA模板分子之间包含六个错配。在一个方面，部分互补序列在引物、探针或封阻引物和DNA模板分子之间包含七个错配。在一个方面，部分互补序列在引物、探针或封阻引物和DNA模板分子之间包含八个错配。在一个方面，部分互补序列在引物、探针或封阻引物和DNA模板分子之间包含九个错配。在一个方面，部分互补序列在引物、探针或封阻引物和DNA模板分子之间包含十个错配。
在一个方面，探针、引物或封阻引物与DNA模板分子的单个区域互补或部分互补。在一个方面，探针、引物或封阻引物与DNA模板分子的两个或更多个区域互补或部分互补。在一个方面，探针、引物或封阻引物与DNA模板分子的三个或更多个区域互补或部分互补。在一个方面，探针、引物或封阻引物与DNA模板分子的四个或更多个区域互补或部分互补。
如本文所用，“错配”是指配对两个不互补的核苷酸的两个序列的比对。错配的非限制性示例包括G-A、G-T、G-U、G-G、C-A、C-T、C-U、C-C、A-A、T-T和T-U。相反，核苷酸的“匹配”比对是指互补对，例如G-C、A-T和A-U。
在一个方面，引物、探针或封阻引物与DNA模板分子互补(完全或部分互补)或同源。如本文所用，“同源”是指与DNA模板分子相同或相似的序列。“相似的”序列在引物、探针或封阻引物和DNA模板之间包含少于5个错配。
为了序列的最优比对以计算它们的百分比互补，可用于比较两个或更多个核苷酸序列之间的序列互补性或同一性的各种成对或多序列比对算法和程序是本领域已知的，例如，ClustalW或Basic Local Alignment Search (BLASTTM)等。尽管其他比对和比较方法是本领域已知的，但是两个序列之间的比对和百分比同一性(包括上述百分比同一性范围)可以通过ClustalW算法确定，参见，例如，Chenna等，“Multiple sequencealignment with the Clustal series of programs,”Nucleic Acids Research 31:3497-3500(2003)；Thompson等，“Clustal W:Improving the sensitivity ofprogressive multiple sequence alignment through sequence weighting,position-specific gap penalties and weight matrix choice,”Nucleic Acids Research 22:4673-4680(1994)；Larkin MA等，“Clustal W and Clustal X version 2.0,”Bioinformatics 23:2947-48(2007)和Altschul等，“Basic local alignment searchtool.”J.Mol.Biol.215:403-410(1990)，其整体和公开内容通过引用并入本文。
如本文所用，关于两个或更多个核苷酸或氨基酸序列的术语“同一性百分比”或“一致性百分比”通过以下方式计算：(i)在比较窗口(“可对齐的”区域或区域)比较两个最优序列(核苷酸或氨基酸)，(ii)确定两个序列中出现相同的核酸碱基(对于核苷酸序列)或氨基酸残基(对于蛋白质和多肽)的位置数量，以产生匹配位置的数量，(iii)用匹配位置的数量除以比较窗口中位置的总数，然后(iv)将该商乘以100％以得出同一性百分比。如果在没有指定特定比较窗口的情况下相对于参考序列计算“同一性百分比”，则通过将比对区域上匹配位置的数量除以参考序列的总长度来确定百分比同一性。因此，出于本申请的目的，当两个序列(查询序列和主题序列)最佳比对(允许其比对中存在间隙)时，查询序列的“同一性百分比”等于两个序列之间相同位置的数量除以查询序列在其长度(或比较窗口)内位置的总数，然后乘以100％。
如本文所用，关于两个核苷酸序列的术语“互补性百分比”或“互补百分比”是指当查询序列和主题序列呈线性关系并且最佳碱基配对而没有二级折叠结构，如环、茎或发夹时，与主题序列的核苷酸最佳碱基配对或杂交的查询序列的核苷酸的百分比。这种互补性百分比可以存在于两条DNA链、两条RNA链或一条DNA链和一条RNA链之间。“互补性百分比”可以通过以下方式计算：(i)在比较窗口内在线性且完全延伸的排列(即，没有折叠或二级结构)中对两个核苷酸序列进行最佳碱基配对或杂交，(ii)确定比较窗口内两个序列之间碱基配对的位置的数量，以产生互补位置的数量，(iii)将互补位置的数量除以比较窗口中位置的总数，以及(iv)将该商乘以100％以得出两个序列的互补性百分比。两个序列的最佳碱基配对可以根据通过氢结合的互补核苷酸碱基的已知配对来确定，例如，鸟嘌呤(G)-胞嘧啶(C)、腺嘌呤(A)-胸腺嘧啶(T)以及A-尿嘧啶(U)。如果在没有指定特定比较窗口的情况下相对于参考序列计算“互补性百分比”，则通过将两个线性序列之间的互补位置的数量除以参考序列的总长度来确定百分比同一性。因此，出于本申请的目的，当两个序列(查询序列和主题序列)最佳碱基配对(允许错配或非碱基配对核苷酸)时，查询序列的“互补性百分比”等于两个序列之间的碱基配对位置的数量除以查询序列在其长度内位置的总数，然后乘以100％。
作为非限制性实例，序列5’-ATGC-3’的互补序列是3’-TACG-5’，并且5’-ATGC-3’的反向互补序列是5’-GCAT-3’。值得注意的是，当从5’至3’方向观察时，互补序列和反向互补序列彼此相同。
如本文所用，“引物”或“PCR引物”是指化学合成的单链寡核苷酸，其被设计为退火到DNA模板分子上的特定位点。不受限制，PCR中的引物被用于启动DNA合成。在一个方面，引物是DNA分子。在一个方面，引物是RNA分子。在一个方面，引物包含6至70个核苷酸。在一个方面，引物包含10至50个核苷酸。在一个方面，引物包含15至30个核苷酸。在一个方面，引物包含18至25个核苷酸。在一个方面，引物包含至少6个核苷酸。在一个方面，引物包含至少10个核苷酸。在一个方面，引物包含至少15个核苷酸。在一个方面，引物包含至少20个核苷酸。在一个方面，引物是正向引物。在一个方面，引物是反向引物。
如本文所用，当在对靶核酸具有特异性的引物的背景下使用时，“特异性”或“特异性地”是指引物和靶标之间的互补性水平，使得存在引物将退火到靶核酸的退火温度并介导靶核酸的扩增，并且不会退火到样品中存在的非靶标序列或介导样品中存在的非靶标序列的扩增。
如本文所用，“正向引物”与dsDNA的反义链杂交，并且“反向引物”与dsDNA的有正义链杂交。在一个方面，正向引物包含DNA。在一个方面，反向引物包含DNA。在一个方面，正向引物包含RNA。在一个方面，反向引物包含RNA。如本文所用，正向和反向引物“组”是指可以在PCR过程中产生扩增子的一对正向和反向引物。
在一个方面，引物包含与DNA模板分子至少80％同一性或互补的序列。在一个方面，引物包含与DNA模板分子至少85％同一性或互补的序列。在一个方面，引物包含与DNA模板分子至少90％同一性或互补的序列。在一个方面，引物包含与DNA模板分子至少95％同一性或互补的序列。在一个方面，引物包含与DNA模板分子至少99％同一性或互补的序列。在一个方面，引物包含与DNA模板分子100％同一性或互补的序列。
聚合酶链式反应(PCR)是一种分子生物学技术，其允许产生DNA靶标区域的多个拷贝。通过PCR产生的DNA拷贝被称为“扩增子”。在一个方面，PCR包括热循环。
如本文所用，“热循环”是指一组受控的定时温度变化。热循环的一个“循环”或“一轮”包括至少两个阶段。一个循环或一轮的第一阶段包括将维持预期时间量的第一温度，并且一个循环或一轮的第二阶段包括维持预期时间量的第二温度。在一个方面，一个循环或一轮还包括第三阶段，该第三阶段包括维持预期时间量的第三温度。在一个方面，一个循环或一轮还包括第四阶段，该第四阶段包括维持预期时间量的第四温度。通常，热循环包括将相同的循环或轮重复数次。
在一个方面，方法包括至少1个循环的热循环。在一个方面，方法包括至少3个循环的热循环。在一个方面，方法包括至少5个循环的热循环。在一个方面，方法包括至少7个循环的热循环。在一个方面，方法包括至少10个循环的热循环。在一个方面，方法包括至少12个循环的热循环。在一个方面，方法包括至少15个循环的热循环。在一个方面，方法包括至少18个循环的热循环。在一个方面，方法包括至少20个循环的热循环。在一个方面，方法包括至少25个循环的热循环。在一个方面，方法包括至少30个循环的热循环。在一个方面，方法包括至少35个循环的热循环。在一个方面，方法包括至少40个循环的热循环。在一个方面，方法包括至少45个循环的热循环。在一个方面，方法包括至少50个循环的热循环。
在一个方面，方法包括2个循环至60个循环的热循环。在一个方面，方法包括5个循环至60个循环的热循环。在一个方面，方法包括7个循环和60个循环的热循环。在一个方面，方法包括10个循环至60个循环的热循环。在一个方面，方法包括12个循环至60个循环的热循环。在一个方面，方法包括15个循环至60个循环的热循环。在一个方面，方法包括18个循环至60个循环的热循环。在一个方面，方法包括20个循环至60个循环的热循环。在一个方面，方法包括25个循环至60个循环的热循环。在一个方面，方法包括30个循环至60个循环的热循环。在一个方面，方法包括35个循环至60个循环的热循环。在一个方面，方法包括40个循环至60个循环的热循环。在一个方面，方法包括50个循环至60个循环的热循环。在一个方面，方法包括5个至50个循环的热循环。在一个方面，方法包括5个循环至45个循环的热循环。在一个方面，方法包括5个循环至30个循环的热循环。在一个方面，方法包括7个循环至50个循环的热循环。在一个方面，方法包括7个循环至45个循环的热循环。
在一个方面，热循环的一个阶段或一轮包括大于或等于40℃的温度。在一个方面，热循环的一个阶段或一轮包括大于或等于50℃的温度。在一个方面，热循环的一个阶段或一轮包括大于或等于60℃的温度。在一个方面，热循环的一个阶段或一轮包括大于或等于65℃的温度。在一个方面，热循环的一个阶段或一轮包括大于或等于70℃的温度。在一个方面，热循环的一个阶段或一轮包括大于或等于75℃的温度。在一个方面，热循环的一个阶段或一轮包括大于或等于76℃的温度。在一个方面，热循环的一个阶段或一轮包括大于或等于77℃的温度。在一个方面，热循环的一个阶段或一轮包括大于或等于78℃的温度。在一个方面，热循环的一个阶段或一轮包括大于或等于79℃的温度。在一个方面，热循环的一个阶段或一轮包括大于或等于80℃的温度。
在一个方面，热循环的一个阶段或一轮包括小于或等于40℃的温度。在一个方面，热循环的一个阶段或一轮包括小于或等于50℃的温度。在一个方面，热循环的一个阶段或一轮包括小于或等于60℃的温度。在一个方面，热循环的一个阶段或一轮包括小于或等于65℃的温度。在一个方面，热循环的一个阶段或一轮包括小于或等于70℃的温度。在一个方面，热循环的一个阶段或一轮包括小于或等于75℃的温度。在一个方面，热循环的一个阶段或一轮包括小于或等于76℃的温度。在一个方面，热循环的一个阶段或一轮包括小于或等于77℃的温度。在一个方面，热循环的一个阶段或一轮包括小于或等于78℃的温度。在一个方面，热循环的一个阶段或一轮包括小于或等于79℃的温度。在一个方面，热循环的一个阶段或一轮包括小于或等于80℃的温度。
在一个方面，热循环的一个阶段或一轮持续1秒至6小时。在一个方面，热循环的一个阶段或一轮持续1秒至5小时。在一个方面，热循环的一个阶段或一轮持续1秒至4小时。在一个方面，热循环的一个阶段或一轮持续1秒至3小时。在一个方面，热循环的一个阶段或一轮持续1秒至2小时。在一个方面，热循环的一个阶段或一轮持续1秒至1.5小时。在一个方面，热循环的一个阶段或一轮持续1秒至1小时。在一个方面，热循环的一个阶段或一轮持续1秒至50分钟。在一个方面，热循环的一个阶段或一轮持续1秒至45分钟。在一个方面，热循环的一个阶段或一轮持续1秒至30分钟。在一个方面，热循环的一个阶段或一轮持续1秒至20分钟。在一个方面，热循环的一个阶段或一轮持续1秒至15分钟。在一个方面，热循环的一个阶段或一轮持续1秒至10分钟。在一个方面，热循环的一个阶段或一轮持续1秒至7.5分钟。在一个方面，热循环的一个阶段或一轮持续1秒至5分钟。在一个方面，热循环的一个阶段或一轮持续1秒至4分钟。在一个方面，热循环的一个阶段或一轮持续1秒至3分钟。在一个方面，热循环的一个阶段或一轮持续1秒至2分钟。在一个方面，热循环的一个阶段或一轮持续1秒至1分钟。在一个方面，热循环的一个阶段或一轮持续1秒至50秒。在一个方面，热循环的一个阶段或一轮持续1秒至40秒。在一个方面，热循环的一个阶段或一轮持续1秒至30秒。在一个方面，热循环的一个阶段或一轮持续1秒至20秒。在一个方面，热循环的一个阶段或一轮持续1秒至10秒之间。
在一个方面，PCR是定量PCR(qPCR)。qPCR用于定量给定样品中的核酸分子。qPCR可以使用与dsDNA结合的荧光染料进行。在热循环的每个循环期间，染料都会与新形成的dsDNA结合，从而产生更多可测量的荧光。荧光信号与复制的DNA量成比例增加，从而实现定量。
探针(例如，TaqManTM探针)也可以在qPCR中代替荧光染料使用。探针通常包含荧光团和猝灭剂。当探针上同时存在荧光团和猝灭剂时，荧光共振能量转移可防止荧光团发射。在PCR过程中，结合在DNA靶标区域上的两个引物之间的探针在引物延伸过程中被水解，从而实现扩增依赖性的荧光增强。因此，测量的荧光与样品中探针靶标序列的量成正比。然而，这种类型的系统不适用于缺乏5’至3’核酸外切酶活性的DNA聚合酶。
在qPCR过程中使用荧光团可以对靶标DNA分子进行定量。可以测量靶标DNA分子的绝对量，或者样品之间靶标分子的相对量。称为阈值循环(Ct)的测量通常被用于测量qPCR样品中靶标DNA分子的相对浓度。如本文所用，“Ct”是指在qPCR期间荧光信号跨越阈值(例如，背景荧光水平)所需的热循环次数。Ct水平与样品中靶标核酸的量成反比(例如，Ct水平越低，样品中靶标DNA分子的量越大)。荧光水平可以通过本领域内所用的任何合适的仪器来检测。适用于检测qPCR荧光的仪器的一个非限制性示例是Bio-Rad CFX96qPCR仪器。
在一个方面，用于检测qPCR荧光的仪器可以检测至少两个荧光通道中的荧光。在一个方面，用于检测qPCR荧光的仪器可以检测至少三个荧光通道中的荧光。在一个方面，用于检测qPCR荧光的仪器可以检测至少四个荧光通道中的荧光。
在一个方面，本文提供的方法包括测量至少两个荧光通道中的荧光。在一个方面，本文提供的方法包括测量至少三个荧光通道中的荧光。在一个方面，本文提供的方法包括测量至少四个荧光通道中的荧光。
在一个方面，本文提供的组合物或方法包含至少一种DNA聚合酶。在一个方面，本文提供的组合物或方法包含DNA聚合酶。在一个方面，本文提供的组合物或方法包含至少一种具有5’至3’核酸外切酶活性的DNA聚合酶。在一个方面，本文提供的组合物或方法包含具有5’至3’核酸外切酶活性的DNA聚合酶。
如本文所用，“DNA聚合酶”是指能够催化核苷酸三磷酸合成DNA分子的酶。DNA聚合酶将核苷酸添加至DNA链的3’端，每次一个核苷酸，从而产生与模板DNA链相比的反向平行DNA链。DNA聚合酶无法从头开始生成新的DNA分子；它们需要可以添加第一个新核苷酸的引物。
一些DNA聚合酶(例如Taq)具有5’至3’核酸外切酶活性。这种5’至3’核酸外切酶活性允许聚合酶去除新合成DNA的5’端的引物，从而使聚合酶活性可以填补空白。在一个方面，具有5’至3’核酸外切酶活性的DNA聚合酶是Taq DNA聚合酶。在一个方面，具有5’至3’核酸外切酶活性的DNA聚合酶是Bst DNA聚合酶。在一个方面，具有5’至3’核酸外切酶活性的DNA聚合酶是DNA聚合酶1酶。在一个方面，具有5’至3’核酸外切酶活性的DNA聚合酶选自下组：Taq DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶和DNA聚合酶1酶。
在一个方面，本文提供的组合物或方法包含DNA聚合酶发挥作用所需的试剂和缓冲剂。如本文所用，“试剂”是指添加到混合物中以引起化学反应或测试化学反应是否发生的任何物质或化合物。在一个方面，试剂包含选自下组的组分：镁、至少一种dNTP、磷酸酶、甜菜碱、二甲基亚砜(DMSO)和四甲基氯化铵(TMAC)。
在一个方面，本文提供的组合物或方法包含DNA模板分子。在一个方面，本文提供的组合物或方法包含至少一个DNA模板分子。如本文所用，“DNA模板分子”是指在PCR期间通过引物结合以产生扩增子的DNA分子。DNA模板分子也可以被封阻引物和探针结合。
DNA模板分子可以细分为离散的“区域”。在一个方面，DNA模板分子包含第一区域。在一个方面，DNA模板分子包含第一区域和第二区域。在一个方面，DNA模板分子包含第一区域、第二区域和第三区域。在一个方面，DNA模板分子包含第一区域、第二区域、第三区域和第四区域。在一个方面，DNA模板分子包含第一区域、第二区域、第三区域、第四区域和第五区域。在一个方面，DNA模板分子包含第一区域、第二区域、第三区域、第四区域、第五区域和第六区域。在一个方面，DNA模板分子包含第一区域、第二区域、第三区域、第四区域、第五区域、第六区域和第七区域。在一个方面，DNA模板分子包含第一区域、第二区域、第三区域、第四区域、第五区域、第六区域、第七区域和第八区域。在一个方面，DNA模板分子包含第一区域、第二区域、第三区域、第四区域、第五区域、第六区域、第七区域、第八区域和第九区域。在一个方面，DNA模板分子包含多达第N个区域，其中N是任何正整数。
在一个方面，引物与DNA模板分子的区域互补或部分互补。在一个方面，正向引物与DNA模板分子的区域互补或部分互补。在一个方面，反向引物与DNA模板分子的区域互补或部分互补。在一个方面，探针与DNA模板分子的区域互补、部分互补或同源。在一个方面，封阻引物与DNA模板分子的区域互补或部分互补。
在一个方面，引物和探针与DNA模板分子的不同区域杂交。在一个方面，引物和探针与DNA模板分子的相同区域杂交。在一个方面，引物和封阻引物与DNA模板分子的不同区域杂交。在一个方面，引物和封阻引物与DNA模板分子的相同区域杂交。在一个方面，探针和封阻引物与DNA模板分子的不同区域杂交。在一个方面，探针和封阻引物与DNA模板分子的相同区域杂交。
在一个方面，DNA模板分子包含非重叠区域(例如，没有两个区域共享任何核苷酸位置)。在一个方面，DNA模板分子包含重叠区域(例如，至少两个区域共享至少一个核苷酸位置)。在一个方面，DNA模板分子包含非重叠区域和重叠区域。
在一个方面，区域包含10至100个核苷酸。在一个方面，区域包含10至90个核苷酸。在一个方面，区域包含10至80个核苷酸。在一个方面，区域包含10至70个核苷酸。在一个方面，区域包含10至60个核苷酸。在一个方面，区域包含10至50个核苷酸。在一个方面，区域包含10至40个核苷酸。在一个方面，区域包含10至30个核苷酸。在一个方面，区域包含10至20个核苷酸。
在一个方面，区域包含12至100个核苷酸。在一个方面，区域包含12至90个核苷酸。在一个方面，区域包含12至80个核苷酸。在一个方面，区域包含12至70个核苷酸。在一个方面，区域包含12至60个核苷酸。在一个方面，区域包含12至50个核苷酸。在一个方面，区域包含12至40个核苷酸。在一个方面，区域包含12至30个核苷酸。在一个方面，区域包含12至20个核苷酸。
在一个方面，区域包含15至100个核苷酸。在一个方面，区域包含15至90个核苷酸。在一个方面，区域包含15至80个核苷酸。在一个方面，区域包含15至70个核苷酸。在一个方面，区域包含15至60个核苷酸。在一个方面，区域包含15至50个核苷酸。在一个方面，区域包含15至40个核苷酸。在一个方面，区域包含15至30个核苷酸。在一个方面，区域包含15至20个核苷酸。
在一个方面，区域包含至少10个核苷酸。在一个方面，区域包含至少11个核苷酸。在一个方面，区域包含至少12个核苷酸。在一个方面，区域包含至少13个核苷酸。在一个方面，区域包含至少14个核苷酸。在一个方面，区域包含至少15个核苷酸。在一个方面，区域包含至少20个核苷酸。在一个方面，区域包含至少25个核苷酸。在一个方面，区域包含至少30个核苷酸。在一个方面，区域包含至少35个核苷酸。在一个方面，区域包含至少40个核苷酸。在一个方面，区域包含至少45个核苷酸。在一个方面，区域包含至少50个核苷酸。在一个方面，区域包含至少60个核苷酸。
在一个方面，0至5000个核苷酸位于两个相邻区域之间。在一个方面，0至4000个核苷酸位于两个相邻区域之间。在一个方面，0至3000个核苷酸位于两个相邻区域之间。在一个方面，0至2000个核苷酸位于两个相邻区域之间。在一个方面，0至1000个核苷酸位于两个相邻区域之间。在一个方面，0至750个核苷酸位于两个相邻区域之间。在一个方面，0至500个核苷酸位于两个相邻区域之间。在一个方面，0至250个核苷酸位于两个相邻区域之间。在一个方面，0至100个核苷酸位于两个相邻区域之间。在一个方面，0至50个核苷酸位于两个相邻区域之间。
在一个方面，0至5000个核苷酸位于DNA模板分子的任意两个区域之间。在一个方面，0至4000个核苷酸位于DNA模板分子的任意两个区域之间。在一个方面，0至3000个核苷酸位于DNA模板分子的任意两个区域之间。在一个方面，0至2000个核苷酸位于DNA模板分子的任意两个区域之间。在一个方面，0至1000个核苷酸位于DNA模板分子的任意两个区域之间。在一个方面，0至750个核苷酸位于DNA模板分子的任意两个区域之间。在一个方面，0至500个核苷酸位于DNA模板分子的任意两个区域之间。在一个方面，0至250个核苷酸位于DNA模板分子的任意两个区域之间。在一个方面，0至100个核苷酸位于DNA模板分子的任意两个区域之间。在一个方面，0至50个核苷酸位于DNA模板分子的任意两个区域之间。
在一个方面，两个或更多个区域可以包括区域的组。在一个方面，第六区域、第五区域和第四区域构成组1，并且第三区域、第二区域和第一区域构成组2。在一个方面，组1位于DNA模板分子上组2的5’处。在一个方面，组1位于DNA模板分子上组2的3’侧。在一个方面，第七区域、第八区域和第九区域构成组3。在一个方面，DNA模板分子按从5’至3’的顺序构成组1、组2、组3。在一个方面，DNA模板分子按从5’至3’的顺序构成组1、组3、组2。在一个方面，DNA模板分子按从5’至3’的顺序构成组2、组1、组3。在一个方面，DNA模板分子按从5’至3’的顺序构成组2、组3、组1。在一个方面，DNA模板分子按从5’至3’的顺序构成组3、组2、组1。在一个方面，DNA模板分子按从5’至3’的顺序构成组3、组1、组2。
在一个方面，位于第四区域和第三区域之间的核苷酸的数量为0至5000个核苷酸、0至2000个核苷酸、0至1500个核苷酸、0至1000个核苷酸、或0至800个核苷酸。在一个方面，位于第四区域和第三区域之间的核苷酸的数量为0至4000个核苷酸。在一个方面，位于第四区域和第三区域之间的核苷酸的数量为0至3000个核苷酸。在一个方面，位于第四区域和第三区域之间的核苷酸的数量为0至2500个核苷酸。在一个方面，位于第四区域和第三区域之间的核苷酸的数量为0至900个核苷酸。在一个方面，位于第四区域和第三区域之间的核苷酸的数量为0至500个核苷酸。
在一个方面，位于第六区域和第一区域之间的核苷酸的数量为0至5000个核苷酸、0至2000个核苷酸、0至1500个核苷酸、0至1000个核苷酸、或0至800个核苷酸。在一个方面，位于第六区域和第一区域之间的核苷酸的数量为0至4000个核苷酸。在一个方面，位于第六区域和第一区域之间的核苷酸的数量为0至3000个核苷酸。在一个方面，位于第六区域和第一区域之间的核苷酸的数量为0至2500个核苷酸。在一个方面，位于第六区域和第一区域之间的核苷酸的数量为0至900个核苷酸。在一个方面，位于第六区域和第一区域之间的核苷酸的数量为0至500个核苷酸。
在一个方面，本文提供的混合物或方法包含探针。如本文所用，“探针”是指用于通过杂交检测互补核酸序列(例如，靶标序列)的存在的单链核酸分子。在一个方面，探针是DNA探针。在一个方面，探针是RNA探针。
在一个方面，探针包含6至70个核苷酸。在一个方面，探针包含10至50个核苷酸。在一个方面，探针包含15至30个核苷酸。在一个方面，探针包含18至25个核苷酸。在一个方面，探针包含至少6个核苷酸。在一个方面，探针包含至少10个核苷酸。在一个方面，探针包含至少15个核苷酸。在一个方面，探针包含至少20个核苷酸。
在一个方面，探针是TaqManTM探针。在一个方面，探针是分子信标。
在一个方面，探针包含荧光团。如本文所用，“荧光团”是指能够在光激发后重新发射光的任何荧光化合物。在一个方面，探针在其5’端包含荧光团。在一个方面，探针在其3’端包含荧光团。在一个方面，探针在其5’端和3’端之间包含荧光团。
在一个方面，荧光团是肽或蛋白质。在一个方面，荧光团是小的有机化合物。在一个方面，荧光团是合成的低聚物或聚合物。在一个方面，荧光团是多组分系统。在一个方面，荧光团选自下组：肽或蛋白质、小的有机化合物、合成的低聚物或聚合物、以及多组分系统。在一个方面，荧光团是有机染料。
肽或蛋白质荧光团的非限制性实例包括绿色荧光蛋白(GFP)、黄色荧光蛋白(YFP)和红色荧光蛋白(RFP)。
小的有机化合物荧光团的非限制性实例包括氧杂蒽衍生物(例如，荧光素、罗丹明、Oregon green、伊红(eosin)、Texas Red)、花青衍生物(例如，花青、吲哚花青(indocarbocyanine)、部花青)、方酸衍生物、方酸轮烷衍生物、萘衍生物、香豆素衍生物、恶二唑衍生物、蒽衍生物、芘衍生物(例如，Cascade blue)、恶嗪衍生物(例如，尼罗红、尼罗蓝、甲酚紫)、吖啶衍生物(例如，普黄素、吖啶橙、吖啶黄)、芳基次甲基衍生物(例如，金胺、结晶紫、孔雀石绿)、四吡咯衍生物和二吡咯亚甲基衍生物。
在一个方面，荧光团选自下组：Cy3TM、FAM、VIC、HEX、Cy5TM、Cy5.5、Quasar 705、ROX、TET、Texas Red或其他有机染料。
在一个方面，荧光团选自下组：FreedomTM染料、ATTOTM染料、Alexa 染料、LI-COR />和罗丹明染料。FreedomTM染料、ATTOTM染料、Alexa />染料、LI-COR />和罗丹明染料可获取自Integrated DNA Technologies(Coralville,Iowa)。参见，例如，idtdna[dot]com/site/Catalog/Modifications/Category/3。
在一个方面，两个或更多个荧光团在光谱上是不同的。如本文所用，当用于指代两种或更多种荧光团时，“在光谱上不同”是指发射不同波长的光的能力，使得检测到的光可以明确地指向给定的荧光团。作为非限制性实例，Cy5(在670nm处发射)和ROX(在605nm处发射)是在光谱上不同的荧光团。在一个方面，多个探针包含各自包含在光谱上不同的荧光团的探针。
在一个方面，探针包含荧光猝灭部分。如本文所用，“荧光猝灭部分”或“猝灭剂”是指吸收来自荧光团的激发能量，从而降低或消除荧光团的荧光强度的任何物质。猝灭剂可用于降低给定物质(例如，荧光团)的荧光强度。在一个方面，猝灭剂消散来自荧光团的光能作为热能。在一个方面，猝灭剂是缺乏天然荧光的染料。
在一个方面，猝灭剂选自下组：MGB、Black Hole Quencher、Iowa Black RQ和IowaBlack FQ。
在一个方面，探针在其5’端包含荧光猝灭部分。在一个方面，探针在其3’端包含荧光猝灭部分。在一个方面，探针在其5’端和3’端之间包含荧光猝灭部分。
在一个方面，多个探针各自包含不同的荧光猝灭部分。在一个方面，多个探针各自包含相同的荧光猝灭部分。
在一个方面，本文提供的混合物或方法包含封阻引物。如本文所用，“封阻引物”是指被设计为与DNA模板分子选择性地结合以阻止靶标序列的扩增的寡核苷酸。在一个方面，封阻引物是DNA分子。在一个方面，封阻引物是RNA分子。在另一个方面，封阻引物包含至少一条长度为约12至约100个核苷酸的连续链，相对于非封阻的等位基因序列，该链优选地退火到待封阻的等位基因序列，并且在其3’端还包含官能团或核苷酸序列，其可组阻止扩增过程(例如，聚合酶链式反应)期间的酶促延伸。
在一个方面，封阻引物包含11至100个核苷酸。在一个方面，封阻引物包含11至90个核苷酸。在一个方面，封阻引物包含11至80个核苷酸。在一个方面，封阻引物包含11至70个核苷酸。在一个方面，封阻引物包含11至60个核苷酸。在一个方面，封阻引物包含11至50个核苷酸。在一个方面，封阻引物包含11至40个核苷酸。在一个方面，封阻引物包含11至30个核苷酸。在一个方面，封阻引物包含11至20个核苷酸。
在一个方面，封阻引物包含至少11个核苷酸。在一个方面，封阻引物包含至少12个核苷酸。在一个方面，封阻引物包含至少15个核苷酸。在一个方面，封阻引物包含至少20个核苷酸。在一个方面，封阻引物包含至少25个核苷酸。在一个方面，封阻引物包含至少30个核苷酸。在一个方面，封阻引物包含至少40个核苷酸。在一个方面，封阻引物包含至少50个核苷酸。在一个方面，封阻引物包含至少60个核苷酸。在一个方面，封阻引物包含至少70个核苷酸。在一个方面，封阻引物包含至少80个核苷酸。在一个方面，封阻引物包含至少90个核苷酸。在一个方面，封阻引物包含至少100个核苷酸。
在一个方面，封阻引物包含阻止DNA聚合酶延伸的化学功能化。在一个方面，封阻引物包含阻止DNA聚合酶在其3’端延伸的化学功能化。在一个方面，化学功能化包含3-碳间隔子。在一个方面，化学功能化包括反向核苷酸。在一个方面，化学功能化包含小沟结合物。在一个方面，化学功能化包括双脱氧核苷酸。在一个方面，化学功能化选自下组：3-碳间隔子、反向核苷酸和小沟结合物。
通常，封阻引物和引物具有部分重叠的序列，因此它们竞争结合给定的靶位点。封阻引物和引物序列之间的重叠区域被称为“重叠子序列”。“重叠子序列”包含与封阻引物序列同源的引物序列的至少3个核苷酸的核苷酸序列。
在一个方面，封阻引物和引物包含重叠序列。在一个方面，封阻引物和正向引物包含重叠序列。在一个方面，封阻引物和反向引物包含重叠序列。在一个方面，重叠序列位于引物的3’端和封阻引物的5’端。
当引物和封阻引物包含重叠子序列时，引物还具有“非重叠子序列”，其是指不与封阻引物序列重叠的引物序列的部分。
在一个方面，阻断序列5’端的3至25个核苷酸与作为正向引物的相同区域互补。在一个方面，阻断序列5’端的3至20个核苷酸与作为正向引物的相同区域互补。在一个方面，阻断序列5’端的3至18个核苷酸与作为正向引物的相同区域互补。在一个方面，阻断序列5’端的3至15个核苷酸与作为正向引物的相同区域互补。在一个方面，阻断序列5’端的3至12个核苷酸与作为正向引物的相同区域互补。在一个方面，阻断序列5’端的3至10个核苷酸与作为正向引物的相同区域互补。作为本段的非限制性实例，如果正向引物与第四区域结合，则封阻引物的5’端的至少一部分也将与第四区域互补。
在一个方面，封阻引物3’端的8至100个核苷酸与作为正向引物的相同区域不互补。在一个方面，封阻引物3’端的8至90个核苷酸与作为正向引物的相同区域不互补。在一个方面，封阻引物3’端的8至80个核苷酸与作为正向引物的相同区域不互补。在一个方面，封阻引物3’端的8至70个核苷酸与作为正向引物的相同区域不互补。在一个方面，封阻引物3’端的8至60个核苷酸与作为正向引物的相同区域不互补。在一个方面，封阻引物3’端的8至50个核苷酸与作为正向引物的相同区域不互补。在一个方面，封阻引物3’端的8至40个核苷酸与作为正向引物的相同区域不互补。在一个方面，封阻引物3’端的8至30个核苷酸与作为正向引物的相同区域不互补。在一个方面，封阻引物3’端的8至20个核苷酸与作为正向引物的相同区域不互补。在一个方面，封阻引物3’端的8至10个核苷酸与作为正向引物的相同区域不互补。作为本段的非限制性示例，如果正向引物与第四区域结合，则封阻引物的3’端的至少一部分将不与第四区域互补。
在一个方面，封阻引物的重叠子序列能够与DNA模板分子杂交。在一个方面，封阻引物包含与DNA模板分子不互补的序列并被称为“非互补区域”。在一个方面，封阻引物的非互补区域形成至少一个发夹结构。在一个方面，封阻引物的非互补区域在封阻引物的3’端处包含2至70个核苷酸，这些核苷酸与与封阻引物可杂交的区域的5’端相邻的序列不互补。在一个方面，封阻引物的非互补区域在封阻引物的3’端处包含2至60个核苷酸，这些核苷酸与与封阻引物可杂交的区域的5’端相邻的序列不互补。在一个方面，封阻引物的非互补区域在封阻引物的3’端处包含2至50个核苷酸，这些核苷酸与与封阻引物可杂交的区域的5’端相邻的序列不互补。在一个方面，封阻引物的非互补区域在封阻引物的3’端处包含2至40个核苷酸，这些核苷酸与与封阻引物可杂交的区域的5’端相邻的序列不互补。在一个方面，封阻引物的非互补区域在封阻引物的3’端处包含2至30个核苷酸，这些核苷酸与与封阻引物可杂交的区域的5’端相邻的序列不互补。在一个方面，封阻引物的非互补区域在封阻引物的3’端处包含2至20个核苷酸，这些核苷酸与与封阻引物可杂交的区域的5’端相邻的序列不互补。在一个方面，封阻引物的非互补区域在封阻引物的3’端处包含2至10个核苷酸，这些核苷酸与与封阻引物可杂交的区域的5’端相邻的序列不互补。作为本段的非限制性示例，如果封阻引物与第四区域部分互补，则其非互补区域将不与与第四区域的5’端相邻的序列互补。
在一个方面，本公开提供了混合物或试剂盒，其包含：(a)具有5’至3’核酸外切酶活性的DNA聚合酶；(b)DNA聚合酶发挥作用所需的试剂和缓冲剂；(c)至少一个DNA模板分子；(d)第一正向引物(FP1)，其包含与至少一个DNA模板分子的第一区域互补的序列；(e)第一探针(TP1)，其包含与至少一个DNA模板分子的第二区域互补或同源的序列；(f)第一反向引物(RP1)，其包含与至少一个DNA模板分子的第三区域同源的序列；(g)第二正向引物(FP2)，其包含与至少一个DNA模板分子的第四区域互补的序列；(h)第二封阻引物(B2)，其包含与所述至少一个DNA模板分子的所述第四区域部分互补并且与位于所述至少一个DNA模板分子的所述第四区域5’侧的模板子序列部分互补的序列；(i)第二探针(TP2)，其包含与所述至少一个DNA模板分子的第五区域互补或同源的序列；(j)第二反向引物(RP2)，其包含与至少一个DNA模板分子的第六区域同源的序列，其中所述第一区域、所述第二区域、所述第三区域、所述第四区域、所述第五区域和所述第六区域不重叠；其中所述第一区域、所述第二区域、所述第三区域、所述第四区域、所述第五区域和所述第六区域各自包含12至50个核苷酸；其中0至5000个核苷酸位于任意两个区域之间；其中所述TP1包含荧光团(TP1荧光团)和荧光猝灭部分；其中所述TP2包含荧光团(TP2荧光团)和荧光猝灭部分；并且其中所述TP1荧光团和所述TP2荧光团在光谱上彼此不同。在一个方面，混合物还包含(k)第三正向引物(FP3)，其包含与至少一个DNA模板的第七区域互补的序列；和(l)第三封阻引物(B3)，其包含与所述至少一个DNA模板的所述第七区域部分互补并且与位于所述至少一个DNA模板分子的所述第七区域5’侧的模板子序列部分互补的序列；(m)第三探针(TP3)，其包含与至少一个DNA模板分子的第八区域互补或同源的序列；(n)第三反向引物(RP3)，其包含与至少一个DNA模板分子的第九区域同源的序列；其中所述第七、第八和第九区域是至少一个DNA模板分子的非重叠子序列；其中所述第七、第八和第九区域各自包含12至50个核苷酸；其中0至5000个核苷酸位于任意两个区域之间；其中TP3包含荧光团(TP3荧光团)和荧光猝灭部分；其中所述TP3荧光团在光谱上不同于所述TP1荧光团和所述TP2荧光团。
在一个方面，封阻引物5’端处的3至25个核苷酸与第四区域互补。在一个方面，封阻引物5’端处的3至20个核苷酸与第四区域互补。在一个方面，封阻引物5’端处的3至18个核苷酸与第四区域互补。在一个方面，封阻引物5’端处的3至15个核苷酸与第四区域互补。在一个方面，封阻引物5’端处的3至12个核苷酸与第四第五区域互补。在一个方面，封阻引物5’端处的3至10个核苷酸与第四区域互补。
在一个方面，封阻引物3’端处的8至100个核苷酸不与第四区域互补。在一个方面，封阻引物3’端处的8至90个核苷酸不与第四区域互补。在一个方面，封阻引物3’端处的8至80个核苷酸不与第四区域互补。在一个方面，封阻引物3’端处的8至70个核苷酸不与第四区域互补。在一个方面，封阻引物3’端处的8至60个核苷酸不与第四区域互补。在一个方面，封阻引物3’端处的8至50个核苷酸不与第四区域互补。在一个方面，封阻引物3’端处的8至40个核苷酸不与第四区域互补。在一个方面，封阻引物3’端处的8至30个核苷酸不与第四区域互补。在一个方面，封阻引物3’端处的8至20个核苷酸不与第四区域互补。在一个方面，封阻引物3’端处的8至15个核苷酸不与第四区域互补。
在一个方面，封阻引物的3’端处的2至70个核苷酸(非互补区域)与邻近第四区域的5’端的序列不互补。在一个方面，封阻引物的3’端处的2至60个核苷酸(非互补区域)与邻近第四区域的5’端的序列不互补。在一个方面，封阻引物的3’端处的2至50个核苷酸(非互补区域)与邻近第四区域的5’端的序列不互补。在一个方面，封阻引物的3’端处的2至40个核苷酸(非互补区域)与邻近第四区域的5’端的序列不互补。在一个方面，封阻引物的3’端处的2至30个核苷酸(非互补区域)与邻近第四区域的5’端的序列不互补。在一个方面，封阻引物的3’端处的2至20个核苷酸(非互补区域)与邻近第四区域的5’端的序列不互补。在一个方面，封阻引物的3’端处的2至10个核苷酸(非互补区域)与邻近第四区域的5’端的序列不互补。
在一个方面，本文提供的任何混合物或试剂盒包含多个第二正向引物、第二封阻引物、第二探针和第二反向引物，其中至少两个第二探针包含光谱上不同的荧光团。在一个方面，本文提供的任何混合物或试剂盒包含多个第三正向引物、第三封阻引物、第三探针和第三反向引物，其中至少两个第三探针包含光谱上不同的荧光团。
在一个方面，本公开提供了一种混合物或试剂盒，其包含：(a)具有5’至3’核酸外切酶活性的DNA聚合酶；(b)DNA聚合酶发挥作用所需的试剂和缓冲剂；(c)至少一个DNA模板分子；(d)第一正向引物(FP1)，其包含与至少一个DNA模板分子的第三区域互补的序列；(e)第一探针(TP1)，其包含与至少一个DNA模板分子的第二区域互补或同源的序列；(f)第一反向引物(RP1)，其包含与至少一个DNA模板分子的第一区域同源的序列；(g)第二正向引物(FP2)，其包含与至少一个DNA模板分子的第五区域互补的序列；(h)第二封阻引物(B2)，其包含与至少一个DNA模板分子的第五区域部分互补并且与位于至少一个DNA模板分子的第五区域5’侧的至少一个DNA模板分子的子序列部分互补的序列；(i)第二探针(TP2)，其包含与至少一个DNA模板分子的第四区域互补或同源的序列；其中所述至少一个DNA模板分子按从5’至3’的顺序包含所述第一区域、所述第二区域、所述第三区域、所述第四区域和所述第五区域；其中所述第一区域、所述第二区域、所述第三区域、所述第四区域和所述第五区域不重叠；其中所述第一区域、所述第二区域、所述第三区域、所述第四区域和所述第五区域各自包含12至50个核苷酸；其中所述第一区域的最5’端核苷酸与所述第五区域的最3’端核苷酸之间的距离在100至3000个核苷酸之间；其中所述TP1包含荧光团(TP1荧光团)和荧光猝灭部分；其中所述TP2包含荧光团(TP2荧光团)和荧光猝灭部分；并且其中所述TP1荧光团和所述TP2荧光团在光谱上彼此不同。在一个方面，混合物还包含(j)第三正向引物(FP3)，其包含与至少一个DNA模板分子的第七区域互补的序列；(k)第三封阻引物(B3)，其包含与至少一个DNA模板分子的第七区域部分互补并且与位于至少一个DNA模板分子的第七区域5’侧的至少一个DNA模板分子的子序列部分互补的序列。至少一个DNA模板分子；和(l)第三探针(TP3)，其包含与至少一个DNA模板分子的第六区域互补或同源的序列；其中所述第六区域和所述第七区域不重叠；其中所述第六区域和所述第七区域各自包含12至50个核苷酸；其中所述第六区域和所述第七区域位于所述第五区域3’侧；其中TP3包含荧光团(TP3荧光团)和荧光猝灭部分；其中TP3荧光团在光谱上不同于所述TP1荧光团和所述TP2荧光团。
在一个方面，第一区域的最5’端核苷酸与第五区域的最3’端核苷酸之间的距离在100至3000个核苷酸之间。在一个方面，第一区域的最5’端核苷酸与第五区域的最3’端核苷酸之间的距离在100至2000个核苷酸之间。在一个方面，第一区域的最5’端核苷酸与第五区域的最3’端核苷酸之间的距离在100至1500个核苷酸之间。在一个方面，第一区域的最5’端核苷酸与第五区域的最3’端核苷酸之间的距离在100至1000个核苷酸之间。在一个方面，第一区域的最5’端核苷酸与第五区域的最3’端核苷酸之间的距离在100至800个核苷酸之间。在一个方面，第一区域的最5’端核苷酸与第五区域的最3’端核苷酸之间的距离在100至500个核苷酸之间。在一个方面，第一区域的最5’端核苷酸与第五区域的最3’端核苷酸之间的距离在100至300个核苷酸之间。
在一个方面，封阻引物5’端处的3至25个核苷酸与第五区域互补。在一个方面，封阻引物5’端处的3至20个核苷酸与第五区域互补。在一个方面，封阻引物5’端处的3至18个核苷酸与第五区域互补。在一个方面，封阻引物5’端处的3至15个核苷酸与第五区域互补。在一个方面，封阻引物5’端处的3至12个核苷酸与第五区域互补。在一个方面，封阻引物5’端处的3至10个核苷酸与第五区域互补。
在一个方面，封阻引物3’端处的8至100个核苷酸不与第五区域互补。在一个方面，封阻引物3’端处的8至90个核苷酸不与第五区域互补。在一个方面，封阻引物3’端处的8至80个核苷酸不与第五区域互补。在一个方面，封阻引物3’端处的8至70个核苷酸不与第五区域互补。在一个方面，封阻引物3’端处的8至60个核苷酸不与第五区域互补。在一个方面，封阻引物3’端处的8至50个核苷酸不与第五区域互补。在一个方面，封阻引物3’端处的8至40个核苷酸不与第五区域互补。在一个方面，封阻引物3’端处的8至30个核苷酸不与第五区域互补。在一个方面，封阻引物3’端处的8至20个核苷酸不与第五区域互补。在一个方面，封阻引物3’端处的8至15个核苷酸不与第五区域互补。
在一个方面，封阻引物的3’端处的2至70个核苷酸(非互补区域)与邻近第五区域的5’端的序列不互补。在一个方面，封阻引物的3’端处的2至60个核苷酸(非互补区域)与邻近第五区域的5’端的序列不互补。在一个方面，封阻引物的3’端处的2至50个核苷酸(非互补区域)与邻近第五区域的5’端的序列不互补。在一个方面，封阻引物的3’端处的2至40个核苷酸(非互补区域)与邻近第五区域的5’端的序列不互补。在一个方面，封阻引物的3’端处的2至30个核苷酸(非互补区域)与邻近第五区域的5’端的序列不互补。在一个方面，封阻引物的3’端处的2至20个核苷酸(非互补区域)与邻近第五区域的5’端的序列不互补。在一个方面，封阻引物的3’端处的2至10个核苷酸(非互补区域)与邻近第五区域的5’端的序列不互补。
在一个方面，本公开提供了一种在水性溶液中产生荧光信号的方法，该方法包含：(a)将包含DNA模板分子的样品与以下混合以产生溶液：(i)具有5’至3’核酸外切酶活性的DNA聚合酶；(ii)所述DNA聚合酶发挥作用所需的试剂和缓冲剂；(iii)第一正向引物(FP1)，其包含与所述DNA模板分子的第一区域互补的序列；(iv)第一探针(TP1)，其包含与所述DNA模板分子的第二区域互补或同源的序列；(v)第一反向引物(RP1)，其包含与所述DNA模板分子的第三区域同源的序列；(vi)第二正向引物(FP2)，其包含与所述DNA模板分子的第四区域互补的序列；(vii)第二封阻引物(B2)，其包含与所述DNA模板分子的所述第四区域部分互补并且与位于所述DNA模板分子的所述第四区域5’侧的所述DNA模板分子的子序列部分互补的序列；(viii)第二探针(TP2)，其包含与所述DNA模板分子的第五区域互补或同源的序列；和(ix)第二反向引物(RP2)，其包含与所述DNA模板分子的第六区域同源的序列；其中所述第一区域、所述第二区域、所述第三区域、所述第四区域、所述第五区域和所述第六区域不重叠；其中所述第一区域、所述第二区域、所述第三区域、所述第四区域、所述第五区域和所述第六区域各自包含12至50个核苷酸；其中0至5000个核苷酸位于任意两个区域之间；其中所述TP1包含荧光团(TP1荧光团)和荧光猝灭部分；其中所述TP2包含荧光团(TP2荧光团)和荧光猝灭部分；并且其中所述TP1荧光团和所述TP2荧光团在光谱上彼此不同；和(b)使步骤(a)中的样品经历至少7轮热循环，其中，任选地，每轮包括在等于或大于78℃的温度持续1秒至30分钟与低于75℃的温度持续1秒至4小时之间交替。在一个方面，溶液还包含：(x)第三正向引物(FP3)，其包含与所述至少一个DNA模板的第七区域互补的序列；(xi)第三封阻引物(B3)，其包含与所述至少一个DNA模板的所述第七区域部分互补并且与位于所述至少一个DNA模板分子的所述第七区域5’侧的模板子序列部分互补的序列；(xii)第三探针(TP3)，其包含与所述至少一个DNA模板分子的第八区域互补或同源的序列；和(xiii)第三反向引物(RP3)，其包含与所述至少一个DNA模板分子的第九区域同源的序列；其中所述第七、第八和第九区域是所述至少一个DNA模板分子的非重叠子序列；其中所述第七、第八和第九区域各自包含12至50个核苷酸；其中0至5000个核苷酸位于任意两个区域之间；其中所述TP3包含荧光团(TP3荧光团)和荧光猝灭部分；并且其中所述TP3荧光团在光谱上不同于所述TP1荧光团和所述TP2荧光团。
在一个方面，本文提供的任何溶液包含多个第一正向引物、第一封阻引物、第一探针和第一反向引物，其中至少两个第一探针包含光谱上不同的荧光团。在一个方面，本文提供的任何溶液包含多个第二正向引物、第二封阻引物、第二探针和第二反向引物，其中至少两个第二探针包含光谱上不同的荧光团。在一个方面，本文提供的任何溶液包含多个第三正向引物、第三封阻引物、第三探针和第三反向引物，其中至少两个所述第三探针包含光谱上不同的荧光团。
在一个方面，本公开提供了一种用于在水性溶液中产生荧光信号的方法，该方法包含：(a)将包含DNA模板分子的样品与以下混合以产生溶液：(i)具有5’至3’核酸外切酶活性的DNA聚合酶；(ii)所述DNA聚合酶发挥作用所需的试剂和缓冲剂；(iii)第一正向引物(FP1)，其包含与所述DNA模板分子的第三区域互补的序列；(iv)第一探针(TP1)，其包含与所述DNA模板分子的第二区域互补或同源的序列；(v)第一反向引物(RP1)，其包含与所述DNA模板分子的第一区域同源的序列；(vi)第二正向引物(FP2)，其包含与所述DNA模板分子的第五区域互补的序列；(vii)第二封阻引物(B2)，其包含与所述DNA模板分子的所述第五区域部分互补并且与位于所述DNA模板分子的所述第五区域5’侧的所述DNA模板分子的子序列部分互补的序列；和(viii)第二探针(TP2)，其包含与所述DNA模板分子的第四区域互补或同源的序列；其中所述至少一个DNA模板分子按从5’至3’的顺序包含所述第一区域、所述第二区域、所述第三区域、所述第四区域和所述第五区域；其中所述第一区域、所述第二区域、所述第三区域、所述第四区域和所述第五区域不重叠；其中所述第一区域、所述第二区域、所述第三区域、所述第四区域和所述第五区域各自包含12至50个核苷酸；其中所述第一区域的最5’端核苷酸与所述第五区域的最3’端核苷酸之间的距离在100至3000个核苷酸之间；其中所述TP1包含荧光团(TP1荧光团)和荧光猝灭部分；其中所述TP2包含荧光团(TP2荧光团)和荧光猝灭部分；并且其中所述TP1荧光团和所述TP2荧光团在光谱上彼此不同；和(b)使步骤(a)中的样品经历至少7轮热循环，其中，任选地，每轮包括在等于或大于78℃的温度持续1秒至30分钟与低于75℃的温度持续1秒至4小时之间交替。在一个方面，溶液还包含：(ix)第三正向引物(FP3)，其包含与至少一个DNA模板的第七区域互补的序列；(x)第三封阻引物(B3)，其包含与所述至少一个DNA模板的所述第七区域部分互补并且与位于所述至少一个DNA模板分子的所述第七区域5’侧的至少一个DNA模板分子的子序列部分互补的序列；和(xi)第三探针(TP3)，其包含与至少一个DNA模板分子的第六区域互补或同源的序列；其中所述第六区域和所述第七区域不重叠；其中所述第六区域和所述第七区域各自包含12至50个核苷酸；其中所述第六区域和所述第七区域位于所述第五区域3’侧；其中TP3包含荧光团(TP3荧光团)和荧光猝灭部分；其中TP3荧光团在光谱上不同于所述TP1荧光团和所述TP2荧光团。
在一个方面，本公开提供了一种检测样品中的DNA模板序列的方法，该方法包含：(a)将样品与以下混合以产生溶液：(i)具有5’至3’核酸外切酶活性的DNA聚合酶；(ii)所述DNA聚合酶发挥作用所需的试剂和缓冲剂；(iii)第一正向引物(FP1)，其包含与所述DNA模板分子的第一区域互补的序列；(iv)第一探针(TP1)，其包含与所述DNA模板分子的第二区域互补或同源的序列；(v)第一反向引物(RP1)，其包含与所述DNA模板分子的第三区域同源的序列；(vi)第二正向引物(FP2)，其包含与所述DNA模板分子的第四区域互补的序列；(vii)第二封阻引物(B2)，其包含与所述DNA模板分子的所述第四区域部分互补并且与位于所述DNA模板分子的所述第四区域5’侧的所述DNA模板分子的子序列部分互补的序列；(viii)第二探针(TP2)，其包含与所述DNA模板分子的第五区域互补或同源的序列；(ix)第二反向引物(RP2)，其包含与所述DNA模板分子的第六区域同源的序列；其中所述第一区域、所述第二区域、所述第三区域、所述第四区域、所述第五区域和所述第六区域不重叠；其中所述第一区域、所述第二区域、所述第三区域、所述第四区域、所述第五区域和所述第六区域各自包含12至50个核苷酸；其中0至5000个核苷酸位于任意两个区域之间；其中所述TP1包含荧光团(TP1荧光团)和荧光猝灭部分；其中所述TP2包含荧光团(TP2荧光团)和荧光猝灭部分；并且其中所述TP1荧光团和所述TP2荧光团在光谱上彼此不同；(b)使步骤(a)中的溶液经受至少7轮热循环，其中，任选地，每轮包括在等于或大于78℃的温度持续1秒至30分钟与低于75℃的温度持续1秒至4小时之间交替；(c)在TP1和TP2对应的荧光通道中测量步骤(b)中每轮热循环后所述溶液的荧光值；(d)确定TP1(Ct1)和TP2(Ct2)的循环阈值(Ct)；(e)如果Ct1小于35个循环，Ct2小于50个循环，并且[Ct2–Ct1]的值在1个循环和12个循环之间，则正向判定所述样品中存在所述DNA模板。在一个方面，溶液还包含：(x)第三正向引物(FP3)，其包含与所述至少一个DNA模板的第七区域互补的序列；(xi)第三封阻引物(B3)，其包含与所述至少一个DNA模板的所述第七区域部分互补并且与位于所述至少一个DNA模板分子的所述第七区域5’侧的模板子序列部分互补的序列；(xii)第三探针(TP3)，其包含与所述至少一个DNA模板分子的第八区域互补或同源的序列；和(xiii)第三反向引物(RP3)，其包含与所述至少一个DNA模板分子的第九区域同源的序列；其中所述第七、第八和第九区域是所述至少一个DNA模板分子的非重叠子序列；其中所述第七、第八和第九区域各自包含12至50个核苷酸；其中0至5000个核苷酸位于任意两个区域之间；其中所述TP3包含荧光团(TP3荧光团)和荧光猝灭部分；并且其中所述TP3荧光团在光谱上不同于所述TP1荧光团和所述TP2荧光团。
在一个方面，本公开提供了一种检测样品中的DNA模板序列的方法，该方法包含：(a)将样品与以下混合以产生溶液：(i)具有5’至3’核酸外切酶活性的DNA聚合酶；(ii)所述DNA聚合酶发挥作用所需的试剂和缓冲剂；(iii)第一正向引物(FP1)，其包含与所述DNA模板分子的第三区域互补的序列；(iv)第一探针(TP1)，其包含与所述DNA模板分子的第二区域互补或同源的序列；(v)第一反向引物(RP1)，其包含与所述DNA模板分子的第一区域同源的序列；(vi)第二正向引物(FP2)，其包含与所述DNA模板分子的第五区域互补的序列；(vii)第二封阻引物(B2)，其包含与所述DNA模板分子的所述第五区域部分互补并且与位于所述DNA模板分子的所述第五区域5’侧的所述DNA模板分子的子序列部分互补的序列；(viii)第二探针(TP2)，其包含与所述DNA模板分子的第四区域互补或同源的序列；其中所述至少一个DNA模板分子按从5’至3’的顺序包含所述第一区域、所述第二区域、所述第三区域、所述第四区域和所述第五区域；其中所述第一区域、所述第二区域、所述第三区域、所述第四区域和所述第五区域不重叠；其中所述第一区域、所述第二区域、所述第三区域、所述第四区域和所述第五区域各自包含12至50个核苷酸；其中所述第一区域的最5’端核苷酸与所述第五区域的最3’端核苷酸之间的距离在100至3000个核苷酸之间；其中所述TP1包含荧光团(TP1荧光团)和荧光猝灭部分；其中所述TP2包含荧光团(TP2荧光团)和荧光猝灭部分；并且其中所述TP1荧光团和所述TP2荧光团在光谱上彼此不同；(b)使步骤(a)中的溶液经历至少7轮热循环，其中，任选地，每轮包括在等于或大于78℃的温度持续1秒至30分钟与低于75℃的温度持续1秒至4小时之间交替；(c)在TP1和TP2对应的荧光通道中测量步骤(b)中每轮热循环后所述溶液的荧光值；(d)确定TP1(Ct1)和TP2(Ct2)的循环阈值(Ct)；和(e)如果Ct1小于35个循环，Ct2小于50个循环，并且[Ct2-Ct1]的值在1个循环和12个循环之间，则正向判定所述样品中存在所述DNA模板。在一个方面，溶液还包含：(ix)第三正向引物(FP3)，其包含与至少一个DNA模板的第七区域互补的序列；(x)第三封阻引物(B3)，其包含与所述至少一个DNA模板的所述第七区域部分互补并且与位于所述至少一个DNA模板分子的所述第七区域5’侧的至少一个DNA模板分子的子序列部分互补的序列；和(xi)第三探针(TP3)，其包含与至少一个DNA模板分子的第六区域互补或同源的序列；其中所述第六区域和所述第七区域不重叠；其中所述第六区域和所述第七区域各自包含12至50个核苷酸；其中所述第六区域和所述第七区域位于所述第五区域3’侧；其中TP3包含荧光团(TP3荧光团)和荧光猝灭部分；其中TP3荧光团在光谱上不同于所述TP1荧光团和所述TP2荧光团。
在一个方面，本公开提供了一种混合物或试剂盒，其包含：(a)具有5’至3’核酸外切酶活性的DNA聚合酶；(b)所述DNA聚合酶发挥作用所需的试剂和缓冲剂；(c)DNA模板分子；(d)第一正向引物(FP1)，其包含与所述DNA模板分子的第一区域互补的序列；(e)第一探针(TP1)，其包含与所述DNA模板分子的第二区域互补或同源的序列；(f)第一反向引物(RP1)，其包含与所述DNA模板分子的第三区域同源的序列；(g)第二正向引物(FP2)，其包含与所述DNA模板分子的第四区域互补的序列，其中所述FP2在其3’端处或3’端附近包含与所述DNA模板分子不互补的一个或多个核苷酸；(h)第二探针(TP2)，其包含与所述DNA模板分子的第五区域互补或同源的序列；(i)第二反向引物(RP2)，其包含与所述DNA模板分子的第六区域同源的序列；其中所述第一区域、所述第二区域、所述第三区域、所述第四区域、所述第五区域和所述第六区域不重叠；其中所述第一区域、所述第二区域、所述第三区域、所述第四区域、所述第五区域和所述第六区域各自包含12至50个核苷酸；其中0至5000个核苷酸位于任意两个区域之间；其中所述TP1包含荧光团(TP1荧光团)和荧光猝灭部分；其中所述TP2包含荧光团(TP2荧光团)和荧光猝灭部分；并且其中所述TP1荧光团和所述TP2荧光团在光谱上彼此不同。
在一个方面，本公开提供了一种混合物或试剂盒，其包含：(a)具有5’至3’核酸外切酶活性的DNA聚合酶；(b)所述DNA聚合酶发挥作用所需的试剂和缓冲剂；(c)DNA模板分子；(d)第一正向引物(FP1)，其包含与所述DNA模板分子的第三区域互补的序列；(e)第一探针(TP1)，其包含与所述DNA模板分子的第二区域互补或同源的序列；(f)第一反向引物(RP1)，其包含与所述DNA模板分子的第一区域同源的序列；(g)第二正向引物(FP2)，其包含与所述DNA模板分子的第五区域互补的序列，其中所述FP2在其3’端处或3’端附近包含与所述DNA模板分子不互补的一个或多个核苷酸；和(h)第二探针(TP2)，其包含与所述DNA模板分子的第四区域互补或同源的序列；其中所述至少一个DNA模板分子按从5’至3’的顺序包含所述第一区域、所述第二区域、所述第三区域、所述第四区域和所述第五区域；其中所述第一区域、所述第二区域、所述第三区域、所述第四区域和所述第五区域不重叠；其中所述第一区域、所述第二区域、所述第三区域、所述第四区域和所述第五区域各自包含12至50个核苷酸；其中所述第一区域的最5’端核苷酸与所述第五区域的最3’端核苷酸之间的距离在100至3000个核苷酸之间；其中所述TP1包含荧光团(TP1荧光团)和荧光猝灭部分；其中所述TP2包含荧光团(TP2荧光团)和荧光猝灭部分；其中所述TP1荧光团和所述TP2荧光团在光谱上彼此不同。
在一个方面，本公开提供了一种用于检测分析物中的多个DNA靶标的方法，该方法包括：(a)将所述分析物与以下混合以产生溶液：(i)具有5’至3’核酸外切酶活性的DNA聚合酶；(ii)所述DNA聚合酶发挥作用所需的试剂和缓冲剂；(iii)多个PCR引物；和(iv)包含荧光团和荧光猝灭部分的多个探针；(b)使步骤(a)中的溶液经历至少7轮热循环，其中任选地，每轮包括在等于或大于78℃的温度持续1秒至30分钟与低于75℃的温度持续1秒至4小时之间交替；(c)在至少两个荧光通道中测量步骤(b)中每轮热循环后所述溶液的荧光值；(d)确定所述至少两个荧光通道中每一个的循环阈值(Ct)；(e)确定荧光信号增强的时间顺序；和(f)将荧光信号增强的顺序映射到所述多个DNA靶标的存在、不存在或数量。
如果没有观察到DNA靶标的qPCR荧光，则可以说样品中不存在该DNA靶标。如果观察到DNA靶标的qPCR荧光，则以说样品中存在该DNA靶标。如本文所用，“DNA靶标”是指期望通过PCR扩增的正向引物和反向引物之间的核酸序列。
在一个方面，术语“多个DNA靶标”包括至少2个靶标、至少3个靶标、至少4个靶标、至少5个靶标、至少6个靶标、至少7个靶标、至少8个靶标、至少9个靶标。靶标、至少10个靶标、至少11个靶标、至少12个靶标、至少13个靶标、至少14个靶标、至少15个靶标、至少18个靶标、至少20个靶标、至少25个靶标、至少30个靶标、至少35个靶标、至少40个靶标、至少45个靶标、至少50个靶标、至少55个靶标、至少60个靶标或至少64个靶标。
在一个方面，DNA靶标是动物基因组DNA靶标。在一个方面，DNA靶标是植物基因组DNA靶标。在一个方面，DNA靶标是细菌基因组DNA靶标。在一个方面，DNA靶标是真菌基因组DNA靶标。在一个方面，DNA靶标是病毒基因组DNA靶标。在一个方面，DNA靶标是人类基因组DNA靶标。
样品(也与术语“分析物”互换)可以从任何生物体获得，其中包括动物、植物、细菌、真菌和病毒。在一个方面，样品是从血液获得的。在一个方面，样品从唾液中获得。在一个方面，样品是从尿液中获得的。在一个方面，样品是从粪便中获得的。在一个方面，样品是从器官获得的。在一个方面，样品是从组织获得的。在一个方面，样品是从单个细胞获得的。在一个方面，样品是从多个细胞获得的。在一个方面，样品获自肿瘤。在一个方面，样品获自良性肿瘤。在一个方面，样品获自恶性肿瘤。
具体设想以下非限制性实施方案：
1.一种混合物或试剂盒，其包含：
(a)任选地，具有5’至3’核酸外切酶活性的DNA聚合酶；
(b)任选地，所述DNA聚合酶发挥作用所需的试剂和缓冲剂；
(c)任选地，至少一个DNA模板分子；
(d)第一正向引物(FP1)，其包含与所述至少一个DNA模板分子的第一区域互补的序列；
(e)第一探针(TP1)，其包含与所述至少一个DNA模板分子的第二区域互补或同源的序列；
(f)第一反向引物(RP1)，其包含与所述至少一个DNA模板分子的第三区域同源的序列；
(g)第二正向引物(FP2)，其包含与所述至少一个DNA模板分子的第四区域互补的序列；
(h)第二封阻引物(B2)，其包含与所述至少一个DNA模板分子的所述第四区域部分互补并且与位于所述至少一个DNA模板分子的所述第四区域5’侧的模板子序列部分互补的序列；
(i)第二探针(TP2)，其包含与所述至少一个DNA模板分子的第五区域互补或同源的序列；和
(j)第二反向引物(RP2)，其包含与所述至少一个DNA模板分子的第六区域同源的序列；
其中所述第一区域、所述第二区域、所述第三区域、所述第四区域、所述第五区域和所述第六区域不重叠；
其中所述第一区域、所述第二区域、所述第三区域、所述第四区域、所述第五区域和所述第六区域各自包含12至50个核苷酸；
其中0至5000个核苷酸位于任意两个区域之间；
其中所述TP1包含荧光团(TP1荧光团)和荧光猝灭部分；
其中所述TP2包含荧光团(TP2荧光团)和荧光猝灭部分；并且
其中所述TP1荧光团和所述TP2荧光团在光谱上彼此不同。
2.根据实施方案1所述的混合物或试剂盒，其中所述第六区域、所述第五区域和所述第四区域构成组1，其中所述第三区域、所述第二区域和所述第一区域构成组2，并且其中组1在所述至少一个DNA模板分子上位于组2的5’侧。
3.根据实施方案1或2所述的混合物或试剂盒，其中位于所述第四区域和所述第三区域之间的核苷酸的数量为0至5000个核苷酸、0至2000个核苷酸、0至1500个核苷酸、0至1000个核苷酸，或0至800个核苷酸之间。
4.根据实施方案1-3中任一项所述的混合物或试剂盒，其中所述第六区域、所述第五区域和所述第四区域构成组1，其中所述第三区域、所述第二区域和所述第一区域构成组2，并且其中组1在所述至少一个DNA模板分子上位于组2的3’侧。
5.根据实施方案4所述的混合物或试剂盒，其中位于所述第六区域和所述第一区域之间的核苷酸的数量为0至5000个核苷酸、0至2000个核苷酸、0至1500个核苷酸、0至1000个核苷酸，或0至800个核苷酸之间。
6.根据实施方案1-5中任一项所述的混合物或试剂盒，其中所述B2的5’端处的3至25个核苷酸与所述第四区域互补。
7.根据实施方案1-6中任一项所述的混合物或试剂盒，其中所述B2的3’端处的8至100个核苷酸不与所述第四区域互补。
8.根据实施方案7所述的混合物或试剂盒，其中所述B2的3’端处的2至70个核苷酸(B2非互补区域)与邻近所述第四区域的5’端的序列不互补。
9.根据实施方案8所述的混合物或试剂盒，其中所述B2非互补区域形成至少一种发夹结构。
10.一种混合物或试剂盒，其中所述B2的3’端包含防止DNA聚合酶延伸的化学功能化。
11.根据实施方案10所述的混合物或试剂盒，其中所述化学功能化选自下组：3-碳间隔子、反向核苷酸和小沟结合物。
12.根据实施方案1-11中任一项所述的混合物或试剂盒，其中所述TP1荧光团和所述TP2荧光团选自下组：Cy3、FAM、VIC、HEX、Cy5、Cy5.5、Quasar 705、ROX、TET、Texas Red或其他有机染料。
13.根据实施方案1-12中任一项所述的混合物或试剂盒，，其中所述TP1荧光猝灭部分和所述TP2荧光猝灭部分选自下组：MGB、Black Hole Quencher、Iowa Black RQ和IowaBlack FQ。
14.根据实施方案1-13中任一项所述的混合物或试剂盒，其中混合物或试剂盒进一步包含：
(k)第三正向引物(FP3)，其包含与所述至少一个DNA模板的第七区域互补的序列；
(l)第三封阻引物(B3)，其包含与所述至少一个DNA模板的所述第七区域部分互补并且与位于所述至少一个DNA模板分子的所述第七区域5’侧的模板子序列部分互补的序列；
(m)第三探针(TP3)，其包含与所述至少一个DNA模板分子的第八区域互补或同源的序列；和
(n)第三反向引物(RP3)，其包含与所述至少一个DNA模板分子的第九区域同源的序列；
其中所述第七、第八和第九区域是所述至少一个DNA模板分子的非重叠子序列；
其中所述第七、第八和第九区域各自包含12至50个核苷酸；
其中0至5000个核苷酸位于任意两个区域之间；
其中所述TP3包含荧光团(TP3荧光团)和荧光猝灭部分；并且
其中所述TP3荧光团在光谱上不同于所述TP1荧光团和所述TP2荧光团。
15.根据实施方案1-14中任一项所述的混合物或试剂盒，其中所述混合物或试剂盒包含多个第二正向引物、第二封阻引物、第二探针和第二反向引物，其中至少两个第二探针包含光谱上不同的荧光团。
16.根据实施方案1-15中任一项所述的混合物或试剂盒，其中所述混合物或试剂盒包含多个第三正向引物、第三封阻引物、第三探针和第三反向引物，其中至少两个第三探针包含光谱上不同的荧光团。
17.一种混合物或试剂盒，其包含：
(a)任选地，具有5’至3’核酸外切酶活性的DNA聚合酶；
(b)任选地，所述DNA聚合酶发挥作用所需的试剂和缓冲剂；
(c)任选地，至少一个DNA模板分子；
(d)第一正向引物(FP1)，其包含与所述至少一个DNA模板分子的第三区域互补的序列；
(e)第一探针(TP1)，其包含与所述至少一个DNA模板分子的第二区域互补或同源的序列；
(f)第一反向引物(RP1)，其包含与所述至少一个DNA模板分子的第一区域同源的序列；
(g)第二正向引物(FP2)，其包含与所述至少一个DNA模板分子的第五区域互补的序列；
(h)第二封阻引物(B2)，其包含与所述至少一个DNA模板分子的所述第五区域部分互补并且与位于所述至少一个DNA模板分子的所述第五区域5’侧的所述至少一个DNA模板分子的子序列部分互补的序列；
(i)第二探针(TP2)，其包含与所述至少一个DNA模板分子的第四区域互补或同源的序列；
其中所述至少一个DNA模板分子按从5’至3’的顺序包含所述第一区域、所述第二区域、所述第三区域、所述第四区域和所述第五区域；
其中所述第一区域、所述第二区域、所述第三区域、所述第四区域和所述第五区域不重叠；
其中所述第一区域、所述第二区域、所述第三区域、所述第四区域和所述第五区域各自包含12至50个核苷酸；
其中所述第一区域的最5’端核苷酸与所述第五区域的最3’端核苷酸之间的距离在100至3000个核苷酸之间；
其中所述TP1包含荧光团(TP1荧光团)和荧光猝灭部分；
其中所述TP2包含荧光团(TP2荧光团)和荧光猝灭部分；并且
其中所述TP1荧光团和所述TP2荧光团在光谱上彼此不同。
18.根据实施方案17所述的混合物或试剂盒，
其中所述第一区域的最5’端核苷酸与所述第五区域的最3’端核苷酸之间的距离在100至3000个核苷酸之间、在100至2000个核苷酸之间、在100至1500个核苷酸之间、在100至1000个核苷酸之间、在100至800个核苷酸之间、在100至500个核苷酸之间、或在100至300个核苷酸。
19.根据实施方案17或18所述的混合物或试剂盒，其中所述B2的5’端处的3至25个核苷酸与所述第五区域互补。
20.根据实施方案17-19中任一项所述的混合物或试剂盒，其中所述B2的3’端处的8至100个核苷酸不与所述第五区域互补。
21.根据实施方案20所述的混合物或试剂盒，其中所述B2的3’端处的2至70个核苷酸(B2非互补区域)与邻近所述第五区域的5’端的序列不互补。
22.根据实施方案21所述的混合物或试剂盒，其中所述B2非互补区域形成至少一个发夹结构。
23.根据实施方案20所述的混合物或试剂盒，其中所述B2包含阻止DNA聚合酶延伸的化学功能化。
24.根据实施方案23所述的混合物或试剂盒，其中所述化学功能化选自下组：3-碳间隔子、反向核苷酸和小沟结合物。
25.根据实施方案17-24中任一项的混合物或试剂盒，，其中所述TP1荧光团和所述TP2荧光团选自下组：Cy3、FAM、VIC、HEX、Cy5、Cy5.5、Quasar 705、ROX、TET、Texas Red或其他有机染料。
26.根据实施方案17-25中任一项的混合物或试剂盒，其中所述TP1荧光猝灭部分和所述TP2荧光猝灭部分选自下组：MGB、Black Hole Quencher、Iowa Black RQ和IowaBlack FQ。
27.根据实施方案17-26中任一项的混合物或试剂盒，其中混合物或试剂盒还包含：
(j)第三正向引物(FP3)，其包含与所述至少一个DNA模板的第七区域互补的序列；
(k)第三封阻引物(B3)，其包含与所述至少一个DNA模板的所述第七区域部分互补并且与位于所述至少一个DNA模板分子的所述第七区域5’侧的模板子序列部分互补的序列；
(l)第三探针(TP3)，其包含与所述至少一个DNA模板分子的第六区域互补或同源的序列；
其中所述第六区域与所述第七区域不重叠；
其中所述第六区域和所述第七区域各自包含12至50个核苷酸；
其中所述第六区域和所述第七区域位于所述第五区域的3’侧；
其中所述TP3包含荧光团(TP3荧光团)和荧光猝灭部分；和
其中所述TP3荧光团在光谱上不同于所述TP1荧光团和所述TP2荧光团。
28.根据实施方案17-27中任一项所述的混合物或试剂盒，其中混合物或试剂盒包含多个第二正向引物、第二封阻引物、和第二探针，其中至少两个第二探针包含光谱上不同的荧光团。
29.根据实施方案17-28中任一项所述的混合物或试剂盒，其中混合物或试剂盒包含多个第三正向引物、第三封阻引物和第三探针，其中至少两个第三探针包含光谱上不同的荧光团。
30.一种在水性溶液中产生荧光信号的方法，所述方法包括：
(a)将包含DNA模板分子的样品与以下混合以产生溶液：
(i)具有5’至3’核酸外切酶活性的DNA聚合酶；
(ii)所述DNA聚合酶发挥作用所需的试剂和缓冲剂；
(iii)第一正向引物(FP1)，其包含与所述DNA模板分子的第一区域互补的序列；
(iv)第一探针(TP1)，其包含与所述DNA模板分子的第二区域互补或同源的序列；
(v)第一反向引物(RP1)，其包含与所述DNA模板分子的第三区域同源的序列；
(vi)第二正向引物(FP2)，其包含与所述DNA模板分子的第四区域互补的序列；
(vii)第二封阻引物(B2)，其包含与所述DNA模板分子的所述第四区域部分互补并且与位于所述DNA模板分子的所述第四区域5’侧的所述DNA模板分子的子序列部分互补的序列；
(viii)第二探针(TP2)，其包含与所述DNA模板分子的第五
区域互补或同源的序列；和
(ix)第二反向引物(RP2)，其包含与所述DNA模板分子的第六区域同源的序列；
其中所述第一区域、所述第二区域、所述第三区域、所述第四区域、所述第五区域和所述第六区域不重叠；
其中所述第一区域、所述第二区域、所述第三区域、所述第四区域、所述第五区域和所述第六区域各自包含12至50个核苷酸；
其中0至5000个核苷酸位于任意两个区域之间；
其中所述TP1包含荧光团(TP1荧光团)和荧光猝灭部分；
其中所述TP2包含荧光团(TP2荧光团)和荧光猝灭部分；并且
其中所述TP1荧光团和所述TP2荧光团在光谱上彼此不同；和
(b)使步骤(a)中的样品经历至少7轮热循环，其中任选地，每轮包括在等于或大于78℃的温度持续1秒至30分钟与低于75℃的温度持续1秒至4小时之间交替。
31.根据实施方案30所述的方法，其中所述第六区域、所述第五区域和所述第四区域构成组1，其中所述第三区域、所述第二区域和所述第一区域构成组2，并且其中组1在所述至少一个DNA模板分子上位于组2的5’侧。
32.根据实施方案30或31所述的方法，其中位于所述第四区域和所述第三区域之间的核苷酸的数量为0至5000个核苷酸、0至2000个核苷酸之间、0至1500个核苷酸之间、0至1000个核苷酸之间、或0至800个核苷酸。
33.根据实施方案30-32中任一项所述的方法，其中所述第六区域、所述第五区域和所述第四区域构成组1，其中所述第三区域、所述第二区域和所述第一区域构成组2，并且其中组1在所述至少一个DNA模板分子上位于组2的3’侧。
34.根据实施方案31-33中任一项所述的方法，其中位于所述第六区域和所述第一区域之间的核苷酸的数量为0至5000个核苷酸、0至2000个核苷酸之间、0至1500个核苷酸之间、0至1000个核苷酸之间、或0至800个核苷酸。
35.根据实施方案30-34中任一项所述的方法，其中所述B2的5’端处的3至25个核苷酸与所述第四区域互补。
36.根据实施方案30-35中任一项所述的方法，其中所述B2的3’端处的8至100个核苷酸不与所述第四区域互补。
37.根据实施方案36所述的方法，其中所述B2的3’端处的2至70个核苷酸(B2非互补区域)与邻近所述第四区域的5’端的序列不互补。
38.根据实施方案37所述的方法，其中所述B2非互补区域形成至少一个发夹结构。
39.根据实施方案35所述的方法，其中所述B2的3’端包含阻止DNA聚合酶延伸的化学功能化。
40.根据实施方案39所述的方法，其中所述化学功能化选自下组：3-碳间隔子、反向核苷酸和小沟结合物。
41.根据实施方案30-40中任一项所述的方法，其中所述TP1荧光团和所述TP2荧光团选自下组：Cy3、FAM、VIC、HEX、Cy5、Cy5.5、Quasar 705、ROX、TET、Texas Red或其他有机染料。
42.根据实施方案30-41中任一项的方法，其中所述TP1荧光猝灭部分和所述TP2荧光猝灭部分选自下组：MGB、Black Hole Quencher、Iowa Black RQ和Iowa Black FQ。
43.根据实施方案30-42中任一项所述的方法，其中所述溶液还包含：
(x)第三正向引物(FP2)，其包含与感兴趣的DNA模板的第七区域互补的序列；
(xi)第三封阻引物(B3)，其包含与感兴趣的DNA模板的所述第七区域部分互补并且与位于所述感兴趣的DNA模板分子的所述第七区域5’侧的模板子序列部分互补的序列；
(xii)第三探针(TP3)，其包含与感兴趣的DNA模板分子的第八区域互补或同源的序列；和
(xiii)第三反向引物(RP3)，其包含与感兴趣的DNA模板分子的第九区域同源的序列；
其中所述第七、第八和第九区域是感兴趣的DNA模板分子的非重叠子序列；
其中所述第七、第八和第九区域各自包含120个核苷酸至50个核苷酸；
其中0个核苷酸至5000个核苷酸位于任意两个区域之间；
其中所述TP3包含荧光团(TP3荧光团)和荧光猝灭部分；并且
其中所述TP3荧光团在光谱上不同于所述TP1荧光团和所述TP2荧光团。
44.根据实施方案30-43中任一项所述的方法，其中所述溶液包含多个第二正向引物、第二封阻引物、第二探针和第二反向引物，其中至少两个第二探针包含光谱上不同的荧光团。
45.根据实施方案30-44中任一项所述的方法，其中所述溶液包含多个第三正向引物、第三封阻引物、第三探针和第三反向引物，其中至少两个第三探针包含光谱上不同的荧光团。
46.一种在水性溶液中产生荧光信号的方法，所述方法包括：
(a)将包含DNA模板分子的样品与以下混合以产生溶液：
(i)具有5’至3’核酸外切酶活性的DNA聚合酶；
(ii)所述DNA聚合酶发挥作用所需的试剂和缓冲剂；
(iii)第一正向引物(FP1)，其包含与所述DNA模板分子的第三区域互补的序列；
(iv)第一探针(TP1)，其包含与所述DNA模板分子的第二区域互补或同源的序列；
(v)第一反向引物(RP1)，其包含与所述DNA模板分子的第一区域同源的序列；
(vi)第二正向引物(FP2)，其包含与所述DNA模板分子的第五区域互补的序列；
(vii)第二封阻引物(B2)，其包含与所述DNA模板分子的所述第五区域部分互补并且与位于所述DNA模板分子的所述第五区域5’侧的所述DNA模板分子的子序列部分互补的序列；和
(viii)第二探针(TP2)，其包含与所述DNA模板分子的第四区域互补或同源的序列；
其中所述DNA模板分子按从5’至3’的顺序包含所述第一区域、所述第二区域、所述第三区域、所述第四区域和所述第五区域；
其中所述第一区域、所述第二区域、所述第三区域、所述第四区域和所述第五区域不重叠；
其中所述第一区域、所述第二区域、所述第三区域、所述第四区域和所述第五区域各自包含12个核苷酸至50个核苷酸；
其中所述第一区域的最5’端核苷酸与所述第五区域的最3’端核苷酸之间的距离在100个核苷酸至3000个核苷酸之间；
其中所述TP1包含荧光团(TP1荧光团)和荧光猝灭部分；
其中所述TP2包含荧光团(TP2荧光团)和荧光猝灭部分；并且
其中所述TP1荧光团和所述TP2荧光团在光谱上彼此不同；和
(b)使步骤(a)中的样品经历至少7轮热循环，其中任选地，每轮包括在等于或大于78℃的温度持续1秒至30分钟与低于75℃的温度持续1秒至4小时之间交替。
47.根据实施方案所述的方法，其中第一区域的最5’端核苷酸与所述第五区域的最3’端核苷酸之间的距离在100个核苷酸至3000个核苷酸之间、在100个核苷酸至2000个核苷酸之间、在100个核苷酸至1500个核苷酸之间、在100个核苷酸至1000个核苷酸之间、在100个核苷酸至800个核苷酸之间、在100个核苷酸至500个核苷酸之间、或在100个核苷酸与300个核苷酸之间。
48.根据实施方案46或47所述的方法，其中所述B2的3’端处的8至100个核苷酸不与所述第五区域互补。
49.根据实施方案46-48中任一项所述的方法，其中所述B2的3’端处的8至100个核苷酸不与所述第五区域互补。
50.根据实施方案49所述的方法，其中所述B2的3’端处的2至70个核苷酸(B2非互补区域)与邻近所述第五区域的5’端的序列不互补。
51.根据实施方案50所述的方法，其中所述B2非互补区域形成至少一个发夹结构。
52.根据实施方案49所述的方法，其中所述B2包含阻止DNA聚合酶延伸的化学功能化。
53.根据实施方案52所述的方法，其中所述化学功能化选自下组：3-碳间隔子、反向核苷酸和小沟结合物。
54.根据实施方案46-53中任一项所述的方法，其中所述TP1荧光团和所述TP2荧光团选自下组：Cy3、FAM、VIC、HEX、Cy5、Cy5.5、Quasar 705、ROX、TET、Texas Red或其他有机染料。
55.根据实施方案46-54中任一项所述的方法，其中所述TP1荧光猝灭部分和所述TP2荧光猝灭部分选自下组：MGB、Black Hole Quencher、Iowa Black RQ和Iowa Black FQ。
56.根据实施方案46-55中任一项所述的方法，其中所述溶液进一步包括：
(ix)第三正向引物(FP3)，其包含与感兴趣的DNA模板的第七区域互补的序列；
(x)第三封阻引物(B3)，其包含与感兴趣的DNA模板的所述第七区域部分互补并且与位于所述感兴趣的DNA模板分子的所述第七区域5’侧的模板子序列部分互补的序列；和
(xi)第三探针(TP3)，其包含与感兴趣的DNA模板分子的第八区域互补或同源的序列；
其中所述第六区域与所述第七区域不重叠；
其中所述第六区域和所述第七区域各自包含12至50个核苷酸；
其中所述第六区域和所述第七区域位于所述第五区域的3’侧；
其中所述TP3包含荧光团(TP3荧光团)和荧光猝灭部分；和
其中所述TP3荧光团在光谱上不同于所述TP1荧光团和所述TP2荧光团。
57.根据权利要求46-56中任一项所述的方法，其中所述溶液包含多个第二正向引物、第二封阻引物和第二探针，其中至少两个第二探针包含光谱上不同的荧光团。
58.根据实施方案46-57中任一项的方法，其中所述溶液包含多个第三正向引物、第三封阻引物和第三探针，其中至少两个第三探针包含光谱上不同的荧光团。
59.一种检测样品中的DNA模板序列的方法，所述方法包括：
(a)将所述样品与以下混合以产生溶液：
(i)具有5’至3’核酸外切酶活性的DNA聚合酶；
(ii)所述DNA聚合酶发挥作用所需的试剂和缓冲剂；
(iii)第一正向引物(FP1)，其包含与所述DNA模板分子的第一区域互补的序列；
(iv)第一探针(TP1)，其包含与所述DNA模板分子的第二区域互补或同源的序列；
(v)第一反向引物(RP1)，其包含与所述DNA模板分子的第三区域同源的序列；
(vi)第二正向引物(FP2)，其包含与所述DNA模板分子的第四区域互补的序列；
(vii)第二封阻引物(B2)，其包含与所述DNA模板分子的所述第四区域部分互补并且与位于所述DNA模板分子的所述第四区域5’侧的所述DNA模板分子的子序列部分互补的序列；
(viii)第二探针(TP2)，其包含与所述DNA模板分子的第五区域互补或同源的序列；和
(ix)第二反向引物(RP2)，其包含与所述DNA模板分子的第六区域同源的序列；
其中所述第一区域、所述第二区域、所述第三区域、所述第四区域、所述第五区域和所述第六区域不重叠；
其中所述第一区域、所述第二区域、所述第三区域、所述第四区域、所述第五区域和所述第六区域各自包含12至50个核苷酸；
其中0至5000个核苷酸位于任意两个区域之间；
其中所述TP1包含荧光团(TP1荧光团)和荧光猝灭部分；
其中所述TP2包含荧光团(TP2荧光团)和荧光猝灭部分；并且
其中所述TP1荧光团和所述TP2荧光团在光谱上彼此不同；
(b)使步骤(a)中的溶液经历至少7轮热循环，其中任选地，每轮包括在等于或大于78℃的温度持续1秒至30分钟与低于75℃的温度持续1秒至4小时之间交替；
(c)在与所述TP1和所述TP2对应的荧光通道中测量步骤(b)中每轮热循环后所述溶液的荧光值；
(d)确定TP1(Ct1)和TP2(Ct2)的循环阈值(Ct)；和
(e)如果Ct1小于35个循环，Ct2小于50个循环，并且[Ct2–Ct1]的值在1个循环和12个循环之间，则正向判定所述样品中存在所述DNA模板。
60.根据实施方案59所述的方法，其中所述溶液还包含：
(x)第三正向引物(FP3)，其包含与所述DNA模板的第七区域互补的序列；
(xi)第三封阻引物(B3)，其包含与所述DNA模板的所述第七区域部分互补并且与位于所述DNA模板分子的所述第七区域5’侧的模板子序列部分互补的序列；
(xii)第三探针(TP3)，其包含与所述DNA模板分子的第八区域互补或同源的序列；和
(xiii)第三反向引物(RP3)，其包含与DNA模板分子的第九区域同源的序列；
其中所述第七、第八和第九区域是所述DNA模板分子的非重叠子序列；
其中所述第七、第八和第九区域各自包含12至50个核苷酸；
其中0至5000个核苷酸位于任意两个区域之间；
其中所述TP3包含荧光团(TP3荧光团)和荧光猝灭部分；并且
其中所述TP3荧光团在光谱上不同于所述TP1荧光团和所述TP2荧光团。
61.根据实施方案59或60所述的方法，其中所述溶液包含多个第一正向引物、第一封阻引物、第一探针和第一反向引物，其中至少两个第一探针包含光谱上不同的荧光团。
62.根据实施方案59-61中任一项所述的方法，其中所述溶液包含多个第二正向引物、第二封阻引物、第二探针和第二反向引物，其中至少两个第二探针包含光谱上不同的荧光团。
63.根据实施方案59-62中任一项所述的方法，其中所述溶液包含多个第三正向引物、第三封阻引物、第三探针和第三反向引物，其中至少两个第三探针包含光谱上不同的荧光团。
64.一种检测样品中的DNA模板序列的方法，所述方法包括：
(a)将所述样品与以下混合以产生溶液：
(i)具有5’至3’核酸外切酶活性的DNA聚合酶；
(ii)所述DNA聚合酶发挥作用所需的试剂和缓冲剂；
(iii)第一正向引物(FP1)，其包含与所述DNA模板分子的第三区域互补的序列；
(iv)第一探针(TP1)，其包含与所述DNA模板分子的第二区域互补或同源的序列；
(v)第一反向引物(RP1)，其包含与所述DNA模板分子的第一区域同源的序列；
(vi)第二正向引物(FP2)，其包含与所述DNA模板分子的第五区域互补的序列；
(vii)第二封阻引物(B2)，其包含与所述DNA模板分子的所述第五区域部分互补并且与位于所述DNA模板分子的所述第五区域5’侧的所述DNA模板分子的子序列部分互补的序列；和
(viii)第二探针(TP2)，其包含与所述DNA模板分子的第四区域互补或同源的序列；
其中所述DNA模板分子按从5’至3’的顺序包含所述第一区域、所述第二区域、所述第三区域、所述第四区域和所述第五区域；
其中所述第一区域、所述第二区域、所述第三区域、所述第四区域和所述第五区域不重叠；
其中所述第一区域、所述第二区域、所述第三区域、所述第四区域和所述第五区域各自包含12至50个核苷酸；
其中所述第一区域的最5’端核苷酸与所述第五区域的最3’端核苷酸之间的距离在100至3000个核苷酸之间；
其中所述TP1包含荧光团(TP1荧光团)和荧光猝灭部分；
其中所述TP2包含荧光团(TP2荧光团)和荧光猝灭部分；并且
其中所述TP1荧光团和所述TP2荧光团在光谱上彼此不同；和
(b)使步骤(a)中的溶液经历至少7轮热循环，其中任选地，每轮包括在等于或大于78℃的温度持续1秒至30分钟与低于75℃的温度持续1秒至4小时之间交替；
(c)在与所述TP1和所述TP2对应的荧光通道中测量步骤(b)中每轮热循环后所述溶液的荧光值；
(d)确定TP1(Ct1)和TP2(Ct2)的循环阈值(Ct)；和
(e)如果Ct1小于35个循环，Ct2小于50个循环，并且[Ct2–Ct1]的值在1个循环和12个循环之间，则正向判定所述样品中存在所述DNA模板。
65.根据实施方案64所述的方法，其中所述溶液还包含：
(ix)第三正向引物(FP3)，其包含与所述DNA模板分子的第七区域互补的序列；
(x)第三封阻引物(B3)，其包含与所述DNA模板的所述第七区域部分互补并且与位于所述DNA模板分子的所述第七区域5’侧的模板子序列部分互补的序列；和
(xi)第三探针(TP3)，其包含与所述DNA模板分子的第六区域互补或同源的序列；
其中所述第六区域与所述第七区域不重叠；
其中所述第六区域和所述第七区域各自包含12至50个核苷酸；
其中所述第六区域和所述第七区域位于所述第五区域的3’侧；
其中所述TP3包含荧光团(TP3荧光团)和荧光猝灭部分；和
其中所述TP3荧光团在光谱上不同于所述TP1荧光团和所述TP2荧光团。
66.根据实施方案64或65所述的方法，其中所述溶液包含多个第一正向引物、第一封阻引物、第一探针和第一反向引物，其中至少两个第一探针包含光谱上不同的荧光团。
67.根据实施方案64-66中任一项所述的方法，其中所述溶液包含多个第二正向引物、第二封阻引物、第二探针和第二反向引物，其中至少两个第二探针包含光谱上不同的荧光团。
68.根据实施方案中任一项所述的方法，其中所述溶液包含多个第三正向引物、第三封阻引物、第三探针和第三反向引物，其中至少两个第三探针包含光谱上不同的荧光团。
69.一种用于检测分析物中的多个DNA靶标的方法，所述方法包括：
(a)将所述分析物与以下混合以产生溶液：
(i)具有5’至3’核酸外切酶活性的DNA聚合酶；
(ii)所述DNA聚合酶发挥作用所需的试剂和缓冲剂；
(iii)多个PCR引物；和
(iv)包含荧光团和荧光猝灭部分的多个探针；
(b)使步骤(a)中的溶液经历至少7轮热循环，其中任选地，每轮包括在等于或大于78℃的温度持续1秒至30分钟与低于75℃的温度持续1秒至4小时之间交替；
(c)在至少两个荧光通道中测量步骤(b)中每轮热循环后所述溶液的荧光值；
(d)确定所述至少两个荧光通道中每一个的循环阈值(Ct)；
(e)确定荧光信号增强的时间顺序；和
(f)将荧光信号增强的顺序映射到所述多个DNA靶标的存在、不存在或数量。
70.根据实施方案69所述的方法，其中所述多个探针各自包含光谱上不同的荧光团。
71.根据实施方案69或70所述的方法，其中所述多个探针各自包含不同的荧光猝灭部分。
72.根据实施方案69或70所述的方法，其中所述多个探针各自包含相同的荧光猝灭部分。
73.根据实施方案69-72中任一项所述的方法，其中所述荧光团选自下组：Cy3、FAM、VIC、HEX、Cy5、Cy5.5、Quasar 705、ROX、TET、Texas Red或其他有机染料。
74.根据实施方案中69-73任一项所述的方法，其中所述荧光猝灭部分选自下组：MGB、Black Hole Quencher、Iowa Black RQ和Iowa Black FQ。
75.根据实施方案69-74中任一项所述的方法，其中所述多个PCR引物包含至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9或至少10组正向和反向引物。
76.根据实施方案69-75中任一项所述的方法，其中所述多个探针包含至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或至少10个探针。
77.根据实施方案69-76中任一项所述的方法，其中所述溶液还包含多个封阻引物。
78.根据实施方案77所述的方法，其中所述多种封阻引物包括至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或至少10个封阻引物。
79.根据实施方案69-78中任一项所述的方法，其中多个DNA靶标包括至少3个靶标、至少4个靶标、至少5个靶标、至少6个靶标、至少7个靶标、至少8个靶标、至少9个靶标、至少10个靶标、至少11个靶标、至少12个靶标、至少13个靶标、至少14个靶标、至少15个靶标、至少18个靶标、至少20个靶标、至少25个靶标、至少30个靶标、至少35个靶标、至少40个靶标、至少45个靶标、至少50个靶标、至少55个靶标、至少60个靶标或至少64个靶标。
80.根据实施方案69-79中任一项所述的方法，其中所述多个DNA靶标包括来自动物基因组、植物基因组、细菌基因组、真菌基因组或病毒基因组的DNA靶标。
81.根据实施方案80所述的方法，其中所述动物基因组是人类基因组。
82.根据实施方案69-81中任一项所述的方法，其中步骤(c)包括在至少三个荧光通道中测量荧光。
83.根据实施方案30-82中任一项所述的方法，其中所述方法包括至少10个循环、至少12个循环、至少15个循环、至少18个循环、至少20个循环、至少25个循环、至少30个循环、至少35个循环、至少40个循环、至少45个循环或至少50个循环的热循环。
84.根据实施方案30-83中任一项所述的方法，其中所述DNA聚合酶选自下组：TaqDNA聚合酶、Best DNA聚合酶和DNA聚合酶1。
85.一种混合物或试剂盒，其包含：
(a)任选地，具有5’至3’核酸外切酶活性的DNA聚合酶；
(b)任选地，所述DNA聚合酶发挥作用所需的试剂和缓冲剂；
(c)任选地，DNA模板分子；
(d)第一正向引物(FP1)，其包含与所述DNA模板分子的第一区域互补的序列；
(e)第一探针(TP1)，其包含与所述DNA模板分子的第二区域互补或同源的序列；
(f)第一反向引物(RP1)，其包含与所述DNA模板分子的第三区域同源的序列；
(g)第二正向引物(FP2)，其包含与所述DNA模板分子的第四区域互补的序列，其中所述FP2在其3’端处或3’端附近包含与所述DNA模板分子不互补的一个或多个核苷酸；
(h)第二探针(TP2)，其包含与所述DNA模板分子的第五区域互补或同源的序列；和
(i)第二反向引物(RP2)，其包含与所述DNA模板分子的第六区域同源的序列；
其中所述第一区域、所述第二区域、所述第三区域、所述第四区域、所述第五区域和所述第六区域不重叠；
其中所述第一区域、所述第二区域、所述第三区域、所述第四区域、所述第五区域和所述第六区域各自包含12至50个核苷酸；
其中0至5000个核苷酸位于任意两个区域之间；
其中所述TP1包含荧光团(TP1荧光团)和荧光猝灭部分；
其中所述TP2包含荧光团(TP2荧光团)和荧光猝灭部分；并且
其中所述TP1荧光团和所述TP2荧光团在光谱上彼此不同。
86.一种混合物或试剂盒，其包含：
(a)任选地，具有5’至3’核酸外切酶活性的DNA聚合酶；
(b)任选地，所述DNA聚合酶发挥作用所需的试剂和缓冲剂；
(c)任选地，DNA模板分子；
(d)第一正向引物(FP1)，其包含与所述DNA模板分子的第三区域互补的序列；
(e)第一探针(TP1)，其包含与所述DNA模板分子的第二区域互补或同源的序列；
(f)第一反向引物(RP1)，其包含与所述DNA模板分子的第一区域同源的序列；
(g)第二正向引物(FP2)，其包含与所述DNA模板分子的第五区域互补的序列，其中所述FP2在其3’端处或3’端附近包含与所述DNA模板分子不互补的一个或多个核苷酸；和
(h)第二探针(TP2)，其包含与所述DNA模板分子的第四区域互补或同源的序列；
其中所述至少一个DNA模板分子按从5’至3’的顺序包含所述第一区域、所述第二区域、所述第三区域、所述第四区域和所述第五区域；
其中所述第一区域、所述第二区域、所述第三区域、所述第四区域和所述第五区域不重叠；
其中所述第一区域、所述第二区域、所述第三区域、所述第四区域和所述第五区域各自包含12至50个核苷酸；
其中所述第一区域的最5’端核苷酸与所述第五区域的最3’端核苷酸之间的距离在100至3000个核苷酸之间；
其中所述TP1包含荧光团(TP1荧光团)和荧光猝灭部分；
其中所述TP2包含荧光团(TP2荧光团)和荧光猝灭部分；并且
其中所述TP1荧光团和所述TP2荧光团在光谱上彼此不同。
现在已经一般性地描述了本公开，通过参考以说明方式提供的以下实施例将更容易理解本公开，除非特别说明，否则这些实施例不旨在限制本公开。
实施例
实施例1.颜色组合
在某些DNA靶标组合不太可能同时存在于同一样品中的应用中，通过使用荧光探针的组合，可以检测到比不同荧光颜色通道数量更多的DNA靶标。例如，在传染性病原体的综合征测试中，大多数患者受到常见病原体列表中的最多一种病原体的影响。
通过使用四个荧光颜色通道A、B、C和D，可以识别多达4+6+4+1＝2(4-1)＝15种不同的病原体，假设任何样品中存在不超过一种病原体。表2中示出了观察到的荧光与DNA靶标的示例性映射。
表2.观察到的荧光与DNA靶标的映射
靶标 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
通道 A B C D AB AC AD BC BD CD ABC ABD ACD BCD ABCD
显示两个不同荧光颜色通道A和B中出现阳性结果的S形qPCR迹线可能表明独特的DNA靶标#5。这可以通过使用针对DNA靶标#5的两种不同的TaqManTM探针来实施，其中一种TaqManTM探针具有A荧光团，且另一种TaqManTM探针具有B荧光团。
即使在溶液中存在多个DNA靶标的情况下，只要不是所有可能的病原体组合都可能存在，就有可能超过荧光颜色通道的数量。例如，使用四个荧光颜色通道，只要样品中存在靶标#1、#2和#3中的至多一个，且存在靶标#4、#5和#6中的至多一个，就有可能检测六个不同的DNA靶标。参见表3。
表3.观察到的荧光与DNA靶标的映射
靶标 1 2 3 4 5 6 1+4 1+5 1+6 2+4 2+5 2+6 3+4 3+5 3+6
通道 A B AB C D CD AC AD ACD BC BD BCD ABC ABD ABCD
实施例2.循环多重分析
循环多重分析允许人们通过使用颜色排列来增加不同的可报告DNA靶标的数量。循环多重分析是基于多重qPCR反应的合理设计，使得当给定DNA靶标存在时，第一荧光通道在较早的循环中显示荧光增强，然后第二荧光通道在较晚的循环中显示荧光增强。因此，在颜色组合中(参见，实施例1)，A和B通道(写为AB)中的荧光增强可以表明第三靶标DNA序列，通过颜色多重分析，排列A>B(首先A中的荧光增强，然后是B))可以代表与排列B>A不同的DNA靶标。
使用4个颜色通道，循环多重分析可以识别多达4+4×3+4×3×2+4×3×2×1＝64个不同的DNA靶标，假设样品具有如表4所示的DNA靶标中的最多1个。
表4.颜色排列
靶标 1 2 3 4 5 6 7 8
通道 A B C D A>B A>C A>D B>A
靶标 9 10 11 12 13 14 15 16
通道 B>C B>D C>A C>B C>D D>A D>B D>C
靶标 17 18 19 20 21 22 23 24
通道 A>B>C A>B>D A>C>B A>C>D A>D>B A>D>C B>A>C B>A>D
靶标 25 26 27 28 29 30 31 32
通道 B>C>A B>C>D B>D>A B>D>C C>A>B C>A>D C>B>A C>B>D
靶标 33 34 35 36 37 38 39 40
通道 C>D>A C>D>B D>A>B D>A>C D>B>A D>B>C D>C>A D>C>B
靶标 41 42 43 44 45 46 47 48
通道 A>B>C>D A>B>D>C A>C>B>D A>C>D>B A>D>B>C A>D>C>B B>A>C>D B>A>D>C
靶标 49 50 51 52 53 54 55 56
通道 B>C>A>D B>C>D>A B>D>A>C B>D>C>A C>A>B>D C>A>D>B C>B>A>D C>B>D>A
靶标 57 58 59 60 61 62 63 64
通道 C>D>A>B C>D>B>A D>A>B>C D>A>C>B D>B>A>C D>B>C>A D>C>A>B D>C>B>A
在表4的符号中，A>B>C>D表示A荧光首先增加，然后是B，然后是C，然后是D。在一些实施方案中，在一个荧光信号的上升和随后荧光信号的上升之间的PCR循环数量可以在3至5之间，这样就可以很容易地确定荧光信号的顺序。因此，循环多重分析允许使用四个颜色通道对64个不同信号进行编码，比颜色组合增加了4倍(参见，实施例1)。这种不同信号的数量增加同样可用于某些不同DNA靶标组可能共存于溶液中的应用。
实施例3.封阻引物置换扩增
循环多重分析的一个非限制性示例实施方案是使用封阻引物置换扩增(BlockerDisplacement Amplification，BDA)来设计同一DNA靶标上不同扩增子的Ct延迟。在BDA中，合理设计的封阻引物寡核苷酸在与模板的结合中与正向引物竞争，导致PCR扩增延迟，从而产生比没有封阻引物的PCR反应更大的Ct值。Ct延迟的精确值可以通过封阻引物的序列和通过封阻引物的浓度来调节。此功能允许设计多个不同的扩增子以提供因所需循环数量而不同的Ct值。在广泛的可能性范围内合理设计Ct延迟值的能力也有助于78可，和三级循环多重分析，其中三种或四种不同荧光信号的顺序被用于确定样品中存在的DNA靶标。BDA的示例之前被描述于美国专利申请公开No.20170067090和WO2019/164885中，二者均通过引用整体并入本文。
设计第一正向引物(FP1)和第二正向引物(FP2)，使其展现出与相应模板的明显的反向互补，第二封阻引物(B2)与第二正向引物的3’区域部分重叠，并且与模板大部分或完全反向互补(见图1)。第一探针(TP1)和第二探针(TP2)落入第一反向引物(RP1)之间的区域，所述第一反向引物与相应模板具有明显的序列相似性。
在一些实施方案中，系统还具有与模板大部分或完全同源的第二反向引物(RP2)。在一些实施方案中，系统具有第三正向引物(FP3)、第三封阻引物(B3)和第三TaqManTM探针(TP3)。在一些实施方案中，系统具有第三正向引物(FP3)、第三封阻引物(B3)、第三TaqManTM探针(TP3)和第三反向引物(RP3)。
实施例4.变体
对于本领域普通技术人员来说存在许多明显的变体。例如，探针可以结合DNA模板的(+)链或(-)链。例如，可以在5’端、3’端或中间用荧光团对探针进行功能化。同样可以在5’端、3’端或中间对猝灭剂进行功能化。引物可以被设计为与预期的DNA靶序列完全或不完全互补。引物可能具有5’突出端，其可用作后续重新分析(例如使用测序)的衔接子。引物或探针可以包含DNA核苷修饰，例如非天然核苷酸，例如肌苷、5’-硝基吲哚、PEG间隔子、iso-C或iso-G。引物或探针可以包含DNA骨架修饰，例如硫代磷酸、锁定核酸、2’-O-甲基或5’-2’DNA连锁。除了标准的dATP、dTTP、dCTP和dGTP之外，反应缓冲剂还可包含dUTP以防止遗留污染。反应缓冲剂可包含拥挤剂(crowding agent)以改善高G/C含量DNA序列的PCR扩增。
实施例5.循环多重PCR
使用PowerUpTM SYBRTM Green DNA Polymerase Master Mix(ThermoFisher)将qPCR应用于NA18537人类基因组DNA模板(20ng；Coriell Cell Repositories)。图6的上方图片中提供了实验设计示意图。第一探针(TP1；SEQ ID NO:7)的5’端包含Cy5荧光团，第二探针(TP2；SEQ ID NO:4)的5’端包含ROX荧光团。两组引物(FP1(SEQ ID NO:5)和RP1(SEQID NO:6)；FP2(SEQ ID NO:1)和RP2(SEQ ID NO:2))间隔12个核苷酸。FP1和RP1产生的扩增子长度为121nt，FP2和RP2产生的扩增子长度为98nt。实验结果如图6的下方图片所示。不同条件下所有图表间的Cy5曲线的循环阈值(Ct)一致，这表明引物对的效率不受系统内其他寡核苷酸的影响。ROX通道的Ct值随着第二封阻引物(B2；SEQ ID NO:3)浓度的增加而增加，ROX通道和Cy5通道之间的ΔCt也是如此，这证明了循环多重分析系统的成功。参见图6。
使用Bio-Rad CFX96 qPCR仪器进行热循环和荧光测量。热循环方案如下：95℃持续3分钟，循环1次；然后50个循环(95℃持续10秒，60℃持续30秒)。在60℃下收集荧光信号。

Claims (35)

1.一种混合物或试剂盒，其包含：
(a)任选地，具有5’至3’核酸外切酶活性的DNA聚合酶；
(b)任选地，所述DNA聚合酶发挥作用所需的试剂和缓冲剂；
(c)任选地，至少一个DNA模板分子；
(d)第一正向引物(FP1)，其包含与所述至少一个DNA模板分子的第一区域互补的序列；
(e)第一探针(TP1)，其包含与所述至少一个DNA模板分子的第二区域互补或同源的序列；
(f)第一反向引物(RP1)，其包含与所述至少一个DNA模板分子的第三区域同源的序列；
(g)第二正向引物(FP2)，其包含与所述至少一个DNA模板分子的第四区域互补的序列；
(h)第二封阻引物(B2)，其包含与所述至少一个DNA模板分子的所述第四区域部分互补并且与位于所述至少一个DNA模板分子的所述第四区域5’侧的模板子序列部分互补的序列；
(i)第二探针(TP2)，其包含与所述至少一个DNA模板分子的第五区域互补或同源的序列；和
(j)第二反向引物(RP2)，其包含与所述至少一个DNA模板分子的第六区域同源的序列；
其中所述第一区域、所述第二区域、所述第三区域、所述第四区域、所述第五区域和所述第六区域不重叠；
其中所述第一区域、所述第二区域、所述第三区域、所述第四区域、所述第五区域和所述第六区域各自包含12至50个核苷酸；
其中0至5000个核苷酸位于任意两个区域之间；
其中所述TP1包含荧光团(TP1荧光团)和荧光猝灭部分；
其中所述TP2包含荧光团(TP2荧光团)和荧光猝灭部分；并且
其中所述TP1荧光团和所述TP2荧光团在光谱上彼此不同。
2.根据权利要求1所述的混合物或试剂盒，其中所述第六区域、所述第五区域和所述第四区域构成组1，其中所述第三区域、所述第二区域和所述第一区域构成组2，并且其中组1在所述至少一个DNA模板分子上位于组2的5’侧。
3.根据权利要求2所述的混合物或试剂盒，其中位于所述第四区域和所述第三区域之间的核苷酸的数量为0至5000个核苷酸。
4.根据权利要求1所述的混合物或试剂盒，其中所述第六区域、所述第五区域和所述第四区域构成组1，其中所述第三区域、所述第二区域和所述第一区域构成组2，并且其中组1在所述至少一个DNA模板分子上位于组2的3’侧。
5.根据权利要求4所述的混合物或试剂盒，其中位于所述第六区域和所述第一区域之间的核苷酸的数量为0至5000个核苷酸。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的混合物或试剂盒，其中所述B2的5’端处的3至25个核苷酸与所述第四区域互补。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的混合物或试剂盒，其中所述B2的3’端处的8至100个核苷酸不与所述第四区域互补。
8.根据权利要求7所述的混合物或试剂盒，其中所述B2的3’端处的2至70个核苷酸(B2非互补区域)与邻近所述第四区域的5’端的序列不互补。
9.根据权利要求8所述的混合物或试剂盒，其中所述B2非互补区域形成至少一个发夹结构。
10.根据权利要求6所述的混合物或试剂盒，其中所述B2的3’端包含阻止DNA聚合酶延伸的化学功能化。
11.根据权利要求10所述的混合物或试剂盒，其中所述化学功能化选自下组：3-碳间隔子、反向核苷酸和小沟结合物。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的混合物或试剂盒，其中所述TP1荧光团和所述TP2荧光团选自下组：Cy3、FAM、VIC、HEX、Cy5、Cy5.5、Quasar 705、ROX、TET、Texas Red或其他有机染料。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的混合物或试剂盒，其中所述TP1荧光猝灭部分和所述TP2荧光猝灭部分选自下组：MGB、Black Hole Quencher、Iowa Black RQ和Iowa BlackFQ。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的混合物或试剂盒，其中所述混合物或试剂盒还包含：
(o)第三正向引物(FP3)，其包含与所述至少一个DNA模板的第七区域互补的序列；
(p)第三封阻引物(B3)，其包含与所述至少一个DNA模板的所述第七区域部分互补并且与位于所述至少一个DNA模板分子的所述第七区域5’侧的模板子序列部分互补的序列；
(q)第三探针(TP3)，其包含与所述至少一个DNA模板分子的第八区域互补或同源的序列；和
(r)第三反向引物(RP3)，其包含与所述至少一个DNA模板分子的第九区域同源的序列；
其中所述第七、第八和第九区域是所述至少一个DNA模板分子的非重叠子序列；
其中所述第七、第八和第九区域各自包含12至50个核苷酸；
其中0至5000个核苷酸位于任意两个区域之间；
其中所述TP3包含荧光团(TP3荧光团)和荧光猝灭部分；并且
其中所述TP3荧光团在光谱上不同于所述TP1荧光团和所述TP2荧光团。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的混合物或试剂盒，其中所述混合物包含多个第二正向引物、第二封阻引物、第二探针和第二反向引物，其中至少两个第二探针包含光谱上不同的荧光团。
16.根据权利要求1所述的混合物或试剂盒，其中所述混合物包含多个第三正向引物、第三封阻引物、第三探针和第三反向引物，其中至少两个第三探针包含光谱上不同的荧光团。
17.一种混合物或试剂盒，其包含：
(a)任选地，具有5’至3’核酸外切酶活性的DNA聚合酶；
(b)任选地，所述DNA聚合酶发挥作用所需的试剂和缓冲剂；
(c)任选地，至少一个DNA模板分子；
(d)第一正向引物(FP1)，其包含与所述至少一个DNA模板分子的第三区域互补的序列；
(e)第一探针(TP1)，其包含与所述至少一个DNA模板分子的第二区域互补或同源的序列；
(f)第一反向引物(RP1)，其包含与所述至少一个DNA模板分子的第一区域同源的序列；
(g)第二正向引物(FP2)，其包含与所述至少一个DNA模板分子的第五区域互补的序列；
(h)第二封阻引物(B2)，其包含与所述至少一个DNA模板分子的所述第五区域部分互补并且与位于所述至少一个DNA模板分子的所述第五区域5’侧的所述至少一个DNA模板分子的子序列部分互补的序列；
(i)第二探针(TP2)，其包含与所述至少一个DNA模板分子的第四区域互补或同源的序列；
其中所述至少一个DNA模板分子按从5’至3’的顺序包含所述第一区域、所述第二区域、所述第三区域、所述第四区域和所述第五区域；
其中所述第一区域、所述第二区域、所述第三区域、所述第四区域和所述第五区域不重叠；
其中所述第一区域、所述第二区域、所述第三区域、所述第四区域和所述第五区域各自包含12至50个核苷酸；
其中所述第一区域的最5’端核苷酸与所述第五区域的最3’端核苷酸之间的距离在100至3000个核苷酸之间；
其中所述TP1包含荧光团(TP1荧光团)和荧光猝灭部分；
其中所述TP2包含荧光团(TP2荧光团)和荧光猝灭部分；并且
其中所述TP1荧光团和所述TP2荧光团在光谱上彼此不同。
18.一种在水性溶液中产生荧光信号的方法，所述方法包括：
(a)将包含DNA模板分子的样品与以下混合以产生溶液：
(i)具有5’至3’核酸外切酶活性的DNA聚合酶；
(ii)所述DNA聚合酶发挥作用所需的试剂和缓冲剂；
(iii)第一正向引物(FP1)，其包含与所述DNA模板分子的第一区域互补的序列；
(iv)第一探针(TP1)，其包含与所述DNA模板分子的第二区域互补或同源的序列；
(v)第一反向引物(RP1)，其包含与所述DNA模板分子的第三区域同源的序列；
(vi)第二正向引物(FP2)，其包含与所述DNA模板分子的第四区域互补的序列；
(vii)第二封阻引物(B2)，其包含与所述DNA模板分子的所述第四区域部分互补并且与位于所述DNA模板分子的所述第四区域5’侧的所述DNA模板分子的子序列部分互补的序列；
(viii)第二探针(TP2)，其包含与所述DNA模板分子的第五区域互补或同源的序列；和
(ix)第二反向引物(RP2)，其包含与所述DNA模板分子的第六区域同源的序列；
其中所述第一区域、所述第二区域、所述第三区域、所述第四区域、所述第五区域和所述第六区域不重叠；
其中所述第一区域、所述第二区域、所述第三区域、所述第四区域、所述第五区域和所述第六区域各自包含12至50个核苷酸；
其中0至5000个核苷酸位于任意两个区域之间；
其中所述TP1包含荧光团(TP1荧光团)和荧光猝灭部分；
其中所述TP2包含荧光团(TP2荧光团)和荧光猝灭部分；并且
其中所述TP1荧光团和所述TP2荧光团在光谱上彼此不同；和
(b)使步骤(a)中的样品经历至少7轮热循环，其中任选地，每轮包括在等于或大于78℃的温度持续1秒至30分钟与低于75℃的温度持续1秒至4小时之间交替。
19.一种在水性溶液中产生荧光信号的方法，所述方法包括：
(a)将包含DNA模板分子的样品与以下混合以产生溶液：
(i)具有5’至3’核酸外切酶活性的DNA聚合酶；
(ii)所述DNA聚合酶发挥作用所需的试剂和缓冲剂；
(iii)第一正向引物(FP1)，其包含与所述DNA模板分子的第三区域互补的序列；
(iv)第一探针(TP1)，其包含与所述DNA模板分子的第二区域互补或同源的序列；
(v)第一反向引物(RP1)，其包含与所述DNA模板分子的第一区域同源的序列；
(vi)第二正向引物(FP2)，其包含与所述DNA模板分子的第五区域互补的序列；
(vii)第二封阻引物(B2)，其包含与所述DNA模板分子的所述第五区域部分互补并且与位于所述DNA模板分子的所述第五区域5’侧的所述DNA模板分子的子序列部分互补的序列；和
(viii)第二探针(TP2)，其包含与所述DNA模板分子的第四区域互补或同源的序列；
其中所述DNA模板分子按从5’至3’的顺序包含所述第一区域、所述第二区域、所述第三区域、所述第四区域和所述第五区域；
其中所述第一区域、所述第二区域、所述第三区域、所述第四区域和所述第五区域不重叠；
其中所述第一区域、所述第二区域、所述第三区域、所述第四区域和所述第五区域各自包含12个核苷酸至50个核苷酸；
其中所述第一区域的最5’端核苷酸与所述第五区域的最3’端核苷酸之间的距离在100个核苷酸至3000个核苷酸之间；
其中所述TP1包含荧光团(TP1荧光团)和荧光猝灭部分；
其中所述TP2包含荧光团(TP2荧光团)和荧光猝灭部分；并且
其中所述TP1荧光团和所述TP2荧光团在光谱上彼此不同；和
(b)使步骤(a)中的样品经历至少7轮热循环，其中任选地，每轮包括在等于或大于78℃的温度持续1秒至30分钟与低于75℃的温度持续1秒至4小时之间交替。
20.一种检测样品中的DNA模板序列的方法，所述方法包括：
(a)将所述样品与以下混合以产生溶液：
(i)具有5’至3’核酸外切酶活性的DNA聚合酶；
(ii)所述DNA聚合酶发挥作用所需的试剂和缓冲剂；
(iii)第一正向引物(FP1)，其包含与所述DNA模板分子的第一区域互补的序列；
(iv)第一探针(TP1)，其包含与所述DNA模板分子的第二区域互补或同源的序列；
(v)第一反向引物(RP1)，其包含与所述DNA模板分子的第三区域同源的序列；
(vi)第二正向引物(FP2)，其包含与所述DNA模板分子的第四区域互补的序列；
(vii)第二封阻引物(B2)，其包含与所述DNA模板分子的所述第四区域部分互补并且与位于所述DNA模板分子的所述第四区域5’侧的所述DNA模板分子的子序列部分互补的序列；
(viii)第二探针(TP2)，其包含与所述DNA模板分子的第五区域互补或同源的序列；和
(ix)第二反向引物(RP2)，其包含与所述DNA模板分子的第六区域同源的序列；
其中所述第一区域、所述第二区域、所述第三区域、所述第四区域、所述第五区域和所述第六区域不重叠；
其中所述第一区域、所述第二区域、所述第三区域、所述第四区域、所述第五区域和所述第六区域各自包含12至50个核苷酸；
其中0至5000个核苷酸位于任意两个区域之间；
其中所述TP1包含荧光团(TP1荧光团)和荧光猝灭部分；
其中所述TP2包含荧光团(TP2荧光团)和荧光猝灭部分；并且
其中所述TP1荧光团和所述TP2荧光团在光谱上彼此不同；
(b)使步骤(a)中的溶液经历至少7轮热循环，其中任选地，每轮包括在等于或大于78℃的温度持续1秒至30分钟与低于75℃的温度持续1秒至4小时之间交替；
(c)在与所述TP1和所述TP2对应的荧光通道中测量步骤(b)中每轮热循环后所述溶液的荧光值；
(d)确定TP1(Ct1)和TP2(Ct2)的循环阈值(Ct)；和
(e)如果Ct1小于35个循环，Ct2小于50个循环，并且[Ct2–Ct1]的值在1个循环和12个循环之间，则正向判定所述样品中存在所述DNA模板。
21.一种检测样品中DNA模板序列的方法，所述方法包括：
(a)将所述样品与以下混合以产生溶液：
(i)具有5’至3’核酸外切酶活性的DNA聚合酶；
(ii)所述DNA聚合酶发挥作用所需的试剂和缓冲剂；
(iii)第一正向引物(FP1)，其包含与所述DNA模板分子的第三区域互补的序列；
(iv)第一探针(TP1)，其包含与所述DNA模板分子的第二区域互补或同源的序列；
(v)第一反向引物(RP1)，其包含与所述DNA模板分子的第一区域同源的序列；
(vi)第二正向引物(FP2)，其包含与所述DNA模板分子的第五区域互补的序列；
(vii)第二封阻引物(B2)，其包含与所述DNA模板分子的所述第五区域部分互补并且与位于所述DNA模板分子的所述第五区域5’侧的所述DNA模板分子的子序列部分互补的序列；和
(viii)第二探针(TP2)，其包含与所述DNA模板分子的第四区域互补或同源的序列；
其中所述DNA模板分子按从5’至3’的顺序包含所述第一区域、所述第二区域、所述第三区域、所述第四区域和所述第五区域；
其中所述第一区域、所述第二区域、所述第三区域、所述第四区域和所述第五区域不重叠；
其中所述第一区域、所述第二区域、所述第三区域、所述第四区域和所述第五区域各自包含12至50个核苷酸；
其中所述第一区域的最5’端核苷酸与所述第五区域的最3’端核苷酸之间的距离在100至3000个核苷酸之间；
其中所述TP1包含荧光团(TP1荧光团)和荧光猝灭部分；
其中所述TP2包含荧光团(TP2荧光团)和荧光猝灭部分；并且
其中所述TP1荧光团和所述TP2荧光团在光谱上彼此不同；和
(b)使步骤(a)中的溶液经历至少7轮热循环，其中任选地，每轮包括在等于或大于78℃的温度持续1秒至30分钟与低于75℃的温度持续1秒至4小时之间交替；
(c)在与所述TP1和所述TP2对应的荧光通道中测量步骤(b)中每轮热循环后所述溶液的荧光值；
(d)确定TP1(Ct1)和TP2(Ct2)的循环阈值(Ct)；和
(e)如果Ct1小于35个循环，Ct2小于50个循环，并且[Ct2–Ct1]的值在1个循环和12个循环之间，则正向判定所述样品中存在所述DNA模板。
22.一种用于检测分析物中的多个DNA靶标的方法，所述方法包括：
(a)将所述分析物与以下混合以产生溶液：
(i)具有5’至3’核酸外切酶活性的DNA聚合酶；
(ii)所述DNA聚合酶发挥作用所需的试剂和缓冲剂；
(iii)多个PCR引物；和
(iv)包含荧光团和荧光猝灭部分的多个探针；
(b)使步骤(a)中的溶液经历至少7轮热循环，其中任选地，每轮包括在等于或大于78℃的温度持续1秒至30分钟与低于75℃的温度持续1秒至4小时之间交替；
(c)在至少两个荧光通道中测量步骤(b)中每轮热循环后所述溶液的荧光值；
(d)确定所述至少两个荧光通道中每一个的循环阈值(Ct)；
(e)确定荧光信号增强的时间顺序；和
(f)将荧光信号增强的顺序映射到所述多个DNA靶标的存在、不存在或数量。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述多个探针各自包含光谱上不同的荧光团。
24.根据权利要求22所述的方法，其中所述多个探针各自包含不同的荧光猝灭部分。
25.根据权利要求22所述的方法，其中所述多个探针各自包含相同的荧光猝灭部分。
26.根据权利要求22-25中任一项所述的方法，其中所述荧光团选自下组：Cy3、FAM、VIC、HEX、Cy5、Cy5.5、Quasar 705、ROX、TET、Texas Red或其他有机染料。
27.根据权利要求22-26中任一项所述的方法，其中所述荧光猝灭部分选自下组：MGB、Black Hole Quencher、Iowa Black RQ和Iowa Black FQ。
28.根据权利要求22-27中任一项所述的方法，其中所述溶液还包含多种封阻引物。
29.根据权利要求22-28中任一项所述的方法，其中所述多个DNA靶标包括来自动物基因组、植物基因组、细菌基因组、真菌基因组或病毒基因组的DNA靶标。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述动物基因组是人类基因组。
31.根据权利要求22-30中任一项所述的方法，其中步骤(c)包括在至少三个荧光通道中测量荧光。
32.根据权利要求18-31中任一项所述的方法，其中所述方法包括至少10个循环的热循环。
33.根据权利要求18-32中任一项所述的方法，其中所述DNA聚合酶选自下组：Taq DNA聚合酶、Best DNA聚合酶和DNA聚合酶1。
34.一种混合物或试剂盒，其包含：
(a)任选地，具有5’至3’核酸外切酶活性的DNA聚合酶；
(b)任选地，所述DNA聚合酶发挥作用所需的试剂和缓冲剂；
(c)任选地，DNA模板分子；
(d)第一正向引物(FP1)，其包含与所述DNA模板分子的第一区域互补的序列；
(e)第一探针(TP1)，其包含与所述DNA模板分子的第二区域互补或同源的序列；
(f)第一反向引物(RP1)，其包含与所述DNA模板分子的第三区域同源的序列；
(g)第二正向引物(FP2)，其包含与所述DNA模板分子的第四区域互补的序列，其中所述FP2在其3’端处或3’端附近包含与所述DNA模板分子不互补的一个或多个核苷酸；
(h)第二探针(TP2)，其包含与所述DNA模板分子的第五区域互补或同源的序列；和
(i)第二反向引物(RP2)，其包含与所述DNA模板分子的第六区域同源的序列；
其中所述第一区域、所述第二区域、所述第三区域、所述第四区域、所述第五区域和所述第六区域不重叠；
其中所述第一区域、所述第二区域、所述第三区域、所述第四区域、所述第五区域和所述第六区域各自包含12至50个核苷酸；
其中0至5000个核苷酸位于任意两个区域之间；
其中所述TP1包含荧光团(TP1荧光团)和荧光猝灭部分；
其中所述TP2包含荧光团(TP2荧光团)和荧光猝灭部分；并且
其中所述TP1荧光团和所述TP2荧光团在光谱上彼此不同。
35.一种混合物或试剂盒，其包含：
(a)任选地，具有5’至3’核酸外切酶活性的DNA聚合酶；
(b)任选地，所述DNA聚合酶发挥作用所需的试剂和缓冲剂；
(c)任选地，DNA模板分子；
(d)第一正向引物(FP1)，其包含与所述DNA模板分子的第三区域互补的序列；
(e)第一探针(TP1)，其包含与所述DNA模板分子的第二区域互补或同源的序列；
(f)第一反向引物(RP1)，其包含与所述DNA模板分子的第一区域同源的序列；
(g)第二正向引物(FP2)，其包含与所述DNA模板分子的第五区域互补的序列，其中所述FP2在其3’端处或3’端附近包含与所述DNA模板分子不互补的一个或多个核苷酸；和
(h)第二探针(TP2)，其包含与所述DNA模板分子的第四区域互补或同源的序列；
其中所述至少一个DNA模板分子按从5’至3’的顺序包含所述第一区域、所述第二区域、所述第三区域、所述第四区域和所述第五区域；
其中所述第一区域、所述第二区域、所述第三区域、所述第四区域和所述第五区域不重叠；
其中所述第一区域、所述第二区域、所述第三区域、所述第四区域和所述第五区域各自包含12至50个核苷酸；
其中所述第一区域的最5’端核苷酸与所述第五区域的最3’端核苷酸之间的距离在100至3000个核苷酸之间；
其中所述TP1包含荧光团(TP1荧光团)和荧光猝灭部分；
其中所述TP2包含荧光团(TP2荧光团)和荧光猝灭部分；并且
其中所述TP1荧光团和所述TP2荧光团在光谱上彼此不同。
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