JP2002502615A

JP2002502615A - 複数のアレル部位における増幅産物のゲノム型決定

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Authority: JP
Inventors: ケニスジェイリヴァク; フェデリコグッドサイド
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Current assignee: Applied Biosystems Inc
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Filing date: 1999-01-08
Publication date: 2002-01-29
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Also published as: US6154707A; US20040053302A1; EP1053348B1; US7132239B2; ATE469982T1; AU2314499A; US6884583B2; WO1999040226A2; US20020164630A1; CA2318880A1; JP4388694B2; US20120053069A1; US20080187913A1; EP1053348A2; WO1999040226A3; DE69942444D1; AU758463B2; CA2318880C

Abstract

(57)【要約】 5'ヌクレアーゼ増幅反応により少なくとも２つのアレル部位において標的配列のゲノム型を決定する方法が提供される。一つの実施態様では、本方法は少なくとも２つの異なるアレル部位を有する標的配列について、3'->5'ヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼおよび前記標的配列にハイブリダイズすることのできるプライマーを用いてアレルオリゴヌクレオチドプローブの２以上のセットの存在下で核酸増幅を行なうことであって、アレルオリゴヌクレオチドプローブの各セットは標的配列の異なるアレル部位を検出するためのものであり、アレルオリゴヌクレオチドプローブの各セットはこのプローブセットによって検出されるアレル部位における異なるアレル変異体に相補的である２以上のプローブを含み、このアレル部位はプライマーがハイブリダイズする標的配列の5'にあり、少なくとも、一つを除いて全てのアレルオリゴヌクレオチドプローブが他のプローブと異なる蛍光因子、および消光因子を有するものである、前記増幅を行なうこと；前記増幅の蛍光スペクトルを検出すること；前記蛍光スペクトルに対する各蛍光因子の寄与を計算すること；および、合成された蛍光スペクトルに対する各蛍光因子の蛍光寄与に基づいて、２以上の異なるアレル部位において異なるアレル変異体の存在又は不存在を決定すること、を含む。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の背景）本発明は一般に、増幅産物検出のためのアッセイ、より具体的には、２以上の
異なるアレル部位における増幅産物のゲノム型検出のためのアッセイに関する。

【０００２】（関連技術の記載）核酸配列解析は多数の研究、医学および工業分野で次第に重要になってきてい
る（例えば、Casky, Science 236: 1223-1228 (1987)；Landegrenら、Science,
242:229-237 (1988)；およびArnheimら、Ann. Rev. Biohem., 61:131-156 (1922
)）。いくつかの核酸増幅スキームの開発はこうした流れにおいて重要な役割を果たしている（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、Innisら編集、PCR Protoc
ols(Academic Press, New York, 1990；McPhersonら編集、PCR:A Practical App
roach(IRL Press, Oxford, 1991)；ライゲーション−ベースの増幅技術、Barany
, PCR Methods and Applications 1:5-16(1991)；その他)。

【０００３】特にPCRは、クローニング、遺伝子発現解析、DNAシーケンシング、遺伝子マッ
ピング、ドラッグデリバリーその他の応用において非常に重要な研究ツールとな
っている（例えば、Arnheimら（上述）；Gillilandら、Proc. Natl. Acad. Sci.
,87:2725-2729(1990)；Bevanら、PCR Methods and Applications, 1:222-228(19
92)；Greenら、PCR Methods and Applications, 1:77-90(1991)；Blackwellら、
Science, 250:1104-1110(1990)）。核酸増幅、特にPCRを行なうために非常に多種の装置が開発されてきた（例えば、Johnsonら、米国特許第5,038,852号（コンピュータ制御サーマルサイクラー
）；Writtwerら、Nucleic Acids Research, 17:4353-4357(1989)(キャピラリー管PCR)；Hallsby、米国特許第5,187,084号（空気ベース温度制御）；Garnerら、
Biotechniques, 14:112-115(1993)(864穴プレートの高スループットPCR)；Wildi
ngら、国際出願No. PCT/US93/04039(マイクロ機械化構造装置におけるPCR)；Sch
niperlskyら、欧州特許出願No.90301061.9（公開番号0381501 A2(ディスポーザブル、単一回使用PCR装置)；その他）。PCR装置開発に必須である重要な設計目標には、微妙な温度制御、マルチサンプルサーマルサイクラーにおけるサンプル
間の変動の最小化、PCR前、または後の処理の自動化、高速サイクリング、サンプル体積の最少化、増幅産物のリアルタイム測定、クロスコンタミネーションあ
るいはサンプルの持ち込み(carryover)の最少化、その他が含まれる。

【０００４】特に、閉鎖反応チャンバー中でPCRを行ない、リアルタイムでPCRをモニターす
ることのできる装置の設計が強く望まれている。閉鎖反応チャンバーはクロスコ
ンタミネーションを防止するために望まれている（例えば、Higuchiら、Biotech
nology, 10:413-417 (1992)および11:1026-1030(1993)；および、Hollandら、PN
AS (USA), 88:7276-7280 (1991)）。明らかに、そのような設計目標の実現は、高頻度の偽陽性や偽陰性はPCRベースの手法の価値を著しく現ずるであろう診断用サンプルの解析において特に望まれるであろう。 PCRのリアルタイムモニターによって、複数標的増幅における出発標的DNA濃度
のより正確な定量を可能とする。なぜならば、PCR中の相対濃度の履歴を考慮することにより、近似した濃度の相対値が分離され得るからである。リアルタイム
モニターはまたPCRの効率の評価を可能とする。この効率はサンプル中のPCR阻害
物の有無を示し得る。

【０００５】 Hollanら、および他の者たちはPCR中の増幅産物の測定のために蛍光ベースのア
プローチを提案した（Hollandら、PNAS(USA),88:7276-7280 (1991)）。そのよう
なアプローチは存在している二本鎖DNAの量を示すために（エチジウムブロミドのような）インターカレート色素を使用するか（Higuchiら、Biotechnology 10:
413-417(1992)、Higuchiら、Biotechnology 11:1026-1030(1993)、米国特許第5,
210,015号）、または、ポリメラーゼの5'ヌクレアーゼ活性により増幅中に切断されて蛍光産物を遊離し、その蛍光因子の濃度が存在する二本鎖DNAの量の関数となるオリゴヌクレオチドを使用する。後者は一般に5'ヌクレアーゼアッセイと
言われる。5'ヌクレアーゼアッセイの一例はTaqman^TM LS-50 PCR検出システム(P
erkin-Elmer)で使用されているアッセイである。

【０００６】一般に、5'ヌクレアーゼアッセイは少なくとも１つの蛍光因子および少なくと
も１つの消光因子でラベルされたオリゴヌクレオチドプローブを使用する。プロ
ーブの切断前は、この少なくとも１つの蛍光因子は検出可能な蛍光を発するより
も寧ろ消光因子を励起する。オリゴヌクレオチドプローブはPCRあるいは類似の増幅反応における増幅のため標的オリゴヌクレオチド配列にハイブリダイズする
。標的配列の増幅を触媒するために使用するポリメラーゼの5'−＞3'ヌクレアー
ゼ活性がこのプローブの切断に働き、それによって、少なくとも１つの蛍光因子
が１以上の消光因子と空間的に分離され、それによって、蛍光因子からのシグナ
ルが消光されなくなる。オリゴヌクレオチドプローブが消化されることによる蛍
光因子からの蛍光の変化および／または消光因子からの蛍光の変化は標的オリゴ
ヌクレオチド配列の増幅を示すために使用される。

【０００７】 5'ヌクレアーゼアッセイにおいて、複数の異なる標的を含むサンプルを、各標
的についてスペクトル的に分離可能な異なる種を用いて解析することがしばしば
望まれる。このような、単一サンプルにおける複数標的の同時検出は各標的につ
いての逐次的解析に対して多くの利点を有する。なぜならば、サンプルは一度解
析され、サンプル処理にはより少ない工程しか必要とせず、唯一度の測定が必要
とされるだけだからである。その結果、より高い処理量およびより改善された簡
便さが達成される。加えて、単一サンプル中の複数標的の検出により、内部較正
が容易となる。同時多種スペクトル検出を用いた方法の一例は、４種のスペクト
ル的に分離可能な蛍光色素を同時に検出するマルチカラーDNAシーケンシングである。

【０００８】 5'ヌクレアーゼアッセイの１つの可能な応用は多型性スクリーニングの分野に
ある。既知のヌクレオチドの相違検出のための現在の診断技術には以下が含まれ
る：アレル-特異的オリゴヌクレオチド(ASO)とのハイブリダイゼーション（Ikut
aら、Nucleic Acids Research 15:797-811 (1987)；Nickersonら、PNAS(USA) 87
;8923-8927(1990)；Saikiら、PNAS(USA) 86:6230-6234(1989)；Verlaan-de Vrie
sら、Gene 50:313-320(1980)；Wallaceら、Nucleic Acids Research 9:879-894(
1981)；Zhang、Nulecid Acids Research 19:3929-3933 (1991)）；アレル-特異的PCR（Gibbsら、Nucleic Acids Research 17:2437-2448(1989)；Newtonら、Nuc
leic Acids Research 17:2503-2516 (1989)）；固相ミニシーケンシング（Syvan
enら、American Journal of Human Genetics 1993;52:49-59(1993)）；オリゴヌ
クレオチドライゲーションアッセイ(OLA)（Grossmanら、Nucleic Acids Researc
h 22:4527-4534(1994)；Landegreら、Science 241:1077-1080(1988)）；アレル-
特異的リガーセ連鎖反応(LCR)(Abravayaら、Nulceic Acis Research 1995；23：
675-682；Baranyら、PNAS(USA) 88；189-193(1991)；Wuら、Genomics 4:560-569
(1989))。ゲノムDNAはこれらの方法で特異的DNA断片の増幅および、それに続いて、どのアレルが存在しているかを決定する検出解析によって解析される。

【０００９】 Leeら、はヒトの嚢胞性繊維症遺伝子の単一アレル部位における種々のアレルを区別するために、Taqポリメラーゼと組み合わせたPCRを使用することを報告し
た（Leeら、Nucl. Acids Res. 21:3761-3766 (1993）)。Livakら、はヒトインシ
ュリン遺伝子の-23 A/Tジアレル多型性を区別することを報告した。この報告では各アレル部位は別々の増幅反応で解析された（Livakら、Nature Genetics, 9:
341-342 (1995)）。Leeら、もLivalらも、どのようにして２以上のアレル部位に
けるアレル変異を単一増幅反応において区別するかを開示していない。現在、ア
レル変異のような実質的に相同な配列の複数のセットを単一増幅反応において区
別する方法及び装置に対する需要がある。本明細書に記載された発明はそのよう
な方法および装置を提供するものである。

【００１０】（発明の概要）本発明は、２以上の実質的に相同な配列の第１のセットのどのメンバーがDNA サンプル中に存在するかを同定し、かつ、２以上の実質的に相同な配列の第２の
別のセットのどのメンバーが前記DNAサンプル中に存在するかを同定する方法に関する。本方法によれば、サンプル中に存在する第１および第２のセットのメン
バーは単一の反応で同定される。一つの実施態様では、本方法は、実質的に相同な配列の第1のセット、および、実質的に相同な配列の第２の別のセットを含むDNAサンプルに対して、5'->3'ヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼおよび前記DNAサンプルにハイブリダイズすることのできる１以上のプライマーを用いて、オリゴヌクレオチドプローブの２以上のセットの存在下で
核酸増幅を行ない、実質的に相同な配列のセットの増幅を行なう工程であって、実質的に相同な配列の各セットが、少なくとも１つの塩基位置で互いに異
る２以上のメンバーを含み、前記オリゴヌクレオチドプローブの各セットが、実質的に相同な配列のセ
ットの１つに属するメンバーを検出するためのものであり、前記オリゴヌクレオチドプローブの各セットが、実質的に相同な配列のセ
ットの異なるメンバーに相補的である２以上のプローブを含み、前記メンバーが
前記プライマーのハイブリダイズするDNAサンプルの配列に対して5'であり、少なくとも、１つを除いて全てのオリゴヌクレオチドプローブは他のプロ
ーブと異なる蛍光因子、および前記蛍光因子の蛍光を消光するために前記プロー
ブ上に設けられた消光因子を含むものである、前記工程；標的配列にハイブリダイズするこれらのアレルオリゴヌクレオチドプローブを
ポリメラーゼのヌクレアーゼ活性によって増幅中に消化する工程；前記増幅の蛍光スペクトルを検出する工程；前記蛍光スペクトルに対する前記各蛍光因子の蛍光の寄与を計算する工程；前記蛍光スペクトルに対する前記各蛍光因子の寄与を基に、実質的に相同な配
列の異なるメンバーが存在することまたは存在しないことを決定する工程、を含む。本発明はまた２以上の異なるアレル部位における種々のアレル変異の存在また
は不存在を5'ヌクレアーゼ反応によって検出する方法に関する。一つの実施態様
においては、本方法は、少なくとも２つの異なるアレル部位を有するDNAのサンプルについて、5'->3' ヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼ、および前記DNAサンプルにハイブリダイズし得る少なくとも１つのプライマーを用いて核酸増幅を行い、前記少な
くとも２つの異なるアレル部位をアレルオリゴヌクレオチドプローブの２以上の
セットの存在下で増幅する工程であって、前記アレルオリゴヌクレオチドプローブの各セットは、異なるアレル部位
を検出するためのものであり、前記アレルオリゴヌクレオチドプローブの各セットは、そのプローブセッ
トによって検出されるアレル部位において異なるアレル変異体に相補的である２
以上のプローブを含み、前記アレル部位は前記プライマーがハイブリダイズする
サンプルDNAの配列に対して5'にあり、少なくとも、１つを除いて全てのアレルオリゴヌクレオチドプローブは他
のプローブと異なる蛍光因子および、前記蛍光因子の蛍光を消光するために前記
プローブ上に置かれた消光因子を含むものである、前記工程；前記DNAサンプルにハイブリダイズしているこれらのオリゴヌクレオチドプローブを、ポリメラーゼのヌクレアーゼ活性によって増幅中に消化する工程；前記増幅の蛍光スペクトルを検出する工程；前記蛍光スペクトルに対する前記各蛍光因子の蛍光寄与を計算する工程；前記蛍光スペクトルに対する前記各蛍光因子の蛍光寄与に基づいて、２以上の
異なるアレル部位において異なるアレル変異の存在または不存在を決定する工程
、を含む。また、5'ヌクレアーゼ増幅反応によって少なくとも２つのアレル部位において
DNAサンプルのゲノム型決定するための方法も提供される。一つの実施態様においては、本方法は、少なくとも２つの異なるアレル部位を有するサンプルDNAについて、5'->3'ヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼ、および前記サンプルDNAにハイブリダイズすることのできる少なくとも１つのプライマーを用いて核酸増幅を行い、
アレルオリゴヌクレオチドプローブの２以上の異なるセットの存在下で前記少な
くとも２つの異なるアレル部位を増幅する工程であって、前記アレルオリゴヌクレオチドプローブの各セットは異なるアレル部位を
検出するためのものであり、前記アレルオリゴヌクレオチドプローブの各セットはそのプローブセット
によって検出されるアレル部位において異なるアレル変異体に相補的である２以
上のプローブを含み、前記アレル部位は前記プライマーがハイブリダイズするサ
ンプルDNAの配列に対して5'にあり、かつ、少なくとも、１つを除いて全てのアレルオリゴヌクレオチドプローブが他
のプローブと異なる蛍光因子、および、前記蛍光因子の蛍光を消光するためにプ
ローブ上に置かれた消光因子を含むものである前記工程；標的配列にハイブリダイズするこれらのアレルオリゴヌクレオチドプローブを
ポリメラーゼのヌクレアーゼ活性によって増幅中に消化する工程；前記増幅の蛍光スペクトルを検出する工程；前記蛍光スペクトルに対する前記各蛍光因子の蛍光寄与を計算する工程；およ
び、前記蛍光スペクトルに対する異なる蛍光因子の蛍光寄与に基づいて、少なくと
も２つの異なるアレル部位においてDNAサンプルのゲノム型を決定する工程、を含む。

【００１１】本発明はまた、少なくとも２つのアレル部位でDNAのサンプルのゲノム型を決定するために使用される蛍光スペクトルに関する。このスペクトルは上記方法の
一つを行うことによって導かれる。本発明はまた、少なくとも２つのアレル部位においてDNAのサンプルのゲノム型を決定するための蛍光シグネチャーに関する。このシグネチャーには、上記方
法の一つを行うことによって導かれる蛍光スペクトルに対する少なくとも３種の
蛍光因子の蛍光シグナル寄与が含まれる。本発明はまた、一連のコントロール、すなわち、少なくとも２つのアレル部位
において既知のアレル変異を有する配列に関する蛍光シグネチャーのライブラリ
ーに関する。蛍光シグネチャーのライブラリーは、ゲノム型を決定しようとして
いるDNAサンプル中にどのアレル変異が存在しているかを決定するために使用することができる。本発明はまた、DNAサンプルの蛍光シグネチャーを決定する方法に関する。一つの実施態様によれば、核酸増幅から得られる蛍光スペクトルに対する少なくと
も３種の蛍光因子の蛍光寄与が計算され、内部標準に対して正規化され、正規化
された蛍光寄与は少なくとも２つの異なるアレル部位についてのDNAサンプルに対する蛍光シグネチャーに対応する。

【００１２】本発明はまた、DNAサンプルの蛍光シグネチャーを既知のゲノム型を有するコントロール配列と比較することによるDNAサンプルのゲノム型決定の方法に関する。本発明はまた、少なくとも２つのアレル部位においてDNAサンプルのゲノム型を5'ヌクレアーゼアッセイによって決定する処理装置および関連装置に関する。
ひとつの実施態様においては、この処理装置は、少なくとも２つのアレル部位に
対するアレルプローブの存在下で、5'ヌクレアーゼアッセイを行ったコントロー
ルサンプルおよび少なくとも一つの未知のサンプルの蛍光スペクトルおよび前記
5'ヌクレアーゼアッセイに用いた少なくとも３種の蛍光因子の蛍光スペクトルを
とり、それらのスペクトルを利用して前記少なくとも３種の蛍光因子の未知およ
びコントロール蛍光スペクトルに対する正規化蛍光寄与を計算するためのロジッ
ク；および、２以上の異なるアレル部位において少なくとも１つの未知のサンプ
ルのゲノム型を、前記少なくとも３種の蛍光物質の、未知サンプルのスペクトル
に対する前記正規化蛍光寄与と、コントロールサンプルのスペクトルに対する前
記正規化蛍光寄与との比較に基づいて決定するためのロジックを備えている。

【００１３】本発明は、また、実質的に相同な配列の少なくとも２つの異なるセットのどの
メンバーがDNAサンプル中に存在しているかを決定するためのキットに関する。一つの実施態様によれば、このキットはオリゴヌクレオチドプローブの２以上の
セットを含み、前記オリゴヌクレオチドプローブの各セットは実質的に相同な配列の異なるセ
ットを検出するためのものであり、前記オリゴヌクレオチドプローブの各セットは前記実質的に相同な配列のセッ
トの異なるメンバーに相補的である２以上のプローブを含み、および、少なくとも、１つを除いて全てのアレルオリゴヌクレオチドプローブは他のプ
ローブと異なる蛍光因子、および、その蛍光因子の蛍光を消光するために前記プ
ローブ上におかれた消光因子を含む。

【００１４】本発明はまた、少なくとも２つのアレル部位においてDNAサンプルのゲノム型決定のためのキットに関する。一つの実施態様では、本キットはアレルオリゴヌ
クレオチドプローブの２以上のセットを含み、前記アレルオリゴヌクレオチドプローブの各セットは異なるアレル部位を検出
するためのものであり、前記アレルオリゴヌクレオチドプローブの各セットは、そのプローブセットに
よって検出されるアレル部位における異なるアレル変異体に相補的である２以上
のプローブを含み、および、少なくとも、１つを除いて全てのアレルオリゴヌクレオチドプローブは他のプ
ローブと異なる蛍光因子、その蛍光因子の蛍光を消光するために前記プローブ上
におかれた消光因子を含む。

【００１５】場合によりアレルプローブは標的配列上で約50〜150塩基、より好ましくは100
塩基未満離れているアレル部位に相補的である。アレルプローブは場合により少
なくとも約20％かつ約80％未満の％GCを有している。全てのアレルプローブは場
合により、隣接するグアニンを４未満しか有しない。一つの実施態様ではどのア
レルプローブも5'末端にグアニンを含まない。上記のキット態様の一つのバリエーションにおいて、プローブは増幅反応に使
用されるアニーリング温度よりも約３〜５℃高い融解温度（Ｔ_m）を有している。他のバリエーションでは、プローブは約65〜70℃、より好ましくは約65〜67℃
の融解温度を有している。上記のキット態様の一つバリエーションにおいて、キットは１以上の増幅プラ
イマーも含む。一つのバリエーションにおいては、プローブ融解温度（Ｔ_m）はプライマーのＴ_mよりも約５〜10℃、好ましくは約７℃高い。別のバリエーションにおいては、プライマーは約55〜65℃、好ましくは約58〜63℃、より好ましく
は58〜60℃の融解温度（Ｔ_m）を有している。好ましくはプライマーの3'末端の５つのヌクレオチドのうちグアニンまたはシトシンは２個以下である。

【００１６】（定義）本明細書において、用語「オリゴヌクレオチド」は天然または改変モノマーま
たは連鎖の直線状オリゴマーを含み、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオ
チドその他を含み、ワトソン-クリック型の塩基対その他のような通常のモノマー−モノマー相互作用によって他のオリゴヌクレオチド配列に特異的に結合し得
るものをいう。通常、モノマーはホスホジエステル結合またはそのアナログで結
合し、数モノマー単位、例えば３〜４個から数十のモノマー単位の大きさにわた
るオリゴヌクレオチドを形成している。“ATGCCTG”のようにオリゴヌクレオチドが文字列で表されるときは、ヌクレオチドは左から右へ5'->3'の順序であると
解され、特に記載しない限り、"A"はデオキシアデノシンを意味し、"C"はデオキ
シシトシン、"G"はデオキシグアノシンを、"T"はチミジンを意味すると解される
。ホスホジエステル結合のアナログには、ホスホロチオエート、ホスホロジチオ
エート、ホスホラニリデート、ホスホルアミデートその他が含まれる。

【００１７】「標的オリゴヌクレオチド配列」とは、ゲノム型を決定するために本発明によ
って増幅する配列を言う。標的オリゴヌクレオチド配列はまた5'ヌクレアーゼア
ッセイのアンプリコンとも呼ばれる。「オリゴヌクレオチドプローブ」とは、増幅された一切の標的オリゴヌクレオ
チド配列を検出するために、ポリメラーゼの5'エンドヌクレアーゼ活性によって
消化される、少なくとも１つの蛍光因子および少なくとも１つの消光剤を有する
オリゴヌクレオチド配列を言う。一般には、本発明に用いられるオリゴヌクレオ
チドプローブは、利用する5'->3'ヌクレオチド活性が結合したプローブを分解し
て蛍光因子と消光因子を分離するために、その5'末端に隣接した充分な数のホス
ホジエステル結合を有しているであろう。

【００１８】二重鎖について「完全にマッチした」とは、二重鎖を形成するオリゴヌクレオ
チドが、それぞれの鎖の各ヌクレオチドが他の鎖のヌクレオチドとワトソン−ク
リック塩基対形成を行うように、互いに二本鎖を形成することをいう。この語は
また、デオキシイノシンのようなヌクレオシドアナログ、２-アミノプリン塩基を有するヌクレオシド、その他のような使用されることのあるヌクレオシドアナ
ログの対を含む。反対に、標的オリゴヌクレオチド配列とオリゴヌクレオチドプ
ローブまたはプライマーとの間の二重鎖における「ミスマッチ」とは、二重鎖の
ヌクレオチド対がワトソン−クリック結合を形成できないことを意味する。「実質的に相同な配列」とは１以上の塩基位置を除いて相同な２以上の配列（
または配列の部分領域）をいう。唯一つのヌクレオチドが異なっている２つのア
レル変異体は実質的に相同な配列のセットの例である。実質的に相同な配列は好
ましくは少なくとも90％相同である。

【００１９】本発明書において用いる「ヌクレオシド」とは、例えば、KornbergとBaker, D
NA replication第２版、(Freeman, San Francisco, 1992)に記載されているよう
な、2'-デオキシおよび2'-ヒドロキシル型を含めた天然のヌクレオシドを含む。
ヌクレオシドについて「アナログ」とは、修飾塩基部分および／または修飾糖部
分を有する合成ヌクレオシドを含むが、但し、特異的ハイブリダイゼーションが
可能なものである。これらは、例えばScheit, Nucleotide Analogs (John Wiley
, New York, 1980)、UhlmanとPeyman, Chemical Reviews 90:543-584 (1990)その他、に記載されている。このようなアナログには、結合特性を増加させる、分
解を低減させる、特異性を増大させる等のために設計された合成ヌクレオシドが
含まれる。

【００２０】（発明の説明）本発明は5'ヌクレアーゼアッセイに関し、その5'ヌクレアーゼアッセイにおい
ては、DNAサンプル中に第１の２以上の実質的に相同な配列セットのどのメンバーが存在が存在するかを同定するために蛍光因子−消光因子プローブの第１のセ
ットが使用され、さらにそのDNAサンプル中に第２の２以上の実質的に相同な配列セットのどのメンバーが存在するかを決定するために前記と同一の反応におい
て蛍光因子−消光因子プローブの第２のセットが使用される。この5'ヌクレアー
ゼアッセイは第１および第２のプローブセットの両方を含む単一の反応において
行なわれる。このアッセイにより、実質的に相同な配列の第1のセットのどのメンバーがサンプル中に存在し、一方、同時に実質的に相同な配列の第２のセット
のどのメンバーがそのサンプル中に存在しているかを決定することができる。 5'ヌクレアーゼアッセイの応用の一例は、ゲノムDNAサンプルの２以上のアレル部位におけるゲノム型決定である。２以上の異なるアレル部位はDNAの単一鎖上にあってもDNAの異なる鎖上にあってもよい。２以上のアレル部位は、例えば、アレル部位がDNA上の同じ鎖にあって互いに近接している場合には、単一の増幅プライマーによって増幅されてもよく、または、複数の異なる増幅プライマー
によって増幅されてもよい。

【００２１】本発明は、DNAサンプルのアレルゲノム型を複数のアレル部位において決定するために適合された5'ヌクレアーゼアッセイ、前記アッセイを実施するための装
置およびキット、および、前記アッセイによって生成された蛍光スペクトルおよ
び蛍光シグネチャーに関する。本発明はまた、前記アッセイによって生成される
蛍光スペクトルおよび蛍光シグネチャーの解析に使用される装置、ロジック、お
よびソフトウエアに関する。本明細書で詳細に説明するように、本発明のアッセイの実行により、DNAサンプル中の２以上の実質的に相同な配列の複数のセットのメンバーの特定の組み合
わせを有するDNAサンプルに特徴的な蛍光スペクトルが生成される。例えば、DNA
サンプルのゲノム型を２以上のアレル部位において決定するために使用される場
合は、本アッセイの実行、即ち、特定の温度、プライマーおよびプローブを用い
たアッセイの実行は、アッセイにかけられたそのゲノム型を有するDNAサンプルに特徴的な蛍光スペクトルを生成する。アッセイに使用する種々の蛍光団（蛍光
因子および消光因子）の蛍光スペクトルに対する寄与の計算により、DNAサンプルに特徴的な蛍光シグネチャーが作り出され得る。次に、与えられた未知のサン
プルの蛍光シグネチャーは、そのサンプル中に２以上のセットのどのメンバーが
存在しているかを決定するために、既知の異なる種々のメンバーの組み合わせを
有するサンプルの蛍光シグネチャーと比較することができる。例えば、未知のサ
ンプルのゲノム型決定の場合、アッセイを行なった結果として生成された蛍光シ
グネチャーは、未知のサンプルのゲノム型を決定するために種々の既知のゲノム
型の蛍光シグネチャーと比較することができる。

【００２２】１．増幅産物を測定するための5'ヌクレアーゼアッセイ本発明は、DNAサンプル中の実質的に相同な配列の２つの異なるセットのメンバーの存在を測定するために、5'ヌクレアーゼアッセイの変法を使用する。一般
に、5'ヌクレアーゼアッセイは、特定のメンバーの増幅を明らかにするために、
蛍光因子および消光因子を有するオリゴヌクレオチドプローブの核酸増幅反応中
の消化を含む。図1(A)-1(D)は5'ヌクレアーゼアッセイの工程を示したものである。このアッセイにおいて、核酸増幅反応は、標的配列（二本鎖配列10）に対して5'->3'ヌク
レアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼ（示していない）および、標的配列10に
ハイブリダイズすることのできるプライマー（フォワードおよびリバースプライ
マー12、14）を用いて、プライマーの一つに対して下流において標的配列にハイ
ブリダイズすることのできるオリゴヌクレオチドプローブ16の存在下で行われる
。図1(A)に示したように、オリゴヌクレオチドプローブ16は蛍光因子(F)および消光因子(Q)を有している。オリゴヌクレオチドプローブ16の結合部位は標的配列10を増幅するために使用されるフォワードプライマー14の結合部位に対して下
流（3'）に位置している。オリゴヌクレオチドプローブ16は好ましくはポリメラ
ーゼがプローブの3'端を伸長できないように構築される。このことは、リンキン
グ部分によってオリゴヌクレオチドプローブの3'末端炭素に蛍光因子または消光
因子を結合させることによって達成してもよい。

【００２３】図1(B)に示したように、核酸ポリメラーゼ（示していない）はフォワードおよ
びリバースプライマー12、14を伸長する。好ましくは、PCRはTaq DNAポリメラー
ゼ、例えば、AMPLITAQ^TMまたはAMPLITAQ^TM Gold（Perkin-Elmer、Norwalk、CN）
または、等価な熱安定性DNAポリメラーゼを用いて行なわれる。プライマーの伸長中に、ポリメラーゼは標的配列にハイブリダイズしたプロー
ブに出会い、プローブを消化することにより鎖置換を行なう。図1(C)に示したよ
うに、プローブの消化はプローブからの蛍光因子（または消光因子）の遊離を生
じさせる。このことにより、プローブ上の蛍光因子および消光因子が互いに空間
的に分離することになり、それにより、サンプル中の蛍光の変化を生じさせ、プ
ライマー12の伸長、従って標的配列10の増幅が示される。図1(D)に示したように
、蛍光因子および消光因子はいずれも標的配列から最終的に外される。

【００２４】蛍光因子−消光因子プローブを使用する核酸増幅反応の詳細な説明には、例え
ば以下のものが挙げられる：Hollandら、PNAS(USA) 88:7276-7280 (1992)；Holl
andら、Clinical Chemistry, 38:462-463 (1992)；Leeら、Nucleic Acid Resear
ch, 21：3761-3766 (1993)、Livakら、PCR Methods and Applications, 4:357-3
62 (1995)および米国出願No.08/559,405。これらの文献は本明細書に含まれるも
のとする。ここで使用する蛍光因子は蛍光シグナルを生成するどのような分子であっても
よい。消光分子は励起された蛍光因子の蛍光エネルギーを吸収することができ、
それによりそうでない場合に励起された蛍光因子から放出されるであろう蛍光シ
グナルを消光できるどのような分子であってもよい。蛍光分子が励起蛍光因子を
消光できるためには、この蛍光因子は一般には、蛍光因子が蓄積された蛍光エネ
ルギーを放出する前のある時間において、励起蛍光因子の最小蛍光距離内になけ
ればならない。

【００２５】この方法に使用するために種々の蛍光因子−消光因子プローブが開発されてい
る。最初、消光因子が蛍光因子を効果的に消光するように、蛍光因子と消光因子
がプローブ上で互いに常に近接しているプローブが開発された。蛍光生成プロー
ブの設計は、5'末端にレポーター色素を有し、3'末端に消光色素を有するプロー
ブが5'ヌクレアーゼアッセイの実行において充分な消光を示すことが発見された
ことによって、それ以来単純化されている（Livakら、PCR Methods and Applica
tions 4: 357-362 (1995)）。例えば、ハイブリダイズしていない場合には消光分子が蛍光物質の蛍光を消光するような一本鎖コンフォメーションの少なくとも
１つとして存在し、標的オリゴヌクレオチドとハイブリダイズした場合には、蛍
光因子の蛍光が消光されないようなコンフォメーションの少なくとも一つとして
存在するような位置に、蛍光因子と消光因子が置かれているプローブが開発され
ている。例えば、出願番号08/559,405を参照せよ（本明細書に含まれるものとす
る）。その結果、蛍光因子および消光因子は検出される効果的な消光を達成する
ためにプローブ内の特異的な距離に置かれる必要がない。このことにより、これ
らのプローブの設計および合成が容易となる。

【００２６】ヘアピン構造の形成を阻害する相補的核酸配列が存在しない場合には自分自身
とハイブリダイズし、消光分子が蛍光因子の近くにくるようにループを形成する
プローブも開発されている（WO 90/03449；欧州特許出願No.0 601 889 A2）。上述の蛍光因子−消光因子プローブのいずれも本発明と組み合わせて使用する
ことができる。 Livakら、WO 90/03446あるいは欧州特許出願No.0 601 889 A2に記載された、蛍光因子と消光因子の距離が増大しているプローブは、ミスマッチとプローブの
識別能力とを折り合わせと期待されるかもしれない。しかしながら、5'末端にレ
ポーターおよび3'末端に消光因子を有するプローブであってもアレルを識別する
ために使用できることが示されている（Livakら、Nature Genetics, 9:341-342
(1995）)。

【００２７】図２は標的配列のゲノム型を単一のアレル部位において同定するためにどのよ
うに5'ヌクレアーゼアッセイが使用できるかを示したものである。図に示したよ
うに、アレルAおよびアレルBに特異的なプローブがPCRアッセイに含まれる。プローブは各々を異なる蛍光レポーター色素、図でFAM（6-カルボキシ-フルオレセ
イン）およびTET（6-カルボキシ-4,7,2',7'-テトラクロロ-フルオレセイン）として示した色素で標識することによって区別できる。プローブと標的配列のミス
マッチはプローブハイブリダイゼーションおよび切断の効率を著しく低下させる
。図３は図２に示したようなアレル識別実験において観察される蛍光スペクトル
を示す。この図では、可能な３種のゲノム型（アレルAについてホモ接合；アレルBについてホモ接合；アレルAおよびBについてヘテロ接合）は互いに区別でき、かつ未反応プローブ（DNAなし）から区別できるスペクトルを有している。これらのスペクトルを未知のサンプルのスペクトルと比較することにより、未知の
サンプルのゲノム型が決定できる。例えば、FAMまたはTET蛍光シグナルのかなり
の増加は、シグナルの増大した蛍光因子を含むプローブに相補的なアレルについ
てホモ接合であることを示す。FAMおよびTETシグナルの両方の増加はヘテロ接合
性を示すものである。

【００２８】 FAMおよびTETの蛍光スペクトルは有意な重なりを有している。図３から分かる
ように、強いFAMシグナル（1/1ホモ接合）をもつスペクトル、強いTETシグナル（2/2ホモ接合）をもつスペクトル、および中程度のFAMおよびTETシグナル（ヘテロ接合）をもつスペクトル間を区別するのは困難である。同一のアッセイにお
いて、追加の蛍光因子を有する追加のアレルプローブを使用することは異なるゲ
ノム型のサンプルから生ずる蛍光スペクトルの弁別を更に複雑化させるであろう
。本明細書で説明するように、出願人は、少なくとも合計３種の異なる蛍光因子
を有する少なくとも４種のアレルプローブを用いて、5'ヌクレアーゼアッセイに
よって生成される蛍光スペクトルに基づいて各サンプルの蛍光シグネチャーを決
定することにより、標的配列のゲノム型を複数のアレル部位において決定するた
めのアッセイを提供する。

【００２９】２．ゲノム型決定増幅のための5'ヌクレアーゼアッセイ複数アレル部位における産物本発明は図1(A)―1(D)に示したアッセイのような5'ヌクレアーゼアッセイの、
DNAサンプル中の実質的に相同な配列の異なる２つのセットのメンバーの存在を単一のアッセイで決定するための適合化に関する。本発明は、ゲノムDNAサンプルの複数アレル部位の検出という観点で記載されるが、本発明はこの特定の応用
に限定することを意図したものではなく、一般にDNAサンプル中の２以上の実質的に相同な配列のセットのメンバーの同定に応用し得ることを意図している。図4A-4Dおよび図5A-5Dは、２以上の異なるアレル部位に対する蛍光因子-消光因子プローブおよび5'ヌクレアーゼアッセイが、２以上のアレル部位においてDN
Aサンプルのゲノム型決定のためにどのように使用できるかを示したものである。唯一つのゲノム型に関するDNAが図4A-4Dおよび5A-5Dに図示されていることに注意が必要である。DNAサンプルが１以上のゲノム型を有するDNAを含む場合、す
なわちヘテロ接合である場合、プローブの異なるグループが各ゲノム型のDNAに対してハイブリダイズするであろう。

【００３０】図4A-4Dは5'ヌクレアーゼアッセイの実施を示したものであり、そこでは、２以上の異なるアレル部位が同じDNA鎖上で充分に互いに接近しており、単一のプライマーで両方のアレル部位を増幅することが可能である。図5A-5Dは5'ヌクレアーゼアッセイの実施を示したものであり、ここでは、２以上の異なるアレル部
位が異なるプライマーを用いて増幅されている。図4Aに示したように、核酸増幅反応は標的配列（二本鎖配列40）に対して5'->
3'ヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼ（示していない）および、標的配
列40にハイブリダイズし得るプライマー（フォワードおよびリバースプライマー
42、44）を用いて行なわれる。増幅反応は、第１のアレル部位47に対する第１の
アレルプローブセット46A、46B、および第２のアレル部位49に対する第２のアレ
ルプローブセット48A、48Bの存在下で行なわれる。アレルプローブの各セットは
、少なくとも１つのヌクレオチドが互いに異なる少なくとも２種のプローブを含
む。

【００３１】全てのアレルプローブは、プライマーの一つが相補的である配列に対して下流
（3'）にある標的配列上のアレル部位に相補的である。図4Aに示したように、１
つを除く全てのアレルプローブは異なる蛍光因子（F₁、F₂、F₃）および消光因子
(Q)を有している。蛍光因子を有していないアレルプローブ48Bは場合により蛍光
因子を有していてもよい。アレルプローブ48B上の蛍光因子は他の蛍光因子と異なっていなければならない（F₄）。図4Aに示したように、第１のセットのプローブの一つ（46A）は第１のアレル部位47にハイブリダイズし、第２のセットのプローブの一つ（48A）は第２のアレル部位49にハイブリダイズする。各セットから唯一つのプローブが特定のアレ
ル部位にハイブリダイズするように示されているが、このセット中の他のプロー
ブもこの部位にハイブリダイズし得ることを述べておかなければならない。これ
については、各セットの異なるアレルプローブはアレル部位へ競合してハイブリ
ダイズする。アレル部位に完全にマッチするアレルプローブは、セット中のミス
マッチを含むプローブよりも、そのアレル部位へのハイブリダイゼーションに関
して熱力学的に好まれるであろう。加えて、ポリメラーゼによるアレルプローブ
の切断はミスマッチを有するアレルプローブよりも完全にマッチしたアレルプロ
ーブに対する方がより効果的であることが分かっている。

【００３２】図4Bに示したように、核酸ポリメラーゼ（示していない）はフォワードおよび
リバースプライマー42、44を伸長する。好ましくは、PCRはTaq DNAポリメラーゼ
、例えば、AMPLITAQ^TMまたはAMPLITAQ^TM Gold(Perkin-Elmer, Norwalk, CN)、あるいは等価な熱安定DNAポリメラーゼを用いて行なわれる。プライマー42、44の伸長中、ポリメラーゼは第1のアレル部位にハイブリダイズしているどれかのアレルプローブに出会い（プローブ46Aとして表示した）、このプローブを消化し始めることにより鎖置換を行なう。図4Bに示したように、
このプローブの消化は、消化されるアレルプローブに結合した蛍光因子（F₁と示
した）放出をもたらす。図4Cに示したように、プライマーの伸長は続き、ポリメラーゼは第２のアレル
部位にハイブリダイズしているどれかのアレルプローブ（プローブ48Aとして示した）に出会い、このプローブを消化することによって鎖置換を行なう。図4Cに
示したように、このプローブの消化は、消化されるアレルプローブに結合した蛍
光因子（F₃と示した）の放出をもたらす。

【００３３】図4Dに示したように、消化されるアレルプローブに結合した蛍光因子および消
光因子はいずれも最終的には標的配列から外される。サンプルの蛍光スペクトルは少なくとも１回の増幅サイクル後にとり、これが
放出された異なる蛍光因子および消光因子の相対数を反映する。図5A-5Cは5'ヌクレアーゼアッセイの実施を示したものであり、ここでは２以上の異なるアレル部位が異なるプライマーを用いて増幅される。図5Aに示したよ
うに、核酸増幅反応は２つの別個の配列（２本鎖配列50、51）上で、5'->3'ヌク
レアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼ（示していない）および、各標的配列50
、51にハイブリダイズすることのできるプライマー（フォワード52、53およびリ
バースプライマー54、55）を用いて行なわれる。２以上のアレル部位が同じ鎖上
にあるのであれば、図４A-4Dに例示したように増幅は単一のプライマー対を用い
て行なうこともできるし、複数プライマーを用いて行なうこともできる。増幅反応は、第1のアレル部位57に対する第１のアレルプローブセット56A、56
Bおよび第２のアレル部位59に対する第２のアレルプローブセット58A、58Bの存在下で行なわれる。アレルプローブの各セットは少なくとも１つのヌクレオチド
において互いに異なっている少なくとも２つのプローブを含んでいる。

【００３４】全てのアレルプローブは、プライマーの一つが相補的である配列に対して下流
（3'）にある標的配列上のアレル部位に相補的である。図5Aに示されたように、
１つを除いて全てのアレルプローブは異なる蛍光因子（F₁、F₂、F₃）、および消
光因子(Q)を有している。蛍光因子を有していないアレルプローブ58Bは場合によ
り蛍光因子を含んでいてもよい。アレルプローブ58B上の蛍光因子は他の蛍光因子と異なっていなければならない（すなわち、F₄）。図5Aに示したように、第1のセットのプローブの一つ（56A）は第1のアレル部位57にハイブリダイズし、第２のセットのプローブの一つ（58A）は第２のアレル部位59にハイブリダイズする。各セットから唯一つのプローブが特定のアレル
部位にハイブリダズするように示されているが、セットの他のプローブもこの部
位にハイブリダイズすることを述べておかなければならない。図5Bに示したように、核酸ポリメラーゼ（示していない）はフォワードおよび
リバースプライマー52、53、54および55を伸長する。好ましくは、PCRはTaq DNA
ポリメラーゼ、例えば、AMPLITAQ^TM、またはAMPLITAQ^TM GOLD(Perkin-Elmer，No
rwalk，CN)、または等価な熱安定DNAポリメラーゼを用いて行なわれる。

【００３５】プライマー伸長中、ポリメラーゼは第1のアレル部位にハイブリダイズしているどれかのアレルプローブ（プローブ56Aとして示してある）に出会い、このプローブを消化し始めることにより鎖置換を行なう。ポリメラーゼはまた第２のア
レル部位にハイブリダイズしているどれかのアレルプローブ（プローブ58Aとして示してある）に出会い、このプローブを消化し始めることにより鎖置換を行な
う。図5Bに示したように、このプローブの消化は消化されるアレルプローブに結
合している蛍光因子（F₁、F₃として示した）の放出をもたらす。図5Cに説明したように、消化されるアレルプローブに結合している蛍光因子お
よび消光因子は最終的には増幅される配列から外される。

【００３６】少なくとも１回の増幅サイクルの後にサンプルの蛍光スペクトルが取られ、こ
れが放出された異なる蛍光因子および消光因子の相対数を反映する。完全にマッチしたアレルプローブと、唯一つのミスマッチを有するプローブ、
更には20-30ヌクレオチド長のプローブ内に唯一つしかミスマッチのないプローブとを弁別するアッセイの性能には多数の要因が寄与する。ミスマッチはハイブ
リダイゼーションに破壊的な効果を有し、それが完全にマッチするプローブをミ
スマッチプローブよりも熱力学的に好都合にする。例えば、ミスマッチプローブ
は完全にマッチしたプローブよりも低い融解温度(T_m)を有しているであろう。複
数ミスマッチは単一ミスマッチよりもハイブリダイゼーションに対してずっと大
きな破壊効果を有している。その結果、複数ミスマッチプローブは完全にマッチ
したプローブよりも熱力学的に都合がずっとよくない。

【００３７】 PCRにおけるアニーリング／伸長温度の適切な選択は、ミスマッチプローブに対して正確にマッチしたプローブのハイブリダイゼーションに有利であろう。こ
の選択を規定する温度範囲(thermal window)は、プローブのその相同または非相
同標的への結合に関する温度遷移によって囲まれる。アニーリング温度を上げる
または下げることにより、ミスマッチに対する識別性はそれぞれ増大または低下
する。異なる実質的に相同な配列間を複数の異なる部位において識別する（例えば、
複数のアレル部位において異なるアレルを同定する）ために使用することを可能
とする本5'ヌクレアーゼアッセイの特徴の一つは、20-30ヌクレオチド長のプローブ内部のわずか単一ミスマッチの場合でも、そのプローブ切断効率が悪いこと
である。また、このアッセイは、競合条件下で行なわれることも述べておくことが重要
である。同一のアレル部位に対する複数プローブが同じ反応容器内に存在する。
ミスマッチに対して識別が劣ることの一部は、完全にマッチしたプローブが増幅
される配列へ安定にハイブリダイゼーションするため、完全にマッチしたプロー
ブがミスマッチプローブの結合を妨げることにある。

【００３８】また、アレルプローブの5'末端はそれが切断される前に外されなければならな
い。Taq DNAポリメラーゼの5'ヌクレアーゼ活性は1-3ヌクレオチドからなる置換
5'鎖を有するフォーク構造を認識すると考えられている（Landegrenら、Science
241:1077-1080 (1988)）。ひとたびプローブ置換が開始されると、完全にマッチしたプローブの場合よりも熱力学的に安定でないミスマッチプローブでは完全
な解離がかなり速いであろう。その結果、ミスマッチプローブのポリメラーゼに
よる切断は完全にマッチしたアレルプローブの切断よりも有意に効率が悪い。 DNAサンプルのゲノム型を複数のアレル部位で決定するための本発明の重要な利点は、本方法がアレルのような実質的に相同な配列間を区別するために100％の効率で5'ヌクレアーゼアッセイが動作することに依存しない、すなわち、完全
にマッチしたアレルプローブが切断されるがミスマッチプローブは全く切断され
ない、ということに依存しないことである。そうではなく、本発明は、ある程度
の非効率性を仮定し、サンプル間でその非効率性の程度が極めて一貫したもので
あることに依存している。与えられた特定の条件、使用するプローブおよびプラ
イマーでゲノム型についての本来的アッセイ非効率性を固有に反映する各ゲノム
型の蛍光スペクトルおよび蛍光シグネチャーを生成することにより、未知の配列
のゲノム型を決定することができる。

【００３９】３．5'ヌクレアーゼアッセイからの蛍光シグネチャーの生成本発明の重要な一側面は、実施的に相同な配列のセットのどのメンバーが存在
しているかを決定するための、例えば、DNAのゲノムサンプルのゲノム型を決定するための、5'ヌクレアーゼアッセイを行なうことによって生成された蛍光スペ
クトルの処理である。図4A-4Dおよび5A-5Dに示したように、反応混合物中に存在
する蛍光因子および消光因子蛍光によって生成されたシグナルはDNAサンプルが増幅され、アレルプローブの幾つかは消化されるにつれて変化するであろう。反
応混合物からの蛍光シグナルは異なる蛍光因子（F₁、F₂およびF₃）、消光剤、お
よび内部標準からの寄与を含む。どのアレルプローブが消化され、どのゲノム型
が存在しているかを決定するために、アレルプローブおよびそれらの蛍光成分の
スペクトルに対する異なる寄与を解明することが必要である。

【００４０】 5'ヌクレアーゼ反応からの蛍光シグナルの解析における第１の工程は、5'ヌク
レアーゼアッセイに使用するアレルプローブ上の蛍光因子および消光因子のスペ
クトルのリファレンスライブラリを作成することである。これらのスペクトルは
蛍光強度値の正規化された１ｘｎ行列として表される。ここで、ｎは一連のｎ波
長における蛍光測定であり、ｎは好ましくは３２値である。行列は行列中の最大
値を１と設定することにより正規化される。スペクトルのリファレンスライブラ
リーおよび関連する１ｘｎ行列はデータベース中に保存され、あるいは解析時に
取得される。次に、5'ヌクレアーゼアッセイがゲノム型が既知のゲノムDNA（「コントロール」）；ゲノム型が未知のゲノムDNAを含むサンプル（「未知」）；およびテンプレートを含まない（「ＮＴ」）サンプルを含む一連のサンプルで行われる。コ
ントロールおよび未知のサンプルの蛍光スペクトルがとられ、蛍光強度値の１ｘ
ｎ行列として表される。ここで、ｎは一連のｎ波長における蛍光測定を表し、ｎ
は好ましくは32値である。この行列は場合により行列中の最大値を１に設定する
ことにより正規化されることがある。

【００４１】コントロールおよび未知の蛍光スペクトルを表す１ｘｎ行列は次に、5'ヌクレ
アーゼアッセイにおいて存在している蛍光種の相対蛍光寄与を測定するためリフ
ァレンススペクトルの１ｘｎ行列表記を用いて解析される。異なる蛍光種の相対
蛍光寄与の測定は、「統計信頼区間の決定を含む多成分解析法」(MULTI COMPONE
NT ANALYSIS METHOD INCLUDING THE DETERMINATION OF A STATISTICAL CONFIDEN
CE INTERVAL)なる名称の出願番号08/659,115の出願に記載された多成分解析法に
よって行うことができる。異なる蛍光種の相対蛍光寄与が決定されたならば、異なる蛍光種の寄与は受動
的蛍光内部標準を用いて正規化される。内部標準は、その蛍光が核酸増幅反応中
に有意な変化をしないという点で受動的である。核酸増幅反応における、および
蛍光スペクトルの正規化のための内部標準の使用は「核酸増幅産物の検出のため
の受動型内部リファレンス」(PASSIVE INTERNAL REFERENCES FOR THHE DETECTIO
N OF NUCLEIC ACID AMPLIFICATION PRODUCTS)なる名称の出願番号08/657,989の出願に記載されている。この文献は本発明に含まれるものとする。

【００４２】コントロールおよび未知の蛍光スペクトルに対する異なる蛍光種の正規化され
た寄与はそれらの「蛍光シグネチャー」に対応する。本明細書において、用語「
蛍光シグネチャー」は、5'ヌクレアーゼアッセイによって生成されたスペクトル
に対する異なる蛍光種の相対寄与を記述するために使用される。なぜならば、こ
の相対寄与は種々のコントロールのスペクトルを互いに区別するために使用でき
、また、未知サンプルに関するスペクトルへの相対寄与と種々のコントロールに
対するスペクトルへの相対寄与との比較に基づいて、未知のDNAサンプルのゲノム型を同定するためにも使用できるからである。蛍光シグネチャーは、実質的に
相同な配列のどのメンバーがサンプル中に存在しているか（例えば、どのアレル
変異体が存在しているか）に依存するだけでなく、与えられた5'ヌクレアーゼア
ッセイ条件（時間、温度）、使用するプローブ、プライマーおよびポリメラーゼ
、プローブ間の相対的ハイブリダイゼーション競合および種々の蛍光種の寄与を
計算するために使用するアルゴリズムを含めた一連のアッセイ依存の変数にも依
存する。本発明の一例として、ApoEゲノム型決定のための蛍光シグネチャー決定
を以下に記載する。

【００４３】４．蛍光シグネチャーからの複数アレル部位におけるゲノム型決定コントロール、未知サンプル、およびNTの蛍光シグネチャーが決定されたなら
ば、各未知サンプルのゲノム型を決定するために各未知サンプルの蛍光シグネチ
ャーはコントロールの各々およびNTの蛍光シグネチャーと比較される。増幅反応
が成功していれば、未知サンプルの蛍光シグネチャーは単一のコントロールの蛍
光シグネチャー、またはヘテロ接合については２つのコントロールの50-50混合物の蛍光シグネチャーと一致するはずである。増幅反応が成功しなかった場合は
、未知サンプルの蛍光シグネチャーはどのコントロールとも一致せず、NTシグネ
チャーと一致するはずである。本発明の一例として、蛍光シグネチャーからのAp
oEゲノム型の決定を以下に記載する。

【００４４】５．複数アレル部位における増幅産物のゲノム型を決定するための蛍光因子-消光因子プローブアッセイを行なうためのキット本発明は、実質的に相同な配列の少なくとも２つの異なるセットのどのメンバ
ーがDNAサンプル中に存在しているかを決定するためのキットにも関連する。一例として、本キットは、5'ヌクレアーゼアッセイを用いてゲノムDNAサンプルの少なくとも２つの異なるアレル部位におけるゲノム型を決定するためのキットで
あることがある。また、本キットは、アレル変異体として互いに関連するもので
はない実質的に相同な配列、例えば、微生物の異なる株由来の配列である２以上
の実質的に相同な配列の２以上のセット間を区別するためのものであってもよい
。

【００４５】一つの実施態様として、本キットには、少なくとも２セットのプローブが含ま
れ、各プローブセットは２以上の実質的に相同な配列間を区別するためのもので
あり、その２以上の実質的に相同な配列は互いに少なくとも１個のヌクレオチド
が異なっており、セット中の各プローブはその２以上の実質的に相同な配列の一
つと完全にマッチする。このキットは、場合により、アッセイに使用する追加の
プローブセット、増幅プライマーおよび／またはポリメラーゼを含んでいてもよ
い。全体として、２以上のセットのプローブは少なくとも３種の蛍光因子を有し
ている。１つのプローブは場合により蛍光因子を有していなくてもよく、または
、異なるセット中に存在する蛍光因子を有していてもよい。プローブの少なくと
も２セットは、検出すべき異なるゲノム型について区別し得る蛍光シグネチャー
を生成するように選択される。

【００４６】別の態様では、本キットは、少なくとも、第１のアレル部位のゲノム型を決定
するための第1のアレルプローブのセット、および、第２のアレル部位のゲノム型を決定するための第２のアレルプローブのセットを含む。本キットは場合によ
りアッセイに使用する追加のアレルプローブのセット、増幅プライマーおよび／
またはポリメラーゼを含んでいてもよい。プローブの各セットは、アレル部位に
ハイブリダイズすることができるが互いに少なくとも１個のヌクレオチドが異な
っている少なくとも２つのプローブを含んでいる。全体として、この２以上のセ
ットのプローブは少なくとも３種の蛍光因子を含んでいる。１つのプローブは場
合により蛍光因子を含んでいなくてもよく、または、別のセット中に存在してい
る蛍光因子を有していてもよい。この少なくとも２つのプローブセットは、検出
すべき異なるゲノム型について区別し得る蛍光シグネチャーを生成するように選
ばれなければならない。本キットはアッセイにおいてコントロールとして働くサンプルDNAを含んでいてもよい。例えば、このサンプルDNAは実質的に相同な配列の特定のメンバーを含んでいてよい。一つの実施態様では、サンプルDNAは第１および第２のアレル部位において既知のゲノム型を有している。本キットは、受動的内部標準として
使用するための蛍光物質を含んでいてもよい。場合により、本キットは5'ヌクレ
アーゼアッセイを行なうためのバッファーまたは他の試薬を含んでいてもよい。

【００４７】６．5'ヌクレアーゼアッセイを行なうためのガイドライン以下のガイドラインは、本発明で使用されるアッセイのような、DNAサンプルのゲノム型をアレル部位において検出するための5'ヌクレアーゼアッセイを行な
うために作られたものである。このガイドラインは、同定すべき相同配列の１つ
を有する天然の配列を用いて、通常の能力を有する者がプライマー配列、プロー
ブ配列およびアッセイにおいて増幅すべき配列の断片（アンプリコン）を選択す
るのを支援する。

【００４８】Ａ．プライマーおよびプローブ設計ガイドラインＩ．アンプリコン長およびプライマー-プローブ分離増幅される配列の長さが減少すると5'ヌクレアーゼアッセイ動作が改善される
ことが分かっている。一貫性のある、かつ、予測し得る結果は50bp程度の短いア
ンプリコンから150bp程度の長さのアンプリコンについて定常的に得られている。より長いアンプリコンも許容できる結果を与えることもあるが、ここに記載し
た最適化ストラテジーが与える予測し得る再現性のある性能を必ずしも与えない
であろう。フォワードおよびリバースプライマーは各アレルオリゴヌクレオチド
プローブに可能な限り近くに置かれるように設計されなければならない。プライ
マーとアレルプローブ間の距離、またはアンプリコン全体の長さが増加すると、
アッセイの性能が低下し、反応は最適化するのがより難しくなる。

【００４９】プライマーとプローブ間がより長い、または短い距離であることの影響は図6A
および6Bに示した。図6Aは、二本鎖アンプリコン62の配列を示す。二本鎖アンプ
リコン62の増幅のための、内側プライマー64と64'、および外側プライマー66、6
6'（矢印内の配列）の配列も示してある。また、蛍光ベースの検出法で使用する
ためのオリゴヌクレオチドプローブ68、68'（小文字）の配列も示した。図6Bは、（１）２つの内側プライマー（64、64'）が使用された場合、（２）内側および外側プライマー（64、66'）が使用された場合、（３）内側および外側プライマー（64'、66）が使用された場合、（４）２つの外側プライマー（64、64'）が
使用された場合の増幅曲線を示すものである。図6Bから分かるように、アンプリ
コンが最も短い（１）の場合に最大の収率（ΔRn）が達成される。アンプリコン
の長さが増加すると収率は低下する[（１）対（４）]。中間の長さのアンプリコ
ンは図6Bに示されており、中程度の結果を与える。

【００５０】 II．アンプリコン配列に基づくプライマーおよびプローブ選択与えられたアンプリコンに対して使用するプライマーおよびプローブ配列の選
択にいくつかの要因が影響を与える。例えば、％GC（配列中のGまたはCである塩
基のパーセンテージ）は少なくとも約20％であり、約80％未満でなければならな
い。許容できる％GCは極めて広い。この融通性の理由は、以下に定義する厳格な
Tm範囲を満たすプライマーおよびプローブがこの広い％GC範囲内で設計できるこ
とにある。プライマーはDNAの異なる供給源間で保存されている領域にハイブリダイズするように選択されなければならない。選択したプライマーが多型性領域にハイブ
リダイズするならば、このプライマーはサンプルの供給源に依存してサンプル中
のDNAを増幅するか、またはしないであろう。非多型性領域にハイブリダイズするプライマーを選択することにより、このプライマーは大部分のサンプルを増幅
することができるはずである。プライマーおよびプローブは、その有する隣接するグアニン(G)が４未満でなければならない。隣接するGが３を越えてはいけないという要求は、これらの構造が見られる反応の収率が低いことが分かったことに起因する。この収率の低さ
は、４以上の隣接Gが見られる場合に形成される相対的に安定な二次構造によるものである。

【００５１】 III．アンプリコン配列に基づくプローブ選択アンプリコン選択のための第II節のガイドラインに加えて、プローブ選択の場
合に以下の追加のガイドラインに従うことが好ましい。一つの実施態様において、プローブ融解温度（T_m）は増幅反応に使用されるア
ニーリング温度よりも約３〜５℃高く、プライマー融解温度（T_m）はアニーリン
グ温度よりも２〜４℃低い。一つの実施態様においては、アニーリング温度は約
60〜64℃であり、より好ましくは約62℃である。アニーリング温度が約62℃であ
る場合、プローブ融解温度は好ましくは約65〜67℃であり、プライマー融解温度
は好ましくは約58〜60℃である。別の実施態様では、プローブ融解温度（T_m）はプライマーのT_mよりも好ましく
は５〜10℃高く、より好ましくは約７℃高い。別の実施態様では、プローブは約65〜70℃、より好ましくは約65〜67℃の融解
温度（T_m）を有している。この実施態様では、プライマーは好ましくは約55〜65
℃、より好ましくは約58〜63℃、更に好ましくは約58〜60℃の融解温度（Tm）を
有している。

【００５２】二本鎖標的のどちらの鎖に相補的なプローブを作製するかを選択する場合、得
られるプローブがGよりもCを多く含むように鎖を選ぶことが好ましい。この要求
は、図７に示した結果に表されるように、GよりもCを多く含むプローブが5'ヌク
レアーゼアッセイにおいてよりよく働くという観察に基づいている。プローブ配列は、5'末端にグアニン(G)を有していてはならない。これは、蛍光因子に近接したGは切断の後でさえ蛍光因子の蛍光をいくらか消光するからである。

【００５３】 IV.アンプリコン配列に基づくプライマー選択プライマー配列を選択する場合は、上述のアンプリコンおよびプローブ選択の
ための第III節のガイドラインに加えて、以下の追加のガイドラインに従うのが好ましい。プライマーはプローブ選択が適用され、可能なプローブ配列が選択された後に
選択されるべきである。図4A-4Dに図示したように、１以上のアレル部位が単一のプライマーで増幅される場合は、プライマーは最も短い可能なアンプリコン長
内でプローブを囲むように選択されるのが好ましい。プライマー配列は好ましく
はプローブと重ならずに可能な限りプローブに近いように選ばれるのが好ましい
。アンプリコンは好ましくは長さが150bp未満であり、より好ましくは長さ100bp
未満である。より短い配列はPCR増幅が機能する確率を増加させるため、短いアンプリコンが好ましい。従って、PCR増幅の強さが蛍光発生プローブからのシグナル生成に最も重要である。同じ反応条件下で、より短いアンプリコンはより長
いアンプリコンよりもより効率的に増幅する。２つの内側プライマーの使用はも
っとも高い蛍光収率（ΔＲ_n）を与えるという発見を考慮し、より短いアンプリコンを選択することの利点を図6Aおよび6Bに示した。

【００５４】図6Aおよび6Bに関して上で議論したように、フォワードおよびリバースプライ
マーはプローブと重ならずに可能な限りプローブに近くなければならない。プラ
イマーは好ましくは、増幅に用いられるアニーリング温度よりも約２〜４℃低い
融解温度を有している。例えば、好ましいアニーリング温度62℃が使用される場
合は、プライマーの融解温度は好ましくは約58℃〜60℃である。フォワードおよびリバースプライマーの3'末端の５つのヌクレオチドはグアニ
ン(G)またはシトシン(C)を１または２個しか有してはならない。また、プライマーは非特異的プライミングを低減するため比較的不安定な3'末
端を有するように選ぶのが好ましい。そのようなプライマーは典型的には3'末端
の最後の５つのヌクレオチド中に２個よりも多いグアニン(G)およびシトシン(C)
を含まない。3'末端において一過性にハイブリダイズしにくいプライマーはDNA ポリメラーゼによって非特異的に伸長されにくいものでもある

【００５５】蛍光モニター増幅反応において使用されるプローブおよびプライマーを選択す
るために上記のガイドラインがどのように使用されるかは図８〜12と関連させて
以下に説明される。図8Aおよび8BはそれぞれアメロゲニンＸ（配列番号１）およびアメロゲニンＹ
（配列番号２）の配列を示す。ここからアンプリコン、プライマーおよびプロー
ブが決定される。図９は、アメロゲニンXの一部とアメロゲニンYの一部の比較を
示す。配列間の記号｜は２つの配列が特定の塩基位置で同じヌクレオチドを有す
ることを示し、配列間の記号−は２つの配列が特定の塩基位置で異なるヌクレオ
チドを有することを示す。図10はアメロゲニンX（塩基50〜750）の一部を示す。5'ヌクレアーゼアッセイ
によって同定されるべきアレル部位は太字で示してある。図11は図10に示したア
メロゲニンXの塩基251〜500をその相補（アンチセンス）鎖とともに示したものである（配列番号３）。5'ヌクレアーゼアッセイによって同定されるアレル部位
は太字で示してある。

【００５６】次に、検出すべきアメロゲニンXのアレル部位に相補的なプローブが選択される。プローブはどちらのプローブがGよりもCを多く有するかに基づいて、センス
またはアンチセンス鎖に相補的に選択されなければならない。プローブの長さは
、プローブが所望の融解温度、好ましくは約65〜67℃の融解温度を有するように
調節されなければならない。プローブの融解温度を計算するための種々のコンピ
ュータープログラムが存在している。以下のプローブは、この選択手順に基づく
、アメロゲニンXのアレル部位のための適切なプローブの一例である：CCAGCAACC
AATGATGCCCGTT（配列番号４）。次に、アレル部位に最も近く、かつ、アメロゲニンXとアメロゲニンY間の多型
性によって中断されないアメロゲニンXの領域に相補的であるプライマーを検索することによって、アッセイに用いるフォワードプライマーが選択される。次に
また、アメロゲニンXとアメロゲニンY間の多型性によって中断されない適切なプ
ライマーを検索することにより、アッセイに使用されるリバースプライマーが選
択される。図12は、この手順によって選択されたアメロゲニンXアンプリコンをフォワードおよびリバースプロモーター（矢印で示した）とともに示したもので
ある。アレル部位は影をつけて表示した。取消線を引いた配列は、アメロゲニン
XとアメロゲニンY間で多型性が存在する配列である。次に、アメロゲニンXと同じ範囲内、好ましくは上述したように約65〜67℃の融解温度を有するようにアメロゲニンYプローブが選択される。以下のプローブはこの選択手順に基づくアメロゲニンYのアレル部位に関する適切なプローブの一例である：CCAGCAAGCACTGATGCCTGTTC（配列番号５）。

【００５７】Ｂ．5'ヌクレアーゼアッセイを動作させるための条件上記で概説したプローブおよびプライマー設計制約は標的アンプリコンに関す
る再現性のある物理化学的パラメータを与える。このプロセスを通じて選択され
た全てのアンプリコンの増幅は同じ反応混合物配合およびサーモサイクルパラメ
ータ下で行なうことができる。表１は好ましい反応混合物配合の範囲およびこの
アッセイに使用する好ましい反応混合物配合の具体例を提供する。表１に概説し
た反応混合物配合は２〜８℃で90日間以上安定であることが分かっている。好ま
しくは、Applied Biosystems-Perkin Elmerから販売されているTaqMan PCR Core
Reagent Kit(部品番号N8080228)に含まれる試薬、および20％グリセロール（部
品番号402929）が反応混合物を調製するために使用される。グリセロールは反応混合物中でGC塩基対がほどけるのを助けるために使用され
る。ゼラチンおよびTWEEN20はROX蛍光を安定化させるために使用される。そうし
なければ、時間経過により蛍光は減少する。

【００５８】 AMPLITAQ^TM Goldはホットスタート法の一部としてポリメラーゼとして使用される。なぜなら、AMPLITAQ^TM Goldは95℃にてインキュベーションされるまで機能しないからである。ホットスタート法を使用することにより、改善された特異
性、感度および産物収率が達成される。ホットスタート法およびその利点はBirc
hら、Nature, 381:445-446(1996)に記載されている。 AmpErase UNG^TMはAMPLITAQ^TM Goldと組み合わせて使用される。AmpErase UNG^T ^M はDNA中のUを認識し、アンプリコンからUを除去してリン酸骨格を残す。AMPLIT
AQ^TM Goldのために反応温度を95℃まで上昇させると、Uが除去されたリン酸骨格
はバラバラになる。このことは、前の増幅から汚染混入したアンプリコンの増幅
を防ぐ働きをする。反応混合物中の比較的高い（５mM）MgCl₂最終濃度は、この反応のために全ての一般的試薬が過剰に存在していることを要求するというストラテジーに従った
ものである。5'ヌクレアーゼアッセイの本来的性質は、シグナルが生成されるた
めにはプローブがPCR中に伸長複合物にハイブリダイズしなければならないことである。高濃度のMg²⁺の使用は、ハイブリダイゼーション平衡をプローブがハイ
ブリダイズする方向にシフトさせる。この結果、プローブハイブリダイゼーショ
ンはより安定であり、反応はより強固で再現性がある。

【００５９】

【表１】表１．２Ｘ反応混合物合計 50ml * 50mlアリコートについて

【００６０】表２はこれらの増幅反応のために好ましいサーマルサイクラー設定の概略であ
る。全ての試験は同じサーモサイクローパラメータ設定を使用するため、96穴プ
レート中で1以上の型の標的定量試験を行なってもよい。

【表２】表２．時間及び温度

【００６１】Ｃ．プローブ濃度とプライマーの最適化解説したように、プライマー、プローブ、反応混合物およびサーモサイクラー
パラメータによるテストランのためにはプライマーおよびプローブ濃度の最適化
のみが必要とされる。プライマー濃度最適化の目的は最適なPCRおよび最大終点値を与える効率的なT_mを得るためである。プローブ濃度最適化の目的は、最大の
5'ヌクレアーゼ性能および最大蛍光シグナルに必要とされる最小のプローブ濃度
に到達するためである。プライマーおよびプローブ濃度が決定されたならば、最
大終点値を与える最小のプライマー濃度を決定するために各プライマーの濃度が
独立に最適化される。最良の収率およびC_Tを与える最小のプローブ濃度を決定す
るために各プローブの濃度が最適化される。標的配列を有するテンプレートが最適化に必要である。このテンプレートはゲ
ノムDNAでも逆転写反応によって生成されたcDNAであっても、標的配列を含むプラスミドであってもよい。

【００６２】Ｄ．プライマーおよびプローブ濃度の決定プローブおよびプライマーの濃度を決定するために、各オリゴヌクレオチドの
1:100 TEバッファー希釈物の260nmにおける吸収を測定する。次に、以下の表３に示した方法を用いてオリゴヌクレオチド濃度をμMで計算する。

【表３】表３．FAM-標識プローブについての吸光係数の計算例吸光度＝吸光係数ｘ経路長ｘ濃度/100 この場合、0.13=221,000M^-1cm^-1 x 0.3cm x C/100、すなわち、 C=196μM

【００６３】Ｅ．プライマー濃度の最適化プライマー濃度は上で定義した62℃伸長温度にて最適化してよい。フォワード
およびリバースプライマーは表４に示した３ｘ３行列で規定されるウェルを100n
Mプローブ濃度で動作させることにより同時に最適化される。この行列によって定義される９つの各条件について最低四重でウェルを動作させる。この行列内の
プライマー濃度範囲（50〜900nM）はこれらのプライマーの公称T_m付近±2℃の効
果的T_m範囲に対応する。表５はプライマー濃度の最適化に使用する行列を示したものである。この行列
は表１に示した組成の反応混合物および表２に示したサーマルサイクルパラメー
タ設定で動作させるすべきである。100nMというプローブ濃度がこの行列と関連したプライマー濃度最適化のために使用されることがある。プライマー濃度の最
良の組み合わせは、最小のサイクル閾値（C_T）および最大の終点値（R_n）を生じ
させるものであろう。

【００６４】

【表４】表４．

【００６５】Ｆ．プローブ濃度の最適化プローブ濃度は、62℃伸長温度および、上で定義した最適フォワードおよびリ
バースプライマー濃度にて最適化される。単一のプローブが使用される場合は、
その濃度は25nM間隔で25〜225nMにてウェルを動作させることによって最適化される。この最適化の目的は最大のR_nと最小のC_tを生じさせる最小プローブ濃度を
選ぶことにある。この行列で規定される９つ条件のそれぞれについて最低４重で
ウェルを動作させる。プローブ濃度は制限的でないように示される必要がある。
定量的応用例では、シグナル対ノイズは最大に最適化される。表５は、プローブ濃度の最適化に使用する行列を示したものである。この行列
は、表１の反応混合物、表２のサーマルサイクルパラメータ設定、および、プラ
イマー濃度最適化行列からの最適フォワードおよびリバースプライマーで動作さ
せるべきである。

【表５】表５．

【００６６】７．アレルプローブの合成本発明の5'ヌクレアーゼアッセイに使用するオリゴヌクレオチドプローブは数
々のアプローチによって合成することができる(例えば、Ozakiら、Nucleic Acid
s Research, 20:5205-5214(1992)；Agrawalら、Nucleic Acids Research, 18：5
419-5423 (1990)その他)。本発明のオリゴヌクレオチドプローブは自動DNA合成機、例えば、Applied Biosystems社(Foster City, California)モデル392または
394 DNA/RNA合成機上で、ホスホラミダイト化学のような標準的な化学（例えば、以下の文献に開示されている：BeaucageとIyer, Tetrahedron 48:2223-2311 (
1992)；Molkoら、米国特許4,980,460；Kosterら、米国特許4,725,677；Caruther
sら、米国特許4,415,732；4,458,066；および、4,973,679；その他）を用いて合
成するのが好都合である。別の化学、例えば、ホスホロチオエート、ホスホラミ
デートその他のような、非天然骨格基を生じさせるものも使用されることがある
。但し、生じたオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション効率および／また
は使用するヌクレアーゼの切断効率が有害な影響を受けないことを条件とする。

【００６７】好ましくは、このオリゴヌクレオチドプローブは長さが15〜60ヌクレオチドの
範囲である。より好ましくは、こオリゴヌクレオチドプローブは長さが18〜30ヌ
クレオチドの範囲である。本発明のオリゴヌクレオチドプローブの正確な配列お
よび長さは、一部には、それが結合する標的オリゴヌクレオチドの性質に依存す
る。結合位置および長さは、特定の実施態様について適切なアニーリングおよび
融解特性を達成するために変えられることがある。そのような設計選択をするた
めのガイダンスは、上記で引用した、5'ヌクレアーゼアッセイが記載された上記
で引用した多くの文献中に見ることができる。オリゴヌクレオチドプローブの3'末端ヌクレオチドはブロックされているか、
核酸ポリメラーゼによって伸長できないようにされていることが好ましい。その
ようなブロッキングは、リンキング部分によってオリゴヌクレオチドプローブの
3'末端炭素にレポーター分子または消光分子を結合させることによって行なうの
が好都合である。

【００６８】８．蛍光因子および消光因子の選択好ましくは、蛍光因子は、プローブの末端3'炭素または末端5'炭素にリンキン
グ部分によって結合させるために誘導体化された蛍光有機色素である。好ましく
は、消光分子も有機色素であり、発明の実施態様に依存して蛍光性であっても非
蛍光性であってもよい。例えば、本発明の好ましい実施態様において、消光分子
は蛍光性である。一般に、消光分子が蛍光性であるか、単に蛍光因子からの遷移
エネルギーを非放射減衰によって放出するかの何れにしろ、消光因子の吸収バン
ドは蛍光因子の蛍光放射バンドと実質的に重なっていなければならない。励起さ
れた蛍光因子からのエネルギーを吸収するがそのエネルギーを放射的に放出しな
い非蛍光性消光分子は、本出願では発色性分子と称される。

【００６９】特定のプローブのための適切な蛍光因子-消光因子対を選択するために利用可能な実践的ガイダンスが文献中に多数存在する。その例として以下の文献が挙げ
られる：Clegg（上で引用した）；Wuら（上で引用した）；Pesceら編集、Fluore
scence Spectroscopy(Marcel Dekker, New York,1971); Whiteら、Fluorescence
Analysis：A Practical Approach(Marcek Dekker, New York, 1970)；その他。
文献には蛍光分子および発色分子の網羅的なリストおよびレポーター-消光対を選択するための関連する光学的特性を提供する文献が含まれる（例えば、Berlma
n, Handbook of Fluorescence Spectra of Aromatic Molecules, 第２版（Acade
mic Press, New York, 1971））；Griffiths, Colour and Constitution of Org
anic Molecules (Academic Press, New York, 1976)；Bishop,編集Indicators(P
ergamon Press, Oxford, 1972)；Haugland, Handbook of Fluorescent Probes a
nd Research Chemicals(Molecular Probes, Eugene, 1992) Pringsheim, Fluore
scence and Phosphorescence(Interscience Publishers, New York, 1949)；その他）。さらに、オリゴヌクレオチドに結合し得る一般的な反応性基による共有
結合のためにレポーター分子および消光分子を誘導体化することに関する広範な
ガイダンスが文献中に存在している。以下の文献がその例である：Haugland(上で引用)；Ullmanら、米国特許第3,996,345号；Khannaら、米国特許第4,351,760 号；その他。

【００７０】蛍光因子-消光因子対の具体例はフルオレセインを含むキサンテン色素、およびローダミン色素から選択してよい。これらの化合物の適切な形態は、そのフェ
ニル部分に置換基を持つものも商業的に広く入手可能であり、これらの置換基は
結合のための部位またはオリゴヌクレオチドへの結合のための結合官能性基とし
て使用することができる。使用し得るいくつかの特定のクラスの色素は「増強さ
れたｌ蛍光を有するエネルギー転移色素」（"ENERGY TRANSFER DYES WITH ENHAN
CED FLUORESCENCE"）、出願番号08/726.462；「増強された蛍光を有するエネルギー転移色素」（"ENERGY TRANSFER DYES WITH ENHANCED FLUORESCENCE"）、出願番号08/642,330に記載されたエネルギー転移蛍光色素；および「4,7-ジクロロ
ローダミン色素」なる名称の米国特許出願番号08/672,196に記載された4,7-ジク
ロロローダミン色素が挙げられる。これらの文献は本明細書に含まれるものとす
る。蛍光化合物の他のグループは、アミノ基をαまたはβ位に有するナフチルア
ミンである。そのようなナフチルアミノ化合物には、1-ジメチルアミノナフチル
-5-スルフォネート、1-アニリノ-8-ナフタレンスルフォネートおよび2-p-トウイ
ジニル-6-ナフタレンスルフォネートが含まれる。他の色素には、3-フェニル-7-
イソシアナトクマリン、アクリジン、例えば9-イソチオシアナトアクリジンおよ
びアクリジンオレンジ；N-(p-(2-ベンゾキサゾリル)フェニル)マレイミド；ベン
ゾキサジアゾール、スチルベン、ピレン、その他が含まれる。

【００７１】好ましくは、蛍光因子および消光因子はフルオレセインおよびローダミン色素
から選ばれる。これらの色素およびオリゴヌクレオチドへの結合のための適切な
リンキング方法論は多くの文献に記載されている（例えば、Khannaら、上記で引
用；Marshall, Histochemical J., 7:299-303 (1975)；Menchenら、米国特許第5
,188,934号、Menchenら、欧州特許出願87310256.0；およびBergotら、国際出願P
CT/US90/05565）。最後の４つの文書は本発明に含まれるものとする。蛍光因子または消光因子分子をオリゴヌクレオチドの5'または3'末端に結合す
るための多数のリンキング部分および方法論が存在する。これらは以下の文献に
よって例示される。Eckstein編集、Oligonucleotides and Analogues：A Practi
cal Approach(IRL Press, Oxford, 1991)；Zuckermanら、Nucleic Acids Resear
ch 15:5305-5321 (1987)(オリゴヌクレオチド上に3'チオール基)；Sharmaら、Nu
cleic Acids Research, 19:3019(1991)(3'スルフィドリル)；Giustiら、PCR Me
thods and Applications, 2:223-227 (1993)およびFungら、米国特許第4,757,14
1号（Applied Biosystems, Foster City, CA から入手できるAminolink^TM IIによる5'ホスホアミノ基）、Stabinsky、米国特許第4,739,044号（3'アミノアルキ
ルホスホリル基）；Agrawal1ら、Tetrahedron Letter, 31:1543-1546 (1990)(ホ
スホラミデートリンクによる結合)；Sproatら、 Nucleic Acids Research, 15:
4837(1987) (5' メルカプト基)；Nelsonら、Nucleic Acids Research, 17:7187-
7194 (1989)(3' アミノ基)；その他。

【００７２】好ましくは、合成中にオリゴヌクレオチドに結合し得る、商業的に入手可能な
リンキング部分、例えば、Clontech Laboratories(Palo Alto, CA)から入手可能
なものが使用される。ローダミンおよびフルオレセイン色素はまた、ホスホラミダイト部分で誘導体
化された色素によって固相合成の最後にオリゴヌクレオチドの5'ヒドロキシルに
結合されるのが都合がよい（例えば、Wooら、米国特許第5,231,191号；およびHo
bbs, Jr., 米国特許4,997,928）。

【００７３】９．APOE アレルコントロールに関する蛍光シグネチャー測定アポリポタンパク質(apo)Eは、リポタンパク質とリポレセプター間の相互作用
を媒介することによりリポタンパク質代謝に中心的な役割を果たす。apoEの一般
的な３種の変異体が等電焦点法によって同定されており、E2、E3，およびE4と命
名されている。apoEの遺伝的変異は血清コレステロールレベル、冠動脈疾患、晩
発性アルツハイマー疾患のかかり易さに影響を与える。一般的なタンパク質変異体E2、E3およびE4はε2、ε3およびε4という名の３種のapoE遺伝子のアレルによってコードされている。これらのアレルを表６に示
した。示したように、apoEアレルは２つのコドン112および158中で単一塩基置換
によって異なっている。従って、apoEのゲノム型決定にはapoE遺伝子中の２つの
別個のアレル部位における塩基の正体を決定することが必要である。

【００７４】

【表６】表６．

【００７５】２つのアレル部位は充分に近いので、これらは単一のapoEアンプリコンとして
増幅可能である。しかしながら、これらの部位は単一のプローブによってアッセ
イするには遠すぎる。PCR産物のシーケンシングまたは制限消化のようなゲル法は単一の反応産物中の両方の多型性部位をアッセイできるが、多大な手間のかか
るゲルを必要とする。今日までに既述されている非-ゲル法は、各多型性部位を別々にアッセイし、従って、１個体のapoEゲノム型を測定するために２つの反応
が必要とされる。本発明の5'ヌクレアーゼアッセイを用いると、単一の反応で両方のアレル部位
においてゲノム型を決定することが可能である。このアプローチはapoE遺伝子の
ように２以上のアレル部位を有する遺伝子のゲノム型を決定するための従来のア
プローチよりもずっと高速である。

【００７６】種々のapoEアレルを区別するための5'ヌクレアーゼアッセイに使用されるプロー
ブは以下のものである：コドン112 CGGCCGCACACGTCCTCCp AE121T1[配列番号６] TET-CGGCCGCGCACGTCCTCCTC-TAMRA AE112CT2[配列番号７]コドン118 FAM-CACTGCCAGGCACTTCTGCA-TAMRA AE158TF1[配列番号８] JOE-CACTGCCAGGCGCTTCTGCAG-TAMRA AE158CJ2[配列番号９]

【００７７】太字の塩基は各コドンにおいて多型性ＴまたはＣに相補的である。コドン112において、AE112T1は、コドン112においてAを含むε2およびε3アレ
ルにハイブリダイズする。AE112T1は蛍光因子を含まないため、ε2およびε3は1
12コドンアレルに関してシグナルを生成しない。コドン112において、AE112T2は、コドン112においてGを含むε4アレルにハイブリダイズする。AE112T2は蛍光因子としてTETを含むため、ε4のサンプルはコドン112アレルに関してTETシグナルを生成する。コドン158においてはAE158TF1はコドン158にAを有するε2アレルにハイブリダ
イズする。AE158TF1は蛍光因子としてFAMを含むため、ε2のサンプルは158コドンアレルについてFAMシグナルを生成する。コドン158において、AE158CJ2はコドン158にGを有するε3およびε4アレルにハイブリダイズする。AE158CJ2は蛍光因子としてJOEを有するため、ε3およびε
4のサンプルは158コドンアレルについてJOEシグナルを生成する。表７は種々のa
poEアレルについて期待される蛍光シグナルを纏めたものである。表７から分かるように、各アレル変異体について別個のスペクトルを予測することができる。
従って、これによりアレルの区別ができヘテロ接合の組み合わせを検出すること
ができる。

【００７８】

【表７】表７．

【００７９】コドン112および158は以下のプライマーを用いて273塩基アンプリコンの一部として増幅させた： ApoE-F1 ACGCGGGCACGGCTGTC （フォワードプライマー）［配列番号10］ ApoE-R1 CTCGCGGATGGCGCTGA （リバースプライマー）［配列番号11］

【００８０】表１に示した特定の反応混合物および表２に示した反応条件をapoEアレルの増
幅を行なうために使用した。増幅後、各反応の蛍光をABI Prism 7200または7700で測定した。装置のソフト
エウアは純粋色素スペクトルのリファレンスライブラリーを使用し、および、種
々の蛍光団のスペクトルに対する蛍光寄与を多成分解析により決定するためのロ
ジックを使用する。反応には、３種の蛍光因子(TET、FAM、およびJOE)、消光因子(TAMRA)、および受動的内部標準(ROX)が存在している。FAM、TET、JOEおよびT
AMRAの相対寄与が測定されたならば、ROXシグナルが使用され、FMA、TET、JOEお
よびTAMRAシグナルをROXシグナルで割ることによって他のシグナルが正規化され
る。図13はapoEアレルε2、ε3およびε4、およびテンプレート無しのサンプル(
NT)に対して上記5'ヌクレアーゼアッセイを行なったことによるスペクトルに対するFAM、TET、JOEおよびTAMRAの正規化された相対寄与を示したものである。こ
れらが種々のアレルに対する蛍光シグネチャーである。

【００８１】図13に示した蛍光シグネチャーから分かるように、蛍光シグナルに対するFAM 、TET、JOEおよびTAMRAの相対寄与の測定は、未知サンプルのゲノム型を決定するために蛍光データを直接読み取ることを妨げるように見える幾つかの不合理な
結果を生じさせることがある。例えば、JOEシグナルはε2アレルおよびテンプレ
ート無し(NT)サンプルについて陰性であることが示される。更に、ε3アレルはJ
OEシグナルのみを有すると期待されるにも関わらず、ε3アレルはJOEシグナルよ
りも強いTETシグナルを有する。これらの結果は、異なる蛍光因子の吸光係数のバラツキ、アレルプローブ間の競合、および多成分解析ロジックにおける不正確
さによるものである。ゲノム型を決定するために直接使用する代わりに、図13に
示した正規化された相対蛍光寄与は未知サンプル由来のシグネチャーに比較し得
る蛍光シグネチャーとして、未知サンプルのゲノム型を同定するために使用され
る。

【００８２】１０．未知APOEサンプルのゲノム型決定３つのNTコントロール、３つのε2コントロール、３つのε3コントロール、３
つのε4コントロール、および84の未知サンプルを含むプレートを第９節に記載したアッセイに従って動作させた。各未知反応は84人のヒト個体からの50ngのゲ
ノムDNAを含むものであった。反応体積は25μlとした。5'ヌクレアーゼアッセイ
を行ない、蛍光を測定した後、正規化された蛍光シグネチャーを各サンプルにつ
いて決定した。NTコントロールを未知サンプルの蛍光に比較することにより、３
つの未知サンプルが有意な増幅を受けなかったことが明らかになった。これらの
サンプルの更なる解析は行なわなかった。一連のコントロールサンプルおよびNTサンプルの蛍光シグネチャーの平均を使
用して以下に示すような４ｘ４行列を構築した。

【００８３】

【数１】 [NT ε2 ε3 ε4]=[FAM_n TET_n JOE_n TMR_n] ｘ

【００８４】次にこのマトリックスを使用してNT、各未知サンプルについてのε2、ε3および
ε4値を計算した。図14は、84のゲノム型を決定したサンプルについての、ウェル対アレル値プロ
ットを示したものである。このプロットは、スペクトルに対するNT寄与を除去し
、次にNTなしでシグネチャーを再正規化することによって得られる。これにより
、1.0、0.5または０のアレル値を得ることができる（各アレルはアレル値0.5を有する）。予想されたように、アレル値は0.0、0.5および1.0付近にクラスターを形成していることが分かる。最も一般的なゲノム型はε3ホモ接合である。これらの個体は約1.0のε3値を有し、約０のε2およびε4値を有している。図14に示したデータの別の見方は、図15に示したε4値に対するε3値の散乱プ
ロット図である。正規化されているので、ε3およびε4の両方について０値を有
する個体はε2ヘテロ接合の筈である。

【００８５】図14および図15に示したように、84のサンプルは以下のApoEゲノム型を有して
いることが分かった： 1 ε2ホモ接合 57 ε3ホモ接合 3 ε4ホモ接合 9 ε2／ε3ヘテロ接合 11 ε3／ε4ヘテロ接合 3 増幅せず

【００８６】これらの結果は、本アッセイが一連のサンプルについてapoEゲノム型を迅速かつ
正確に決定することができることを示すものである。本アッセイは冠動脈疾患お
よび／または晩発性アルツハイマー疾患のリスクを評価するための診断ツールと
して使用することができる。本発明は、上記で詳述した好ましい実施態様および実施例を参照して開示され
ているが、これらの実施例は説明のためのものであって、限定の意味はない。な
ぜならば、当業者は容易に改変を思いつくことが予想され、それらの改変は本発
明の精神および付属する請求の範囲の範囲内にあるものだからである。

【００８７】

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】図1(A)-1(D)は5'ヌクレアーゼアッセイの工程を示したものである。図1(A)はフォワードおよびリバースプライマーの重合を示したものである。図1(B)は蛍光因子-消光因子プローブの、核酸ポリメラーゼの5'−＞3'ヌクレアーゼ活性による鎖置換を示したものである。図1(C)はポリメラーゼによる蛍光因子の切断を示したものである。図1(D)は標的配列の増幅の完了を示したものである。

【図２】図２は標的配列のゲノム型を単一のアレル部位において同定する
ために5'ヌクレアーゼアッセイがどのように使用できるかを示す。

【図３】図３は図２に示したようなアレル識別実験において観察される蛍
光スペクトルを示す。

【図４】図4A-4Dは２以上の異なるアレル部位に関する蛍光因子−消光因子プローブおよび5'ヌクレアーゼアッセイが、２以上の異なるアレル部位におい
て標的配列のゲノム型決定のためにどのように使用できるかを示したものである
。図4Aは２つのアレル部位を有する標的配列について5'−＞3'ヌクレアーゼ活性
を有する核酸ポリメラーゼおよび前記標的配列にハイブリダイズし得るプライマ
ーを用いて行う核酸増幅反応を示した図である。図4Bは、フォワードおよびリバースプライマーを伸長している核酸ポリメラー
ゼを示す。図4Cは伸長を続けているプライマーおよび鎖置換を行っているポリメラーゼを
示す。図4Dは標的配列から置換される消化されたアレルプローブに結合していた蛍光
因子および消光因子を示す。

【図５】図5A-5Cは２以上の異なるアレル部位に関する蛍光-消光因子プロ
ーブおよび5'ヌクレアーゼアッセイが、２以上の異なるアレル部位において、各
アレル部に対して異なるプライマーを用いて、どのようにゲノム型決定に使用で
きるかを示したものである。図5Aは5'->3'ヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼ、および、異なるDN
A配列にハイブリダイズし得る２つのプライマーを用いて、DNA配列に対して行わ
れる核酸増幅反応を示す。図5Bは、プライマーを伸長し、異なるアレル部位に関する蛍光因子を遊離させ
ている核酸ポリメラーゼを示す。図5Cは、DNAから置換される、消化されるプローブに結合した蛍光因子および消光因子を示す。

【図６Ａ】図6Aおよび6Bはプライマーおよびプローブ間のより長い、また
はより短い距離の影響を示す。図6A二本鎖アンプリコンに対する内側プライマーおよび外側プライマーと共に
二本鎖アンプリコンの配列を示す。

【図６Ｂ】図6Bはプライマーおよびプローブの異なる組合せが使用された
場合に生成される蛍光シグナルを比較した増幅曲線を示す。

【図７】図７は、5'ヌクレアーゼアッセイにおいてGよりもCの多いプロー
ブがよりよく機能することを示す。

【図８】アンプリコン、プライマーおよびプライマーが決定されている図
8Aと図8BはそれぞれアメロゲニンXおよびアメロゲニンYを示す。

【図９】図９はアメロゲニンXの一部とアメロゲニンYの一部との比較を示
し、配列間の記号｜は２つの配列が特定の塩基一で同じヌクレオチドを有するこ
とを示し、配列間の記号−は２つの配列が特定の塩基一で異なるヌクレオチドを
有することを示す。

【図１０】図１０は、5'ヌクレアーゼアッセイによって同定されるアレル
部位（太字で示した）を有するアメロゲニンXの一部（塩基50〜750）を示す。

【図１１】図１１は、図10で示したアメロゲニンXの塩基251〜500をその相補（アンチセンス）鎖と共に示す。

【図１２】図１２は本方法によって選択されたアメロゲニンXアンプリコンを示す。

【図１３】図１３は、apoEアレルε２、ε３およびε4、およびテンプレート無し（NT）サンプルに関しての上述の5'ヌクレアーゼアッセイ実施から得ら
れたスペクトルに対する、FAM、TET、JOEおよびTAMRAの正規化された相対寄与を
示す。

【図１４】図１４は、ApoEゲノム型サンプルに関する、ウエルに対するア
レル値プロットを示す。

【図１５】図１５は、図１４に示したデータに関するε3対ε4のスキャッ
タープロット図を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｍ 33/566 33/566 (72)発明者グッドサイドフェデリコアメリカ合衆国カリフォルニア州 95124 サンホセエレスタードライヴ 4854 Ｆターム(参考） 2G043 AA03 CA04 EA01 EA13 FA03 GA07 GB07 GB21 LA01 4B029 AA23 BB20 4B063 QA13 QA18 QA19 QQ42 QR08 QR14 QR32 QR41 QR46 QR48 QR50 QR56 QR62 QR66 QS25 QS34 QX02 【要約の続き】算すること；および、合成された蛍光スペクトルに対する各蛍光因子の蛍光寄与に基づいて、２以上の異なるアレル部位において異なるアレル変異体の存在又は不存在を決定すること、を含む。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】 DNAサンプル中に、実質的に相同な配列の２以上のセットのどのメンバーが存在しているかを同定する方法であって、実質的に相同な配列の第1のセット、および、実質的に相同な配列の第２の別のセットを含むDNAサンプルに対して、5'->3'ヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼおよび前記DNAサンプルにハイブリダイズすることのできるフォワードおよびリバースプライマーの１以上のセットを用いて、オリゴヌクレオチドプ
ローブの２以上のセットの存在下で核酸増幅を行ない、実質的に相同な配列のセ
ットの増幅を行なうことであって、実質的に相同な配列の各セットが、互いに少なくとも１つの塩基位置で
異なっている２以上のメンバーを含み、前記オリゴヌクレオチドプローブの各セットが、実質的に相同な配列のセ
ットの１つに属するメンバーを検出するためのものであり、前記オリゴヌクレオチドプローブの各セットが、実質的に相同な配列のセ
ットの異なるメンバーに相補的である２以上のプローブを含み、前記メンバーが
前記プライマーのハイブリダイズするDNAサンプルの配列に対して5'にあり、前記オリゴヌクレオチドプローブは、少なくとも、１つを除いて他のプロ
ーブと異なる蛍光因子、および前記蛍光因子の蛍光を消光するために前記プロー
ブ上に設けられた消光因子を含むものである、前記増幅を行なうこと；標的配列にハイブリダイズするこれらのオリゴヌクレオチドプローブをポリメ
ラーゼのヌクレアーゼ活性によって増幅中に消化すること；前記増幅の蛍光スペクトルを検出すること；前記蛍光スペクトルに対する前記各蛍光因子の蛍光の寄与を計算すること；お
よび、前記蛍光スペクトルに対する前記各蛍光因子の寄与に基づいて、実質的に相同
な配列の異なるメンバーが存在することまたは存在しないことを決定すること；を含む、前記方法。
【請求項２】核酸増幅が受動的内部標準の存在下で行なわれる、請求項１
に記載の方法。
【請求項３】受動的内部標準がROXである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】全てのオリゴヌクレオチドプローブが異なる蛍光因子を有す
る、請求項１に記載の方法。
【請求項５】核酸増幅が、約４〜6mM MgCl₂を含む反応混合物中で行なわれる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】核酸増幅が、グリセロールを含む反応混合物中で行なわれる
、請求項１に記載の方法。
【請求項７】核酸増幅がゼラチンおよびTWEEN20からなる群のメンバーの少なくとも１つを含む反応混合物中で行なわれる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】核酸増幅が、約７〜９％グリセロール、0.04〜0.06％ゼラチ
ン、および0.005〜0.015％TWEEN20を含む反応混合物中で行なわれる、請求項１に記載の方法。
【請求項９】核酸増幅が、約７〜９％グリセロール、0.04〜0.06％ゼラチ
ン、0.005〜0.015％TWEEN20および25-75mMトリスバッファーを含む反応混合物中
で行なわれる、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】核酸増幅が、約７〜９％グリセロール、0.04〜0.06％ゼラ
チン、0.005〜0.015％TWEEN20、25〜75mMトリスバッファー、pH8.0、４〜６mM M
gCl₂、175〜225μM dATP、175〜225μM dCTP、175〜225μM デアザdGTP、350〜4
50μM dUTP、0.045〜0.055U/μl AMPLITAQ^TM Gold、0.5〜0.015U/μl AmpErase
UNG、および57〜63nMの受動的リファレンスを含む反応混合物中で行なわれる、
請求項１に記載の方法。
【請求項１１】フォワードおよびリバースプライマーの１以上のセットが
約50〜150塩基長のアンプリコンを規定する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】フォワードおよびリバースプライマーの１以上のセットが
約100塩基長未満のアンプリコンを規定する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】全てのプローブの％GCが少なくとも約20％、かつ約80％未
満である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】いずれのプローブも４以上の隣接するグアニンを有してい
ない、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】全てのプローブが増幅に使用するアニーリング温度よりも
３〜５℃高い融解温度を有し、プライマー融解温度が前記アニーリング温度より
も約２〜４℃低い、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】アニーリング温度が約60〜64℃である、請求項１５に記載
の方法。
【請求項１７】全てのプローブが約65〜67℃の融解温度を有する、請求項
１に記載の方法。
【請求項１８】プライマー融解温度が約58〜60℃である、請求項17に記載
の方法。
【請求項１９】全てのプローブが、プライマーの融解温度よりも約５〜10
℃高い融解温度を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】全てのプローブがプライマーの融解温度よりも約７℃高い
融解温度を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】いずれのプローブも5'末端にグアニンを有しない、請求項
１に記載の方法。
【請求項２２】 3'末端の５つのヌクレオチドがグアニンまたはシトシンを
２以下しか有しない、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】プローブの少なくとも１つがそれ自身にハイブリダイズし
てヘアピンを形成する、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】少なくとも１つのプローブ上の蛍光因子が、配列にハイブ
リダイズした場合に、ハイブリダイズしない場合および非-ヘアピン状態の1本鎖
形態にある場合よりも強い蛍光を放射する、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】少なくとも１つの蛍光因子がエネルギー転移色素である、
請求項１に記載の方法。
【請求項２６】少なくとも２つのアレル部位において、5'ヌクレアーゼ増
幅反応によってDNAサンプルのゲノム型を決定する方法であって、少なくとも２つの異なるアレル部位を有するDNAサンプルについて、5'->3'ヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼおよび前記DNAサンプルにハイブリダイズすることのできるフォワードおよびリバースプライマーの少なくとも１つの
セットを用いて、アレルオリゴヌクレオチドプローブの２以上のセットの存在下
で核酸増幅を行ない、前記少なくとも２つの異なるアレル部位を増幅することで
あって、前記アレルオリゴヌクレオチドプローブの各セットは、異なるアレル部位
を検出するためのものであり、前記アレルオリゴヌクレオチドプローブの各セットは、前記プローブセッ
トによって検出されるアレル部位において異なるアレル変異体に相補的である２
以上のプローブを含み、前記アレル部位は前記プライマーがハイブリダイズする
サンプルDNA配列に対して5'にあり、少なくとも、１つを除いて全てのアレルオリゴヌクレオチドプローブが他の
プローブと異なる蛍光因子、および前記蛍光因子の蛍光を消光すべく前記プロー
ブ上に置かれた消光因子を有するものである、前記増幅を行なうこと；標的配列にハイブリダイズするアレルオリゴヌクレオチドをポリメラーゼのヌ
クレアーゼ活性によって増幅中に消化すること；前記増幅の蛍光スペクトルを検出すること；前記蛍光スペクトルに対する前記各蛍光因子の蛍光寄与を計算すること；およ
び、前記蛍光スペクトルに対する前記各蛍光因子の蛍光寄与に基づいて、２以上の
異なるアレル部位において、異なるアレル変異が存在するか、または存在しない
かを決定すること、を含む、前記方法。
【請求項２７】少なくとも２つの異なるアレル部位がDNAの単一鎖上にあり、フォワードおよびリバースプライマーの単一セットによって増幅される、請
求項２６に記載の方法。
【請求項２８】少なくとも２つの異なるアレル部位がDNAの単一鎖上にあり、各アレル部位がフォワードおよびリバースプライマーの異なるセットによっ
て増幅される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】少なくとも２つの異なるアレル部位がDNAの別々の鎖上にあり、各アレル部位がフォワードおよびリバースプライマーの異なるセットによ
って増幅される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】核酸増幅が受動的内部標準の存在下に行なわれる、請求項
２６に記載の方法。
【請求項３１】受動的内部標準がROXである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】全てのオリゴヌクレオチドプローブが異なる蛍光因子を有
する、請求項２６に記載の方法。
【請求項３３】核酸増幅が約４〜６m MgCl₂を含む反応混合物中で行なわれる、請求項２６に記載の方法。
【請求項３４】核酸増幅がグリセロールを含む反応混合物中で行なわれる
、請求項２６に記載の方法。
【請求項３５】核酸増幅がゼラチンおよびTWEEN20からなる群の少なくとも１つのメンバーを含む反応混合物中で行なわれる、請求項２６に記載の方法。
【請求項３６】核酸増幅が、約７〜９％グリセロール、0.04〜0.06％ゼラ
チン、および0.005〜0.015％ TWEEN20を含む反応混合物中で行なわれる、請求項
２６に記載の方法。
【請求項３７】核酸増幅が、約７〜９％グリセロール、0.04〜0.06％ゼラ
チン、0.005〜0.015％TWEEN20および25〜75mMトリスバッファーpH8.0を含む反応
混合物中で行なわれる、請求項２６に記載の方法。
【請求項３８】核酸増幅が、約７〜９％グリセロール、0.04〜0.06％ゼラ
チン、0.005〜0.015％TWEEN20、25〜75mMトリスバッファーpH8.0、４〜６mM MgC
l₂、175〜225μM dATP、175〜225μM dCTP、175〜225μM dGTP、350〜450μM dU
TP、0.045〜0.055U/μl AMPLITAQ^TM Gold、0.5〜0.015U/μl AmpErase UNGおよび57〜63nMの受動的リファレンスを含む反応混合物中で行なわれる、請求項２６
に記載の方法。
【請求項３９】フォワードおよびリバースプライマーが約50〜150塩基長のアンプリコンを規定する、請求項２６に記載の方法。
【請求項４０】フォワードおよびリバースプライマーの１以上のセットが
約100塩基長未満のアンプリコンを規定する、請求項２６に記載の方法。
【請求項４１】全てのプローブの％GCが約20％であり、かつ約80％未満で
ある、請求項２６に記載の方法。
【請求項４２】４以上の隣接グアニン請求項２６に記載の方法。
【請求項４３】全てのプローブが、増幅に用いられるアニーリング温度よ
りも３〜５℃高い融解温度を有し、プライマーの融解温度が前記アニーリング温
度よりも約２〜４℃低い、請求項２６に記載の方法。
【請求項４４】アニーリング温度が約60〜64℃である、請求項４３に記載
の方法。
【請求項４５】融解温度が約65〜67℃である、請求項２６に記載の方法。
【請求項４６】プライマー融解温度が約58〜60℃である、請求項４５に記
載の方法。
【請求項４７】融解温度がプライマーの融解温度よりも５〜10℃高い、請
求項２６に記載の方法。
【請求項４８】全てのプローブがプライマーの融解温度よりも約７℃高い
融解温度を有する、請求項２６に記載の方法。
【請求項４９】 5'末端にグアニンの、請求項２６記載の方法。
【請求項５０】プライマーの3'末端の５つのヌクレオチドがグアニンまた
はシトシンを２以下しか含まない、請求項２６に記載の方法。
【請求項５１】プローブの少なくとも一つがそれ自身とハイブリダイズし
てヘアピンを形成する、請求項２６に記載の方法。
【請求項５２】プローブの一つが、配列にハイブリダイズしない場合およ
び非ヘアピン形の一本鎖形態にある場合よりも、配列にハイブリダイズした場合
の方が強い蛍光シグナルを放射する、請求項２６に記載の方法。
【請求項５３】少なくとも一つの蛍光因子がエネルギー転移色素である、
請求項２６に記載の方法。
【請求項５４】 5'ヌクレアーゼ増幅反応によって２つのアレル部位におい
てDNAサンプルのゲノム型決定を行なうための方法であって、少なくとも２つの異なるアレル部位を有するサンプルDNAについて、5'->3'ヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼ、および前記サンプルDNAにハイブリダイズし得るフォワードおよびリバースプライマーの少なくとも１つのセットを
用いて、アレルオリゴヌクレオチドプローブの２以上のセットの存在下で核酸増
幅を行ない、前記少なくとも２つのアレル部位を増幅することであって、前記アレルオリゴヌクレオチドプローブの各セットは、異なるアレル部位
を検出するためのものであり、前記アレルオリゴヌクレオチドプローブの各セットは、前記プローブセッ
トによって検出されるアレル部位において異なるアレル変異体に相補的である２
以上のプローブを含み、前記アレル部位は前記プライマーがハイブリダイズする
配列の5'にあり、少なくとも、１つを除いて全てのアレルオリゴヌクレオチドプローブは他
のプローブと異なる蛍光因子、および前記蛍光因子の蛍光を消光するために前記
プローブ上に置かれた消光因子を含むものである、前記増幅を行なうこと；前記サンプルDNAにハイブリダイズしているこれらのアレルオリゴヌクレオチドプローブを増幅中にポリメラーゼのヌクレアーゼ活性によって消化すること；前記増幅の蛍光スペクトルを検出すること；前記蛍光スペクトルに対する前記各蛍光因子の蛍光寄与を計算すること；前記蛍光スペクトルに対する前記異なる蛍光因子の蛍光寄与に基づいて、少な
くとも２つの異なるアレル部位におて標的配列のゲノム型を決定すること、を含む、前記方法。
【請求項５５】少なくとも２つのアレル部位においてDNAサンプルのゲノム型を決定するための蛍光スペクトルであって、少なくとも２つの異なるアレル部位を有するDNAについて、5'->3'ヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼおよび前記DNAサンプルにハイブリダイズすることができるプライマーを用いて、アレルオリゴヌクレオチドプローブの２以上
のセットの存在下で核酸増幅を行なったことから導かれる蛍光スペクトルであっ
て、前記アレルオリゴヌクレオチドプローブの各セットが異なるアレル部位を検
出するためのものであり、前記アレルオリゴヌクレオチドプローブの各セットが、前記プローブセット
により検出されるアレル部位において異なるアレル変異体に相補的である２以上
のプローブを含み、前記アレル部位は前記プライマーがハイブリダイズする配列
の5'にあり、少なくとも、１つを除いて全てのプローブが他のプローブと異なる蛍光因子
、および前記蛍光因子の蛍光を消光するために前記プローブ上に置かれた消光因
子を含むものである、前記蛍光スペクトル。
【請求項５６】少なくとも２つの異なるアレル部位が単一のDNA鎖上に存在し、フォワードおよびリバースプライマーの単一セットによって増幅される、
請求項５５に記載のスペクトル。
【請求項５７】少なくとも２つの異なるアレル部位が単一のDNA鎖上に存在し、各アレル部位がフォワードおよびリバースプライマーの異なるセットによ
って増幅される、請求項５５に記載の蛍光スペクトル。
【請求項５８】少なくとも２つの異なるアレル部位が別々のDNA鎖上にあり、各アレル部位がフォワードおよびリバースプライマーの異なるセットによっ
て増幅される、請求項５５に記載の蛍光スペクトル。
【請求項５９】核酸増幅が受動的内部標準の存在下で行なわれる、請求項
５５に記載の蛍光スペクトル。
【請求項６０】受動的内部標準がROXである、請求項５９に記載の蛍光スペクトル。
【請求項６１】全てのオリゴヌクレオチドプローブが異なる蛍光因子を含
む、請求項５５に記載のスペクトル。
【請求項６２】フォワードおよびリバースプライマーが約50〜150塩基長のアンプリコンを規定する、請求項５５に記載のスペクトル。
【請求項６３】フォワードおよびリバースプライマーの１以上のセットが
約100塩基長未満のアンプリコンを規定する、請求項５５に記載のスペクトル。
【請求項６４】蛍光因子の少なくとも１つがエネルギー転移色素である、
請求項５５に記載のスペクトル。
【請求項６５】少なくとも２つのアレル部位においてDNAサンプルのゲノム型を決定するための蛍光シグネチャーであって、 5'->3'ヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼおよび前記DNAサンプルにハイブリダイズすることのできるフォワードおよびリバースプライマーを用いて
、アレルオリゴヌクレオチドプローブの２以上のセットの存在下でDNAサンプルについて核酸増幅を行ない、前記少なくとも２つの異なるアレル部位を増幅した
ことから導かれる蛍光スペクトルに対する少なくとも３種の蛍光因子の蛍光シグ
ナル寄与を含み、前記アレルオリゴヌクレオチドプローブの各セットが異なるアレル部位を
検出するためのものであり、前記アレルオリゴヌクレオチドプローブの各セットは、前記プローブセッ
トによって検出されるアレル部位において異なるアレル変異体に相補的である２
以上のプローブを含み、前記アレル部位は前記プライマーがハイブリダイズする
配列に対して5'にあり、少なくとも、１つを除いて全てのオリゴヌクレオチドプローブが他のプロ
ーブと異なる蛍光因子、および前記蛍光因子の蛍光を消光するために前記プロー
ブ上におかれた消光因子を含むものである、前記蛍光シグネチャー。
【請求項６６】少なくとも２つの異なるアレル部位がDNAの単一鎖上にあり、フォワードおよびリバースプライマーの単一セットによって増幅される、請
求項に６５記載の蛍光シグネチャー。
【請求項６７】少なくとも２つの異なるアレル部位がDNAの単一鎖上にあり、各アレル部位がフォワードおよびリバースプライマーの異なるセットによっ
て増幅される、請求項６５に記載の蛍光シグネチャー。
【請求項６８】少なくとも２つの異なるアレル部位がDNAの別々の鎖上に存在し、各アレル部位がフォワードおよびリバースプライマーの異なるセットに
よって増幅される、請求項６５に記載の蛍光シグネチャー。
【請求項６９】核酸増幅が受動的内部標準の存在下で行なわれる、請求項
６５に記載の蛍光シグネチャー。
【請求項７０】受動的内部標準がROXである、請求項６９に記載の蛍光シグネチャー。
【請求項７１】全てのオリゴヌクレオチドプローブが異なる蛍光因子を有
する、請求項６５に記載の蛍光シグネチャー。
【請求項７２】フォワードおよびリバースプライマーが約50〜150塩基長のアンプリコンを規定するものである、請求項６５に記載の蛍光シグネチャー。
【請求項７３】フォワードおよびリバースプライマーの１以上のセットが
約100塩基長未満のアンプリコンを規定するものである、請求項６５に記載の蛍光シグネチャー。
【請求項７４】蛍光因子の少なくとも一つがエネルギー転移色素である、
請求項６５に記載の蛍光シグネチャー。
【請求項７５】少なくとも２つのアレル部位においてDNAサンプルのゲノム型を決定するための蛍光シグネチャーのライブラリであって、少なくとも２つの異なるアレル部位において既知のアレル変異体を有する一連
のコントロール配列について、5'->3'ヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラー
ゼおよび前記DNAサンプルにハイブリダイズすることのできるフォワードおよびリバースプライマーを用いて、アレルオリゴヌクレオチドプローブの２以上のセ
ットの存在下で核酸増幅を行ない、前記少なくとも２つの異なるアレル部位を増
幅したことから導かれる一連の蛍光スペクトルに対する少なくとも３種の蛍光因
子の蛍光シグナル寄与を含み、前記アレルオリゴヌクレオチドプローブの各セットは異なるアレル部位を
検出するためのものであり、前記アレルオリゴヌクレオチドプローブの各セットは、前記プローブセッ
トによって検出されるアレル部位において異なるアレル変異体に相補的である２
以上のプローブを含み、前記アレル部位は前記プライマーがハイブリダイズする
配列に対して5'にあり、少なくとも、１つを除いて全てのオリゴヌクレオチドプローブが他のプロ
ーブと異なる蛍光因子、および前記蛍光因子の蛍光を消光するために前記プロー
ブ上におかれた消光因子を含むものである、前記ライブラリー。
【請求項７６】 DNAサンプルの蛍光シグネチャーを決定する方法であって、少なくとも２つの異なるアレル部位を有するDNAサンプルについて、5'->3'ヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼおよび前記DNAサンプルにハイブリダイズすることのできるプライマーを用いて、アレルオリゴヌクレオチドプローブ
の２以上のセットおよび内部標準の存在下で核酸増幅を行ない、前記少なくとも
２つの異なるアレル部位を増幅することから得られる蛍光スペクトルに対する少
なくとも３種の蛍光因子の蛍光寄与を計算することであって、前記アレルオリゴヌクレオチドプローブの各セットは異なるアレル部位を
検出するためのものであり、前記アレルオリゴヌクレオチドプローブの各セットは、前記プローブセッ
トによって検出されるアレル部位において異なるアレル変異体に相補的である２
以上のプローブを含み、前記アレル部位はプライマーがハイブリダイズする配列
に対して5'にあり、少なくとも、１つを除いて全てのオリゴヌクレオチドプローブが他のプロ
ーブと異なる蛍光因子、および前記蛍光因子の蛍光を消光するために前記プロー
ブ上におかれた消光因子を含むものである、前記計算を行なうこと；および、各蛍光因子の前記蛍光寄与を内部標準に対して正規化すること、を含み、前記正規化蛍光寄与が前記少なくとも２つの異なるアレル部位に関する
DNAサンプルの蛍光シグネチャーに対応するものである、前記方法。
【請求項７７】２以上の異なるアレル部位にてDNAサンプルのゲノム型を決定する方法であって、少なくとも２つの異なるアレル部位を有する標的配列について、5'->3'ヌクレ
アーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼおよび前記DNAサンプルにハイブリダイズすることのできるプライマーを用いて、アレルオリゴヌクレオチドプローブの２
以上のセットおよび内部標準の存在下で核酸増幅を行ない、前記２以上の異なる
アレル部位を増幅することから得られる蛍光スペクトルに対する少なくとも３種
の蛍光因子の蛍光寄与を計算することであって、前記アレルオリゴヌクレオチドプローブの各セットが異なるアレル部位
を検出するためのものであり、前記アレルオリゴヌクレオチドプローブの各セットは、前記プローブセ
ットによって検出されるアレル部位において異なるアレル変異体に相補的である
２以上のプローブを含み、前記アレル部位はプライマーがハイブリダイズする配
列に対して5'にあり、少なくとも、１つを除いて全てのオリゴヌクレオチドプローブが他のプローブ
と異なる蛍光因子、および前記蛍光因子の蛍光を消光するために前記プローブ上
におかれた消光因子を含むものである、前記計算を行なうこと；各蛍光因子の前記蛍光寄与を内部標準に対して正規化することであって、前記
正規化蛍光寄与が前記少なくとも２つの異なるアレル部位に関するDNAサンプルの蛍光シグネチャーに対応するものとなる、前記正規化を行なうこと；および、前記DNAサンプルの前記正規化蛍光寄与を少なくとも２つのアレル部位にて既知のゲノム型を有するコントロール配列の正規化蛍光寄与と比較することにより
、少なくとも２つのアレル部位にてDNAサンプルのゲノム型を決定することを含む、前記方法。
【請求項７８】少なくとも２つの異なるアレル部位にて5'ヌクレアーゼア
ッセイを用いてDNAサンプルのゲノム型を決定する処理装置であって、少なくとも２つのアレル部位に対するアレルプローブの存在下で5'ヌクレアー
ゼアッセイを行ったコントロールサンプルおよび少なくとも１つの未知サンプル
の蛍光スペクトル、および前記5'ヌクレアーゼアッセイで使用された少なくとも
３種の蛍光因子の蛍光スペクトルをとり、前記スペクトルを用いて、前記少なく
とも３種の蛍光因子の前記未知サンプルの蛍光スペクトルおよびコントロール蛍
光スペクトルに対する正規化蛍光寄与を計算するためのロジック；および、前記少なくとも３種の蛍光因子の前記未知サンプルおよび前記コントロールサ
ンプルのスペクトルに対する前記正規化蛍光寄与の比較に基づいて、２以上の異
なるアレル部位において少なくとも１つの未知サンプルのゲノム型を決定するた
めのロジック、を備えた前記処理装置。
【請求項７９】実質的に相同な配列の２以上のセットのどのメンバーがDN
Aサンプル中に存在しているかを同定するためのキットであって、オリゴヌクレオチドプローブの２以上のセットを含み、前記オリゴヌクレオチドプローブの各セットは実質的に相同な配列のセッ
トの１つに属するメンバーを検出するためのものであり、前記オリゴヌクレオチドプローブの各セットは、実質的に相同な配列のセ
ットの異なるメンバーに相補的である２以上のプローブを含み、各メンバーはそ
のセット中の他のメンバーと少なくとも一つの塩基位置で異なっており、少なくとも、一つを除いてオリゴヌクレオチドプローブは他のプローブと
異なる蛍光因子および前記蛍光因子の蛍光を消光するために前記プローブ上にお
かれた消光因子を有するものである、前記キット。
【請求項８０】更にフォワードおよびリバースプライマーの１以上のセッ
トを含む、請求項７９に記載のキット。
【請求項８１】フォワードおよびリバースプライマーの各セットが約50〜
150塩基長のアンプリコンを規定するものである、請求項８０に記載のキット。
【請求項８２】フォワードおよびリバースプライマーの各セットが約100 塩基長未満のアンプリコンを規定するものである、請求項８０に記載のキット。
【請求項８３】全てのプローブが増幅に使用するアニーリング温度よりも
３〜５℃高い融解温度を有し、プライマーの融解温度が前記アニーリング温度よ
りも２〜４℃低い、請求項８０記載のキット。
【請求項８４】プライマーが約58〜60℃の融解温度を有する、請求項８０
記載のキット。
【請求項８５】全てのプローブがプライマーの融解温度よりも約５〜10℃
高い融解温度を有する、請求項８０に記載のキット。
【請求項８６】全てのプローブがプライマーの融解温度よりも約７℃高い
融解温度を有する、請求項８０に記載のキット。
【請求項８７】すべてのプローブの％GCが少なくとも約20％、かつ約80％
未満である、請求項７９に記載のキット。
【請求項８８】いずれのプローブも４つ以上の隣接グアニンを有しない、
請求項７９に記載のキット。
【請求項８９】全てのプローブが約65〜67℃の融解温度を有する、請求項
７９に記載のキット。
【請求項９０】いずれのプローブも5'末端にグアニンを有しない、請求項
７９に記載のキット。
【請求項９１】蛍光因子の少なくとも１つがエネルギー転移色素である、
請求項７９に記載のキット。
【請求項９２】少なくとも２つのアレル部位でDNAサンプルのゲノム型を決定するためのキットであって、アレルオリゴヌクレオチドプローブの２以上のセットを含み、前記アレルオリゴヌクレオチドプローブの各セットは異なるアレル部位を検
出するためのものであって、前記アレルオリゴヌクレオチドプローブの各セットは前記プローブセットに
よって検出されるアレル部位における異なるアレル変異体に相補的である２以上
のプローブを含み、前記アレル部位は前記プライマーがハイブリダイズする配列
に対して5'にあり、少なくとも、１つを除いて全てのアレルオリゴヌクレオチドプローブが他の
プローブと異なる蛍光因子、および前記蛍光因子の蛍光を消光するために前記プ
ローブ上におかれた消光因子を有しているものである、前記キット。
【請求項９３】さらにフォワードおよびリバースプライマーの1以上のセットを含む、請求項９２記載のキット。
【請求項９４】フォワードおよびリバースプライマーの各セットは約50〜
150塩基長のアンプリコンを規定するものである、請求項９３に記載のキット。
【請求項９５】フォワードおよびリバースプライマーの各セットは約100 塩基長未満のアンプリコンを規定するものである請求項９３に記載のキット。
【請求項９６】全てのプローブが増幅に使用するアニーリング温度よりも
約３〜５℃高い融解温度を有し、プライマー融解温度が前記アニーリング温度よ
りも約２〜４℃低い、請求項９３に記載のキット。
【請求項９７】プライマーが約58〜60℃の融解温度を有する、請求項９３
に記載のキット。
【請求項９８】全てのプローブがプライマーの融解温度よりも約５〜10℃
低い融解温度を有している、請求項９３に記載のキット。
【請求項９９】全てのプローブがプライマーの融解温度よりも７℃高い融
解温度を有している、請求項９３に記載のキット。
【請求項１００】全てのプローブの％GCが少なくとも約20％であり、かつ
、約80％未満である、請求項９２に記載のキット。
【請求項１０１】いずれのプローブも４以上の隣接するグアニンを有しな
い、請求項９２に記載のキット。
【請求項１０２】全てのプローブが約65〜67℃の融解温度を有する、請求
項９２に記載のキット。
【請求項１０３】 5'末端にグアニンを有するプローブが存在しない、請求
項９２に記載のキット。
【請求項１０４】蛍光因子の少なくとも１つがエネルギー転移色素である
、請求項９２に記載のキット。
【請求項１０５】 14〜18％グリセロール、0.04〜0.06％ゼラチン、および
0.01〜0.03％ TWEEN20を含む反応混合物を含む、5'ヌクレアーゼアッセイを行な
うためのキット。
【請求項１０６】更に25〜75mMのトリスバッファーを含む、請求項１０５
に記載のキット。
【請求項１０７】さらに、４〜６mM MgCl₂、175〜225μM dATP、175〜225
μM dCTP、175〜225μMデアザdGTP、350〜450μM dUTP、0.045〜0.055U/μl AMP
LITAQ^TM GOld、0.5〜0.015U/μl AmpErase UNG、および57〜63nMの受動的レファ
レンスを含む、請求項１０６に記載のキット。