JP2018139536A - 核酸検出用オリゴヌクレオチド - Google Patents

Abstract

【課題】微量の標的核酸を高感度に検出可能な核酸検出用オリゴヌクレオチドを提供する。【解決手段】核酸検出用オリゴヌクレオチド５は第１〜第３オリゴヌクレオチド１〜３ｄを含む。第１オリゴヌクレオチド１はオリゴヌクレオチド５のうち最上流側に結合し、５’末端の１塩基以上が鋳型核酸１００ａと相補的配列を有し、第２オリゴヌクレオチド２はオリゴヌクレオチド５のうち最下流側に結合し、３’末端の１塩基以上が鋳型核酸１００ａと相補的配列を有する。第３オリゴヌクレオチド３ａ〜３ｄは第１、第２オリゴヌクレオチド１、２が結合する領域の間に結合し、５’及び３’末端以外の１塩基以上が鋳型核酸１００ａと相補的配列を有する。第１〜第３オリゴヌクレオチド１〜３ｄのうち隣接するオリゴヌクレオチドは一方から見て上流側のオリゴヌクレオチドの５’末端と、他方から見て下流側のオリゴヌクレオチドの３’末端の１塩基以上が相補的配列を有する。【選択図】図１

Description

本開示は、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法により得られる特定の標的核酸を検出するための核酸検出用オリゴヌクレオチドに関する。

臨床や病理学等の様々な分野において、遺伝子の発現解析、機能解析、診断等を目的として、ＰＣＲ法が広く利用されている。ＰＣＲは、一般に、（１）熱処理により二本鎖核酸を一本鎖核酸に解離するステップ、（２）一本鎖核酸（鋳型核酸）にプライマをアニーリングさせる（鋳型核酸にプライマを結合させる）ステップ、及び（３）核酸ポリメラーゼを用いて上記プライマの伸長生成物を形成する（一本鎖と相補的な核酸が合成される）ステップ、の３つのステップを１サイクルとして、このサイクルを繰り返すことにより、目的の遺伝子配列を指数関数的に増幅させることができる。

中でも、リアルタイムＰＣＲ（Ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ）は、核酸の増幅量を経時的に（リアルタイムに）モニターし解析する手法として、ｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）発現解析、ＳＮＰ（Ｓｉｎｇｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）解析、感染症診断等様々な目的で広く利用されている。リアルタイムＰＣＲでは、サイクル数とＰＣＲ最終産物の量（最終的な核酸の増幅量）から既知のスタンダードとの比較により目的遺伝子の初期量を算出する。ＰＣＲ最終産物は、光学的に定量される。例えば、一本鎖と相補的な核酸が合成される際に、標的核酸に結合した蛍光プローブが分解されて発光された蛍光を測定する。

また、従来のＰＣＲ法の１つとして、特許文献１は、標的核酸中の特定塩基配列に相補的な配列を有し、該標的核酸と結合した場合に蛍光を発する、インターカレーター性蛍光色素で標識した核酸プローブ（インターカレーター性の蛍光プローブ）を用いる方法を開示している。該方法によれば、該プローブが標的核酸と相補結合を形成することで測定可能な蛍光を発するため、試料中の特定塩基配列を含む一本鎖ＲＮＡについて、反応液を急激に昇温及び降温するという操作を繰り返すことなく、概ね一定温度で蛍光を測定することが可能となる。

特開２０００−０１４４００号公報

しかしながら、特許文献１に開示される従来技術では、上述した利点があるものの、図５に示すように、鋳型核酸の初期濃度が低くなるほどＰＣＲ産物の増幅曲線は立ち上がりが遅くなり、さらに、指数関数的な増加が見られない。そのため、鋳型核酸の初期濃度が低い（微量である）と、ＰＣＲ最終産物が発する蛍光を検出することができないという問題がある。

そこで、本開示は、微量の標的核酸を高感度に検出が可能となる核酸検出用オリゴヌクレオチドを提供することを目的とする。

上記目的を達成するために、本開示の一形態に係る核酸検出用オリゴヌクレオチドは、鋳型核酸に結合する、蛍光物質及び消光物質により修飾された核酸検出用オリゴヌクレオチドであって、核酸検出用オリゴヌクレオチドは、少なくとも第１オリゴヌクレオチド、第２オリゴヌクレオチド、及び第３オリゴヌクレオチドを含み、第１オリゴヌクレオチドは、鋳型核酸に結合する核酸検出用オリゴヌクレオチドのうち最も３’末端側に結合し、５’末端の少なくとも１つの塩基が鋳型核酸と相補的配列を有しており、第２オリゴヌクレオチドは、鋳型核酸に結合する核酸検出用オリゴヌクレオチドのうち最も５’末端側に結合し、３’末端の少なくとも１つの塩基が鋳型核酸と相補的配列を有しており、第３オリゴヌクレオチドは、第１オリゴヌクレオチドと第２オリゴヌクレオチドとが鋳型核酸にそれぞれ結合する領域の間の領域に結合し、５’末端及び３’末端以外の少なくとも１つの塩基が鋳型核酸と相補的配列を有しており、第１オリゴヌクレオチド、第２オリゴヌクレオチド、及び第３オリゴヌクレオチドのうち隣接して鋳型核酸に結合するオリゴヌクレオチドは、一方から見て鋳型核酸の５’末端側にあるオリゴヌクレオチドの５’末端と、他方から見て鋳型核酸の３’末端側にあるオリゴヌクレオチドの３’末端の少なくとも１つの塩基が相補的配列を有する。

本開示によれば、微量の標的核酸を高感度に検出することが可能となる核酸検出用オリゴヌクレオチドを提供できる。

実施の形態に係る核酸検出用オリゴヌクレオチドが鋳型核酸に結合した状態を示す模式図 実施の形態に係る核酸検出用オリゴヌクレオチドの結合部位を示す模式図 実施の形態に係る核酸検出用オリゴヌクレオチドが鋳型核酸に結合する過程を示す図 実施の形態に係る核酸検出用オリゴヌクレオチドが蛍光を発する様子を説明する図 従来技術におけるＰＣＲ増幅曲線

以下、本開示の実施の形態について、図面を参照しながら説明する。なお、以下に説明する実施の形態は、いずれも本開示の好ましい一具体例を示すものである。したがって、以下の実施の形態で示される、数値、形状、材料、構成要素、構成要素の配置位置及び接続形態、並びに、ステップ及びステップの順序などは、一例であって本開示を限定する主旨ではない。よって、以下の実施の形態における構成要素のうち、本開示の最上位概念を示す独立請求項に記載されていない構成要素については、任意の構成要素として説明される。

なお、各図は、模式図であり、必ずしも厳密に図示されたものではない。また、各図において、実質的に同一の構成に対しては同一の符号を付しており、重複する説明は省略又は簡略化する。

（実施の形態）
以下、本実施の形態に係る核酸検出用オリゴヌクレオチドについて、図面を参照して説明する。

本開示における「上流側」とは塩基配列の領域内で３’末端側を、「下流側」とは塩基配列の領域内で５’末端側を意味する。

また、本開示における「核酸」とは、ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）及びＲＮＡ（リボ核酸）を意味する。

［Ａ．核酸検出用オリゴヌクレオチド］
以下、本実施の形態に係る核酸検出用オリゴヌクレオチドについて、図１〜図４を用いて説明する。

図１は、本実施の形態に係る核酸検出用オリゴヌクレオチド５が鋳型核酸１００ａに結合した状態を示す模式図である。図２は、本実施の形態に係る核酸検出用オリゴヌクレオチド５の結合部位２１、２２、２３ａ〜２３ｄ、３０ａ〜３０ｅを示す模式図である。図３は、本実施の形態に係る核酸検出用オリゴヌクレオチド５が鋳型核酸１００ａに結合する様子を説明する図である。図４は、本実施の形態に係る核酸検出用オリゴヌクレオチド５が蛍光を発する様子を説明する図である。

なお、以下、核酸検出用オリゴヌクレオチド５を、単に、オリゴヌクレオチド５と称する場合がある。

［Ａ−１．核酸検出用オリゴヌクレオチドの基本構造］
図１〜図３に示すように、本実施の形態に係る核酸検出用オリゴヌクレオチド５は、その両端を蛍光物質１０及び消光物質１１により修飾されたオリゴヌクレオチドである。核酸検出用オリゴヌクレオチド５においては、蛍光物質１０と消光物質１１とが近接しているため、蛍光物質１０の有する蛍光シグナルを発する機能が、消光物質１１によって妨げられている。しかしながら、図４に示すように、ＤＮＡの伸長反応の過程で、鋳型核酸１００ａに結合した核酸検出用オリゴヌクレオチド５は、例えば、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼの有する５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により分解され、核酸検出用オリゴヌクレオチド５に修飾されていた蛍光物質１０及び消光物質１１は、相互に空間的に分離されるため、蛍光物質１０が蛍光シグナルを発する。この蛍光シグナルの強さは、増幅された標的核酸の分子数に比例する。

［Ａ−１−１．蛍光物質及び消光物質］
本実施の形態に係る核酸検出用オリゴヌクレオチド５を修飾する蛍光物質１０は、核酸増幅工程中に分解又は蛍光が減衰しなければよい。蛍光物質１０としては、特に限定されないが、例えば、フルオロセイン又はその誘導体（例えば、ＦＡＭ（カルボキシフルオレセイン）、ＪＯＥ（６−カルボキシ−４’,５’−ジクロロ２’,７’−ジメトキシフルオレセイン）、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）、ＴＥＴ（テトラクロロフルオレセイン）、ＨＥＸ（５'−ヘキサクロロ−フルオレセイン−ＣＥホスホロアミダイト））、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）シリーズ、ローダミン又はその誘導体（例えば、５−カルボキシローダミン６Ｇ（ＣＲ６Ｇ）やテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ））、Ｃｙ（登録商標）色素（例えば、Ｃｙ３、Ｃｙ５）等を使用してもよい。蛍光色素１０の核酸検出用オリゴヌクレオチド５への結合方法は、通常の方法に従って行うことができる。蛍光物質１０の消光を利用すれば、インターカレーターなどの他の二重鎖核酸構造への挿入色素を用いることなく、また、ＦＲＥＴ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ）現象を起こす２種類のプローブを用いることなく、１種類の蛍光物質に標識されたプローブを用いて単純かつ特異的に標的核酸配列を検出することができる。核酸検出用オリゴヌクレオチド５の塩基配列中の蛍光物質１０の修飾位置は、特に限定されないが、末端（最も末端の塩基から５塩基以内）に修飾されてもよく、中でも、最も末端の塩基に標識されていてもよい。

また、消光物質１１としては、ＴＡＭＲＡ（テトラメチル−ローダミン）、ＤＡＢＣＹＬ（４−（４−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸）、ＢＨＱ１（ＢＨＱ：Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（登録商標））、ＢＨＱ２、ＢＨＱ３等が挙げられるが、これらに限定されない。

蛍光物質１０及び消光物質１１は、蛍光物質１０を核酸検出用オリゴヌクレオチド５の５’末端に、消光物質１１を３’末端に修飾してもよく、消光物質１１を核酸検出用オリゴヌクレオチド５の５’末端に、蛍光物質１０を３’末端に修飾してもよい。

［Ａ−１−２．核酸検出用オリゴヌクレオチドの塩基配列］
本実施の形態に係る核酸検出用オリゴヌクレオチド５は、鋳型核酸１００ａにおける特定の塩基配列と相補的な塩基配列を有する。そのため、核酸検出用オリゴヌクレオチド５は、鋳型核酸１００ａの特定の塩基配列を有する領域に特異的に結合することができる。

核酸検出用オリゴヌクレオチド５は、少なくとも１つの塩基が鋳型核酸１００ａと相補的な配列を有している。核酸検出用オリゴヌクレオチド５は、相補鎖である鋳型核酸１００ａに含まれる連続する７〜２５個であってもよく、好ましくは、９〜２５個、より好ましくは、１２〜２５個、さらに好ましくは、１５〜２５個と相補的なヌクレオチドを有していてもよい。核酸検出用オリゴヌクレオチド５が鋳型核酸１００ａと相補的な塩基配列を多く有することにより、鋳型核酸１００ａの標的部位（図２の結合部位２１、２２、２３ａ〜２３ｄ）に結合しやすくなるとともに、鋳型核酸１００ａとの結合力が強まるからである。

核酸検出用オリゴヌクレオチド５の塩基配列は、Ｔｍ値の説明で後述するように、標的核酸の塩基配列により適宜設計することができる。

［Ａ−２．核酸検出用オリゴヌクレオチドの構成要素］
本実施の形態に係る核酸検出用オリゴヌクレオチド５は、少なくとも第１オリゴヌクレオチド１、第２オリゴヌクレオチド２、及び第３オリゴヌクレオチド３を含む。これらのオリゴヌクレオチドは、通常、「プローブ」と呼ばれるものである。

図１〜図３に示すように、第１オリゴヌクレオチド１は、核酸検出用オリゴヌクレオチド５のうち、鋳型核酸１００ａの最も上流側に結合する。第１オリゴヌクレオチド１は、５’末端の少なくとも１つの塩基が鋳型核酸１００ａと相補的な配列を有している。第２オリゴヌクレオチド２は、核酸検出用オリゴヌクレオチド５のうち、鋳型核酸１００ａの最も下流側に結合する。第２オリゴヌクレオチド２は、３’末端の少なくとも１つの塩基が鋳型核酸１００ａと相補的な配列を有している。第３オリゴヌクレオチド３は、第１オリゴヌクレオチド１と第２オリゴヌクレオチド２とが鋳型核酸１００ａにそれぞれ結合する領域の間の領域に結合する。第３オリゴヌクレオチド３は、５’末端及び３’末端以外の少なくとも１つの塩基が鋳型核酸１００ａと相補的な配列を有している。

また、第３オリゴヌクレオチド３は、複数種類のオリゴヌクレオチド（第３オリゴヌクレオチド３ａ、３ｂ、３ｃ、３ｄ）を含んでもよい。標的核酸の塩基配列に基づき設計された、塩基配列の異なる複数種類の第３オリゴヌクレオチド３ａ、３ｂ、３ｃ、３ｄ（以降、３ａ〜３ｄと称す。）を含むことにより、鋳型核酸１００ａに多くの蛍光物質１０を付与することができる。

なお、複数種類の第３オリゴヌクレオチド３ａ〜３ｄのＴｍ値は、第１オリゴヌクレオチド１のＴｍ値よりも大きく、第２オリゴヌクレオチド２のＴｍ値よりも小さければよい。理由については、後述するため、ここでの説明を省略する。

［Ａ−２−１．第１、第２及び第３オリゴヌクレオチドの関連性］
以下、第１、第２、及び第３オリゴヌクレオチドの関連性（例えば、鋳型核酸への結合位置等）について、図２及び図３を用いて説明する。

図２に示すように、本実施の形態に係る核酸検出用オリゴヌクレオチド５は、鋳型核酸１００ａの３’末端側（上流側）から順に、第１オリゴヌクレオチド１、第３オリゴヌクレオチド３ａ〜３ｄ、第２オリゴヌクレオチド２が鋳型核酸１００ａと結合する。これらの核酸検出用オリゴヌクレオチド５のうち、隣接するオリゴヌクレオチド５は、結合部位３０ａ〜３０ｅにおいて互いに結合する。また、個々のオリゴヌクレオチド１、２、３ａ〜３ｄはそれぞれ、結合部位２１、２２、２３ａ〜２３ｄにおいて、鋳型核酸１００ａと結合する。

また、本実施の形態においては、第１オリゴヌクレオチド１、第２オリゴヌクレオチド２、及び第３オリゴヌクレオチド３ａ〜３ｄのうち隣接して鋳型核酸１００ａに結合するオリゴヌクレオチドは、一方から見て鋳型核酸１００ａの５’末端側（下流側）にあるオリゴヌクレオチドの５’末端と、他方から見て鋳型核酸１００ａの３’末端側（上流側）にあるオリゴヌクレオチドの３’末端の少なくとも１つの塩基が相補的配列を有する。

例えば、図３（ｂ）に示すように、隣接して鋳型核酸１００ａに結合する第１オリゴヌクレオチド１及び第３オリゴヌクレオチド３ａは、第３オリゴヌクレオチド３ａから見て鋳型核酸１００ａの上流側にある第１オリゴヌクレオチド１の３’末端（図３の（ｂ）の、消光物質１１で修飾される末端）の少なくとも１つの塩基と、第１オリゴヌクレオチド１から見て鋳型核酸１００ａの下流側にある第３オリゴヌクレオチド３ａの５’末端（図３の（ｂ）の、蛍光物質１０で修飾される末端）の少なくとも１つの塩基と、が相補的な配列を有する。このように、隣接する核酸検出用オリゴヌクレオチド５（ここでは、第１オリゴヌクレオチド１及び第３オリゴヌクレオチド３ａ）が互いに対向する側に相補的な配列を有することにより、隣接する核酸検出用オリゴヌクレオチド５の末端が互いに結合する。これにより、互いに対向する側に相補的な配列を有しない核酸検出用オリゴヌクレオチドを鋳型核酸に結合させる場合に比べ、鋳型核酸１００ａに、より多くの核酸検出用オリゴヌクレオチド５を結合させることができる。そのため、鋳型核酸１００ａに、より多くの蛍光物質１０を付与することができ、微量の標的核酸であっても高感度に蛍光を検出することができる。

［Ａ−２−２．核酸検出用オリゴヌクレオチドのＴｍ値］
核酸検出用オリゴヌクレオチド５の結合位置及び結合の順序等をコントロールするために、Ｔｍ値に基づいて核酸検出用オリゴヌクレオチド５を設計してもよい。以下、本実施の形態に係る核酸検出用オリゴヌクレオチド５のＴｍ値について、図２及び図３を用いて説明する。

本実施の形態に係る核酸検出用オリゴヌクレオチド５は、第１オリゴヌクレオチド１、第２オリゴヌクレオチド２、及び第３オリゴヌクレオチド３のそれぞれのＴｍ値は、鋳型核酸１００ａに結合するプライマのＴｍ値よりも大きくてもよい。これにより、核酸検出用オリゴヌクレオチド５は、プライマが鋳型核酸１００ａに結合する前に、鋳型核酸１００ａに結合することができる。

ここで、Ｔｍ値とは、標準二本鎖核酸のＴｍ値（融解温度）を意味する。Ｔｍ値は、常法により、融解曲線から求めることができる。融解曲線は、例えば、標準二本鎖核酸のみを含有する溶液の温度を、熱変性を生じさせる高温から低温へと変化させる際に、当該溶液の吸光度や蛍光強度を経時的に（リアルタイムに）測定することにより求めることができる。得られた融解曲線において、吸光度や蛍光強度の温度に対する平均変化率、又は微分値が最大となる温度がＴｍ値である。

また、Ｔｍ値は、算出値を用いてもよい。例えば、汎用されているプライマ／プローブ設計ソフトウェア等を用いることにより、標準二本鎖核酸の塩基配列情報から、Ｔｍ値を算出することができる。すなわち、Ｔｍ値を決定する要因はＰＣＲ増幅産物の二本鎖ＤＮＡの結合の強さに依存しており、ＧＣ含量や、増幅長等により左右されるため、標的核酸によってＴｍ値を変えることが可能である。

本実施の形態に係る核酸検出用オリゴヌクレオチド５のＴｍ値（Ｔｍ（ｎ））は、プライマのＴｍ値（Ｔｍ（ｐ））よりも大きければよく、例えば、Ｔｍ（ｐ）値が６０℃である場合、Ｔｍ（ｎ）値は、７０℃以上８０℃以下である。

さらに、本実施の形態に係る核酸検出用オリゴヌクレオチド５は、第１オリゴヌクレオチド１、第２オリゴヌクレオチド２、及び第３オリゴヌクレオチド３ａ〜３ｄのそれぞれのＴｍ値は、鋳型核酸１００ａの上流側から下流側に向けて結合する順に小さくなってもよい。

すなわち、核酸検出用オリゴヌクレオチド５のうち、鋳型核酸１００ａの上流側から下流側に向けて結合する順に、第１オリゴヌクレオチド１のＴｍ値（Ｔｍ（ｎ１））＞第３オリゴヌクレオチド３ａのＴｍ値（Ｔｍ（ｎ３ａ））＞第３オリゴヌクレオチド３ｂのＴｍ値（Ｔｍ（ｎ３ｂ））＞第３オリゴヌクレオチド３ｃのＴｍ値（Ｔｍ（ｎ３ｃ））＞第３オリゴヌクレオチド３ｄのＴｍ値（Ｔｍ（ｎ３ｄ））＞第２オリゴヌクレオチド２のＴｍ値（Ｔｍ（ｎ２））となってもよい。

これにより、プライマの結合領域側から鋳型核酸１００ａの下流側に向かって順に、核酸検出用オリゴヌクレオチド５が鋳型核酸１００ａに結合する。そのため、核酸検出用オリゴヌクレオチド５の全てが鋳型核酸１００ａに結合する前にプライマが結合したとしても、ＤＮＡ伸長反応の間に、少しでも多くの核酸検出用オリゴヌクレオチド５を鋳型核酸１００ａに結合することができる。

以下、本実施の形態における第１オリゴヌクレオチド１、第２オリゴヌクレオチド２、第３オリゴヌクレオチド３ａ〜３ｄ、及びプライマが鋳型核酸１００ａに結合する過程を、図３を用いて説明する。

例えば、図３の（ａ）に示すように、第１オリゴヌクレオチド１は、鋳型核酸１００ａに結合する核酸検出用オリゴヌクレオチド５のうち、鋳型核酸１００ａの最も上流側に結合する。このとき、第１オリゴヌクレオチド１の３’末端の塩基配列は、鋳型核酸１００ａと相補的な塩基配列を有しないため、３’末端（ここでは、消光物質１１で修飾された側）のみ、鋳型核酸１００ａと結合しない状態で残る。

第１オリゴヌクレオチド１の３’末端の塩基配列は、第１オリゴヌクレオチド１に隣接して鋳型核酸１００ａと結合する第３オリゴヌクレオチド３ａの５’末端（ここでは、蛍光物質１０で修飾された側）と相補的な塩基配列を有する。そのため、図２の結合部位３０ａ及び図３の（ｂ）に示すように、第１オリゴヌクレオチド１及び第３オリゴヌクレオチド３ａは、隣接する末端同士が結合する。

また、第１オリゴヌクレオチド１の５’末端（蛍光物質１０で修飾された側）の相補的な塩基配列の塩基数は、第１オリゴヌクレオチド１が鋳型核酸１００ａと結合を維持できれば特に限定されず、少なくとも１塩基であればよく、例えば、７塩基以上２５塩基以下、好ましくは、９塩基以上２５塩基以下、より好ましくは、１２塩基以上２５塩基以下、さらに好ましくは、１５塩基以上２５塩基以下である。

このように、第１オリゴヌクレオチド１が５’末端に鋳型核酸１００ａの上流側の塩基配列と相補的な塩基配列を有することにより、核酸検出用オリゴヌクレオチド５のうち最もプライマの結合領域側に結合することができる。ここで、第１オリゴヌクレオチド１は、３’末端‘（消光物質１１で修飾された側）に鋳型核酸１００ａと相補的な塩基配列を有しないため、他のオリゴヌクレオチド５が第１オリゴヌクレオチド１よりも下流側に隣接して結合した場合、隣接する他のオリゴヌクレオチド５の５’末端側と結合することができる。

次に、図３の（ｂ）に示すように、第３オリゴヌクレオチド３ａは、第１オリゴヌクレオチド１に隣接して鋳型核酸１００ａと結合する。ここで、第３オリゴヌクレオチド３ａの５’末端（蛍光物質１０で修飾された側）の少なくとも１つの塩基は、第１オリゴヌクレオチド１の３’末端（消光物質１１で修飾された側）の相補的な塩基配列と結合する。

隣接するオリゴヌクレオチド５（ここでは、第１オリゴヌクレオチド１及び第３オリゴヌクレオチド３ａ）同士の相補的な塩基配列は、結合を維持できればよく、例えば、少なくとも１塩基であればよく、５塩基以下であればよい。この相補的な塩基配列は、Ｃ（シトシン）及びＧ（グアニン）の割合が相対的に高い方がよい。Ｃ及びＧは水素結合で結合され、Ａ（アデニン）及びＴ（チミン）よりも強い結合力を有するため、ＣＧの割合が高い方が相補的な配列における結合を強めることができる。

次に、図３の（ｂ）に示すように、第３オリゴヌクレオチド３ａの５’末端（蛍光物質１０で修飾された側）の塩基配列は、第１オリゴヌクレオチド１の３’末端（消光物質１１で修飾された側）の相補的な塩基配列と結合する。そして、第３オリゴヌクレオチド３ａの５’末端及び３’末端以外の少なくとも１つの塩基が鋳型核酸１００ａと結合する。第３オリゴヌクレオチド３ａの５’末端及び３’末端以外の（３’末端及び５’末端の間の）相補的な塩基配列（図２の結合部位２３ａの塩基配列）は、第３オリゴヌクレオチド３ａが鋳型核酸１００ａとの結合を維持できれば特に限定されず、好ましい塩基数については、上述した第１オリゴヌクレオチド１と同様である。

また、図３の（ｃ）に示すように、第３オリゴヌクレオチド３ａは、第３オリゴヌクレオチド３ａの３’末端側（蛍光物質１０で修飾された側）に隣接する第３オリゴヌクレオチド３ｂの５’末端（消光物質１１で修飾された側）と相補的な配列を有しており、第３オリゴヌクレオチド３ｂの５’末端の少なくとも１つの塩基が第３オリゴヌクレオチド３ａの３’末端と結合する。第３オリゴヌクレオチド３ｂの５’末端及び３’末端以外の（３’末端及び５’末端の間の）相補的な塩基配列（図２の結合部位２３ｂの塩基配列）は、第３オリゴヌクレオチド３ｂが鋳型核酸１００ａとの結合を維持できれば特に限定されず、好ましい塩基数については、上述した第１オリゴヌクレオチド１と同様である。

最後に、第２オリゴヌクレオチド２は、鋳型核酸１００ａに結合する核酸検出用オリゴヌクレオチド５のうち、鋳型核酸１００ａの最も下流側に結合する。第２オリゴヌクレオチド２の５’末端（蛍光物質１０で修飾された側）の塩基配列は、隣接する第３オリゴヌクレオチド３ｄの３’末端（消光物質１１で修飾された側）と相補的な塩基配列を有するため、第２オリゴヌクレオチド２は第３オリゴヌクレオチド３ｄの３’末端（消光物質１１で修飾された側）と結合する（図２の結合部位３０ｅ）。

以上のように、鋳型核酸１００ａの上流から下流に向かって順に核酸検出用オリゴヌクレオチド５を鋳型核酸１００ａに結合させるためには、個々のオリゴヌクレオチド５のＴｍ値に差異が生じるように設計すればよく、より好ましくは、互いのＴｍ値にそれぞれ１℃以上、より好ましくは２℃以上、さらに好ましくは３℃以上の差異が生じるように設計すればよい。

そして、核酸検出用オリゴヌクレオチド５のＴｍ値をプライマのＴｍ値よりも大きくすることにより、図３の（ｄ）に示すように、プライマは、全ての核酸検出用オリゴヌクレオチド５が鋳型核酸１００ａに結合した後に、鋳型核酸１００ａに結合する。

このように、プライマが鋳型核酸１００ａに結合すると、ＤＮＡポリメラーゼが作用し、ＤＮＡの伸長反応が開始される。これにより、核酸検出用オリゴヌクレオチド５の分解が起こり、蛍光シグナルが発せられる。

［Ａ−２−３．蛍光のメカニズム］
本実施の形態における蛍光のメカニズムについて、図４を用いて説明する。図４は、本実施の形態に係る核酸検出用オリゴヌクレオチド５が蛍光を発する様子を説明する図である。

本実施の形態においては、図３の（ｄ）に示すように、全ての核酸検出用オリゴヌクレオチド５が鋳型核酸１００ａに結合した後、プライマ（フォワード（Ｆｗ）プライマ及びリバース（Ｒｖ）プライマ）が鋳型核酸１００ａ及び１００ｂに結合する。上述したように、これらのプライマが結合すると、ＤＮＡポリメラーゼの作用により、ＤＮＡの伸長反応が開始される。

なお、本明細書では、核酸検出用オリゴヌクレオチド５が鋳型核酸１００ａに結合する例を示したが、本開示の核酸検出用オリゴヌクレオチド５は、鋳型核酸１００ｂに結合してもよい。

図４に示すように、プライマが伸長（上記、ＤＮＡの伸長を指す。）する過程で、鋳型核酸１００ａに結合した第１オリゴヌクレオチド１は、ＤＮＡポリメラーゼの有する５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により分解される。このとき、第１オリゴヌクレオチド１に修飾されていた蛍光物質１０及び消光物質１１は、相互に空間的に分離され（例えば、第１オリゴヌクレオチドの一部１ａ、１ｂ、１ｃ）、蛍光物質１０が蛍光シグナルを発する。

分解される前の第１オリゴヌクレオチド１では、蛍光物質１０及び消光物質１１が近接しているため、蛍光物質１０の有する蛍光シグナルを発する機能が消光物質１１により妨げられている。しかしながら、ＤＮＡの伸長過程で、第１オリゴヌクレオチド１が分解されると、消光物質１１の作用が及ばなくなり、蛍光物質１０は蛍光シグナルを発する。

この蛍光シグナルは、増幅された標的核酸の分子数（コピー数）に比例するため、得られる蛍光シグナルの強度に基づいて、標的核酸の初期濃度を算出することができる。

［Ｂ．プライマ］
本実施の形態におけるプライマは、Ｔｍ値の説明で上述したように、標的核酸の塩基配列により適宜設定することができる。なお、Ｔｍ値が相対的に高いほど、鋳型核酸に対する結合性が相対的に高くなるため、標的核酸の種類に応じて、好適なＴｍ値を有するプライマを設計してもよい。

［まとめ］
以上のように、本実施の形態に係る核酸検出用オリゴヌクレオチド５は、鋳型核酸１００ａに結合する、蛍光物質１０及び消光物質１１により修飾された核酸検出用オリゴヌクレオチド５であって、核酸検出用オリゴヌクレオチド５は、少なくとも第１オリゴヌクレオチド１、第２オリゴヌクレオチド２、及び第３オリゴヌクレオチド３を含み、第１オリゴヌクレオチド１は、鋳型核酸１００ａに結合する核酸検出用オリゴヌクレオチド５のうち最も３’末端側に結合し、５’末端の少なくとも１つの塩基が鋳型核酸１００ａと相補的配列を有しており、第２オリゴヌクレオチド２は、鋳型核酸１００ａに結合する核酸検出用オリゴヌクレオチド５のうち最も５’末端側に結合し、３’末端の少なくとも１つの塩基が鋳型核酸１００ａと相補的配列を有しており、第３オリゴヌクレオチド３は、第１オリゴヌクレオチド１と第２オリゴヌクレオチド２とが鋳型核酸１００ａにそれぞれ結合する領域の間の領域に結合し、５’末端及び３’末端以外の少なくとも１つの塩基が鋳型核酸１００ａと相補的配列を有しており、第１オリゴヌクレオチド１、第２オリゴヌクレオチド２、及び第３オリゴヌクレオチド３のうち隣接して鋳型核酸１００ａに結合するオリゴヌクレオチドは、一方から見て鋳型核酸１００ａの５’末端側にあるオリゴヌクレオチドの５’末端と、他方から見て鋳型核酸の３’末端側にあるオリゴヌクレオチドの３’末端の少なくとも１つの塩基が相補的配列を有する。

このように、隣接する核酸検出用オリゴヌクレオチド５が互いに対向する側に相補的な配列を有することにより、隣接する核酸検出用オリゴヌクレオチド５の末端が互いに結合する。これにより、対向する側に相補的な配列を有しない核酸検出用オリゴヌクレオチドを鋳型核酸に結合させる場合に比べ、鋳型核酸１００ａにより多くの核酸検出用オリゴヌクレオチド５を結合させることができる。そのため、鋳型核酸１００ａに、より多くの蛍光物質１０を付与することができ、微量の標的核酸であっても高感度に蛍光を検出することができる。

また、本実施の形態に係る核酸検出用オリゴヌクレオチド５では、第３オリゴヌクレオチド３は、複数種類のオリゴヌクレオチド３ａ〜３ｄを含んでもよい。標的核酸（鋳型核酸１００ａ）の塩基配列に基づき設計された、塩基配列の異なる複数種類の第３オリゴヌクレオチド３ａ〜３ｄを含むことにより、鋳型核酸１００ａに多くの蛍光物質１０を付与することができる。

また、本実施の形態に係る核酸検出用オリゴヌクレオチド５では、第１オリゴヌクレオチド１、第２オリゴヌクレオチド２、及び第３オリゴヌクレオチド３のそれぞれのＴｍ値は、鋳型核酸１００ａに結合するプライマのＴｍ値よりも大きくてもよい。これにより、核酸検出用オリゴヌクレオチド５は、プライマが鋳型核酸１００ａに結合する前に、鋳型核酸１００ａに結合することができる。

さらに、本実施の形態に係る核酸検出用オリゴヌクレオチド５は、第１オリゴヌクレオチド１、第２オリゴヌクレオチド２、及び第３オリゴヌクレオチド３のそれぞれのＴｍ値は、鋳型核酸１００ａの３’末端側から５’末端側に向けて結合する順に小さくなってもよい。これにより、プライマの結合領域側から鋳型核酸１００ａの下流側に向かって順に、核酸検出用オリゴヌクレオチド５が鋳型核酸１００ａに結合する。そのため、核酸検出用オリゴヌクレオチド５の全てが鋳型核酸１００ａに結合する前にプライマが結合したとしても、ＤＮＡが伸長する間に、少しでも多くの核酸検出用オリゴヌクレオチド５を鋳型核酸１００ａに結合することができる。

以上、本開示に係る核酸検出用オリゴヌクレオチドについて、実施の形態に基づいて説明したが、本開示は、これらの実施の形態に限定されるものではない。本開示の主旨を逸脱しない限り、当業者が思いつく各種変形を実施の形態に施したものや、実施の形態における一部の構成要素を組み合わせて構築される別の形態も、本開示の範囲内に含まれる。

１ 第１オリゴヌクレオチド
２ 第２オリゴヌクレオチド
３、３ａ、３ｂ、３ｃ、３ｄ 第３オリゴヌクレオチド
５ 核酸検出用オリゴヌクレオチド
１０ 蛍光物質
１１ 消光物質
１００ａ、１００ｂ 鋳型核酸

Claims (4)

1. 鋳型核酸に結合する、蛍光物質及び消光物質により修飾された核酸検出用オリゴヌクレオチドであって、
   前記核酸検出用オリゴヌクレオチドは、少なくとも第１オリゴヌクレオチド、第２オリゴヌクレオチド、及び第３オリゴヌクレオチドを含み、
   前記第１オリゴヌクレオチドは、前記鋳型核酸に結合する前記核酸検出用オリゴヌクレオチドのうち最も３’末端側に結合し、５’末端の少なくとも１つの塩基が前記鋳型核酸と相補的配列を有しており、
   前記第２オリゴヌクレオチドは、前記鋳型核酸に結合する前記核酸検出用オリゴヌクレオチドのうち最も５’末端側に結合し、３’末端の少なくとも１つの塩基が前記鋳型核酸と相補的配列を有しており、
   前記第３オリゴヌクレオチドは、前記第１オリゴヌクレオチドと前記第２オリゴヌクレオチドとが前記鋳型核酸にそれぞれ結合する領域の間の領域に結合し、５’末端及び３’末端以外の少なくとも１つの塩基が前記鋳型核酸と相補的配列を有しており、
   前記第１オリゴヌクレオチド、前記第２オリゴヌクレオチド、及び前記第３オリゴヌクレオチドのうち隣接して前記鋳型核酸に結合するオリゴヌクレオチドは、一方から見て前記鋳型核酸の５’末端側にあるオリゴヌクレオチドの５’末端と、他方から見て前記鋳型核酸の３’末端側にあるオリゴヌクレオチドの３’末端の少なくとも１つの塩基が相補的配列を有する、
   核酸検出用オリゴヌクレオチド。
2. 前記第３オリゴヌクレオチドは、複数種類のオリゴヌクレオチドを含む、
   請求項１に記載の核酸検出用オリゴヌクレオチド。
3. 前記第１オリゴヌクレオチド、前記第２オリゴヌクレオチド、及び前記第３オリゴヌクレオチドのそれぞれのＴｍ値は、前記鋳型核酸に結合するプライマのＴｍ値よりも大きい、
   請求項１又は２に記載の核酸検出用オリゴヌクレオチド。
4. 前記第１オリゴヌクレオチド、前記第２オリゴヌクレオチド、及び前記第３オリゴヌクレオチドのそれぞれのＴｍ値は、前記鋳型核酸の３’末端側から５’末端側に向けて結合する順に小さくなる、
   請求項１〜３のいずれか１項に記載の核酸検出用オリゴヌクレオチド。

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