JP2018139520A - 核酸検出用オリゴヌクレオチド - Google Patents

Abstract

【課題】微量の標的遺伝子を高感度に検出可能な核酸検出用オリゴヌクレオチドを提供する。
【解決手段】核酸検出用オリゴヌクレオチドは、鋳型核酸１００に結合する、蛍光物質１０及び消光物質１１により修飾された核酸検出用オリゴヌクレオチドであって、第１オリゴヌクレオチド１及び第２オリゴヌクレオチド２を含み、センス鎖１００ｂとアンチセンス鎖１００ａとからなる二本鎖鋳型核酸１００のアンチセンス鎖１００ａに結合可能なフォワードプライマと、センス鎖１００ｂに結合可能なリバースプライマとに挟まれた領域において、第１オリゴヌクレオチド１は、鋳型核酸１００のアンチセンス鎖１００ａ及びセンス鎖１００ｂの一方の領域に結合し、第２オリゴヌクレオチド２は、鋳型核酸１００のアンチセンス鎖１００ａ及びセンス鎖１００ｂの他方の領域に結合し、第１オリゴヌクレオチド及び第２オリゴヌクレオチドは互いに相補的でない塩基配列を有する。
【選択図】図１

Description

本開示は、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法により得られる特定の標的核酸を検出するための核酸検出用オリゴヌクレオチドに関する。

臨床や病理学等の様々な分野において、遺伝子の発現解析、機能解析、診断等を目的として、ＰＣＲ法が広く利用されている。ＰＣＲは、一般に、（１）熱処理により二本鎖核酸を一本鎖核酸に解離するステップ、（２）一本鎖核酸（鋳型核酸）にプライマをアニーリングさせる（鋳型核酸にプライマを結合させる）ステップ、及び（３）核酸ポリメラーゼを用いて上記プライマの伸長生成物を形成する（一本鎖と相補的な核酸が合成される）ステップ、の３つのステップを１サイクルとして、このサイクルを繰り返すことにより、目的の遺伝子配列を指数関数的に増幅させることができる。

中でも、リアルタイムＰＣＲ（Ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ）は、核酸の増幅量を経時的に（リアルタイムに）モニターし解析する手法として、ｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）発現解析、ＳＮＰ（Ｓｉｎｇｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）解析、感染症診断等様々な目的で広く利用されている。リアルタイムＰＣＲでは、サイクル数とＰＣＲ最終産物の量（最終的な核酸の増幅量）から既知のスタンダードとの比較により目的遺伝子の初期量を算出する。ＰＣＲ最終産物は、光学的に定量される。例えば、一本鎖と相補的な核酸が合成される際に、標的核酸に結合した蛍光プローブが分解されて発光された蛍光を測定する。

また、従来のＰＣＲ法の１つとして、特許文献１は、標的核酸中の特定塩基配列に相補的な配列を有し、該標的核酸と結合した場合に蛍光を発する、インターカレーター性蛍光色素で標識した核酸プローブ（インターカレーター性の蛍光プローブ）を用いる方法を開示している。該方法によれば、該プローブが標的核酸と相補結合を形成することで測定可能な蛍光を発するため、試料中の特定塩基配列を含む一本鎖ＲＮＡについて、反応液を急激に昇温及び降温するという操作を繰り返すことなく、概ね一定温度で蛍光を測定することが可能となる。

特開２０００−０１４４００号公報

しかしながら、特許文献１に開示される従来技術では、上述した利点があるものの、図５に示すように、鋳型核酸の初期濃度が低くなるほどＰＣＲ産物の増幅曲線は立ち上がりが遅くなり、さらに、指数関数的な増加が見られない。そのため、鋳型核酸の初期濃度が低い（微量である）と、ＰＣＲ最終産物が発する蛍光を検出することができないという問題がある。

そこで、本開示は、微量の標的核酸を高感度に検出することが可能となる核酸検出用オリゴヌクレオチドを提供することを目的とする。

上記目的を達成するために、本開示の一形態に係る核酸検出用オリゴヌクレオチドは、鋳型核酸に結合する、蛍光物質及び消光物質により修飾された核酸検出用オリゴヌクレオチドであって、核酸検出用オリゴヌクレオチドは、少なくとも第１オリゴヌクレオチド及び第２オリゴヌクレオチドを含み、センス鎖とアンチセンス鎖とからなる二本鎖である鋳型核酸のアンチセンス鎖に結合可能なフォワードプライマと、センス鎖に結合可能なリバースプライマとに挟まれた領域において、第１オリゴヌクレオチドは、鋳型核酸のアンチセンス鎖及びセンス鎖の一方の領域に結合し、第２オリゴヌクレオチドは、鋳型核酸のアンチセンス鎖及びセンス鎖の他方の領域に結合し、第１オリゴヌクレオチド及び第２オリゴヌクレオチドは互いに相補的でない塩基配列を有する。

本開示によれば、微量の標的遺伝子を高感度に検出することが可能となる核酸検出用オリゴヌクレオチドを提供できる。

実施の形態に係る核酸検出用オリゴヌクレオチドが鋳型核酸に結合した状態を示す模式図 実施の形態における第１オリゴヌクレオチド及び第２オリゴヌクレオチドが互いに相補的な塩基配列を有する場合に生じる現象を説明する模式図 実施の形態に係る核酸検出用オリゴヌクレオチドが鋳型核酸に結合する過程を示す図 実施の形態に係る核酸検出用オリゴヌクレオチドが蛍光を発する様子を説明する図 従来技術におけるＰＣＲ増幅曲線

以下、本開示の実施の形態について、図面を参照しながら説明する。なお、以下に説明する実施の形態は、いずれも本開示の好ましい一具体例を示すものである。したがって、以下の実施の形態で示される、数値、形状、材料、構成要素、構成要素の配置位置及び接続形態、並びに、ステップ及びステップの順序などは、一例であって本開示を限定する主旨ではない。よって、以下の実施の形態における構成要素のうち、本開示の最上位概念を示す独立請求項に記載されていない構成要素については、任意の構成要素として説明される。

なお、各図は、模式図であり、必ずしも厳密に図示されたものではない。また、各図において、実質的に同一の構成に対しては同一の符号を付しており、重複する説明は省略又は簡略化する。

（実施の形態）
以下、本実施の形態に係る核酸検出用オリゴヌクレオチドについて、図面を参照して説明する。

本開示における「上流側」とは塩基配列の領域内で３’末端側を、「下流側」とは塩基配列の領域内で５’末端側を意味する。

また、本開示における「核酸」とは、ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）及びＲＮＡ（リボ核酸）を意味する。

［Ａ．核酸検出用オリゴヌクレオチド］
以下、本実施の形態に係る核酸検出用オリゴヌクレオチドについて、図１〜図４を用いて説明する。

図１は、本実施の形態に係る核酸検出用オリゴヌクレオチド５が鋳型核酸１００に結合した状態を示す模式図である。図２は、本実施の形態における第１オリゴヌクレオチド１及び第２オリゴヌクレオチド２が互いに相補的な塩基配列を有する場合に生じる現象を説明する模式図である。図３は、本実施の形態に係る核酸検出用オリゴヌクレオチド５が鋳型核酸１００に結合する様子を説明する図である。図４は、本実施の形態に係る核酸検出用オリゴヌクレオチド５が蛍光を発する様子を説明する図である。

なお、以下、核酸検出用オリゴヌクレオチド５を、単に、オリゴヌクレオチド５と称する場合がある。

［Ａ−１．核酸検出用オリゴヌクレオチドの基本構造］
図１に示すように、本実施の形態に係る核酸検出用オリゴヌクレオチド５は、その両端を蛍光物質１０及び消光物質１１により修飾されたオリゴヌクレオチドである。核酸検出用オリゴヌクレオチド５においては、蛍光物質１０と消光物質１１とが近接しているため、蛍光物質１０の有する蛍光シグナルを発する機能が、消光物質１１によって妨げられている。しかしながら、図４に示すように、ＤＮＡの伸長反応の過程では、鋳型核酸１００に結合した核酸検出用オリゴヌクレオチド５は、例えば、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼの有する５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により分解され、核酸検出用オリゴヌクレオチド５に修飾されていた蛍光物質１０及び消光物質１１は、相互に空間的に分離されるため、蛍光物質１０が蛍光シグナルを発する。この蛍光シグナルの強さは、増幅された標的核酸の分子数に比例する。

［Ａ−１−１．蛍光物質及び消光物質］
本実施の形態に係る核酸検出用オリゴヌクレオチド５を修飾する蛍光物質１０は、核酸増幅工程中に分解又は蛍光が減衰しなければよい。蛍光物質１０としては、特に限定されないが、例えば、フルオロセイン又はその誘導体（例えば、ＦＡＭ（カルボキシフルオレセイン）、ＪＯＥ（６−カルボキシ−４’,５’−ジクロロ２’,７’−ジメトキシフルオレセイン）、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）、ＴＥＴ（テトラクロロフルオレセイン）、ＨＥＸ（５'−ヘキサクロロ−フルオレセイン−ＣＥホスホロアミダイト））、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）シリーズ、ローダミン又はその誘導体（例えば、５−カルボキシローダミン６Ｇ（ＣＲ６Ｇ）やテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ））、Ｃｙ（登録商標）色素（例えば、Ｃｙ３、Ｃｙ５）等を使用してもよい。蛍光物質１０の核酸検出用オリゴヌクレオチド５への結合方法は、通常の方法に従って行うことができる。蛍光物質１０の消光を利用すれば、インターカレーターなどの他の二重鎖核酸構造への挿入色素を用いることなく、また、ＦＲＥＴ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ）現象を起こす２種類のプローブ（核酸検出用オリゴヌクレオチド）を用いることなく、１種類の蛍光物質１０に標識されたプローブを用いて単純かつ特異的に標的核酸配列を検出することができる。核酸検出用オリゴヌクレオチド５の塩基配列中の蛍光物質１０の修飾位置は、特に限定されないが末端（最も末端の塩基から５塩基以内）に修飾されてもよく、中でも、最も末端の塩基に標識されていてもよい。

また、消光物質１１としては、ＴＡＭＲＡ（テトラメチル−ローダミン）、ＤＡＢＣＹＬ（４−（４−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸）、ＢＨＱ１（ＢＨＱ：Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（登録商標））、ＢＨＱ２、ＢＨＱ３等が挙げられるが、これらに限定されない。

蛍光物質１０及び消光物質１１は、蛍光物質１０を核酸検出用オリゴヌクレオチド５の５’末端に、消光物質１１を３’末端に修飾してもよく、消光物質１１を核酸検出用オリゴヌクレオチド５の５’末端、蛍光物質１０を３’末端に修飾してもよい。

［Ａ−１−２．核酸検出用オリゴヌクレオチドの塩基配列］
本実施の形態に係る核酸検出用オリゴヌクレオチド５は、鋳型核酸１００における特定の塩基配列と相補的な塩基配列を有する。そのため、核酸検出用オリゴヌクレオチド５は、鋳型核酸１００の特定の塩基配列を有する領域に特異的に結合することができる。

核酸検出用オリゴヌクレオチド５は、相補鎖である鋳型核酸１００に含まれる連続する７〜２５個であってもよく、好ましくは、９〜２５個、より好ましくは、１２〜２５個、さらに好ましくは、１５〜２５個と相補的なヌクレオチドを有していてもよい。核酸検出用オリゴヌクレオチド５が鋳型核酸１００と相補的な塩基配列を多く有することにより、鋳型核酸１００の標的部位（個々の核酸検出用オリゴヌクレオチド５の塩基配列と相補的な特定の塩基配列を有する領域）に結合しやすくなるとともに、鋳型核酸１００との結合力が強まるからである。

核酸検出用オリゴヌクレオチド５の塩基配列は、Ｔｍ値の説明で後述するように、標的核酸の塩基配列により適宜設計することができる。

［Ａ−２．核酸検出用オリゴヌクレオチドの構成要素］
本実施の形態に係る核酸検出用オリゴヌクレオチド５は、少なくとも第１オリゴヌクレオチド１及び第２オリゴヌクレオチド２を含む。これらのオリゴヌクレオチドは、通常、「プローブ」と呼ばれるものである。

また、核酸検出用オリゴヌクレオチド５は、二本鎖である鋳型核酸１００のアンチセンス鎖１００ａに結合可能なフォワードプライマと、センス鎖１００ｂに結合可能なリバースプライマとに挟まれた領域において、第１オリゴヌクレオチド１は、鋳型核酸１００のアンチセンス鎖１００ａ及びセンス鎖１００ｂの一方の領域に結合し、第２オリゴヌクレオチド２は、鋳型核酸１００のアンチセンス鎖１００ａ及びセンス鎖１００ｂの他方の領域に結合する。例えば、図１及び図３に示すように、第１オリゴヌクレオチド１は、鋳型核酸１００のアンチセンス鎖１００ａの、上記２つのプライマに挟まれた領域に結合する。このとき、第２オリゴヌクレオチド２は、鋳型核酸１００のセンス鎖１００ｂの、上記２つのプライマに挟まれた領域に結合する。

核酸検出用オリゴヌクレオチド５は、「Ａ−１−２．核酸検出用オリゴヌクレオチドの塩基配列」で上述した通り、第１オリゴヌクレオチド１及び第２オリゴヌクレオチド２は、互いに相補的でない塩基配列を有する。これにより、第１オリゴヌクレオチド１及び第２オリゴヌクレオチド２を含む核酸検出用オリゴヌクレオチド５が互いに結合することを抑制し、核酸検出用オリゴヌクレオチド５を鋳型核酸１００のアンチセンス鎖１００ａ及びセンス鎖１００ｂのそれぞれの領域（フォワードプライマとリバースプライマとに挟まれた領域）に結合させることができる。そのため、核酸検出用オリゴヌクレオチド５を鋳型核酸１００のアンチセンス鎖１００ａにのみ結合させる場合に比べ、鋳型核酸１００により多くの核酸検出用オリゴヌクレオチド５を結合させることができる。したがって、本実施の形態に係る核酸検出用オリゴヌクレオチド５は、鋳型核酸１００に、より多くの蛍光物質１０を付与することができ、微量の標的核酸であっても高感度に蛍光を検出することができる。

また、第１オリゴヌクレオチド１及び第２オリゴヌクレオチド２の少なくとも一方は、２種類以上のオリゴヌクレオチド５を含んでもよい。これにより、例えば、図１に示すように、複数種類の第１オリゴヌクレオチド１ａ、１ｂ、１ｃ及び複数種類の第２オリゴヌクレオチド２ａ、２ｂ、２ｃがそれぞれ、二本鎖の鋳型核酸１００のアンチセンス鎖１００ａ及びセンス鎖１００ｂに互い違いに結合するため、一本鎖の鋳型核酸１００（例えば、アンチセンス鎖１００ａ）にのみ核酸検出用オリゴヌクレオチド５を結合させる場合に比べ、鋳型核酸１００に、より多くの蛍光物質１０を付与することができる。

なお、複数種類の第１オリゴヌクレオチド１ａ〜１ｃのＴｍ値及び複数種類の第２オリゴヌクレオチド２ａ〜２ｃのＴｍ値は、フォワードプライマ及びリバースプライマのＴｍ値よりも大きければよい。理由については、後述するため、ここでの説明を省略する。

また、複数種類の第１オリゴヌクレオチド１ａ〜１ｃのＴｍ値は、フォワードプライマの結合領域側から鋳型核酸１００のアンチセンス鎖１００ａの下流側に向かう順に小さくなればよい。同様に、複数種類の第２オリゴヌクレオチド２ａ〜２ｃのＴｍ値は、リバースプライマの結合領域側から鋳型核酸１００のセンス鎖１００ｂの下流側に向かう順に小さくなればよい。理由については、後述するため、ここでの説明を省略する。

［Ａ−２−１．第１及び第２オリゴヌクレオチドの関連性］
以下、第１及び第２オリゴヌクレオチドの関連性（例えば、鋳型核酸への結合位置等）について、図１及び図２を用いて説明する。

図１に示すように、本実施の形態に係る核酸検出用オリゴヌクレオチド５は、第１オリゴヌクレオチド１及び第２オリゴヌクレオチド２を含み、第１オリゴヌクレオチド１と第２オリゴヌクレオチド２は互いに相補的でない塩基配列を有する。また、第１オリゴヌクレオチド１は、複数種類の第１オリゴヌクレオチド１ａ、１ｂ、１ｃを含み、第２オリゴヌクレオチド２は、複数種類の第２オリゴヌクレオチド２ａ、２ｂ、２ｃを含む。そのため、第１オリゴヌクレオチド１ａ、１ｂ、１ｃ及び第２オリゴヌクレオチド２ａ、２ｂ、２ｃは鋳型核酸１００のアンチセンス鎖１００ａ及びセンス鎖１００ｂに互い違いに結合する。

「第１オリゴヌクレオチド１及び第２オリゴヌクレオチド２は互いに相補的でない配列を有する」とは、互いに相補的な配列が３個以下であること、好ましくは、互いに相補的な配列が２個以下であること、より好ましくは、１個以下であること、さらに好ましくは、０個であることをいう。互いに相補的な塩基配列が３個以下であれば、核酸検出用オリゴヌクレオチド５同士（第１オリゴヌクレオチド１及び第２オリゴヌクレオチド２）の結合を抑制することができる。

しかしながら、核酸検出用オリゴヌクレオチド５に含まれる第１オリゴヌクレオチド１及び第２オリゴヌクレオチド２が互いに相補的な塩基配列を有すると、第１オリゴヌクレオチド１及び第２オリゴヌクレオチド２が結合してしまい、鋳型核酸１００に結合しにくくなる。例えば、図２に示すように、第１オリゴヌクレオチド１ａと第２オリゴヌクレオチド２ｃとが互いに相補的な配列を有する場合、それぞれが鋳型核酸１００に結合する前に結合してしまう。

［Ａ−２−２．核酸検出用オリゴヌクレオチドのＴｍ値］
核酸検出用オリゴヌクレオチド５の結合位置及び結合の順序等をコントロールするために、Ｔｍ値に基づいて核酸検出用オリゴヌクレオチド５を設計してもよい。以下、本実施の形態に係る核酸検出用オリゴヌクレオチド５のＴｍ値について、図３を用いて説明する。

本実施の形態に係る核酸検出用オリゴヌクレオチド５では、第１オリゴヌクレオチド１及び第２オリゴヌクレオチド２のそれぞれのＴｍ値は、フォワードプライマ及びリバースプライマのＴｍ値よりも大きくてもよい。これにより、核酸検出用オリゴヌクレオチド５は、上記２つのプライマが鋳型核酸１００に結合する前に、鋳型核酸１００に結合することができる。

ここで、Ｔｍ値とは、標準二本鎖核酸のＴｍ値（融解温度）を意味する。Ｔｍ値は、常法により、融解曲線から求めることができる。融解曲線は、例えば、標準二本鎖核酸のみを含有する溶液の温度を、熱変性を生じさせる高温から低温へと変化させる際に、当該溶液の吸光度や蛍光強度を経時的に（リアルタイムに）測定することにより求めることができる。得られた融解曲線において、吸光度や蛍光強度の温度に対する平均変化率、又は微分値が最大となる温度がＴｍ値である。

また、Ｔｍ値は、算出値を用いてもよい。例えば、汎用されているプライマ／プローブ設計ソフトウェア等を用いることにより、標準二本鎖核酸の塩基配列情報から、Ｔｍ値を算出することができる。すなわち、Ｔｍ値を決定する要因はＰＣＲ増幅産物の二本鎖ＤＮＡの結合の強さに依存しており、ＧＣ含量や、増幅長等により左右されるため、標的核酸によってＴｍ値を変えることが可能である。

本実施の形態に係る核酸検出用オリゴヌクレオチド５のＴｍ値（Ｔｍ（ｎ））は、プライマのＴｍ値（Ｔｍ（ｐ））よりも大きければよく、例えば、Ｔｍ（ｐ）値が６０℃である場合、Ｔｍ（ｎ）値は、７０℃以上８０℃以下である。

また、第１オリゴヌクレオチド１及び第２オリゴヌクレオチド２の少なくとも一方は、２種類以上のオリゴヌクレオチド５を含んでもよく、これらの２種類以上のオリゴヌクレオチド５のＴｍ値は、結合した鋳型核酸１００の３’末端側（上流側）から５’末端側（下流側）に向けて結合する順に小さくなってもよい。

すなわち、第１オリゴヌクレオチド１のうち、鋳型核酸１００のアンチセンス鎖１００ａの上流側から下流側に向けて結合する順に、第１オリゴヌクレオチド１ａのＴｍ値（Ｔｍ（ｎ１ａ））＞第１オリゴヌクレオチド１ｂのＴｍ値（Ｔｍ（ｎ１ｂ））＞第１オリゴヌクレオチド１ｃのＴｍ値（Ｔｍ（ｎ１ｃ））となってもよい。

同様に、第２オリゴヌクレオチド２のうち、鋳型核酸１００のセンス鎖１００ｂの上流側から下流側に向けて結合する順に、第２オリゴヌクレオチド２ａのＴｍ値（Ｔｍ（ｎ２ａ））＞第２オリゴヌクレオチド２ｂのＴｍ値（Ｔｍ（ｎ２ｂ））＞第２オリゴヌクレオチド２ｃのＴｍ値（Ｔｍ（ｎ２ｃ））となってもよい。

これにより、プライマ（フォワードプライマ及びリバースプライマ）の結合領域側から鋳型核酸１００の下流側に向かって順に、核酸検出用オリゴヌクレオチド５が鋳型核酸１００に結合する。そのため、核酸検出用オリゴヌクレオチド５の全てが鋳型核酸１００に結合する前にプライマが結合したとしても、ＤＮＡ伸長反応の間に、少しでも多くの核酸検出用オリゴヌクレオチド５を鋳型核酸１００に結合することができる。

以下、本実施の形態における第１オリゴヌクレオチド１、第２オリゴヌクレオチド２、及びプライマが鋳型核酸１００に結合する過程を、図３を用いて説明する。

例えば、図３の（ａ）に示すように、第１オリゴヌクレオチド１ａは、鋳型核酸１００（アンチセンス鎖１００ａ）に結合する第１オリゴヌクレオチド１のうち、最もフォワードプライマの結合領域側に結合する。同様に、第２オリゴヌクレオチド２ａは、鋳型核酸１００（センス鎖１００ｂ）に結合する第２オリゴヌクレオチド２のうち、最もリバースプライマの結合領域側に結合する。

また、第１オリゴヌクレオチド１ａ及び第２オリゴヌクレオチド２ａの鋳型核酸１００との相補的な塩基配列の塩基数は、第１オリゴヌクレオチド１ａ及び第２オリゴヌクレオチド２ａがそれぞれ鋳型核酸１００（アンチセンス鎖１００ａ及びセンス鎖１００ｂ）と結合を維持できれば特に限定されず、例えば、７塩基以上２５塩基以下、好ましくは、９塩基以上２５塩基以下、より好ましくは、１２塩基以上２５塩基以下、さらに好ましくは、１５塩基上２５塩基以下である。

この相補的な塩基配列は、Ｃ（シトシン）及びＧ（グアニン）の割合が相対的に高い方がよい。Ｃ及びＧは水素結合で結合され、Ａ（アデニン）及びＴ（チミン）よりも強い結合力を有するため、ＣＧの割合が高い方が相補的な配列における結合を強めることができる。

なお、第１オリゴヌクレオチド１ａ及び第２オリゴヌクレオチド２ａは、上述したように、鋳型核酸１００に結合する第１オリゴヌクレオチド１及び第２オリゴヌクレオチド２のうち最も高いＴｍ値（Ｔｍ（ｎ１ａ）及びＴｍ（ｎ２ａ））を有する。ここで、Ｔｍ（ｎ１ａ）＝Ｔｍ（ｎ２ａ）であってもよいが、Ｔｍ（ｎ１ａ）＞Ｔｍ（ｎ２ａ）とするためには、第１オリゴヌクレオチド１の塩基数を第２オリゴヌクレオチド２の塩基数よりも多くすればよい。又は、第１オリゴヌクレオチド１及び第２オリゴヌクレオチド２が同じ塩基数を有する場合であっても、第１オリゴヌクレオチド１を構成する塩基配列のＧＣの割合を高くすればよい。

次に、図３の（ｂ）に示すように、第１オリゴヌクレオチド１ｂは、第１オリゴヌクレオチド１ａよりも鋳型核酸１００（アンチセンス鎖１００ａ）の下流側に結合する。同様に、第２オリゴヌクレオチド２ｂは、第２オリゴヌクレオチド２ａよりも鋳型核酸１００（センス鎖１００ｂ）の下流側に結合する。

第１オリゴヌクレオチド１ｂのＴｍ値（Ｔｍ（ｎ１ｂ））は、第１オリゴヌクレオチド１ａのＴｍ値（Ｔｍ（ｎ１ａ））よりも低ければよく、第１オリゴヌクレオチド１ｃのＴｍ値（Ｔｍ（ｎ１ｃ））よりも高ければよい。すなわち、Ｔｍ（ｎ１ａ）＞Ｔｍ（ｎ１ｂ）＞Ｔｍ（ｎ１ｃ）であればよい。

同様に、第２オリゴヌクレオチド２ｂのＴｍ値（Ｔｍ（ｎ２ｂ））についても、他の第２オリゴヌクレオチド２ａ及び２ｃのＴｍ値（Ｔｍ（ｎ２ａ）及びＴｍ（ｎ２ｃ））に対し、Ｔｍ（ｎ２ａ）＞Ｔｍ（ｎ２ｂ）＞Ｔｍ（ｎ２ｃ）であればよい。

なお、第１オリゴヌクレオチド１ｂ及び第２オリゴヌクレオチド２ｂの鋳型核酸１００との相補的な塩基配列については、図３の（ａ）の説明で上述したものと同様であるため、ここでの説明を省略する。

また、図３の（ｃ）に示すように、第１オリゴヌクレオチド１ｃは、鋳型核酸１００（アンチセンス鎖１００ａ）に結合する第１オリゴヌクレオチド１のうち、フォワードプライマの結合領域から最も離れた領域（鋳型核酸１００の最も下流側）に結合する。同様に、第２オリゴヌクレオチド２ｃは、鋳型核酸１００（センス鎖１００ｂ）に結合する第２オリゴヌクレオチド２のうち、リバースプライマの結合領域から最も離れた領域（鋳型核酸１００の最も下流側）に結合する。

第１オリゴヌクレオチド１ｃ及び第２オリゴヌクレオチド２ｃのＴｍ値、並びに、第１オリゴヌクレオチド１ｃ及び第２オリゴヌクレオチド２ｃの鋳型核酸１００との相補的な塩基配列については、図３の（ｂ）の説明で上述したものと同様であるため、ここでの説明を省略する。

以上のように、複数種類の第１オリゴヌクレオチド１ａ〜１ｃを鋳型核酸１００（アンチセンス鎖１００ａ）の上流から下流に向かって順に鋳型核酸１００（アンチセンス鎖１００ａ）に結合させるためには、個々の第１オリゴヌクレオチド１ａ〜１ｃのＴｍ値（Ｔｍ（ｎ１ａ）〜Ｔｍ（ｎ１ｃ））に差異が生じるように設計すればよく、より好ましくは、互いのＴｍ値にそれぞれ１℃以上、より好ましくは２℃以上、さらに好ましくは３℃以上の差異が生じるように設計すればよい。

また、複数種類の第２オリゴヌクレオチド２ａ〜２ｃについても、鋳型核酸１００のセンス鎖１００ｂに結合する以外は、同様であるため、ここでの説明を省略する。

なお、上述したように、第１オリゴヌクレオチド１ａ〜１ｃのＴｍ値（Ｔｍ（ｎ１ａ）〜Ｔｍ（ｎ１ｃ））は、Ｔｍ（ｎ１ａ）＞Ｔｍ（ｎ１ｂ）＞Ｔｍ（ｎ１ｃ）であればよく、第２オリゴヌクレオチド２ａ〜２ｃのＴｍ値（Ｔｍ（ｎ２ａ）〜Ｔｍ（ｎ２ｃ））は、Ｔｍ（ｎ２ａ）＞Ｔｍ（ｎ２ｂ）＞Ｔｍ（ｎ２ｃ）であればよい。

そして、核酸検出用オリゴヌクレオチド５のＴｍ値（Ｔｍ（ｎ））をプライマ（フォワード（Ｆｗ）プライマ及びリバース（Ｒｖ）プライマ）のＴｍ値（Ｔｍ（ｐ））よりも大きくすることにより、図３の（ｄ）に示すように、プライマは、全ての核酸検出用オリゴヌクレオチド５が鋳型核酸１００に結合した後に、鋳型核酸１００に結合する。

このように、プライマが鋳型核酸１００に結合すると、ＤＮＡポリメラーゼが作用し、ＤＮＡの伸長反応が開始される。これにより、核酸検出用オリゴヌクレオチド５の分解が起こり、蛍光シグナルが発せられる。

［Ａ−２−３．蛍光のメカニズム］
本実施の形態における蛍光のメカニズムについて、図４を用いて説明する。図４は、本実施の形態に係る核酸検出用オリゴヌクレオチド５が蛍光を発する様子を説明する図である。

本実施の形態においては、図３の（ｄ）に示すように、全ての核酸検出用オリゴヌクレオチド５が鋳型核酸１００に結合した後、プライマ（フォワード（Ｆｗ）プライマ及びリバース（Ｒｖ）プライマ）が鋳型核酸１００に結合する。上述したように、これらのプライマが結合すると、ＤＮＡポリメラーゼの作用により、ＤＮＡの伸長反応が開始される。

図４に示すように、フォワードプライマが伸長（上記、ＤＮＡの伸長を指す。）する過程で、鋳型核酸１００のアンチセンス鎖１００ａに結合した第１オリゴヌクレオチド１ａは、ＤＮＡポリメラーゼの有する５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により分解される。このとき、第１オリゴヌクレオチド１ａに修飾されていた蛍光物質１０及び消光物質１１は、相互に空間的に分離され（例えば、分解された第１オリゴヌクレオチドの一部３ａ、３ｂ）、蛍光物質１０が蛍光シグナルを発する。

同様に、鋳型核酸１００のセンス鎖１００ｂに結合した第２オリゴヌクレオチド２ａもリバースプライマが伸長する過程で分解され、第２オリゴヌクレオチド２ａに修飾されていた蛍光物質１０及び消光物質１１が互いに空間的に分離され（例えば、分解された第２オリゴヌクレオチドの一部４ａ、４ｂ）、蛍光物質１０が蛍光シグナルを発する。

分解される前の第１オリゴヌクレオチド１及び第２オリゴヌクレオチド２では、蛍光物質１０及び消光物質１１が近接しているため、蛍光物質１０の有する蛍光シグナルを発する機能が消光物質１１により妨げられている。しかしながら、ＤＮＡの伸長過程で、第１オリゴヌクレオチド１及び第２オリゴヌクレオチド２が分解されると、消光物質１１の作用が及ばなくなり、蛍光物質１０は蛍光シグナルを発する。

この蛍光シグナルは、増幅された標的核酸の分子数（コピー数）に比例するため、得られる蛍光シグナルの強度に基づいて、標的核酸の初期濃度を算出することができる。

［Ｂ．プライマ］
本実施の形態におけるプライマは、Ｔｍ値の説明で上述したように、標的核酸の塩基配列により適宜設定することができる。なお、Ｔｍ値が相対的に高いほど、鋳型核酸に対する結合性が相対的に高くなるため、標的核酸の種類に応じて、好適なＴｍ値を有するプライマを設計してもよい。

［まとめ］
以上のように、本実施の形態に係る核酸検出用オリゴヌクレオチド５は、鋳型核酸１００に結合する、蛍光物質１０及び消光物質１１により修飾された核酸検出用オリゴヌクレオチド５であって、核酸検出用オリゴヌクレオチド５は、第１オリゴヌクレオチド１及び第２オリゴヌクレオチド２を含み、二本鎖である鋳型核酸１００のアンチセンス鎖１００ａに結合可能なフォワードプライマと、センス鎖１００ｂに結合可能なリバースプライマとに挟まれた領域において、第１オリゴヌクレオチド１は、鋳型核酸１００のアンチセンス鎖１００ａ及びセンス鎖１００ｂの一方の領域に結合し、第２オリゴヌクレオチド２は、鋳型核酸１００のアンチセンス鎖１００ａ及びセンス鎖１００ｂの他方の領域に結合し、第１オリゴヌクレオチド１及び第２オリゴヌクレオチド２は互いに相補的でない塩基配列を有する。

これにより、第１オリゴヌクレオチド１及び第２オリゴヌクレオチド２を含む核酸検出用オリゴヌクレオチド５が互いに結合することを抑制し、核酸検出用オリゴヌクレオチド５を鋳型核酸１００のアンチセンス鎖１００ａ及びセンス鎖１００ｂのそれぞれの領域（フォワードプライマとリバースプライマとに挟まれた領域）に結合させることができる。そのため、核酸検出用オリゴヌクレオチド５を鋳型核酸１００のアンチセンス鎖１００ａにのみ結合させる場合に比べ、鋳型核酸１００により多くの核酸検出用オリゴヌクレオチド５を結合させることができる。したがって、本実施の形態に係る核酸検出用オリゴヌクレオチド５は、鋳型核酸１００に、より多くの蛍光物質１０を付与することができ、微量の標的核酸であっても高感度に蛍光を検出することができる。

また、本実施の形態に係る核酸検出用オリゴヌクレオチド５では、第１オリゴヌクレオチド１及び第２オリゴヌクレオチド２の少なくとも一方は、２種類以上のオリゴヌクレオチドを含んでもよい。これにより、第１オリゴヌクレオチド１及び第２オリゴヌクレオチド２が二本鎖の鋳型核酸１００に互い違いに結合することができ、一本鎖の鋳型核酸１００（例えば、アンチセンス鎖１００ａ）にのみ核酸検出用オリゴヌクレオチド５を結合させる場合に比べ、鋳型核酸１００に、より多くの蛍光物質１０を付与することができる。

また、本実施の形態に係る核酸検出用オリゴヌクレオチド５では、上記２種類以上のオリゴヌクレオチド５のＴｍ値は、結合した鋳型核酸１００の３’末端側から５’末端側に向けて結合する順に小さくなってもよい。これにより、プライマ（フォワードプライマ及びリバースプライマ）の結合領域側から鋳型核酸１００の下流側に向かって順に、核酸検出用オリゴヌクレオチド５が鋳型核酸１００に結合する。そのため、核酸検出用オリゴヌクレオチド５の全てが鋳型核酸１００に結合する前にプライマが結合したとしても、ＤＮＡが伸長する間に、少しでも多くの核酸検出用オリゴヌクレオチド５を鋳型核酸１００に結合することができる。

さらに、本実施の形態に係る核酸検出用オリゴヌクレオチド５は、第１オリゴヌクレオチド１及び第２オリゴヌクレオチド２のそれぞれのＴｍ値は、フォワードプライマ及びリバースプライマのＴｍ値よりも大きくてもよい。これにより、核酸検出用オリゴヌクレオチド５は、フォワードプライマ及びリバースプライマが鋳型核酸１００に結合する前に、鋳型核酸１００に結合することができる。

以上、本開示に係る核酸検出用オリゴヌクレオチドについて、実施の形態に基づいて説明したが、本開示は、これらの実施の形態に限定されるものではない。本開示の主旨を逸脱しない限り、当業者が思いつく各種変形を実施の形態に施したものや、実施の形態における一部の構成要素を組み合わせて構築される別の形態も、本開示の範囲内に含まれる。

１、１ａ、１ｂ、１ｃ 第１オリゴヌクレオチド
２、２ａ、２ｂ、２ｃ 第２オリゴヌクレオチド
５ 核酸検出用オリゴヌクレオチド
１０ 蛍光物質
１１ 消光物質
１００ 鋳型核酸
１００ａ アンチセンス鎖
１００ｂ センス鎖

Claims (4)

1. 鋳型核酸に結合する、蛍光物質及び消光物質により修飾された核酸検出用オリゴヌクレオチドであって、
   前記核酸検出用オリゴヌクレオチドは、少なくとも第１オリゴヌクレオチド及び第２オリゴヌクレオチドを含み、
   センス鎖とアンチセンス鎖とからなる二本鎖である鋳型核酸のアンチセンス鎖に結合可能なフォワードプライマと、センス鎖に結合可能なリバースプライマとに挟まれた領域において、
   前記第１オリゴヌクレオチドは、前記鋳型核酸のアンチセンス鎖及びセンス鎖の一方の前記領域に結合し、
   前記第２オリゴヌクレオチドは、前記鋳型核酸のアンチセンス鎖及びセンス鎖の他方の前記領域に結合し、
   前記第１オリゴヌクレオチド及び前記第２オリゴヌクレオチドは互いに相補的でない塩基配列を有する、
   核酸検出用オリゴヌクレオチド。
2. 前記第１オリゴヌクレオチド及び前記第２オリゴヌクレオチドの少なくとも一方は、２種類以上のオリゴヌクレオチドを含む、
   請求項１に記載の核酸検出用オリゴヌクレオチド。
3. 前記２種類以上のオリゴヌクレオチドのＴｍ値は、結合した前記鋳型核酸の３’末端側から５’末端側に向けて結合する順に小さくなる、
   請求項２に記載の核酸検出用オリゴヌクレオチド。
4. 前記第１オリゴヌクレオチド及び前記第２オリゴヌクレオチドのそれぞれのＴｍ値は、前記フォワードプライマ及び前記リバースプライマのＴｍ値よりも大きい、
   請求項１〜３のいずれか１項に記載の核酸検出用オリゴヌクレオチド。

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