JP2019502374A5

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Publication number: JP2019502374A5
Application number: JP2018529612A
Authority: JP
Filing date: 2016-12-08
Publication date: 2020-01-16
Anticipated expiration: 2036-12-08

Claims

断片化核酸を連結するための均一な方法であって、以下のステップ：
断片化された標的核酸を含む可能性があるサンプルを、
何れかの標的核酸が前記サンプル中に存在する場合、第１のセンス鎖及び第１のアンチセンス鎖を含む第１の増幅産物を産生するための第１の塩基配列及び第２の塩基配列を含む一対の外部プライマーと、
第３の塩基配列及び第４の塩基配列を含む互いに相補的な一対の内部プライマーであって、前記第３の塩基配列が、前記第１の増幅産物の前記第１のアンチセンス鎖にハイブリダイズして、第２の増幅産物の第２のセンス鎖を生じるように構成されており、前記第４の塩基配列が、前記第１の増幅産物の前記第１のセンス鎖にハイブリダイズして前記第２の増幅産物の第２のアンチセンス鎖を生じるように構成されている前記一対の内部プライマーに、
接触させることを含む、増幅ステップを行うこと；と、
前記第１のセンス鎖の第１の３’末端領域を前記第１のアンチセンス鎖の第２の３’末端領域とアニーリングすること、ここで、前記第１のセンス鎖の前記第１の３’末端領域が、前記第１のアンチセンス鎖上の第１のセンス鎖の伸長をプライミングし、前記第１のアンチセンス鎖の前記第２の３’末端領域が、前記第１のセンス鎖上の前記第１のアンチセンス鎖の伸長をプライミングする、と、
前記第２のセンス鎖の第３の３’末端領域を前記第２のアンチセンス鎖の第４の３’末端領域とアニーリングすること、ここで、前記第２のセンス鎖の前記第３の３’末端領域が、前記第２のアンチセンス鎖上の前記第２のセンス鎖の伸長をプライミングし、前記第２のアンチセンス鎖の前記第４の３’末端領域が、前記第２のセンス鎖上の前記第２のアンチセンス鎖の伸長をプライミングする、により、
完全長標的核酸を得ること；とを含み、
全てのステップが均一な様式で実施される、前記方法。
完全長増幅産物を１つまたは複数の検出可能なプローブと接触させることを含むハイブリダイズステップを行うこと；と、
完全長増幅産物の存在又は非存在を検出すること、ここで、前記完全長増幅産物の存在が、前記サンプル中の前記標的核酸の存在を示し、前記完全長増幅産物の非存在が、前記サンプル中の前記標的核酸の非存在を示す；とをさらに含む、請求項１に記載の方法。
前記ハイブリダイズステップが、前記完全長増幅産物を、ドナー蛍光部分及び対応するアクセプター部分で標識された第５の塩基配列を含む前記１つまたは複数の検出可能プローブのうちの１つと接触させることを含み、
前記検出ステップが、プローブのドナー蛍光部分とアクセプター部分との間の蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の存在又は非存在を検出すること、ここで、蛍光の存在又は非存在が、前記サンプル中の前記標的核酸の存在又は非存在を示す、を含む、
請求項２に記載の方法。
前記増幅ステップが、５’から３’のヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ酵素を使用する、請求項１から３の何れか一項に記載の方法。
前記ドナー蛍光部分及び前記対応するアクセプター部分が、前記プローブ上で互いに８ヌクレオチド以内である、請求項２から４の何れか一項に記載の方法。
前記アクセプター部分がクエンチャーである、請求項３から５の何れか一項に記載の方法。
前記ハイブリダイズステップが、前記完全長増幅産物の二本鎖核酸との相互作用の際に蛍光シグナルを発する二本鎖ＤＮＡ結合色素を含む分子プローブを含む前記１つまたは複数の検出可能プローブのうちの１つと前記完全長増幅産物とを接触させることを含み、
前記検出ステップが、融解曲線分析により蛍光共鳴の存在又は非存在を検出することであって、蛍光の存在又は非存在が、前記サンプル中の前記標的核酸の存在又は非存在を示すこと含む、
請求項２に記載の方法。
互いに相補的な前記一対の内部プライマーの相対濃度が、前記一対の外部プライマーの濃度以下である、請求項１から７の何れか一項に記載の方法。
前記増幅ステップが、断片化された標的核酸を含む可能性がある前記サンプルを、互いに相補的な内部プライマーの第２の対と接触させることをさらに含む、請求項１から８の何れか一項に記載の方法。
断片化核酸を連結するためのキットであって、
標的核酸の何れかがサンプル中に存在する場合、第１のセンス鎖及び第１のアンチセンス鎖を含む第１の増幅産物を産生するための第１の塩基配列及び第２の塩基配列を含む一対の外部プライマー；と、
第３の塩基配列及び第４の塩基配列を含む一対の自己相補的内部プライマーであって、前記第３の塩基配列が、前記第１の増幅産物の前記第１のアンチセンス鎖にハイブリダイズして、第２の増幅産物の第２のセンス鎖を生じるように構成されており、前記第４の塩基配列が、前記第１の増幅産物の前記第１のセンス鎖にハイブリダイズして前記第２の増幅産物の第２のアンチセンス鎖を生じるように構成されている前記一対の自己相補的内部プライマー；と、
を含む前記キット。
ドナー蛍光部分及び対応するアクセプター部分を含む第５の検出可能に標識された塩基配列をさらに含む、請求項１０に記載のキット。
前記第１、第２、第３、第４、及び第５のオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも１つが少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項１０から１１の何れか一項に記載のキット。
前記一対の自己相補的内部プライマーの相対濃度が、前記一対の外部プライマーの濃度以下である、請求項１０から１２の何れか一項に記載のキット。