CN103114146B - 一种检测K-ras基因突变的试剂盒及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测K-ras基因突变的试剂盒及其检测方法。所述试剂盒包括扩增引物对，TaqMan-MGB探针和PNA；所述扩增引物序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；所述TaqMan-MGB探针序列如SEQ ID NO:3所示；所述PNA序列SEQ ID NO:4所示。所述检测方法包括提取待测样本DNA，K-ras野生型及其突变型质粒标准品的制备，检测K-ras基因突变，检测K-ras基因突变的定性判断和标准曲线绘制及突变定量分析等几个步骤。本发明具有快速、简便、高灵敏、高通量的特点，可用于组织、尿液、血清或血浆临床标本的K-ras基因突变的定性或定量检测。

Description

一种检测K-ras基因突变的试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明属于分子检测技术领域，具体是涉及一种用于定量检测组织、尿液、血清或血浆中是否含有K-ras突变型基因的试剂盒及其检测方法。

背景技术

K-ras的突变激活是人类多种肿瘤细胞恶性转化的主要原因之一，有如分子开关，正常时能控制调控细胞生长的路径；发生异常时导致细胞增殖失控，并阻止细胞自我毁灭。K-ras基因突变多发生在第12、13密码子，这种异常在胰腺癌（75%-95%）、结直肠癌（40%-50%）和肺癌（20%-30%）等肿瘤组织中发生率较高，在这些肿瘤患者的血清或血浆中也常能检测到K-ras基因突变。

目前，靶向治疗已经成为肿瘤临床治疗的重要手段。大量临床证据表明，K-ras基因发生突变的结直肠癌患者在接受西妥昔单抗、帕尼单抗等靶向药物治疗时效果很差，而K-ras野生型患者对这些靶向药物表现出良好的疗效。目前K-ras基因检测已被写入《美国国立癌症综合网络（NCCN）结直肠癌临床实践指南》，要求所有转移性结直肠癌患者都应检测K-ras基因状态，并且只有K-ras野生型患者才建议接受西妥昔单抗和帕尼单抗治疗。

临床工作中并不是所有的病人都能获得肿瘤标本，尤其是一些复发和初发时已有远处转移，或者是处于癌症晚期、不能耐受手术的癌症患者，血清或血浆K-ras基因突变检测可为其提供用药指导。Gerlinger等（2012）对肿瘤异质性的专门研究表明，肿瘤组织不同部位的体细胞基因突变谱并不相同，提示血清或血浆K-ras基因突变检测有可能比采用单一的肿瘤活检组织进行检测更具有临床指导意义。越来越多的研究也表明，癌症病人的血清或血浆中能否检测到癌细胞逸出的突变DNA，以及分析血清或血浆中肿瘤基因含量的变化，可以为肿瘤的疗效监测及预后提供重要的参考。这种方法的优点包括低侵袭性，方便在不同时间点获取样本，没有空间抽样偏差。

不论是采用肿瘤组织检测还是采用血清或血浆检测，K-ras基因突变检测的是来源于肿瘤组织的体细胞突变，不同于检测一般性的遗传突变；在肿瘤组织中尤其在血清或血浆中存在大量野生型DNA，相当一部分患者其血清或血浆的K-ras基因突变比例低于1%。目前临床上仍大都采用测序法等灵敏度>5%的检测手段，突变基因特异扩增PCR法（ARMS）的检测灵敏度一般也在1%-5%之间，不能很好地适用于血清或血浆K-ras基因突变检测。在2012年6月的Nature杂志上，分别来自意大利和美国的两个研究小组报告称，相当一部分结直肠癌的靶向药物耐药是与患者肿瘤组织本就存在K-ras基因突变有关，只是由于这些患者肿瘤组织的K-ras基因突变率较低，因此测序法等常规手段难以检出。

发明内容

本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种高灵敏度、操作简便、定量检测患者的肿瘤组织、血清或血浆中是否携带K-ras基因突变的试剂盒及方法。

为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：

一种检测K-ras基因突变的试剂盒，包括如下成分：

扩增引物对，TaqMan-MGB探针和PNA；

其中，所述扩增引物序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；

所述TaqMan-MGB探针序列如SEQ ID NO:3所示；

所述PNA序列SEQ ID NO:4所示。

另外，所述TaqMan-MGB探针5’端连接有FAM标记的荧光发光基团,3’端连接有MGB标记的荧光淬灭基团。

一种应用权利要求1所述试剂盒检测K-ras基因突变的方法，包括如下步骤：

（1）提取待测样本DNA；

（2）K-ras野生型及其突变型质粒标准品的制备

采集含有K-ras野生型DNA及其突变型DNA的样品，提取野生型DNA和突变型DNA，K-ras野生型DNA的序列如SEQ ID NO:5所示，所述K-ras突变型DNA为SEQ IDNO:6～SEQ ID NO:12所示序列中的任意一种；野生型DNA用SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:2所示的引物对进行PCR扩增，PCR反应体系为:

PCR反应程序为：95°C 30s；95°C 5s，75°C 20s，52°C 30s，进行40个循环；

突变型DNA用SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物对及SEQ ID NO:4所示PNA进行PCR扩增，PCR反应体系为:

PCR反应程序为：95°C 30s；95°C 5s，75°C 20s，52°C 30s，进行40个循环；

通过琼脂糖凝胶电泳切胶回收DNA片段，并进行纯化，制备成浓度为3×10¹⁰拷贝数/μL的野生型质粒和突变型质粒；将野生型质粒和突变型质粒分别倍比稀释至10⁴、10³、10²、10¹和10⁰；将突变型质粒与野生型质粒以1:100的拷贝数比例混合成1%突变比例混合质粒；

（3）检测K-ras基因突变

以稀释至10³的野生型质粒为阴性对照，ddH₂O为空白对照，1%突变比例混合质粒为阳性对照，对待测样本DNA进行荧光PCR检测，测定CT值；PCR反应体系中未加入PNA的CT值记为CT_-PNA，反应体系中加入PNA的CT值记为CT_+PNA，ΔCT=CT_+PNA-CT_-PNA；其中，要求稀释至10³的野生型质粒和空白对照管的CT_+PNA＞37或无CT值显示，1%突变比例混合质粒的ΔCT＜8；

（4）检测K-ras基因突变的定性判断

若待检样本DNA的CT_+PNA>37或无CT值显示，则判断为突变阴性；

若待检样本DNA的CT_+PNA≤37，则计算其ΔCT；若ΔCT>10，判断为突变阴性；若ΔCT<8，判断为突变阳性；8≤ΔCT≤10，判断为突变可疑，再次检测其CT_-PNA和CT_+PNA，若ΔCT仍＜10，则判断为突变阳性，否则判断为突变阴性；

（5）标准曲线绘制及突变定量分析

以稀释至10⁴、10³、10²和10¹的野生型质粒作为模板，按照测定CT_-PNA时的PCR反应体系进行PCR，得到4种浓度模板的CT_-PNA值，以CT_-PNA值为纵坐标，以野生型质粒浓度为横坐标绘制标准曲线；根据标准曲线和经步骤（4）定性判断标准定为阳性突变的样本DNA的CT_-PNA值、CT_+PNA值求得CT_-PNA值、CT_+PNA值分别对应的拷贝数，计算K-ras基因突变率，K-ras基因突变率=CT_+PNA对应的拷贝数/CT_-PNA对应的拷贝数。

4、如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（3）所述加入PNA的PCR反应体系为：

加入PNA的PCR反应PCR程序为：95°C 30s；95°C 5s，75°C 20s，52°C 30s，进行40个循环；

所述不加PNA的PCR反应体系为

所述不加PNA的PCR反应程序为：95°C 30s；95°C 5s，75°C 20s，52°C 30s，进行40个循环。

本发明还提供了一种扩增K-ras基因（包括K-ras野生型基因和K-ras突变型基因）的引物对，所述引物对序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；一种TaqMan-MGB探针，所述TaqMan-MGB探针序列如SEQ ID NO:3所示，所述TaqMan-MGB探针5’端连接有FAM标记的荧光发光基团,3’端连接有MGB标记的荧光淬灭基团；一种PNA，所述PNA序列如SEQ ID NO:4所示。

下面对本发明作进一步说明和解释：

本发明设计了一对PCR引物用于扩增K-ras基因，设计了一条PNA用于阻滞野生型K-ras基因的扩增，设计一条TaqMan-MGB探针用于检测K-ras基因的扩增信号，利用PCR引物、PNA及探针，对已知突变量的质粒标准品（可以为本发明所述的7种K-ras基因突变型质粒中的任何一种）进行实时定量PCR检测，根据CT值，得出标准曲线，从而计算出样本中的突变K-ras基因含量。

PCR引物对由上游引物和下游引物组成，上游引物为5’-TGACATGTTCTAATATAGTCACATT-3’（SEQ ID NO:1）,下游引物为5’-AGCTGTATCGTCAAGGCACTCT-3’（SEQ ID NO:2），扩增片段长124bp；

TaqMan-MGB探针长17bp，序列为5’-CCTGCTGAAAATGACTG-3’（SEQ ID NO:3）,其5’端标记有FAM荧光发光基团，3’端标记有MGB荧光淬灭基团；

PNA长16bp，序列为NH2-CCTACGCCACCAGCTC-COOH（SEQ ID NO:4）。

总之，本发明在荧光探针和PNA钳制技术的基础上，建立了检测K-ras基因12和13密码子七种常见突变的实时PCR定量方法。此方法的有益效果为：（1）灵敏度高，可达千分之一，最低检测限仅为1-2拷贝；（2）与普通PCR相比，其结果可实时观察，产物不需要凝胶电泳检测，完全闭管操作，有效地降低了PCR产物污染的风险；（3）检测速度快，适用于高通量的样本检测。

附图说明

图1为梯度稀释的野生型质粒标准品不加入PNA的扩增曲线；图1中，①至⑤依次为10⁴、10³、10²、10¹、10⁰的野生型质粒标准品的扩增曲线，⑥为空白对照管（ddH₂O）的扩增曲线；

图2为梯度稀释的野生型质粒标准品加入PNA后的扩增曲线；图2中，①和②分别为10⁴和10³的野生型质粒标准品的扩增曲线，③为10²、10¹、10⁰的野生型质粒标准品及其空白对照管（ddH₂O）的扩增曲线（无CT值显示）；

图3为梯度稀释的突变型质粒加入PNA后的扩增曲线；图3中，①至⑤依次为10⁴、10³、10²、10¹、10⁰的G12D突变型质粒标准品的扩增曲线，⑥为空白对照管（ddH₂O）的扩增曲线；

图4为不同突变比例的混合质粒加入PNA后的扩增曲线；图4中，①为10⁴的野生型质粒标准品的扩增曲线（不加PNA），②至⑥依次为10⁴的野生型质粒标准品与突变型质粒以10:1、100:1、200:1、1000:1和2000:1比例混合的扩增曲线（加入PNA），⑦为10⁴的野生型质粒标准品以及与突变型质粒以5000:1比例混合后的扩增曲线（加入PNA），⑧为空白对照管（ddH₂O）的扩增曲线；

图5为梯度稀释的野生型质粒标准品不加入PNA的标准曲线；图5中，截距：37.14，斜率：-3.11，误差0.007，相关系数：-0.999，效率：109.72。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图及实施例，对本发明进行进一步的详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1：高灵敏度K-ras基因突变检测体系的建立

1.引物、PNA和探针的设计与合成

针对K-ras基因的1号外显子区域，设计4条荧光探针和相应的PCR引物对，通过大量实验，从中优选出一条探针及其相对应的引物对。引物与荧光探针均委托专业公司合成，其中标记探针5’端的荧光报告基团为FAM；标记探针3’端的荧光猝灭基团为MGB。PNA序列由国内某专业公司合成。

2.K-ras基因野生型及其七种常见突变型质粒模板标准品的制备

1）从医院搜集K-ras野生型（SEQ ID NO:5）和七种常见突变型（SEQ ID NO:6～SEQ IDNO:12）的结直肠癌肿瘤组织标本，提取DNA，野生型DNA用SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:2所示的引物对进行PCR扩增，PCR反应体系及程序为:

95°C 30s；95°C 5s，75°C 20s，52°C 30s，进行40个循环。

突变型DNA用SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物对及SEQ ID NO:4所示PNA进行PCR扩增，PCR反应体系及程序为:

95°C 30s；95°C 5s，75°C 20s，52°C 30s，进行40个循环。

通过琼脂糖凝胶电泳切下目标DNA片段，并进行纯化。

2）将上述八种纯化的PCR产物按以下方式分别连接到pMD18*T载体上。

纯化的PCR扩增产物        4.5μl

16℃连接过夜；

3）将连接产物转化至大肠杆菌JM109感受态细胞中。

自-70℃冰箱中取出受感态大肠杆菌，插入湿冰中溶解约15分钟，轻轻混匀。吸取50ul移入1.5ml管，并立刻将细菌放回-70℃冰箱。

细菌      50ul

DNA       5ul

轻轻混匀，静置冰上30分钟。

于42℃水浴中热休克细菌45秒，迅速移入湿冰中，静置2分钟，加入900ul LB培养液，放入37℃恒温箱摇床，200rpm摇晃培养1小时。取200ul涂于含氨卞青霉素的LB琼脂平板皿上，待干燥后，倒置，存放于37℃的培养箱中过夜；

4）次日，挑选单克隆菌落，接种，摇菌；

5)进行菌落PCR，送PCR产物进行DNA测序鉴定；鉴定成功后，摇菌，提取质粒，于-20℃保存。

提取的质粒，紫外分光光度计定量，稀释到浓度为3×10¹⁰拷贝数/μL，将模板倍比稀释为10⁴、10³、10²、10¹、10⁰。

3．荧光PCR扩增

以上述八种梯度稀释的质粒标准品为模板，进行两次PCR扩增，其中一次在体系中加入PNA（见表1），另一次不加入PNA，分析加入PNA与否对野生型K-ras及其七种突变型K-ras质粒扩增的影响。

将上述七种突变型质粒分别与野生型质粒以1:10、1:100、1:200、1:1000、1:2000和1:5000的比例混合，分析两次PCR扩增CT值的变化（ΔCT=CT_+PNA-CT_-PNA）。

PCR反应程序为：

95°C 30s；95°C 5s，75°C 20s，52°C 30s（荧光采集），进行40个循环。

表1

4．结果分析

以10⁴、10³、10²、10¹、10⁰的野生型质粒标准品为模板，进行两次PCR扩增，一次反应体系中不加入PNA，扩增曲线如图1所示；另一次反应体系中加入PNA，分析加入PNA对野生型质粒标准品扩增的影响。其中10⁴的野生型质粒加入PNA后虽然仍产生扩增信号，但也受到了强烈的抑制，使得加入PNA前后CT值的变化（ΔCT=CT_+PNA-CT_-PNA）大于11，结果如图2所示。加入PNA后，10³、10²、10¹、10⁰的野生型质粒扩增受到完全抑制，无CT值显示。分别以10⁴、10³、10²、10¹、10⁰的七种突变型质粒为模板，进行两次PCR扩增，结果加入PNA前后CT值无明显变化（ΔCT<0.5），其中10⁴、10³、10²、10¹、10⁰的突变型质粒加入PNA后的扩增曲线如图3所示。

将上述七种突变型质粒标准品分别与10⁴的野生型质粒以1:10、1:100、1:200、1:1000、1:2000和1:5000的比例混合，比较两次PCR扩增的CT值差异，结果1:10突变比例混合时ΔCT接近3.5,1:100比例混合时ΔCT接近7,1:1000比例混合时ΔCT接近10，1:5000比例混合时ΔCT接近12，与10⁴的纯野生型质粒的ΔCT接近（结果如图4所示），说明本方法的检测灵敏度可达千分之一。

实施例2：本方法与测序法检测结直肠癌K-ras基因突变的比较

1.DNA提取

从肿瘤医院搜集78例新鲜的结直肠癌组织标本，采用组织DNA提取试剂盒完成DNA提取。

2．本发明方法检测K-ras基因突变

参考表1配置50μl PCR反应体系，10³的野生型K-ras质粒作为阴性对照，2μl ddH₂O作为空白对照，1%突变比例混合质粒作为阳性对照，将反应管放入荧光PCR检测仪内，记录样本摆放顺序，循环条件设置为95℃ 30s，（95℃ 5s，75℃ 20s，52℃ 30s）40次循环；荧光检测通道设置为FAM，增益设置为6。

3．本发明方法检测K-ras基因突变的定性判断

反应体系中未加入PNA的CT值定为CT_-PNA，反应体系中加入PNA的CT值定为CT_+PNA；10³的野生型K-ras质粒和空白对照管的CT_+PNA需大于37或无CT值显示，1%突变比例混合质粒的ΔCT（CT_+PNA-CT_-PNA）需小于8。

对于待检样本：若CT_+PNA>37或无CT值显示，判断为突变阴性；

若CT_+PNA≤37，计算ΔCT=CT_+PNA-CT_-PNA，若ΔCT>10，判断为突变阴性，若ΔCT<8，判断为突变阳性；8≤ΔCT≤10，判断为突变可疑，可再次检测CT_-PNA和CT_+PNA，若ΔCT仍小于10，判断为突变阳性，否则判断为突变阴性。

4．K-ras基因突变的测序分析

将反应体系中未加入PNA的所有待检样本的PCR产物交由专业测序公司完成测序。

5．标准曲线绘制及突变定量分析

10⁴、10³、10²、10¹的野生型质粒标准品作为模板，参考表1配置50μl PCR反应体系（不加入PNA），得到4种浓度模板的CT值（CT_-PNA），以此绘制标准曲线（如图5所示）；PCR反应体系中PNA的存在并不影响突变型的扩增，因此10⁴、10³、10²、10¹的突变型质粒标准品的CT_+PNA与10⁴、10³、10²、10¹的野生型质粒标准品的CT_-PNA是一一对应的。对于未知样本DNA，通过上述定性判断标准定为突变型后，可进一步根据绘制的标准曲线和CT_-PNA与CT_+PNA，计算出K-ras基因突变率=CT_+PNA对应的拷贝数/CT_-PNA对应的拷贝数。

6．结果与分析

统计测序法和PNA-钳制荧光PCR法检测K-ras基因突变的效果，78例结直肠癌中基因测序阳性22例，经PNA-钳制荧光PCR法检测全部为突变阳性，ΔCT均小于3.5（定量分析结果显示突变比例在12.3%-45.8%）；基因测序阴性56例，其中有8例经PNA-钳制PCR法检测为突变阳性（其中有3例突变比例在1%以下），两种方法定性检测K-ras基因突变的结果如表2所示。

表2

Claims (2)

1.一种检测K-ras基因突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如下成分：

扩增引物对，TaqMan-MGB探针和PNA；

其中，所述扩增引物序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；

所述TaqMan-MGB探针序列如SEQ ID NO:3所示；

所述PNA序列SEQ ID NO:4所示。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述TaqMan-MGB探针5’端连接有FAM标记的荧光发光基团, 3’端连接有MGB标记的荧光淬灭基团。