CN110452988A

CN110452988A - 检测esr1基因突变的引物组、试剂、试剂盒和方法

Info

Publication number: CN110452988A
Application number: CN201910797590.8A
Authority: CN
Inventors: 张喆; 程德勇; 吴亚; 蔡从利
Original assignee: Wuhan Youzhiyou Medical Technology Co Ltd
Current assignee: Wuhan Youzhiyou Medical Technology Co Ltd
Priority date: 2019-08-27
Filing date: 2019-08-27
Publication date: 2019-11-15

Abstract

本发明公开了一种检测ESR1基因突变的引物组、试剂、试剂盒和方法，涉及生物医学领域。本发明公开的检测ESR1基因突变的引物组包括如下引物组合中的任意一种或多种：引物组合1、引物组合2和引物组合3。该引物组可以准确检测ESR1基因的11种突变，具有灵敏度高和特异性好的优势，可以准确检测总量为20ngDNA样本中0.1％比例的突变。并且能够适用于组织样本和血浆样本的检测，能够灵活适应临床检测的需求，检测方法操作过程简单，检测结果清晰明了易分析。

Description

检测ESR1基因突变的引物组、试剂、试剂盒和方法

技术领域

本发明涉及生物医学领域，具体而言，涉及一种检测ESR1基因突变的引物组、试剂、试剂盒和方法。

背景技术

乳腺癌是严重威胁我国女性健康的恶性肿瘤之一，2018年3月23日，国家癌症中心发布了中国女性乳腺癌的最新数据，估计了2014年中国女性乳腺癌的发病与死亡情况，结果显示，乳腺癌位居女性恶性肿瘤发病首位。根据国家癌症中心公布的数据，2014年全国女性乳腺癌新发病例约27.89万例，占女性恶性肿瘤发病16.51％，位居女性恶性肿瘤发病第1位。

在全球范围内，中国占据新诊断乳腺癌病例的12.2％，占据乳腺癌死亡的9.6％。根据国际癌症研究署(International Agency for Research on Cancer，IARC)全球癌症发布报告，中国女性乳腺癌的发病率和死亡率在全球184个国家和地区中处于较低水平，但是发病人数占全球的11.19％，仅次于美国，且近20年来发病率与死亡率增长迅速，防控形势十分严峻。

乳腺癌为激素依赖性肿瘤，雌激素可刺激乳腺癌细胞的生长和增值，在乳腺癌的发生、发展及侵袭、转移中发挥重要作用。因此，内分泌治疗通过降低体内雌激素水平或者抑制雌激素的作用，从而达到抑制肿瘤细胞生长的目的。

使用芳香化酶抑制剂(aromatase inhibitors，AI)是目前内分泌治疗中一种非常重要的手段。

ESR1(Estrogen receptor 1)即为雌激素受体α，其编码的雌激素受体(ER)是Luminal亚型乳腺癌发生发展的主要驱动基因之一。获得ESR1突变是芳香化酶抑制剂耐药的一个重要机制。雌激素与ER受体结合启动乳腺癌肿瘤细胞转录与增殖，AI可以抑制雌激素与ER受体结合，从而抑制肿瘤细胞的转录与增殖，一旦ESR1突变，ER受体在没有雌激素作用下依然能启动肿瘤细胞的转录和增殖，对AI产生耐药。ESR1突变主要发生在经过AI治疗后的乳腺癌患者中，原发肿瘤几乎没有ESR1突变。ESR1突变的乳腺癌患者若使用AI作为内分泌治疗，将缩短患者的无进展生存期(progression-free survival，PFS)。因此，检测ESR1基因突变情况对预测AI是否耐受，指导乳腺癌患者的内分泌治疗具有重要的意义。

目前针对基因突变的检测方法很多，如Sanger测序法，二代测序法、ARMS-qPCR法、数字PCR法等。其中，Sanger测序法技术成本低，普及广泛，是目前突变检测的金标准。但其检测灵敏度较低，组织样本中仅能检出10-15％以上的突变，对于较低丰度突变样本则无法检出，更不能满足血样本检测的需求。二代测序法检测灵敏度高，能够达到1％甚至0.1％的突变检测，但其所使用仪器昂贵，操作复杂，检测周期较长，临床推广起来也存在很大的困难。ARMS-qPCR法检测灵敏度高，操作简单，检测时间也较短，是目前临床上组织样本突变检测的主流方法。但其检测灵敏度基本在1％左右，对于血浆样本而言，由于其中游离核酸含量非常少，需要检测方法灵敏度更低，检测的绝对拷贝数低至个位数，才能准确检测出来。因此ARMS-qPCR法对于血浆样本检测仍然存在一定的局限性。

数字PCR法是近年来血浆样本突变检测中所使用较多的方法之一，其检测灵敏度非常高，达到了0.01％甚至更低。并且数字PCR不依赖传统荧光定量PCR的Ct值，是真正意义上的绝对定量，可以确定低至单拷贝待检靶分子的绝对数目。但该方法使用仪器较贵，试剂成本较高，且操作上虽然比二代测序简单很多，但依然没有传统荧光定量PCR方便，且对人员要求更加高，所以目前并没有得到很大规模的使用。

目前关于ESR1突变检测已报道的文献和专利中，用于组织样本的突变检测多以Sanger测序法和ARMS-qPCR法为主，血浆样本的突变检测则多使用数字PCR。

对于肿瘤靶向药物的基因突变检测，传统的组织样本是目前最常规、最为准确的待检样本。具体的对于ESR1突变检测而言，其最大的意义在于预测乳腺癌患者内分泌治疗过程中出现的耐药，反复的获取组织样本对患者伤害较大，并且人体组织并不是可重复再生的资源，所以从临床实际使用上来看使用组织样本检测有很大的局限性。随着医学的发展，液体活检技术以其无创性及样品易于获得且内容丰富的特点，受到了极大地关注。越来越多的临床研究表明，组织样本和血浆样本检测结果有着较高的一致性。通过采取患者血液提取其中游离DNA(ctDNA)进行检测，可以对患者治疗过程中进行动态监测，一出现耐药突变即可调整治疗方案，对患者治疗效果会更佳。因此，使用血浆样本进行ESR1基因突变检测，对临床而言更有意义。

常规的ARMS-PCR方法灵敏度只能稳定达到1％突变检测，但血浆样本中游离的DNA往往碎片化并且总量非常少，为了达到较好的突变检测效果，采集患者的血液越多越好，但采集血液越多，对患者伤害越大且操作起来也更加繁琐，不利于临床实际推广。目前临床上推荐采集患者5-10ml全血用于后续检测。这样，所提取的游离DNA浓度有限，不可以无限量的提高上样量，这也要求所选择的检测方法其灵敏度要达到更高。

目前临床上并没有一个较好且较为方便的方法能够对血浆样本ESR1基因突变检测达到非常好的效果，且没有一种较好方法能够兼容组织和血浆这两种样本类型的检测，解决临床需求的痛点和难点。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测ESR1基因突变的引物组。

本发明的另一目的在于提供一种检测ESR1基因突变的试剂。

本发明的另一目的在于提供一种检测ESR1基因突变的试剂盒。

本发明的另一目的在于提供一种检测ESR1基因突变的方法。

本发明是这样实现的：

第一方面，本发明提供了一种检测ESR1基因突变的引物组，其包括如下引物组合中的任意一种或多种：引物组合1、引物组合2和引物组合3；

其中，引物组合1包括：SEQ ID NO.12所示的下游引物、SEQ ID NO.15所示的特异性探针以及选自SEQ ID NO.1-9中任意一种或几种的上游引物；

引物组合2包括：SEQ ID NO.13所示的下游引物、SEQ ID NO.16所示的特异性探针以及SEQ ID NO.10所示的上游引物；

引物组合3包括：SEQ ID NO.14所示的下游引物、SEQ ID NO.17所示的特异性探针以及SEQ ID NO.11所示的上游引物。

其中，引物组合1可以检测D538G、Y537N、Y537S、Y537C、L536R、L536H、L536P、L536Q和V534E突变位点。

具体的，SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.1的引物组合1-a可以检测D538G；

SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.2的引物组合1-b可以检测Y537N；

SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.3的引物组合1-c可以检测Y537S；

SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.4的引物组合1-d可以检测Y537C；

SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.5的引物组合1-e可以检测L536R；

SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.6的引物组合1-f可以检测L536H；

SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.7的引物组合1-g可以检测L536P；

SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.8的引物组合1-h可以检测L536Q；

SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.9的引物组合1-i可以检测V534E。

引物组合2检测E380Q突变位点；引物组合3检测S463P突变位点。

上述11种突变位点所对应的碱基变化如下表1所示。

表1：ESR1基因突变类型对应的碱基突变

突变编号	氨基酸序列突变	碱基序列突变
			1	D538G	1613A>G
2	Y537N	1609T>A
			3	Y537S	1610A>C
4	Y537C	1610A>G
			5	L536R	1607T>G
6	L536H	1607T>A
			7	L536P	1607T>C
8	L536Q	1607_1608TC>AG
			9	V534E	1601T>A
10	E380Q	1138G>C
			11	S463P	1387T>C

该引物组可以准确检测ESR1基因11种突变，具有灵敏度高并且特异性好的优势，灵敏度达到20ngDNA样本中0.1％比例的突变准确检出。并且能够兼容组织样本和血浆样本的检测，能够灵活适应临床检测的需求。操作过程简单，检测结果清晰明了易分析。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述引物组还包括质控引物，所述质控引物的碱基序列如SEQ ID NO.18所示。将质控引物与SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.15组合，用于样本质量评定。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，每个引物组合中的特异性探针(SEQ IDNO.15-17)其两端分别带有荧光报告基团和荧光淬灭基团；

优选地，所述荧光报告基团选自FAM、VIC、ROX、CY3或CY5中的任意一种；

优选地，所述荧光淬灭基团选自TAMRA、BHQ1、BHQ2或NFQ中的任意一种。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，特异性探针的荧光报告基团为FAM，特异性探针的荧光淬灭基团均为NFQ(Non-Fluorescent Quencher)。NFQ基团本身不产生荧光，因此可以大大降低本底信号的强度。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，每个引物组合中的探针(SEQ ID NO.15-17)为MGB特异性探针，其连接有MGB修饰基团(例如MGB-NFQ)；MGB修饰基团与所述荧光淬灭基团连接。

MGB修饰基团本身不产生荧光，因此可以大大降低本底信号的强度，特异性探针上连接MGB修饰基团，可以将探针的Tm值提高10℃左右，因此同样的Tm值，MGB探针可以比普通Taqman探针设计的更短，使得探针在退火过程中能优先于模板结合，特异性更强。

本发明提供的引物组可以基于荧光定量PCR，对ESR1基因的11种突变位点(D538G、Y537N、Y537S、Y537C、L536R、L536H、L536P、L536Q、V534E、E380Q、S463P)进行检测，该引物组中的上游引物经过合理优化，有效地提高了其检测的灵敏度，可以准确检测低拷贝突变，能够满足临床常规组织样本检测需求。并进一步通过引物改进，增强整体性能，能够达到血浆样本检测的需求，并且做到一个体系适应两种不同类型的样本检测。特异性方面，对于组织样本可以耐受50ng的基因组DNA背景干扰，对于血浆样本，2-5ml血浆提取ctDNA，用于后续检测。

第二方面，本发明提供了一种检测ESR1基因突变的试剂，其包括如上所述的引物组。

第三方面，本发明提供了一种检测ESR1基因突变的试剂盒，其包括如上所述的引物组，或者如上所述的试剂。

该试剂盒可用于高通量、低成本快速检测ESR1基因11种突变，其灵敏度高，特异性强，可适用于从新鲜组织或者石蜡包埋切片组织中提取的基因组DNA检测，也能适用于从EDTA抗凝全血分离血浆中提取的游离ctDNA的检测。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述试剂盒还包括PCR缓冲液和/或酶混合液；

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述PCR缓冲液中包括PCR添加剂、MgCl₂或dNTPs中的至少一种；

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述PCR添加剂包括DMSO、甘油或BSA中的至少一种；

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述MgCl₂的浓度为1-5mM；例如，MgCl₂的浓度典型但非限制性的为1mM、2mM、3mM、4mM或5mM。

优选地，所述MgCl₂的浓度为3mM。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述dNTPs包括dATP、dCTP、dGTP和dUTP。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述dATP、所述dCTP、所述dGTP和所述dUTP的浓度均独立地为0.1-0.5mM。

例如，dATP的浓度典型但非限制性的为0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM或0.5mM；dCTP的浓度典型但非限制性的为0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM或0.5mM；dGTP的浓度典型但非限制性的为0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM或0.5mM；dUTP的浓度典型但非限制性的为0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM或0.5mM。

优选地，dATP、dCTP、dGTP和dUTP的浓度分别为0.15mM、0.15mM、0.15mM、0.3mM。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述酶混合液包括Taq酶和UNG酶。

其中UNG(uracil-N-glycosylase)酶为尿嘧啶-N-糖基化酶，其特点是最佳活性温度为50℃，95℃灭活，其作用原理是选择性水解断裂含有dU的双链或单链DNA中的尿嘧啶糖苷键，形成有缺失碱基的DNA链。在PCR反应中，使用UNG酶可预防扩增产物对后续实验污染。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述Taq酶和所述UNG酶在PCR体系预混液的总量比为：(0.5U-1.0U)：(0.1U-0.5U)。

例如，Taq酶和UNG酶的总量比典型但非限制性的为0.5U：0.1U、0.5U：0.2U、0.5U:0.5U、1.0U:0.1U或1.0U:0.5U。

优选地，所述Taq酶和所述UNG酶在PCR体系预混液的总量比为：0.5U：0.2U。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述试剂盒还包括阳性对照液和/或空白对照液。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述阳性对照液包括突变质粒，所述突变质粒含有突变片段，所述突变片段选自SEQ ID NO.19-29中的任意一种。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述阳性对照液为含11种突变质粒的混合液，11种突变质粒分别含有SEQ ID NO.19-29所示的突变片段。该质粒可为本领域技术人员熟知的质粒，这11种质粒浓度可以相同。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述阳性对照液的突变质粒浓度为2000-3000copies/μL(是指每种突变质粒的浓度为2000-3000copies/μL)。

例如，该阳性对照液的浓度典型但非限制性的为2000copies/μL、2200copies/μL、2400copies/μL、2600copies/μL、2800copies/μL或3000copies/μL。该浓度下，可以良好的保证阳性对照液的稳定性，检出率，同时浓度很低，避免了试剂的浪费。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述空白对照液包括Tris-HCl缓冲液。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述Tris-HCl缓冲液的浓度为7-13mM，pH为7.5-8.5。

例如，Tris-HCl缓冲液的浓度典型但非限制性的为7mM、9mM、11mM或13mM；pH典型但非限制性的为7.5、8.0或8.5。

本发明提供的试剂盒包括上述引物组，其成本低，效率高，结果真实可靠，使用其进行检测的过程均为闭管反应，加入UNG防污染系统，显著降低污染，操作简单，耗时短，只需100min即可完成检测。并且采用阳性对照和空白对照监测试剂盒质量，避免了假阳性和假阴性结果的发生。

第四方面，本发明提供了一种检测ESR1基因突变的方法，其包括：往含有如上所述的引物组的PCR反应体系中加入待测样本的DNA模板，进行PCR扩增。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述方法利用如上所述的试剂盒进行。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述DNA模板来源于组织样本或血浆样本，更优选为血浆样本。

本发明提供的方法应用上述引物组合物、试剂或试剂盒，以待测样本的DNA为模板，进行PCR扩增反应并进行基因分型。该方法操作简单，成本低，耗时短，结果准确可靠。

如上所述的方法，待检测样本的DNA模板为从新鲜组织或者石蜡包埋切片组织中提取的基因组DNA，或者从EDTA抗凝全血分离血浆中提取的游离DNA。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，在PCR反应体系中，上游引物、下游引物以及特异性探针的浓度比为0.1μM-0.5μM：0.1μM-0.5μM：0.1μM-0.2μM；

优选地，在PCR反应体系中，上游引物：下游引物：探针＝0.2μM：0.2μM：0.1μM；

优选地，在PCR反应体系中，MgCl₂浓度为1-5mM；

优选地，在PCR反应体系中，MgCl₂浓度为3mM；

优选地，在PCR反应体系中，dATP、dCTP、dGTP和dUTP的浓度各自为0.1-0.4mM；

优选地，在PCR反应体系中，在PCR反应体系中，dATP、dCTP、dGTP和dUTP的浓度分别为0.15mM、0.15mM、0.15mM、0.3mM；

优选地，在PCR反应体系中，Taq酶和UNG酶总量比为：(0.5U-1.0U)：(0.1U-0.5U)；

优选地，在PCR反应体系含有Taq酶和UNG酶；

优选地，在PCR反应体系中，Taq酶和UNG酶总量比为0.5U：0.1U、0.5U:0.5U、1.0U:0.1U或1.0U:0.5U。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，以25μl PCR反应体系中含有：

需要说明的是，每一个反应体系加入一个引物组合检测相应的突变位点，例如检测D538G，加入的SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.1的组合。

上述体系仅为例证性，在实际应用中可以按照比例扩大或缩小该混合物体积及其中各组分含量。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，PCR扩增的时的退火温度为60-64℃；优选为62℃；

优选地，PCR扩增的条件包括：37℃、10min；95℃、5min；95℃、15s，62℃、30s，72℃、15s，45个循环。

该检测方法操作简单，成本低，耗时短，兼容强，结果准确可靠。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述PCR扩增反应后，所得结果按表2进行结果判定。

本发明的检测方法具有灵敏度高、特异性强、结果真实可信的优点，并且，该检测方法能够适应组织样本和血浆样本检测，能适用临床实际需求。同时该检测方法操作简单快速，能在100min内完成检测。另外本发明提供的结果判读简单客观，直接使用突变反应液检测Ct值进行判读，不需要额外使用质控Ct值计算相关ΔCt值进行结果判读。检测结果方便直观，与常规方法相比简单更多。

综上，采用本发明提供的引物组、试剂盒和方法，可检测ESR1基因的11种突变位点，具有较高的灵敏度和特异性以及可靠的检测结果。可有效解决或缓解如何快速简单并且准确的检测出人类ESR1基因是否突变，并且能够兼容组织样本和血浆样本，满足目前临床实际需求。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实施例1的引物的设计结构及其与目标序列配对示意图。

图2为本发明实施例中提供的pEASY-T1质粒的结构示意图。

图3为本发明实施例1中引物组检测基因组DNA特异性检测结果。

图4为对照引物组1检测基因组DNA特异性检测结果。

图5为对照引物组2检测基因组DNA特异性检测结果。

图6为本发明实施例1引物组检测ctDNA特异性检测结果。

图7为对照引物组1检测ctDNA特异性检测结果。

图8为对照引物组2检测ctDNA特异性检测结果。

图9为64℃退火条件D538G位点下扩增效率。

图10为64℃退火条件下D538G位点组织样本特异性检测结果。

图11为64℃退火条件下D538G位点血浆样本特异性检测结果。

图12为60℃退火条件下D538G位点扩增效率。

图13为60℃退火条件下D538G位点组织样本特异性检测结果。

图14为60℃退火条件下D538G位点血浆样本特异性检测结果。

图15为62℃退火条件下D538G位点扩增效率。

图16为62℃退火条件下D538G位点组织样本特异性检测结果。

图17为62℃退火条件下D538G位点血浆样本特异性检测结果。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

(1)本实施例提供了检测ESR1基因突变的引物组，其包括：引物组合1、引物组合2和引物组合3。

引物组合1包括：SEQ ID NO.12所示的下游引物(命名为ESR1-R1)、SEQ ID NO.15所示的特异性探针(命名为ESR1-P1)以及SEQ ID NO.1-9的所示的上游引物；SEQ ID NO.1-9所示的上游引物依次命名为：D538G-F2、Y537N-F2、Y537S-F2、Y537C-F2、L536R-F2、L536H-F2、L536P-F2、L536Q-F2、V534E-F2。

引物组合2包括：SEQ ID NO.13所示的下游引物(命名为ESR1-R2)、SEQ ID NO.16所示的特异性探针(命名为ESR1-P2)以及SEQ ID NO.10所示的上游引物(命名为E380Q-F2)；

引物组合3包括：SEQ ID NO.14所示的下游引物(命名为ESR1-R3)、SEQ ID NO.17所示的特异性探针(命名为ESR1-P3)以及SEQ ID NO.11所示的上游引物(命名为S463P-F2)。

其中，上述各特异性探针均为MGB探针，可以特异性识别目的序列。MGB修饰基团与荧光淬灭基团连接；特异性探针的荧光报告基团为FAM，特异性探针的荧光淬灭基团均为NFQ(Non-Fluorescent Quencher)。NFQ基团本身不产生荧光，因此可以大大降低本底信号的强度。

引物组合1可以检测D538G、Y537N、Y537S、Y537C、L536R、L536H、L536P、L536Q和V534E突变位点；即检测这些位点的引物组合共用SEQ ID NO.12所示的下游引物、SEQ IDNO.15所示的特异性探针，仅在于上游引物不同。

具体地，SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.1的引物组合1-a可以检测D538G；

SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.2的引物组合1-b可以检测Y537N；

SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.3的引物组合1-c可以检测Y537S；

SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.4的引物组合1-d可以检测Y537C；

SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.5的引物组合1-e可以检测L536R；

SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.6的引物组合1-f可以检测L536H；

SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.7的引物组合1-g可以检测L536P；

SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.8的引物组合1-h可以检测L536Q；

SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.9的引物组合1-i可以检测V534E。

引物组合2检测E380Q突变位点；引物组合3检测S463P突变位点。

上述引物的碱基序列如下：

上游引物：

D538G-F2：

GTACAGCATGAAGTGCAAGAACGTGACAAAGACCTATGG(SEQ ID NO.1)；

Y537N-F2：

CTGTACAGCATGAAGTGCAAGATATGTACGCCCCTCA(SEQ ID NO.2)；

Y537S-F2：

GTACAGCATGAAGTGCAAGACTAGATCTACCCTCTC(SEQ ID NO.3)；

Y537C-F2：

CATCTGTACAGCATGAAGTGCAAGAAATCTAGTAACCTCTG(SEQ ID NO.4)；

L536R-F2：

CATCTGTACAGCATGAAGTGCAACGCATCATTGCCCCG(SEQ ID NO.5)；

L536H-F2：

ATCTGTACAGCATGAAGTGCAAACCTACAATGCCCCA(SEQ ID NO.6)；

L536P-F2：

ATCTGTACAGCATGAAGTGCAAGAGTTCAAGGCCCCC(SEQ ID NO.7)；

L536Q-F2：

ATCTGTACAGCATGAAGTGCAAGAATTCTTCACCCCAG(SEQ ID NO.8)；

V534E-F2：

TGGAGCATCTGTACAGCATGAAGTTTCCTCCCGTGGA(SEQ ID NO.9)；

E380Q-F2：

TGGATTTGACCCTCCATGATCAGTCTTCTTTTCTAC(SEQ ID NO.10)；

S463P-F2：

TCTCTCTCTGCGCATTCAGGAGCACCAGAATTTCTGC(SEQ ID NO.11)。

质控引物ESR1-F：CAAAGGCATGGAGCATCTGTAC(SEQ ID NO.18)。

下游引物：

ESR1-R1：CACGGCTAGTGGGCGCA(SEQ ID NO.12)；

ESR1-R2：AACAGTAGCTTCCCTGGGTGC(SEQ ID NO.13)；

ESR1-R3：AAAGTGTCTGTGATCTTGTCCAGG(SEQ ID NO.14)。

特异性探针：

ESR1-P1：CTGGACGCCCACCG(SEQ ID NO.15)；

ESR1-P2：CTAGAGATCCTGATGATTG(SEQ ID NO.16)；

ESR1-P3：CACCCTGAAGTCTC(SEQ ID NO.17)。

为了提高引物的检测检测性能，包括特异性以及灵敏度，本实施例的引物组在设计方面进行了较大改变，以达到更优秀的性能，满足组织样本和血浆样本检测的需求。探针方面，使用常规方法设计并合成。

引物设计以及组合上，传统的ARMS引物设计原理是使引物的3'端末端最后一个碱基和突变序列匹配，和野生序列不匹配，以达到在野生型背景下特异地识别突变模板。为了进一步增强引物的识别能力，提高特异性，本实施例在传统ARMS引物上进行改进，具体表现为：

在引物3'端倒数第6-9个碱基处插入5-10个碱基片段，插入的碱基片段和模板序列不匹配，且自身不形成发卡结构。引物3'端最后一个碱基和突变序列匹配，和野生序列不匹配。引物5'端到插入碱基片段的第一个碱基之间保证有20-30个碱基。本实施例的引物设计结构如图1所示。

本实施例的引物设计特点如下：

1.引物5'端到插入碱基片段的第一个碱基之间有20-30个碱基，这20-30个碱基我们可以称为结合区，结合区适当的长度可以保证所设计引物能够准确地定位到目标序列并且保证了引物和目的片段之间的结合力。

2.引物3'端倒数第6-9个碱基处插入5-10个碱基片段。由于插入的碱基片段人为设计，其不与模板序列互补配对，在引物退火、延伸的过程中插入的片段会形成一个凸起，我们称插入的5-10个碱基片段为凸起区。这个凸起会影响后面6-9个碱基与模板序列的结合情况。末位6-9个碱基我们称为识别区。只有后续6-9个碱基与模板序列完全匹配的时候，引物3'端和模板序列结合才能牢固，PCR反应才能高效的正常进行。否则末端6-9个碱基和序列模板结合不牢固，在高温退火的条件下，即使引物前端的结合区配对在模板序列上，但由于插入的凸起区和后续的识别区都无法牢固的结合在模板序列上，PCR无法正常高效的进行退火和延伸步骤，从而引物不会识别野生序列，从而提高了特异性。

3.根据待扩增突变序列信息，设计引物3'端最后一个碱基和目的突变序列完全匹配，和野生序列不匹配。这里保持常规ARMS引物设计原则，将突变位点放在引物3'端最后一个碱基上。对于突变序列而言，识别区6-9个碱基和突变序列完全匹配，这样识别区会牢固的结合在突变模板上，即使前面有小凸起的存在，PCR反应依然可以高效正常进行；对于野生序列而言，识别区6-9个碱基中最后一个碱基和野生序列不匹配，导致识别区无法牢固的与野生序列相结合，加上前面凸起区人为设计与目的序列不匹配，这样增加了不匹配片段的长度，即使结合区和野生序列结合，但后续片段均不与野生序列结合，PCR反应无法正常进行，这样大大地提高了检测体系的特异性，从而使血浆突变检测变成了可能。

通过此设计，可以极大的提高检测体系特异性，这样可以将扩增循环数从常规的40个循环提升至45个循环，扩大了低丰度突变的检测范围，从而提高了检测灵敏度。对于组织样本，常规ARMS引物可以满足，但血浆样本中游离核酸ctDNA含量较少，且血浆背景比较复杂，常规ARMS引物检测效果并不是非常理想，本实施例提供的引物可以克服上述难题，达到理想效果。

(2)采用上述引物组检测ESR1基因11种突变的方法，如下：

(a)配制反应体系：每个管中加入含有上述引物组合、PCR反应缓冲液和酶混合液配置的PCR反应体系预混液，加入待测样本DNA，并进行荧光定量PCR反应。

其中，每25μlPCR反应体系(一个体系检测一种突变，使用一种引物组合)预混液，含有如下表所示的组分：

PCR反应体系中：MgCl₂浓度为3.0mM，dATP、dCTP、dGTP和dUTP的浓度分别为0.15mM、0.15mM、0.15mM、0.3mM。

(b)荧光定量PCR反应

条件为：37℃处理10min，95℃预变性5min，45个循环：95℃15s，62℃30s并收集荧光信号，72℃15s。

(c)在上述PCR反应后，所得结果按表2进行结果判定。

表2结果判定

该方法具有灵敏度高、特异性强、结果真实可信的优点，并且，该检测方法能够适应组织样本和血浆样本检测，能适用临床实际需求。同时该检测方法操作简单快速，能在100min内完成检测。另外本发明结果判读简单客观，在高灵敏度和强特异性的支持下，结果判读可以直接使用突变反应液检测Ct值进行，不需要额外使用质控反应液检测Ct值计算相关ΔCt值进行结果判读。Ct值小于或等于规定数值即为阳性，大于规定数值即为阴性，方便直观。

实施例2

试剂盒配置及组装

制备阳性对照液和空白对照液，该阳性对照液中含有11种质粒DNA，这些11种质粒DNA中分别含有的ESR1基因的11种DNA片段，该质粒的选择及设计为本领域技术人员熟知，均为2000copies/μl；该空白对照液为Tris-HCl(10mM)缓冲液。

PCR体系预混液配制：

按照下表3进行质控PCR体系预混液的配制：

表3质控PCR体系预混液成分

按照下表4进行11种突变检测PCR体系预混液的配制：

表4突变检测PCR体系预混液成分

按照下表5进行酶混合液的配制：

表5酶混合液成分

计算12人份各成分使用量，每一种反应液根据配方配制12人份反应预混液，加入到对应的反应管中，充分混匀。

组装试剂盒：将试剂盒各组分按顺序组装成成品试剂盒，具体包括1号管质控体系预混液，2-12号管突变检测体系预混液，13号管酶混合液，14号管阳性对照，15号管空白对照。

实施例3

(1)制备评价参考品

为更加准确的评价实施例1的引物组性能，包括特异性，准确性、检测限、重复性等指标，使用质粒、细胞系基因组DNA，组织样本DNA和血浆样本ctDNA，制备相关参考品，用于引物组的性能评价，具体实施如下：

根据GENE bank数据库中ESR1基因11种突变序列，合成11段DNA片段，将11种突变的DNA片段，分别克隆连接到pEASY-T1(Transgen)质粒载体上(结构见图2)。该质粒转化到DH5α菌株内，菌株经培养后分别提取质粒，其A260/A280值在1.6～2.0之间，且序列经测序确认无误。

11种突变DNA序列如下表6所示。

表6

其中突变位点用斜体加大字体标明。

另外提取Jurkat细胞系基因组DNA，将上述所得到的11种突变质粒进行定量并梯度稀释，和基因组DNA混合成含有不同比例突变质粒的混合样本，作为不同用途的参考品，另外使用组织样本DNA和血浆样本ctDNA作为特异性评价参考品，具体详见下表7。

表7参考品列表

注：特异性参考品N1～N4为独立提取4份FFPE样本DNA，并稀释浓度为25ng/μl；N5-N8为独立提取4份血浆样本ctDNA，并稀释浓度为10ng/μl。检测过程中，每个参考品加样量为2μl。

(2)设置对照引物组

为了更好的说明实施例1引物组的特点，设计了二组对照引物组：对照引物组1和对照引物组2。

对照引物组1为根据常规的ARMS-PCR原理设计的引物；对照引物组2为参考实施例1的引物设计方法进行改造所得，这样可以更加直观的展示实施例1所设计的引物的优越性。对照引物组2和实施例1引物组在引物设计细节上有所不同(比如插入凸起的位置以及插入片段的长度和具体碱基)。

通过比较上述三个不同组合的效果，来验证实施例1的引物组的效果。

具体地，三组引物组使用相同的下游引物和探针，仅仅在上游引物序列上有区别，以能够更加清晰的分辨出实施例1的引物组的优势。

具体地，对照引物组1设计上按照ARMS-PCR原理，引物3'设计为和突变序列相匹配和野生序列不匹配，且引物中间没有插入片段(即缺乏凸起区)，除了3'最后一个碱基外，其余碱基均与模板序列相匹配。

具体序列如下：

D538G-F：ACGTGGTGCCCCTCTATGG；

Y537N-F：CAAGAACGTGGTGCCCCTCA；

Y537S-F：AAGAACGTGGTGCCCCTCTC；

Y537C-F：GAACGTGGTGCCCCTCTG；

L536R-F：AAGAACGTGGTGCCCCG；

L536H-F：CAAGAACGTGGTGCCCCA；

L536P-F：CAAGAACGTGGTGCCCCC；

L536Q-F：AAGAACGTGGTGCCCCAG；

V534E-F：CATGAAGTGCAAGAACGTGGA；

E380Q-F：CCATGATCAGGTCCACCTTCTAC；

S463P-F：CGCATTCAGGAGTGTACACATTTCTGC。

对照引物组2中引物采用和实施例1中引物相同的设计原则，只是在每条引物的细节上会有不同，具体地表现为识别区碱基会有6-9不同个数，有的引物识别区会有9个碱基，有的引物识别区只有6个碱基；插入片段的碱基个数也会有所不同；插入片段的序列也会有所不同，插入片段只需要满足于模板序列不匹配，能够在扩增过程中形成凸起就行，并没有要求固定序列。比如模板序列碱基为A，插入序列碱基可以设计为C/G/A中任意三种中个一个，只要不是T能和模板序列形成A/T互补即可。不同长度的插入位置以及插入碱基，均会使引物达到不同的性能效果。

具体地，对照引物组2各突变位点的上游引物序列如下：

D538G-F1：ACAGCATGAAGTGCAAGAACGTGGCTATGACCTATGG；

Y537N-F1：TGTACAGCATGAAGTGCAAGAAATGTACATCCCTCA；

Y537S-F1：GTACAGCATGAAGTGCAAGAACGTAACTATCCTCTC；

Y537C-F1：TCTGTACAGCATGAAGTGCAAGAACGCTAGTACCCTCTG；

L536R-F1：GCATCTGTACAGCATGAAGTGCAAGAGATGATCGCCCCG；

L536H-F1：CTGTACAGCATGAAGTGCAAGAGTACAATGCCCCA；

L536P-F1：ATCTGTACAGCATGAAGTGCAAGGGTACAACGCCCCC；

L536Q-F1：GTACAGCATGAAGTGCAAGAACACAACACCCCAG；

V534E-F1：AGCATCTGTACAGCATGAAGTGTGGAGACGTGGA；

E380Q-F1：TGTGGATTTGACCCTCCATGATCAGACTTGTTTTCTAC；

S463P-F1：TCTCTCTGCGCATTCAGGAGTGCGTGTATTTCTGC。

合成上述三组引物组，参考实施例1的方法配制PCR反应体系，具体见下表8：

表8

使用本实施例中的步骤(1)所制备的参考品进行检测，以评价三组引物组各自特异性、灵敏度以及重复性等性能指标。

实验铺板如下表9-表11：

表9特异性检测的实验设计铺板

表10灵敏度检测的实验设计铺板

表11重复性/准确性检测的实验设计铺板

其中NTC表示表示空白对照，PC表示阳性对照，RF表示质控反应体系，其所用的上游引物序列如SEQ ID NO.18所示，下游引物为SEQ ID NO.12，特异性探针为SEQ ID NO.15。

质控反应体系针对ESR1基因设计特异性的引物、探针，其位置不在待检测突变位置上，所以对于野生型ESR1基因或者突变型ESR1基因均能扩增，它反映的是待测样本中ESR1基因的总量。质控反应体系检测的Ct值不参与结果判读，它主要的作用是反映待检测样本的质量好坏与否。石蜡包埋组织由于处理工艺会对DNA质量有较大影响，血浆样本中游离核酸又存在量少以及片段化严重的原因，所以需要加入质控反应体系，来衡量待测DNA(石蜡或血浆样本DNA)质与量。

具体地，质控反应体系检测Ct值<25，则表示加入样本量过大，建议稀释至合适浓度进行检测；

质控反应体系检测25≤Ct值≤30，则表示加入样本质量较好，检测结果最为准确；

质控反应体系检测30＜Ct值＜34，则表示加入样本质量较差，量较少，只有突变频率比较高的突变才能检出；

质控反应体系检测Ct值≥34，则表示加入样本质量太差，无法准确检测，建议重新提取样本或重新稀释新鲜样本进行检测。

PCR扩增条件选择比较常规的3步法扩增，具体为95℃15s，60℃30s，72℃30s，45个循环。

检测结果如下：

(a)特异性结果

使用特异性参考品进行检测，即使用野生型模板进行测试，特异性好的突变检测引物体系不会有明显扩增曲线，或者偶尔有扩增曲线，其Ct值在阳性划定范围之外。

结果见图3-图5，对于基因组DNA参考品而言，对照引物组合1即常规ARMS引物在扩增40个循环左右会出现明显非特异性扩增，而对照引物组2和实施例1的引物组偶尔会出现非特异扩增，但不影响结果判读，实施例1的引物组明显优于对照引物组2。

结果见图6-图8，对于血浆ctDNA参考品而言，对照引物组1的常规ARSM引物特异性更差，40循环以内部分位点也会出现非特异性扩增。对照引物组2和实施例1的引物组均只会在40循环以后出现随机翘尾，且实施例1的引物组出现的非特异频率和曲线信号值要明显低于对照引物组2。

(b)准确性测试

使用三组引物分别对准确性参考品P1-P11进行检测，三组引物均可以准确检测出对应参考品。由于在设计上三组引物均针对突变位点进行特异性设计，三组引物在准确性上无明显差异。

(c)灵敏度(检测限)结果

三组引物组分别检测对应位点的检测限参考品三次。

对照引物组1即ARMS引物在设计上没有插入凸起片段碱基，整个引物和模板序列匹配度是最高的，所以扩增效率上最好。ARMS引物最大的问题主要在特异性较差上。对照引物组2和实施例1的引物组相比扩增效率差一些，部分位点检测Ct值会超出我们设定的判读范围。

实施例1引物组扩增结果见下表12。

表12

对照引物组1扩增结果见下表13。

表13

对照引物组2扩增结果见下表14。

表14

(d)重复性结果

三组引物组分别检测对应位点的重复性参考品十次，并计算CV值。三组引物组检测均能准确检出对应突变，并且检测10次Ct值之间相差的变异系数CV均小于5％。

实施例1引物组检测结果见下表15。

表15

对照引物组1检测结果见下表16。

表16

对照引物组2检测结果见下表17。

表17

综合上述结果，我们从扩增效率、检测极限(灵敏度)、特异性以及重复性多个方面对实施例1的引物组，对照引物组1和对照引物组2进行比较，对照引物组1即常规ARMS引物在特异性能够满足石蜡组织样本的检测，但对于血浆样本而言，非特异性扩增较严重，无法满足检测需求。对照引物组2使用本发明实施例1中相同的设计方式，仅在细节上存在差异，其在两种类型样本中检测特异性均能够控制在较好水平，但其扩增效率会差于实施例1引物组，部分位点无法满足我们划定的判读范围。只有实施例1引物组，在所描述引物设计方法下，进行细节上的调整，在特异性和扩增效率上均满足预期要求，整体而言性能更加优异。

实施例4

比较不同浓度的引物、探针、MgCl₂、dNTPs的扩增效果

PCR扩增中引物探针组合的浓度比为0.1μM-0.5μM：0.1μM-0.5μM：0.1μM-0.2μM。为了提高体系的扩增灵敏度和特异性，需要对引物以及探针的浓度进行细致优化。设计引物探针浓度比为：(0.1μM：0.1μM：0.1μM)；(0.1μM：0.1μM：0.2μM)；(0.2μM：0.2μM：0.1μM)；(0.2μM：0.2μM：0.2μM)；(0.3μM：0.3μM：0.1μM)；(0.3μM：0.3μM：0.2μM)；(0.4μM：0.4μM：0.1μM)；(0.4μM：0.4μM：0.2μM)(0.5μM：0.5μM：0.1μM)；(0.5μM：0.5μM：0.2μM)然后分别配制PCR体系，检测同样的野生型及突变型模板，选择扩增灵敏度和特异性均较好的引物探针浓度组合为0.2μM：0.2μM：0.1μM。

制备PCR缓冲液，并对PCR缓冲液各组分进行优化。首先调整PCR缓冲液中MgCl₂浓度，设置1mM、2mM、3mM、4mM、5mM的MgCl₂浓度，分别制备PCR体系，检测同样的野生型及突变型模板，选择扩增灵敏度和特异性均较好的MgCl₂浓度为3.0mM。

然后调整PCR缓冲液中dATP、dCTP、dGTP和dUTP的浓度，设置dATP、dCTP、dGTP和dUTP的浓度为：0.1mM、0.1mM、0.1mM、0.2mM；0.15mM、0.15mM、0.15mM、0.3mM；0.2mM、0.2mM、0.2mM、0.4mM，分别制备PCR体系，检测同样的野生型及突变型模板，选择扩增灵敏度和特异性均较好的dATP、dCTP、dGTP和dUTP的浓度为0.15mM、0.15mM、0.15mM、0.3mM。

制备酶混合液，并对酶混合液浓度进行优化。设置Taq酶0.5U、UNG酶0.2U；Taq酶1.0U、UNG酶0.2U；Taq酶1.0U、UNG酶0.5U，分别制备PCR体系，检测同样的野生型及突变型模板，选择扩增灵敏度和特异性均较好的Taq酶0.5U，UNG酶0.2U。

实施例5

PCR反应条件测试以及确定

本发明所描述检测体系对于特异性这个关键性能指标要求较高，我们选择在退火温度以及退火时间上进行调整，以选择最优扩增条件。增加退火温度、减少退火时间均可以提高特异性。因此，我们设置3个不同退火温度，3个不同长度的退火时间来筛选最优反应条件。

具体地，对于退火温度，我们设立扩增条件如下：95℃15s，60℃/62℃/64℃30s，72℃30s，45个循环。

我们使用上述实施例1的引物组和体系配制方法，使用特异性和准确性参考品作为样品进行检测，对结果进行分析以筛选出合适退火温度。

实验结果表明，在64℃退火条件下，检测组织样本和血浆样本特异性都非常优秀，没有任何非特异扩增曲线，但扩增效率上影响太大，该温度不选用(见图9-图11)。

在60℃退火条件下，引物组合检测灵敏度效果最好。特异性方面，检测组织样本和血浆样本在40个循环后偶尔出现非特异扩增曲线，但不影响结果判读(见图12-14)。

在62℃退火条件下，引物组检测扩增效率比60℃略有下降，但整体变化不大。特异性方面，提高了退火温度，非特异出现的概率明显减少，基本没有，在特异性方面，62℃更加优秀(见图15-17)。

综合上述结果，可以看出，退火温度为62℃扩增效果较好。

延长退火时间可以增加反应扩增效率，但是对于特异性有可能会有影响。对于目前市场上主流的仪器AB 7500而言，收集信号最低要求30s，所以退火时间采用30s/45s/60s三个不同的长度时间进行对比。评价方式按照上述特异性和灵敏度评价方式进行参考品检测。

检测结果显示，对于三种不同退火时间，灵敏度和特异性没有本质改变，从缩短检测时间角度考虑，选择退火时间为30s。

根据上述反应结果，最终确定荧光定量PCR反应条件为：

37℃10min；95℃5min；95℃15s，62℃30s，72℃15s，45个循环；每个循环后收集突变检测通道荧光信号。

实施例6

对于ESR1基因突变检测体系而言，除了野生型背景DNA模板影响检测反应体系的扩增效率以及特异性外，一些干扰物质也会对体系整体性能存在一定的影响。

干扰因素主要有相似序列干扰，血液样本中干扰物质等。为评价实施例1中所述引物组、探针检测体系对干扰因素的抵抗能力，设计相关实验，具体评估如下：

1.相似序列干扰

根据实施例1引物组的扩增目的片段，随机改变其中几个碱基，对此序列进行人工合成，然后用实施例1引物组进行检测，方法参考实施例1。相似序列的序列见下表18。

表18

上述序列表格中，下划线碱基表示随机更改的碱基，斜体字号加大碱基表示突变位点。

更改的序列我们要求目的11个突变位点碱基均与野生型序列一样，在目的突变位点以外的地方进行碱基更换(见表18中下划线)，原则上，实施例1引物、探针组合应不得检出突变。用更改的序列代替原序列作为模板，具体检测结果如下表19所示。

表19以表18中的更改序列作为模板进行检测的结果

检测位点	检测结果
		D538G	no CT
Y537N	no CT
		Y537S	no CT
Y537C	no CT
		L536R	no CT
L536H	no CT
		L536P	no CT
L536Q	no CT
		V534E	no CT
E380Q	no CT
		S463P	no CT

上述结果表明，实施例1中引物组不能扩增更改后的序列，其能够准确区分相似序列，只会扩增原目的突变序列，不会被相似序列所干扰。

2.血液中干扰物

采集血液中可能存在的干扰物分为内源性干扰物及外源干扰物质，其中内源干扰物质主要包括血红蛋白、甘油三酯、铁蛋白等，设定其浓度分别为2g/L、37mmol/L和200ng/mL，以及外源性干扰物质主要有紫杉醇、卡铂、依西美坦等，设定其浓度分别为90μg/mL、90μg/mL、和0.645mol/L。

使用11种突变质粒和上述干扰物进行混合，加入干扰物之前11种突变质粒浓度稀释为500coies/μl，加入干扰物质后使干扰物质达到设定的浓度并且突变质粒浓度依然保持为500copies/μl。这样保证相同的突变质粒浓度，仅比较加入和不加入干扰物质对突变质粒检测情况，来判断干扰物质是否互对实施例1中引物组、探针检测体系存在干扰。检测结果见下表20。

表20干扰物质检测结果

位点	无添加	血红蛋白	甘油三酯	铁蛋白	紫杉醇	卡铂	依西美坦
								D538G	33.36	32.8	32.92	33.14	32.72	33.21	32.8
Y537N	33.42	32.8	32.66	33.14	33.46	32.36	33.21
								Y537S	32.75	32.05	32.84	32.52	32.32	32.14	33.39
Y537C	32.66	33.4	33.18	32.72	33.46	32.48	32.19
								L536R	32.6	33.01	32.8	32.43	32.16	32.39	33.42
L536H	33.23	32.22	33.34	32.81	33.23	32.63	32.18
								L536P	32.24	32.29	32.18	33.11	33.11	32.78	32.83
L536Q	32.72	32.02	33.09	33.24	33.09	32.51	32.01
								V534E	32.84	33.29	33.27	32.77	32.86	33.5	33.17
E380Q	33.16	33.44	32.32	32.87	32.83	32.26	32.24
								S463P	33	33.13	32.87	32.22	32.16	32.15	32.69

由上结果可知，在加入以上干扰物质后，突变位点检测Ct值无明显变化，干扰物质对实施例1中引物组、探针检测体系无明显影响。说明本发明实施例1提供的引物组和检测方法在检测上述突变位点时可以有效抵抗内源性干扰及外源干扰，检测稳定。

实验例7

使用实施例1的引物组和方法，与数字PCR检测方式进行性能对比验证，进一步测试本发明所制备引物组和方法的性能优劣性。具体操作如下：

本实验例中收集60例乳腺癌患者的组织样本和60例乳腺癌患者血浆样本，然后分别从组织中提取基因组DNA，从血浆中提取游离ctDNA。

(1)组织DNA样本制备

取60例组织样本，采用凯杰QIAamp DNAFFPE Tissue Kit试剂盒(Cat#56404)提取组织基因组DNA，测定DNA的浓度和纯度，要求DNA浓度大于10ng/μl，OD260nm/OD280nm在1.8-2.0之间。

(2)游离DNA样本制备

取60例血浆样本，采用凯杰QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit试剂盒(Cat#55114)提取血浆游离DNA，测定DNA的浓度和纯度，要求DNA总量大20ng，OD260nm/OD280nm在1.8-2.0之间。

(3)样本的荧光定量PCR检测

将步骤1或2中样品稀释至10ng/μl取2μl分别加入到23μl的实施例1的检测反应体系中，使反应体系总体积为25μl，并放入荧光定量PCR仪，按如下所示设置PCR反应程序后进行扩增反应：37℃10min；95℃5min；95℃15s，62℃30s，72℃15s，45个循环；每个循环后收集FAM荧光信号。

(4)样本的数字PCR检测

将步骤1或2中样品稀释至10ng/μl取2μl分别加入到23μl的数字PCR的ESR1检测反应体系中，使反应总体积为25μl，并使用微滴发生仪生成微滴，微滴生成完成后放入普通PCR仪，按如下所示设置PCR反应程序后进行扩增反应：

95℃10min；

94℃15s，60℃60s，45个循环；

98℃10min；

4℃保持。

扩增完成后采用微滴分析仪进行检测。

上述数字PCR检测体系中，所用引物、探针结合数字PCR原理，针对ESR1基因11种突变序列进行设计，使用探针识别的方法进行突变位点检测，具体为：

上游引物序列：

D538G-DF：CATCTGTACAGCATGAAGTGCA；

Y537N-DF：CTGTACAGCATGAAGTGC；

Y537S-DF：CATCTGTACAGCATGAAGTGC；

Y537C-DF：AGCATCTGTACAGCATGAAGTGC；

L563R-DF：AGCATCTGTACAGCATGAAGTGC；

L536H-DF：TCTGTACAGCATGAAGTGC；

L536P-DF：ACAGCATGAAGTGCAAGAACGT；

L536Q-DF：GCATCTGTACAGCATGAAGTG；

V534E-DF：CTGTACAGCATGAAGTGCA；

E380Q-DF：AGGCTTTGTGGATTTGAC；

S463P-DF：CTCACTCTCTCTCTGCGC；

下游引物序列：

D538G-DR：CGGTGGGCGTCCAGCATCTCC；

Y537N-DR：GGCGTCCAGCATCTCCAGCA；

Y537S-DR：GTGGGCGTCCAGCATCTCCAGC；

Y537C-DR：GCGTCCAGCATCTCCAGC；

L536R-DR：TGGGCGTCCAGCATCTCCAG；

L536H-DR：GTCCAGCATCTCCAGCAG；

L536P-DR：CGGTGGGCGTCCAGCATCT；

L536Q-DR：CGTCCAGCATCTCCAGCAGC；

V534E-DR：GTCCAGCATCTCCAGCAG；

E380Q-DR：ACCAATCATCAGGATCTCTAG；

S463P-DR：CTCTTCCAGAGACTTCAG；

探针序列：

D538G-DP：TGCCCCTCTATGGCCT；

Y537N-DP：TGCCCCTCAATGAC；

Y537S-DP：TGCCCCTCTCTGACCT；

Y537C-DP：TGCCCCTCTGTGACC；

L536R-DP：CCCGCTATGACCTGC；

L536H-DP：TGCCCCACTATGACC；

L536P-DP：CCCCTATGACCTGCTGC；

L536Q-DP：TGCCCCAGTATGACCTGC；

V534E-DP：TGGAGCCCCTCTAT；

E380Q-DP：TCCACCTTCTACAAT；

S463P-DP：CACATTTCTGCCCA。

D538G-DF、D538G-DR和D538G-DP作为一个组合，检测D538G突变，其他位点检测以此类推。

样本的检测结果分析：组织基因组DNA实验结果见表21；血浆游离DNA实验结果见表22。

表21组织样本基因组DNA检测结果

由表中结果可以看出，60例组织样本中，检测到D538G突变4例，Y537S突变2例，Y537C突变2例，L536R突变1例。采用数字PCR方法对60例乳腺癌患者的ESR1基因进行检测，数字PCR方法检测的实验结果与本发明提供的方法的实验结果完全一致。

表22血浆游离DNA检测结果

由表22中结果可以看出，60例血浆样本中，检测到D538G突变6例，Y537S突变2例，Y537C突变1例，L536R突变2例，S463P突变1例，V534E突变1例。采用数字PCR方法对60例乳腺癌患者的ESR1基因进行检测，数字PCR方法检测的实验结果与本发明实施例1的提供的方法的实验结果完全一致。

综上，本发明实施例1提供的引物组的检测灵敏度达到20ngDNA样本中0.1％比例的突变准确检出。20ngDNA理论值为6000拷贝，0.1％的突变即为6拷贝。数字PCR的检测灵敏度虽然可以低至0.01％甚至更低，但在检测上样量有限的情况下，过低的灵敏度是不准确且无实际意义的，比如检测20ngDNA样本，检测灵敏度达到0.01％，这样检测理论值突变只有0.6拷贝，这是不符合实际地，因为绝对的拷贝数最低只能为1。对于数字PCR而言，一定高的上样量才能够更好的发挥其检测灵敏度低的优势。另一个方面，将检测的绝对拷贝数低至更低的1拷贝，在临床实际运用中意义并没有太大，并且PCR反应非常灵敏，更低的检测极限其出现误判的概率也会大大增加。所以，本发明实施例1提供的引物组从自身产品性能和临床实际情况出发，将产品检测灵敏度定位在0.1％这样的一个比例，能够适应临床检测的需求，同时适用于组织样本和血液血浆样本的检测。且特异性好，能够有效地检测目标序列，对相似序列不产生特异性扩增。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 武汉友芝友医疗科技股份有限公司

<120> 检测ESR1基因突变的引物组、试剂、试剂盒和方法

<160> 29

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gtacagcatg aagtgcaaga acgtgacaaa gacctatgg 39

<210> 2

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ctgtacagca tgaagtgcaa gatatgtacg cccctca 37

<210> 3

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gtacagcatg aagtgcaaga ctagatctac cctctc 36

<210> 4

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

catctgtaca gcatgaagtg caagaaatct agtaacctct g 41

<210> 5

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

catctgtaca gcatgaagtg caacgcatca ttgccccg 38

<210> 6

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

atctgtacag catgaagtgc aaacctacaa tgcccca 37

<210> 7

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

atctgtacag catgaagtgc aagagttcaa ggccccc 37

<210> 8

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

atctgtacag catgaagtgc aagaattctt caccccag 38

<210> 9

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

tggagcatct gtacagcatg aagtttcctc ccgtgga 37

<210> 10

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

tggatttgac cctccatgat cagtcttctt ttctac 36

<210> 11

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

tctctctctg cgcattcagg agcaccagaa tttctgc 37

<210> 12

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

cacggctagt gggcgca 17

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

aacagtagct tccctgggtg c 21

<210> 14

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

aaagtgtctg tgatcttgtc cagg 24

<210> 15

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

ctggacgccc accg 14

<210> 16

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

ctagagatcc tgatgattg 19

<210> 17

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

caccctgaag tctc 14

<210> 18

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

caaaggcatg gagcatctgt ac 22

<210> 19

<211> 250

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

catcaggcac atgagtaaca aaggcatgga gcatctgtac agcatgaagt gcaagaacgt 60

ggtgcccctc tatggcctgc tgctggagat gctggacgcc caccgcctac atgcgcccac 120

tagccgtgga ggggcatccg tggaggagac ggaccaaagc cacttggcca ctgcgggctc 180

tacttcatcg cattccttgc aaaagtatta catcacgggg gaggcagagg gtttccctgc 240

cacggtctga 250

<210> 20

<211> 250

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

catcaggcac atgagtaaca aaggcatgga gcatctgtac agcatgaagt gcaagaacgt 60

ggtgcccctc aatgacctgc tgctggagat gctggacgcc caccgcctac atgcgcccac 120

tagccgtgga ggggcatccg tggaggagac ggaccaaagc cacttggcca ctgcgggctc 180

tacttcatcg cattccttgc aaaagtatta catcacgggg gaggcagagg gtttccctgc 240

cacggtctga 250

<210> 21

<211> 250

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

catcaggcac atgagtaaca aaggcatgga gcatctgtac agcatgaagt gcaagaacgt 60

ggtgcccctc tctgacctgc tgctggagat gctggacgcc caccgcctac atgcgcccac 120

tagccgtgga ggggcatccg tggaggagac ggaccaaagc cacttggcca ctgcgggctc 180

tacttcatcg cattccttgc aaaagtatta catcacgggg gaggcagagg gtttccctgc 240

cacggtctga 250

<210> 22

<211> 250

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

catcaggcac atgagtaaca aaggcatgga gcatctgtac agcatgaagt gcaagaacgt 60

ggtgcccctc tgtgacctgc tgctggagat gctggacgcc caccgcctac atgcgcccac 120

tagccgtgga ggggcatccg tggaggagac ggaccaaagc cacttggcca ctgcgggctc 180

tacttcatcg cattccttgc aaaagtatta catcacgggg gaggcagagg gtttccctgc 240

cacggtctga 250

<210> 23

<211> 250

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

catcaggcac atgagtaaca aaggcatgga gcatctgtac agcatgaagt gcaagaacgt 60

ggtgccccgc tatgacctgc tgctggagat gctggacgcc caccgcctac atgcgcccac 120

tagccgtgga ggggcatccg tggaggagac ggaccaaagc cacttggcca ctgcgggctc 180

tacttcatcg cattccttgc aaaagtatta catcacgggg gaggcagagg gtttccctgc 240

cacggtctga 250

<210> 24

<211> 250

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

catcaggcac atgagtaaca aaggcatgga gcatctgtac agcatgaagt gcaagaacgt 60

ggtgccccac tatgacctgc tgctggagat gctggacgcc caccgcctac atgcgcccac 120

tagccgtgga ggggcatccg tggaggagac ggaccaaagc cacttggcca ctgcgggctc 180

tacttcatcg cattccttgc aaaagtatta catcacgggg gaggcagagg gtttccctgc 240

cacggtctga 250

<210> 25

<211> 250

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

catcaggcac atgagtaaca aaggcatgga gcatctgtac agcatgaagt gcaagaacgt 60

ggtgcccccc tatgacctgc tgctggagat gctggacgcc caccgcctac atgcgcccac 120

tagccgtgga ggggcatccg tggaggagac ggaccaaagc cacttggcca ctgcgggctc 180

tacttcatcg cattccttgc aaaagtatta catcacgggg gaggcagagg gtttccctgc 240

cacggtctga 250

<210> 26

<211> 250

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

catcaggcac atgagtaaca aaggcatgga gcatctgtac agcatgaagt gcaagaacgt 60

ggtgccccag tatgacctgc tgctggagat gctggacgcc caccgcctac atgcgcccac 120

tagccgtgga ggggcatccg tggaggagac ggaccaaagc cacttggcca ctgcgggctc 180

tacttcatcg cattccttgc aaaagtatta catcacgggg gaggcagagg gtttccctgc 240

cacggtctga 250

<210> 27

<211> 250

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

catcaggcac atgagtaaca aaggcatgga gcatctgtac agcatgaagt gcaagaacgt 60

ggagcccctc tatgacctgc tgctggagat gctggacgcc caccgcctac atgcgcccac 120

tagccgtgga ggggcatccg tggaggagac ggaccaaagc cacttggcca ctgcgggctc 180

tacttcatcg cattccttgc aaaagtatta catcacgggg gaggcagagg gtttccctgc 240

cacggtctga 250

<210> 28

<211> 401

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

aaaaataatt acttgacttc actataaagt atgttcgtat tgcatttact ccatctagta 60

gaaaatagac cttgtcagtt caaatccctg ttgcattaat ttcaccagta atgagtcttt 120

ttcatttgag tcagcagggt ttttcttgct tgttttcagg ctttgtggat ttgaccctcc 180

atgatcaggt ccaccttcta caatgtgcct ggctagagat cctgatgatt ggtctcgtct 240

ggcgctccat ggagcaccca gggaagctac tgtttgctcc taacttgctc ttggacaggt 300

aagtgacctg gctgtagctt aggagtagca tgttctttac gatcatagtt cattcatgaa 360

actattttat tcatctctcg gtgaagcttc agagaacttt a 401

<210> 29

<211> 401

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

ttgcaaatgc attaggaatt ttacactgta acccggtttt aaatgggtcc agagcatccc 60

cattgctaga ctactgtgct gaggaagggc actggctcat tgttacatcc catgaacact 120

ctgggtctcc tagacctcat cctctttgag cttctctctc tcactctctc tctgcgcatt 180

caggagtgta cacatttctg cccagcaccc tgaagtctct ggaagagaag gaccatatcc 240

accgagtcct ggacaagatc acagacactt tgatccacct gatggccaag gcaggcctga 300

ccctgcagca gcagcaccag cggctggccc agctcctcct catcctctcc cacatcaggc 360

acatgaggtg aggcatctgt gggcttccta caggagagac a 401

Claims

1.一种检测ESR1基因突变的引物组，其特征在于，其包括如下引物组合中的任意一种或多种：引物组合1、引物组合2和引物组合3；

2.根据权利要求1所述的检测ESR1基因突变的引物组，其特征在于，所述引物组还包括质控引物，所述质控引物的碱基序列如SEQ ID NO.18所示。

3.根据权利要求1或2所述的检测ESR1基因突变的引物组，其特征在于，每个引物组合中的特异性探针的两端分别带有荧光报告基团和荧光淬灭基团；

优选地，所述荧光淬灭基团选自TAMRA、BHQ1、BHQ2或NFQ中的任意一种；

优选地，每个引物组合的特异性探针连接有MGB修饰基团，所述MGB修饰基团与所述荧光淬灭基团连接。

4.一种检测ESR1基因突变的试剂，其特征在于，其包括权利要求1-3任一项所述的引物组。

5.一种检测ESR1基因突变的试剂盒，其特征在于，其包括权利要求1-3任一项所述的引物组，或者权利要求4所述的试剂。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR缓冲液和/或酶混合液；

优选地，所述PCR缓冲液中包括PCR添加剂、MgCl₂或dNTPs中的至少一种；

优选地，所述PCR添加剂包括DMSO、甘油或BSA中的至少一种；

优选地，所述MgCl₂的浓度为1-5mM；

优选地，所述MgCl₂的浓度为3mM；

优选地，所述dNTPs包括dATP、dCTP、dGTP和dUTP；

优选地，所述dATP、所述dCTP、所述dGTP和所述dUTP的浓度均独立地为0.1-0.5mM；

优选地，dATP、dCTP、dGTP和dUTP的浓度分别为0.15mM、0.15mM、0.15mM、0.3mM；

优选地，所述酶混合液包括Taq酶和UNG酶；

优选地，所述Taq酶和所述UNG酶在PCR体系预混液的总量比为：(0.5U-1.0U)：(0.1U-0.5U)；

7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照液和/或空白对照液；

优选地，所述阳性对照液包括突变质粒，所述突变质粒含有突变片段，所述突变片段选自SEQ ID NO.19-29中的任意一种；

优选地，所述阳性对照液为含11种突变质粒的混合液，11种突变质粒分别含有SEQ IDNO.19-29所示的突变片段；

优选地，所述阳性对照液的突变质粒浓度为2000-3000copies/μL；

优选地，所述空白对照液包括Tris-HCl缓冲液；

优选地，所述Tris-HCl缓冲液的浓度为7-13mM，pH为7.5-8.5。

8.一种检测ESR1基因突变的方法，其特征在于，其包括：往含有权利要求1-3任一项所述的引物组的PCR反应体系中加入待测样本的DNA模板，进行PCR扩增；

优选地，所述方法利用权利要求5-7任一项所述的试剂盒进行；

优选地，所述DNA模板来源于组织样本或血浆样本，更优选为血浆样本。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，在PCR反应体系中，上游引物、下游引物以及特异性探针的浓度比为0.1μM-0.5μM：0.1μM-0.5μM：0.1μM-0.2μM；

优选地，在PCR反应体系中，上游引物：下游引物：探针为0.2μM：0.2μM：0.1μM；

优选地，在PCR反应体系中，MgCl₂浓度为1-5mM；

优选地，在PCR反应体系中，MgCl₂浓度为3mM；

优选地，在PCR反应体系含有Taq酶和UNG酶；

优选地，在PCR反应体系中，Taq酶和UNG酶总量比为0.5U：0.1U、0.5U：0.2U、0.5U:0.5U、1.0U:0.1U或1.0U:0.5U。

10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，PCR扩增时的退火温度为60-64℃；优选为62℃；