CN108779453A

CN108779453A - 多项扩增法

Info

Publication number: CN108779453A
Application number: CN201780017193.3A
Authority: CN
Inventors: 山口正裕; 蔵田信也
Original assignee: Nippon Steel and Sumikin Eco Tech Corp
Current assignee: Nippon Steel Eco Tech Corp
Priority date: 2016-04-21
Filing date: 2017-04-19
Publication date: 2018-11-09
Also published as: WO2017183648A1; JP2017192349A; JP5997407B1

Abstract

本发明提供一种技术，在使用下一代测序仪主要以多个基因作为目标的情况下，用于有效地均匀地附加测定所必需的人工核酸序列。本发明提供一种方法，该方法使用由包含至少1对以上的包含正向引物(a)和反向引物(b)的引物对的引物对组X、包含正向引物(c)和反向引物(d)的引物对Y、以及包含正向引物(e)和反向引物(f)的引物对Z构成的引物组，同时地扩增多个目标核酸组，所述正向引物(a)在3’末端侧具有与目标核酸互补的序列，在其上游侧具有人工核酸序列A的全部或3’末端侧的一部分序列，所述反向引物(b)在3’末端侧具有与目标核酸互补的序列，在其上游侧具有人工核酸序列B的全部或3’末端侧的一部分序列，所述正向引物(c)在3’末端侧具有人工核酸序列A，在5’末端侧具有人工核酸序列C，所述反向引物(d)在3’末端侧具有人工核酸序列B，在5’末端侧具有人工核酸序列D，所述正向引物(e)具有人工核酸序列C的全部或一部分序列，所述反向引物(f)具有人工核酸序列D的全部或一部分序列。

Description

多项扩增法

技术领域

本发明主要涉及进行特定的核酸序列组的检测或序列确定的分析。在特定的实施方式中，本发明提供向作为目标的核酸序列附加包含用于识别样品的作为人工核酸序列的条形码序列(バーコード配列)的1个以上的人工设计的核酸序列(以下称作人工核酸序列)的扩增方法。

背景技术

在医疗中的基因诊断、食品中的卫生检查、环境中的监测等多个领域中，使用检测特定的核酸序列的操作。

而且，近年来由于下一代测序仪兴起，与以往方法的测序法相比核酸序列确定变得相当容易，因此作为新的分析方法显现出流行的趋势。

在下一代测序仪中，为了提供来自于多个样品的扩增产物的混合物，必须在想要进行序列确定的核酸片段的两个末端附加包含用于识别样品的条形码序列的特定的人工核酸序列，在扩增作为目标的核酸序列的步骤以外，还需要用于该目的的核酸扩增反应步骤。

即使使用在对于作为目标的核酸序列而言特异性引物的5’末端侧预先附加有包含条形码序列的特定的人工核酸序列的引物，也可以得到提供给下一代测序仪的核酸片段，然而必须依照核酸序列的种类以样品的个数准备条形码序列不同的引物，极为不经济。为此，希望有将由不同于特异性引物的、仅由人工核酸序列构成的引物用于扩增，在扩增的过程中共同地附加于各个核酸序列的方法。

另外，在作为目标的核酸为多种的情况下，经常使用多重PCR，然而容易在各目标核酸的扩增效率方面产生波动，对于引物设计要求高度的技术。

作为为了抑制扩增效率的波动、并且用于获得附加有人工核酸序列的扩增产物的方法，报告过使用了在3’末端侧具有人工核酸序列的引物、及使用了将该人工核酸序列的全部或3’末端侧的一部分附加于特异性序列的5’末端侧的引物的扩增反应方法(专利文献1、2)。

根据专利文献1、2，通过使具有特异性序列的引物的浓度低于由附加有人工核酸序列的核酸构成的引物(以下称作人工核酸引物)的浓度，共同地附加于全部目标序列的人工核酸引物就可以支配性地进行扩增反应，扩增效率的波动得到抑制。

但是，在使用专利文献1、2的方法制备用于提供给下一代测序仪的核酸序列的情况下，由于以高浓度使用的人工核酸引物为约60～70碱基，形成长链，因此产生引物二聚体的可能性提高。特别是在作为目标的核酸序列为多个的情况下，由于所用的特异性引物的种类增加，因此会高频率地产生引物二聚体。由此，在下一代测序仪分析时会带来目标序列以外的序列信息增多的问题。

此外，一旦作为目标的核酸序列的种类增加，所用的特异性引物的总量就会增加，其结果是，人工核酸引物无法支配性地进行扩增反应，会有没有附加人工核酸序列的核酸序列的比例变高的问题。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：WO2006/023919

专利文献2：日本特表2012－522517

发明内容

发明所要解决的问题

因而，在使用下一代测序仪主要以多个基因作为目标的情况下，希望有用于有效并且均匀地附加测定所必需的人工核酸序列的技术。

用于解决问题的方法

本发明人等在解决所述的问题时，对于在抑制非特异性序列的扩增的同时附加人工核酸序列的核酸扩增方法反复进行了研究。其结果是发现，在向目标基因序列附加人工核酸序列的反应中，通过在特异性引物以外还使用具有长链、短链的2对人工核酸序列的引物(图1A中的“引物对Y”及“引物对Z”)，可以抑制来自于引物的非特异性序列的扩增，并且可以有效地扩增作为目标的附加有人工核酸序列的核酸。此外，通过降低包含条形码序列等的人工核酸引物(引物对Y)浓度，提高短链的引物(引物对Z)浓度，可以更加有效地扩增目的产物。本发明是基于该发现而完成的。

此种技术可以适用于各种目的的分析。例如，为了确定基因变异的部位，可以包罗性地分析可能成为癌症的原因的基因。除此以外，本技术还可以在各种SNP分析、基因变异分析、基因表达分析中在使用下一代测序仪时合适地利用，只要是检查对象为基因扩增产物、是通过附加人工核酸序列并识别样品来分析多个目标基因的方法，其适用范围就没有限制。

本发明提供一种方法，该方法使用由包含至少1对以上的包含正向引物(a)和反向引物(b)的引物对的引物对组X、包含正向引物(c)和反向引物(d)的引物对Y及包含正向引物(e)和反向引物(f)的引物对Z构成的引物组同时地扩增多个目标核酸组，所述正向引物(a)在3’末端侧具有与目标核酸互补的序列，在其上游侧具有人工核酸序列A的全部或3’末端侧的一部分序列，所述反向引物(b)在3’末端侧具有与目标核酸互补的序列，在其上游侧具有人工核酸序列B的全部或3’末端侧的一部分序列，所述正向引物(c)在3’末端侧具有人工核酸序列A，在5’末端侧具有人工核酸序列C，所述反向引物(d)在3’末端侧具有人工核酸序列B，在5’末端侧具有人工核酸序列D，所述正向引物(e)具有人工核酸序列C的全部或一部分序列，所述反向引物(f)具有人工核酸序列D的全部或一部分序列。

在特定的实施方式中，本发明提供扩增试样中的1种或多种核酸序列、并且在其两末端附加包含条形码序列的人工核酸序列的方法。扩增反应溶液含有由包含至少1对以上的包含正向引物(a)和反向引物(b)的引物对的引物对组X、包含正向引物(c)和反向引物(d)的引物对Y及包含正向引物(e)和反向引物(f)的引物对Z构成的引物组，所述正向引物(a)在3’末端侧具有与目标核酸互补的序列，在其上游侧具有人工核酸序列A的全部或3’末端侧的一部分序列，所述反向引物(b)在3’末端侧具有与目标核酸互补的序列，在其上游侧具有人工核酸序列B的全部或3’末端侧的一部分序列，所述正向引物(c)在3’末端侧具有人工核酸序列A，在5’末端侧具有人工核酸序列C，所述反向引物(d)在3’末端侧具有人工核酸序列B，在5’末端侧具有人工核酸序列D，所述正向引物(e)具有人工核酸序列C的全部或一部分序列，所述反向引物(f)具有人工核酸序列D的全部或一部分序列。

另外，本发明提供一种方法，是扩增核酸序列、并且在其两末端附加人工核酸序列的方法，用于抑制来自于特异性引物及人工核酸序列的非特异性扩增，有效地获得作为目标的核酸序列。

另外，本发明提供一种方法，是扩增核酸序列、并且在其两末端附加人工核酸序列的方法，用于通过将特异性引物及没有附加人工核酸序列的扩增产物在扩增反应的后期分解，由此有效地获得附加有人工核酸序列的核酸序列。

发明效果

根据本发明，能够有效地扩增为了提供给下一代测序仪而附加有人工核酸序列的核酸序列。通过有效地获得目的产物，由此利用下一代测序仪取得的读出数(リード数)也变多，可以期望分析精度的提高。另外，由于包含条形码序列的长链引物的使用量少便可以实现效果，全部以共通的短链引物进行主要的扩增，因此是也能够实现低成本化的方法。

本说明书包含作为本申请的优先权基础的日本专利申请、特愿2016-85134的说明书和/或附图中记载的内容。

附图说明

图1表示用于提供给下一代测序仪分析的人工核酸序列的附加反应中的本发明和现有技术的各自的流程。本发明(图1A)中显示，在附加人工核酸序列C、D的阶段中，由于引物对Y为低浓度，因此难以产生非特异性扩增，通过主要使用短碱基长度的引物对Z进行扩增，可以有效地获得目的产物。

图1表示用于提供给下一代测序仪分析的人工核酸序列的附加反应中的本发明和现有技术的各自的流程。在现有技术(图1B)中显示，因仅利用引物对Y进行主要的扩增，而容易产生非特异性扩增，目的产物的产量降低。

图2表示如实施例1中详细记载所示那样将利用本发明扩增了的目标基因群提供给下一代测序仪分析所得的读出数。所有的目标基因被检测，分别得到足以进行分析的量的读出数。

图3表示如实施例2中详细记载所示那样改变了引物对组X中的各引物对的浓度时的各目标基因的读出数比与引物浓度比的关系。无论目标基因的种类如何，读出数与引物浓度都可以观察到半对数的相关关系。

图4利用电泳图表示如实施例3中详细记载所示那样并用了引物对Y、Z时和仅使用了引物对Y时的扩增产物的差别。

图5利用电泳图表示如实施例4中详细记载所示那样使用了活性或Hot-Start法的不同的DNA聚合酶时的扩增产物的差别。

具体实施方式

本发明中，使用由引物对组X及引物对Y、Z构成的引物组，同时地扩增多个目标核酸组。

引物对组X包含至少1对包含正向引物(a)和反向引物(b)的引物对，所述正向引物(a)在3’末端侧具有与目标核酸互补的序列，在其上游侧具有人工核酸序列A的全部或3’末端侧的一部分序列，所述反向引物(b)在3’末端侧具有与目标核酸互补的序列，在其上游侧具有人工核酸序列B的全部或3’末端侧的一部分序列。

引物对Y包含正向引物(c)和反向引物(d)，所述正向引物(c)在3’末端侧具有人工核酸序列A，在5’末端侧具有人工核酸序列C，所述反向引物(d)在3’末端侧具有人工核酸序列B，在5’末端侧具有人工核酸序列D。

引物对Z包含正向引物(e)和反向引物(f)，所述正向引物(e)具有人工核酸序列C的全部或一部分序列，所述反向引物(f)具有人工核酸序列D的全部或一部分序列。

引物对组X中，正向引物(a)在3’末端侧具有与目标核酸互补的序列，在其上游侧具有人工核酸序列A的全部或3’末端侧的一部分序列。与目标核酸互补的序列可以为10～40碱基长度，优选为15～30碱基长度，更优选为15～25碱基长度。人工核酸序列A的全部或3’末端侧的一部分序列可以为10～30碱基长度，优选为10～25碱基长度，更优选为15～25碱基长度。人工核酸序列A的3’末端侧的一部分序列可以是从人工核酸序列A的5’末端侧除去任意个数的核苷酸后的序列。另外，也可以在人工核酸序列A的全部或3’侧的一部分序列的上游侧附加有其他的序列。

引物对组X中，反向引物(b)在3’末端侧具有与目标核酸互补的序列，在其上游侧具有人工核酸序列B的全部或3’末端侧的一部分序列。与目标核酸互补的序列可以为10～40碱基长度，优选为15～30碱基长度，更优选为15～25碱基长度。人工核酸序列B的全部或3’末端侧的一部分序列可以为10～30碱基长度，优选为10～25碱基长度，更优选为15～25碱基长度。人工核酸序列B的3’末端侧的一部分序列可以是从人工核酸序列B的5’末端侧除去任意个数的核苷酸后的序列。另外，也可以在人工核酸序列B的全部或3’侧的一部分序列的上游侧附加有其他的序列。

引物对组X包含1对以上的引物。通常，种类越是增加，则认为越难以均匀地扩增，然而如果是5对左右，则可以容易地扩增，即使是20对以上，也可以通过进行序列组合的最佳化来扩增。

引物对Y中，正向引物(c)在3’末端侧具有人工核酸序列A，在5’末端侧具有人工核酸序列C。人工核酸序列A可以为15～50碱基长度，优选为15～40碱基长度，更优选为20～30碱基长度。人工核酸序列C可以为15～40碱基长度，优选为20～40碱基长度，更优选为20～30碱基长度。

也可以在人工核酸序列C的3’末端与人工核酸序列A的5’末端之间，具有用于识别样品的人工核酸序列(条形码序列)。条形码序列可以为3～20碱基长度，优选为5～15碱基长度，更优选为5～10碱基长度。

引物对Y中，反向引物(d)在3’末端侧具有人工核酸序列B，在5’末端侧具有人工核酸序列D。人工核酸序列B可以为15～50碱基长度，优选为15～40碱基长度，更优选为20～30碱基长度。人工核酸序列D可以为15～40碱基长度，优选为20～40碱基长度，更优选为20～30碱基长度。

也可以在人工核酸序列D的3’末端与人工核酸序列B的5’末端之间，具有用于识别样品的人工核酸序列(条形码序列)。条形码序列可以为3～20碱基长度，优选为5～15碱基长度，更优选为5～10碱基长度。

引物对Z中，正向引物(e)具有人工核酸序列C的全部或一部分序列，反向引物(f)具有人工核酸序列D的全部或一部分序列。关于引物对Z的碱基长度，为了抑制非特异性扩增，期望在10～40碱基的范围中设计，优选为10～30碱基，更优选为10～20碱基。

作为人工核酸序列A、B、C、D及条形码序列，可以合适地使用下一代测序仪分析中所用的序列。例如适于将Illumina公司所公开的Illumina Adapter Sequence Document(http://support.illumina.com/downloads/illumine–customer–sequence-letter.html)中记载为Primer的序列的全部或一部分作为人工核酸序列A、B、C、D使用，将记载为Index Adapter的序列作为条形码序列使用。

本发明中，对于引物对组X及引物对Y、Z，可以最先将它们全都混合，不伴随中途的纯化、稀释地利用一连串的反应完成扩增。

本发明为了抑制非特异性序列的扩增以及第一阶段的特异性引物所致的过量扩增、即没有附加人工核酸序列C、D的产物的过量生成，通过与被认为特别是可以抑制扩增循环初期的活性的各种方法、试剂组合，由此能够实现更加有效的扩增。具体而言优选使用Touchdown PCR、经过化学修饰的Hot-Start DNA聚合酶等使扩增反应效率缓慢地升高的方法、试剂。

所谓经过化学修饰的Hot-Start DNA聚合酶，是导入了在室温下使酶失活的热不稳定性的封闭基团的DNA聚合酶，这些封闭基团在扩增的前阶段到达高温时被除去，酶变为活化状态。此种修饰例如可以通过使柠康酸酐、顺乌头酸酐等与蛋白质的赖氨酸残基键合来实现(日本专利第3026554号)。由于与另一个作为Hot-Start修饰法的使用了单克隆抗体的方法(美国专利第5338671号)相比，直到活化为止的时间长，在扩增循环的过程中活性阶段性地提高，因此具有扩增初期的特异性高的特征。

本发明中，优选使用具有5’→3’外切核酸酶活性的DNA聚合酶。这是因为，在进行利用通用引物(引物对Z)的扩增时，通过在将杂交于3’侧的特异性引物(引物对组X)或利用特异性引物扩增了的、没有附加人工核酸序列C、D的扩增产物分解的同时进行延伸，来自于特异性引物的二聚体的生成就得到抑制，并且最终附加有人工核酸序列的扩增产物的比率提高。

关于Hot-Start中的修饰法及5’→3’外切核酸酶活性的有无，将主要市售的酶分类于表1中。即，作为表1中所示的酶，可以特别合适地使用Amplitaq Gold DNA聚合酶(Thermo Fisher Scientific公司)、FastStart Taq DNA聚合酶(Roche Diagnostics公司)、MethylTaq DNA聚合酶(Nippon Gene公司)等。

本方法中的扩增循环通过设定用于进行利用特异性引物(引物对组X)的扩增的前半循环、和用于进行利用引物对Y、Z的通用扩增的后半循环的2个温度条件，由此能够实现更加有效的扩增。前半循环期望进行2～20个循环，优选为5～15个循环，更优选为5～10个循环。后半循环期望进行20～70个循环，优选为30～60个循环，更优选为35～50个循环。

作为进入本方法的扩增循环前进行的最初的热变性工序，特别是在使用经过化学修饰的Hot-StartDNA聚合酶的情况下，期望在94～98℃进行1～15分钟。更优选为1～10分钟，进一步优选为2～8分钟。

关于本方法的扩增循环，作为前半循环中的热变性工序，期望在94～98℃进行5～90秒，更优选为5～60秒，进一步优选为10～30秒。

关于本方法的扩增循环，作为前半循环中的退火工序，由于人工核酸序列A或B被共通地附加于各特异性引物，因此期望进行30～120秒。更优选为60～120秒，进一步优选为60～90秒。关于温度，期望相对于特异性引物部分的Tm(通常为55～65℃，优选为60℃附近)而言为-10℃～+10℃，优选为-5℃～+5℃。

关于本方法的扩增循环，作为前半循环中的延伸工序，期望进行30～120秒，优选为30～90秒，更优选为45～90秒。延伸工序的温度通常为60～80℃，优选为60～75℃，更优选为65～75℃。

关于本方法的扩增循环，作为后半循环中的热变性工序，期望在94～98℃进行5～90秒，更优选为5～60秒，进一步优选为10～30秒。

关于本方法的扩增循环，作为后半循环中的退火工序，为了抑制引物对组X的杂交，期望比较短地进行即为5～30秒，更优选为5～15秒。关于温度，相对于引物对Z的Tm(通常为50～65℃)而言，期望为-10℃～+10℃，优选为-5℃～+5℃。

关于本方法的扩增循环，作为后半循环中的延伸工序，期望进行30～120秒，优选为60～120秒，更优选为60～90秒。延伸工序的温度通常为60～80℃，优选为60～75℃，更优选为65～75℃。

引物对组X中的各引物对的Tm值期望波动尽可能小。具体而言，相对于全部引物的平均Tm(通常为55～65℃)值，期望为±10℃的范围，优选为±5℃，更优选为±3℃。

关于引物对组X中的各引物对的浓度，为了抑制没有附加人工核酸序列C、D的产物的过量生成，期望处于1～30nM的范围，优选为1～20nM，更优选为1～10nM。通过在试样溶液中，调整引物对组X中的各引物对的浓度，可以使各目标基因的扩增效率接近均匀。

引物对Y的浓度在进行人工核酸序列C、D的附加的浓度中期望压制得尽可能低。具体而言，期望处于5～50nM的范围，优选为5～30nM，更优选为5～20nM。

引物对Z的浓度期望处于10～200nM的范围，优选为20～100nM，更优选为20～50nM。在试样溶液中，引物对Z可以以引物对Y的浓度的至少3倍存在。另外，在试样溶液中，所述引物对Y优选以不产生来自于它的引物二聚体的浓度存在，并且所述引物对Z优选以对于获得目的产物而言充分的浓度存在。

扩增可以利用PCR法、LAMP法、NASBA法、ICAN法、LCR法、滚环法(Rolling Cycle法)SMAP法、PALSAR法等来进行。

引物中使用的核酸可以是DNA、RNA等天然核酸，也可以是2’、4’-BNA^coc、3’-Amino-2’、4’-BNA、2’、4’-BNA^NC(BNA全都是Bridged Nucleic Acid的简称)、PNA(Peptide NucleicAcid)、LNA(Locked Nucleic Acid)、TNA(Threose nucleic acid)、GNA(Glycol nucleicacid)等人工核酸。

下面将举出实施例而对本发明进一步具体说明，然而这些实施例是本发明的单纯的例示，而并非意图限定本发明。

实施例1

数十项·数十样品的同时扩增

作为PCR反应的模板，使用了48个样品的从采集自人口腔内粘膜的棉签中提取的DNA。DNA浓度为1～4ng/μl的范围。

PCR反应溶液的组成包含模板DNA 10μl、给定量的Amplitaq Gold DNA聚合酶、LD(Thermo Fisher Scientific公司)、4种dNTP(均为0.2mM)、氯化镁水溶液(3mM)、10×PCRgold buffer、引物混合物、条形码引物(10nM)、通用引物(40nM)。反应溶液是用灭菌水定容为40μl而制备。另外将引物混合物(图1A的引物对组X)的碱基序列及各引物对浓度表示于表2中，将条形码引物(图1A的引物对Y)及通用引物(图1A的引物对Z)的碱基序列表示于表3中。

将上述反应溶液用PCR扩增装置(Life touch(日本Genetics公司制))提供给以下的PCR反应。

(1)热变性工序：95℃、300秒

(2)热变性工序：95℃、10秒

(3)退火工序：61℃、90秒

(4)延伸工序：72℃、60秒

(5)热变性工序：95℃、10秒

(6)退火工序：61℃、10秒

(7)延伸工序：72℃、90秒

在(1)的热变性工序后，重复进行10个循环的工序(2)～(4)，再重复进行50个循环的工序(5)～(7)。

将各扩增产物各以2μl进行等量混合，使用AmpureXP(Beckman Coulter公司制)进行纯化后，提供给下一代测序仪测定(Miseq；Illumina公司制)。

依照处于条形码引物中的条形码序列进行分离，计数样品中的各目标基因的读出数，将所得的结果表示于图2中。全部目标基因得到检测，分别得到足以进行分析的量的读出数。

实施例2

多重扩增的引物混合物中的各引物对的浓度研究

作为PCR反应的模板，使用从采集自人口腔内粘膜的棉签中提取的DNA，改变引物混合物的浓度组成而进行了比较研究。

PCR反应溶液的组成包含模板DNA 10μl、给定量的Amplitaq Gold DNA聚合酶、LD(Thermo Fisher Scientific公司)、4种dNTP(均为0.2mM)、氯化镁水溶液(3mM)、10×PCRgold buffer、引物混合物、条形码引物(10nM)、通用引物(40nM)。反应溶液是用灭菌水定容至40μl而制备。另外将条形码引物及通用引物的碱基序列表示于表4中。

(1)热变性工序：95℃、300秒

(2)热变性工序：95℃、10秒

(3)退火工序：61℃、90秒

(4)延伸工序：72℃、60秒

(5)热变性工序：95℃、10秒

(6)退火工序：61℃、10秒

(7)延伸工序：72℃、90秒

将各扩增产物各以20μl进行等量混合，使用AmpureXP(Beckman Coulter公司制)进行纯化后，提供给下一代测序仪测定(Miseq；Illumina公司制)。

将引物混合物的碱基序列和各引物对浓度及各样品、各目标基因的读出数表示于表5中。另外将各目标基因的读出数比与引物浓度比的关系表示于图3中。

根据结果，目标基因的读出数与引物浓度可以在半对数上观察到正的相关性。该结果显示，本方法中通过对每个目标基因设定恰当的引物浓度，能够实现均匀的扩增。

实施例3

多重扩增的条形码引物及通用引物的效果研究

作为PCR反应的模板，使用从采集自人口腔内粘膜的棉签中提取的DNA，进行了仅用条形码引物进行扩增的情况与并用通用引物的情况的比较。

关于PCR反应溶液的组成，模板DNA 10μl、给定量的Amplitaq Gold DNA聚合酶、LD(Thermo Fisher Scientific公司)、4种dNTP(均为0.2mM)、氯化镁水溶液(3mM)、10×PCRgold buffer、引物混合物是共通的，一方包含条形码引物(10nM)、通用引物(40nM)，另一方包含条形码引物(50nM)。引物混合物的组成与实施例2相同。另外，将条形码引物、通用引物的碱基序列表示于表6中。反应溶液是用灭菌水定容至40μl而制备。

(1)热变性工序：95℃、300秒

(2)热变性工序：95℃、10秒

(3)退火工序：61℃、90秒

(4)延伸工序：72℃、60秒

(5)热变性工序：95℃、10秒

(6)退火工序：61℃、10秒

(7)延伸工序：72℃、90秒

将上述的扩增产物提供给Agilent 2100生物分析仪，进行了电泳结果的比较。将结果表示于图4中。

在仅为条形码引物的情况下，约160bp的产物被大量扩增，该产物比目的产物的产物长度(300～500bp)短，被认为是来自于引物二聚体等的非特异性产物。另一方面，在减少了条形码引物、并使用了相应量的通用引物的体系中，短的片段长度明显减少。根据以上结果可以说，通过使用短的通用引物，可以抑制来自于设计上较长的条形码引物的非特异性产物的产生。

实施例4

基于DNA聚合酶的种类的扩增效率的研究

作为PCR反应的模板，使用从采集自人口腔内粘膜的棉签中提取的DNA，进行了改变DNA聚合酶的种类的情况的比较。

PCR反应溶液的组成包含模板DNA 10μl、作为DNA聚合酶的给定量的AmplitaqGold DNA聚合酶、LD(Thermo Fisher Scientific公司)、Takara Ex Taq HS(Takara Bio公司)、Hot-Start Gene Taq(Nippon Gene公司)的任意1种、4种dNTP(均为0.2mM)、相对于各聚合酶为给定量的氯化镁水溶液、PCR buffer、引物混合物、条形码引物(10nM)、通用引物(40nM)。将引物混合物的碱基序列及各引物对浓度表示于表7中。条形码引物、通用引物与实施例3相同。各反应溶液是用灭菌水定容至40μl而制备。

(1)热变性工序：95℃、300秒

(2)热变性工序：95℃、10秒

(3)退火工序：61℃、90秒

(4)延伸工序：72℃、60秒

(5)热变性工序：95℃、10秒

(6)退火工序：61℃、10秒

(7)延伸工序：72℃、90秒

将上述的扩增产物提供给Agilent 2100生物分析仪，进行了电泳结果的比较。将结果表示于图5中。

在该反应中，目的产物分布于约450～550bp。在使用了Amplitaq Gold LD的扩增中，基本上在被认为是目的产物的碱基长度的范围中观察到峰。另一方面，在使用了TakaraEx Taq HS的扩增中，在350～450bp的较短的碱基长度的范围中也观察到峰，对此可以推测是因为，在扩增循环初期过量地生成由特异性引物带来的产物。另外，在除此以外的碱基长度范围中也确认到峰，可以认为是进行了非特异性扩增。在使用了Hot-Start Gene Taq的扩增中，确认有大量短的非特异性产物。在400bp附近观察到最大的峰，可以认为是没有附加人工核酸序列C、D。可以推测，利用不具有5’→3’外切核酸酶活性的酶的扩增难以附加人工核酸序列C、D，另外引物对组X未被分解而残留，由此也容易引起非特异性扩增。

[表1]DNA聚合酶的分类

[表2]引物混合物的碱基序列及浓度(实施例1)

[表3]条形码引物及通用引物的碱基序列(实施例1)

[表4]条形码引物及通用引物的碱基序列(实施例2)

[表5]引物混合物组成及读出数

[表6]条形码引物及通用引物的碱基序列(实施例3)

[表7]引物混合物的碱基序列和浓度(实施例4)

将本说明书中引用的全部刊物、专利及专利申请直接作为参考引入到本说明书中。

产业上的可利用性

本发明除了可以用于SNP分析的多项化以外，还可以用于基因表达分析、癌症相关基因变异分析等使用下一代测序仪进行的分析。

序列表自由文本

＜序列号1～78＞

序列号1～78表示表2的引物混合物中的各引物的碱基序列。

＜序列号79～93＞

序列号79～93表示表3的条形码引物的各引物的碱基序列。

＜序列号94及95＞

序列号94及95表示表3的通用引物的各引物的碱基序列。

＜序列号96～98＞

序列号96～98表示表4的条形码引物的各引物的碱基序列。

＜序列号99及100＞

序列号99及100表示表4的通用引物的各引物的碱基序列。

＜序列号101～190＞

序列号101～190表示表5的引物混合物中的各引物的碱基序列。

＜序列号191及192＞

序列号191及192表示表6的条形码引物的各引物的碱基序列。

＜序列号193及194＞

序列号193及194表示表6的通用引物的各引物的碱基序列。

＜序列号195～214＞

序列号195～214表示表7的引物混合物中的各引物的碱基序列。

Claims

1.一种方法，该方法使用由包含至少1对以上的包含正向引物(a)和反向引物(b)的引物对的引物对组X、包含正向引物(c)和反向引物(d)的引物对Y、以及包含正向引物(e)和反向引物(f)的引物对Z构成的引物组，同时地扩增多个目标核酸组，

所述正向引物(a)在3’末端侧具有与目标核酸互补的序列，在其上游侧具有人工核酸序列A的全部或3’末端侧的一部分序列，所述反向引物(b)在3’末端侧具有与目标核酸互补的序列，在其上游侧具有人工核酸序列B的全部或3’末端侧的一部分序列，

所述正向引物(c)在3’末端侧具有人工核酸序列A，在5’末端侧具有人工核酸序列C，所述反向引物(d)在3’末端侧具有人工核酸序列B，在5’末端侧具有人工核酸序列D，

所述正向引物(e)具有人工核酸序列C的全部或一部分序列，所述反向引物(f)具有人工核酸序列D的全部或一部分序列。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，

所述引物对Y的正向引物(c)和反向引物(d)分别在人工核酸序列C、D的3’末端与人工核酸序列A、B的5’末端之间具有用于识别样品的人工核酸序列，即以下的条形码序列。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，

最先将所述的引物对组X及引物对Y、Z全都混合，不进行中途的纯化、稀释地利用一连串的反应完成所述扩增。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，

在试样溶液中，所述引物对Z以所述引物对Y的浓度的至少3倍存在。

5.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，

在试样溶液中，所述引物对Y以不产生来自于它的引物二聚体的浓度存在，并且所述引物对Z以足以获得目的产物的浓度存在。

6.根据权利要求1～5中任一项所述的方法，其中，

所述引物对组X包含至少5对引物。

7.根据权利要求1～6中任一项所述的方法，其中，

所述引物对组X包含至少20对引物。

8.根据权利要求1～7中任一项所述的方法，其中，

在试样溶液中，所述引物对组X中的各引物对以1nM～20nM的范围存在。

9.根据权利要求1～8中任一项所述的方法，其中，

在试样溶液中，通过调整所述引物对组X中的各引物对的浓度，可以使各目标基因的扩增效率接近均匀。

10.根据权利要求1～9中任一项所述的方法，其中，

所述扩增是PCR法、LAMP法、NASBA法、ICAN法、LCR法、滚环法SMAP法、PALSAR法的任意1种。

11.根据权利要求1～10中任一项所述的方法，其中，

进行2个循环以上的利用所述引物对组X的扩增，进行20个循环以上的利用所述引物对Y、Z的扩增。

12.根据权利要求1～11中任一项所述的方法，其中，

使用具有5’→3’外切核酸酶活性的DNA聚合酶进行所述扩增。