JP2017192349A - 多項目増幅手法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】標的遺伝子配列に人工核酸配列を付加する反応において、特異的プライマーの他に長鎖、短鎖の2対の人工核酸配列を有するプライマー(図1A中の「プライマー対Y」及び「プライマー対Z」)を用いることで、プライマーに由来する非特異的配列の増幅を抑制でき、かつ目的とする人工核酸配列が付加された核酸を効率よく増幅できる複数の標的核酸群を同時に増幅する方法。
【選択図】図1A
Description
プライマー対群Xは、3’末端側に標的核酸に相補的な配列を持ち、その上流側に人工核酸配列Aの全部あるいは3‘末端側の一部の配列を持つフォワードプライマー(a)と、3’末端側に標的核酸に相補的な配列を持ち、その上流側に人工核酸配列Bの全部あるいは3‘末端側の一部の配列を持つリバースプライマー(b)からなるプライマー対を、少なくとも1対以上含む。
プライマー対Yは、3‘末端側に人工核酸配列Aを持ち、5’末端側に人工核酸配列Cを持つフォワードプライマー(c)と、3‘末端側に人工核酸配列Bを持ち、5’末端側に人工核酸配列Dを持つリバースプライマー(d)からなる。
プライマー対Zは、人工核酸配列Cの全部あるいは一部の配列を持つフォワードプライマー(e)と、人工核酸配列Dの全部あるいは一部の配列を持つリバースプライマー(f)からなる。
プライマー対群Xにおいて、フォワードプライマー(a)は、3’末端側に標的核酸に相補的な配列を持ち、その上流側に人工核酸配列Aの全部あるいは3‘末端側の一部の配列を持つ。標的核酸に相補的な配列は、10〜40塩基長であるとよく、好ましくは、15〜30塩基長であり、より好ましくは、15〜25塩基長である。人工核酸配列Aの全部あるいは3‘末端側の一部の配列は、10〜30塩基長であるとよく、好ましくは、10〜25塩基長であり、より好ましくは、15〜25塩基長である。人工核酸配列Aの3‘末端側の一部の配列は、人工核酸配列Aにおける5’末端側から任意の数のヌクレオチドを除いた配列であるとよい。また、人工核酸配列Aの全部あるいは3’側の一部の配列の上流側には、別の配列が付加されていてもよい。
プライマー対群Xにおいて、リバースプライマー(b)は、3’末端側に標的核酸に相補的な配列を持ち、その上流側に人工核酸配列Bの全部あるいは3‘末端側の一部の配列を持つ。標的核酸に相補的な配列は、10〜40塩基長であるとよく、好ましくは、15〜30塩基長であり、より好ましくは、15〜25塩基長である。人工核酸配列Bの全部あるいは3‘末端側の一部の配列は、10〜30塩基長であるとよく、好ましくは、10〜25塩基長であり、より好ましくは、15〜25塩基長である。人工核酸配列Bの3‘末端側の一部の配列は、人工核酸配列Bにおける5’末端側から任意の数のヌクレオチドを除いた配列であるとよい。また、人工核酸配列Bの全部あるいは3’側の一部の配列の上流側には、別の配列が付加されていてもよい。
プライマー対群Xは、1対以上のプライマーからなる。通常、種類が増えるほど均一に増幅することが難しくなるとされるが、5対程度であれば容易に増幅可能であり、20対以上であっても、配列の組み合わせの最適化を行うことで増幅が可能である。
プライマー対Yにおいて、フォワードプライマー(c)は、3‘末端側に人工核酸配列Aを持ち、5’末端側に人工核酸配列Cを持つ。人工核酸配列Aは、15〜50塩基長であるとよく、好ましくは、15〜40塩基長であり、より好ましくは、20〜30塩基長である。人工核酸配列Cは、15〜40塩基長であるとよく、好ましくは、20〜40塩基長であり、より好ましくは、20〜30塩基長である。
人工核酸配列Cの3’末端と人工核酸配列Aの5’末端の間に、検体を識別するための人工核酸配列(バーコード配列)を有してもよい。バーコード配列は、3〜20塩基長であるとよく、好ましくは、5〜15塩基長であり、より好ましくは、5〜10塩基長である。
プライマー対Yにおいて、リバースプライマー(d)は、3‘末端側に人工核酸配列Bを持ち、5’末端側に人工核酸配列Dを持つ。人工核酸配列Bは、15〜50塩基長であるとよく、好ましくは、15〜40塩基長であり、より好ましくは、20〜30塩基長である。人工核酸配列Dは、15〜40塩基長であるとよく、好ましくは、20〜40塩基長であり、より好ましくは、20〜30塩基長である。
人工核酸配列Dの3’末端と人工核酸配列Bの5’末端の間に、検体を識別するための人工核酸配列(バーコード配列)を有してもよい。バーコード配列は、3〜20塩基長であるとよく、好ましくは、5〜15塩基長であり、より好ましくは、5〜10塩基長である。
5〜30nM、さらに好ましくは5〜20nMである。
PCR反応の鋳型として、ヒト口腔内粘膜より採取したスワブから抽出したDNAを48検体用いた。DNA濃度は1〜4ng/μlの範囲であった。
PCR反応溶液の組成は、鋳型DNA10μl、所定量のAmplitaq Gold DNA Polymerase, LD (サーモフィッシャーサイエンティフィク社)、4種のdNTP(いずれも0.2mM)、塩化マグネシウム水溶液(3mM)、10×PCR gold buffer、primer mix、barcode primer(10nM)、universal primer(40nM)からなる。反応溶液は、滅菌水で40μlにメスアップして調製した。またprimer mix(図1Aのプライマー対群X)の塩基配列および各プライマー対濃度を表2に、barcode primer(図1Aのプライマー対Y)およびuniversal primer(図1Aのプライマー対Z)の塩基配列を表3に示す。
(1)熱変性工程:95℃、300秒間
(2)熱変性工程:95℃、10秒間
(3)アニーリング工程:61℃、90秒間
(4)伸長工程:72℃、60秒間
(5)熱変性工程:95℃、10秒間
(6)アニーリング工程:61℃、10秒間
(7)伸長工程:72℃、90秒間
(1)の熱変性工程の後、工程(2)〜(4)を10サイクル繰り返し、さらに工程(5)〜(7)を50サイクル繰り返した。
PCR反応溶液の組成は、鋳型DNA10μl、所定量のAmplitaq Gold DNA Polymerase, LD(サーモフィッシャーサイエンティフィク社)、4種のdNTP(いずれも0.2mM)、塩化マグネシウム水溶液(3mM)、10×PCR gold buffer、primer mix、barcode primer(10nM)、universal primer(40nM)からなる。反応溶液は、滅菌水で40μlにメスアップして調製した。またbarcode primerおよびuniversal primerの塩基配列を表4に示す。
(1)熱変性工程:95℃、300秒間
(2)熱変性工程:95℃、10秒間
(3)アニーリング工程:61℃、90秒間
(4)伸長工程:72℃、60秒間
(5)熱変性工程:95℃、10秒間
(6)アニーリング工程:61℃、10秒間
(7)伸長工程:72℃、90秒間
(1)の熱変性工程の後、工程(2)〜(4)を10サイクル繰り返し、さらに工程(5)〜(7)を50サイクル繰り返した。
PCR反応溶液の組成は、鋳型DNA10μl、所定量のAmplitaq Gold DNA Polymerase, LD (サーモフィッシャーサイエンティフィク社)、4種のdNTP(いずれも0.2mM)、塩化マグネシウム水溶液(3mM)、10×PCR gold buffer、primer mixは共通であり、一方はbarcode primer(10nM)、universal primer(40nM)、もう一方はbarcode primer(50nM)を含む。Primer mixの組成は、実施例2と同様である。またbarcode primer、universal primerの塩基配列を表6に示す。反応溶液は、滅菌水で40μlにメスアップして調製した。
(1)熱変性工程:95℃、300秒間
(2)熱変性工程:95℃、10秒間
(3)アニーリング工程:61℃、90秒間
(4)伸長工程:72℃、60秒間
(5)熱変性工程:95℃、10秒間
(6)アニーリング工程:61℃、10秒間
(7)伸長工程:72℃、90秒間
(1)の熱変性工程の後、工程(2)〜(4)を10サイクル繰り返し、さらに工程(5)〜(7)を50サイクル繰り返した。
PCR反応溶液の組成は、鋳型DNA10μl、DNAポリメラーゼとして所定量のAmplitaq Gold DNA Polymerase, LD (サーモフィッシャーサイエンティフィク社)、Takara Ex Taq HS(タカラバイオ社)、Hot-Start Gene Taq(ニッポン・ジーン社)のいずれか1種類、4種のdNTP(いずれも0.2mM)、各ポリメラーゼに対して所定量の塩化マグネシウム水溶液、PCR buffer、primer mix、barcode primer(10nM)、universal primer(40nM)を含む。primer mixの塩基配列および各プライマー対濃度を表7に示す。barcode primer、universal primerは実施例3と同様である。各反応溶液は、滅菌水で40μlにメスアップして調製した。
(1)熱変性工程:95℃、300秒間
(2)熱変性工程:95℃、10秒間
(3)アニーリング工程:61℃、90秒間
(4)伸長工程:72℃、60秒間
(5)熱変性工程:95℃、10秒間
(6)アニーリング工程:61℃、10秒間
(7)伸長工程:72℃、90秒間
(1)の熱変性工程の後、工程(2)〜(4)を10サイクル繰り返し、さらに工程(5)〜(7)を50サイクル繰り返した。
配列番号1〜78は、表2のprimer mix中の各プライマーの塩基配列を示す。
<配列番号79〜93>
配列番号79〜93は、表3のbarcode primerの各プライマーの塩基配列を示す。
<配列番号94及び95>
配列番号94及び95は、表3のuniversal primerの各プライマーの塩基配列を示す。
<配列番号96〜98>
配列番号96〜98は、表4のbarcode primerの各プライマーの塩基配列を示す。
<配列番号99及び100>
配列番号99及び100は、表4のuniversal primerの各プライマーの塩基配列を示す。
<配列番号101〜190>
配列番号101〜190は、表5のprimer mix中の各プライマーの塩基配列を示す。
<配列番号191及び192>
配列番号191及び192は、表6のbarcode primerの各プライマーの塩基配列を示す。
<配列番号193及び194>
配列番号193及び194は、表6のuniversal primerの各プライマーの塩基配列を示す。
<配列番号195〜214>
配列番号195〜214は、表7のprimer mix中の各プライマーの塩基配列を示す。
Claims (12)
- 3’末端側に標的核酸に相補的な配列を持ち、その上流側に人工核酸配列Aの全部あるいは3‘末端側の一部の配列を持つフォワードプライマー(a)と、3’末端側に標的核酸に相補的な配列を持ち、その上流側に人工核酸配列Bの全部あるいは3‘末端側の一部の配列を持つリバースプライマー(b)からなるプライマー対を、少なくとも1対以上含むプライマー対群Xおよび、3‘末端側に人工核酸配列Aを持ち、5’末端側に人工核酸配列Cを持つフォワードプライマー(c)と、3‘末端側に人工核酸配列Bを持ち、5’末端側に人工核酸配列Dを持つリバースプライマー(d)からなるプライマー対Yおよび、人工核酸配列Cの全部あるいは一部の配列を持つフォワードプライマー(e)と、人工核酸配列Dの全部あるいは一部の配列を持つリバースプライマー(f)からなるプライマー対Zにより構成されるプライマーセットを用いて複数の標的核酸群を同時に増幅する方法。
- 前記プライマー対Yのフォワードプライマー(c)とリバースプライマー(d)の各々が、人工核酸配列C、Dの3’末端と人工核酸配列A,Bの5’末端の間に、検体を識別するための人工核酸配列(以下、バーコード配列)を有する、請求項1に記載の方法。
- 前記増幅が、前記のプライマー対群Xおよびプライマー対Y,Zを最初にすべて混合し、途中の精製・希釈を伴わず、一連の反応で完了する請求項1又は2に記載の方法。
- 試料溶液中において、前記プライマー対Zが、前記プライマー対Yの濃度の少なくとも3倍で存在する、請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- 試料溶液中において、前記プライマー対Yが、それに由来するプライマーダイマーが産生されない濃度で存在し、かつ、前記プライマー対Zが、目的産物を得るのに十分な濃度で存在する、請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- 前記プライマー対群Xが、少なくとも5対のプライマーからなる、請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
- 前記プライマー対群Xが、少なくとも20対のプライマーからなる、請求項1〜6のいずれかに記載の方法。
- 試料溶液中において、前記プライマー対群X中の各プライマー対が、1〜20nMの範囲で存在する、請求項1〜7のいずれかに記載の方法。
- 試料溶液中において、前記プライマー対群X中の各プライマー対の濃度を調整することで、各標的遺伝子の増幅効率を均一に近づけることができる、請求項1〜8に記載の方法。
- 前記増幅が、PCR法、LAMP法、NASBA法、ICAN法、LCR法、Rolling Cycle法SMAP法、PALSAR法のいずれか1つである、請求項1〜9のいずれかに記載の方法。
- 前記プライマー対群Xによる増幅は2サイクル以上、前記プライマー対Y、Zによる増幅は20サイクル以上行われる、請求項1〜10のいずれかに記載の方法。
- 前記増幅が、5’→3’エキソヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼを用いて行われる、請求項1〜11に記載の方法。
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