JP2015023874A - Rnaの検出方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】RNAを検出するための方法であって、(C)逆転写酵素、少なくとも1種のオリゴヌクレオチドプライマー、少なくとも1種のデオキシリボヌクレオチド、及び逆転写反応の鋳型となるRNAを含有する組成物を逆転写反応に供して得られるcDNAと鋳型となったRNAとで形成されるDNA/RNAハイブリッドと、耐熱性DNAポリメラーゼ、耐熱性リボヌクレアーゼ H、及びインターカレーティング色素を含む成分とを混合して組成物を調製する工程、(D)工程(C)で調製した組成物を90℃以上、15秒〜10分の熱処理とポリメラーゼ連鎖反応に供し、核酸を増幅する工程、並びに(E)工程(D)において増幅された核酸を、インターカレーティング色素からの蛍光シグナルの強度を測定することによって検出する工程、を含む方法。
【選択図】なし
Description
(A)逆転写酵素、少なくとも1種のオリゴヌクレオチドプライマー、少なくとも1種のデオキシリボヌクレオチド、及び逆転写反応の鋳型となるRNAを含有する組成物を調製する工程、
(B)工程(A)で調製した組成物をインキュベーションし、cDNAを合成する工程、
(C)工程(B)で合成したcDNA、耐熱性DNAポリメラーゼ、耐熱性リボヌクレアーゼ H、及びインターカレーティング色素を含有する組成物を調製する工程、
(D)工程(C)で調製した組成物を用いてポリメラーゼ連鎖反応を行い、核酸を増幅する工程、並びに
(E)工程(D)において増幅された核酸を、インターカレーティング色素からの蛍光シグナルの強度を測定することによって検出する工程、
を包含する、RNAを検出するための方法に関する。本発明の第2の発明において、工程(E)は工程(D)におけるポリメラーゼ連鎖反応中に実施されていても良い。また、工程(E)で測定されたシグナル強度から鋳型となるRNAの定量が実施されても良い。
本発明の組成物は、耐熱性DNAポリメラーゼ、耐熱性リボヌクレアーゼ H、及びインターカレーティング色素を含む。
本発明のRNAの検出方法は、
(A)逆転写酵素、少なくとも1種のオリゴヌクレオチドプライマー、少なくとも1種のデオキシリボヌクレオチド、及び鋳型となるRNAを含有する組成物を調製する工程、
(B)工程(A)で調製した組成物をインキュベーションし、cDNAを合成する工程、
(C)工程(B)で合成したcDNA、耐熱性DNAポリメラーゼ、耐熱性リボヌクレアーゼ H、及びインターカレーティング色素を含有する組成物を調製する工程、
(D)工程(C)で調製した組成物を用いてポリメラーゼ連鎖反応を行い、核酸を合成する工程、並びに
(E)工程(D)において合成された核酸を、インターカレーティング色素からの蛍光シグナルの強度を測定することによって検出する工程、
を含む。
本発明のキットは、RNAの検出を行うためのキットであり、耐熱性DNAポリメラーゼ、耐熱性リボヌクレアーゼ H、及びインターカレーティング色素を含む。本発明のキットは、逆転写反応によって合成されたcDNAを鋳型とする核酸増幅反応を効率よく行うことができるため、目的の配列を有するRNAの検出に有用であり、また、目的の配列を有するRNAの定量により有用である。
(1)RNAからのcDNAの合成
Human Testis Total RNA(Clontech社製)を鋳型として、PrimeScript(登録商標)RT reagent Kit(Perfect Real Time)(タカラバイオ社製、製品コード:RR037A)を利用し、製品の標準プロトコールに従い逆転写反応を行い、cDNAを調製した。
リアルタイムPCR装置としては、Thermal Cycler Dice(登録商標) Real Time System (タカラバイオ社製)を用いた。逆転写反応により得られたcDNAのうち20ng分を鋳型に、SYBR(登録商標) Premix Ex TagTM(Perfect Real Time)(タカラバイオ社製、製品コード:RR041)を使用して、Apolipoprotein E(APOE)遺伝子の配列を増幅・検出した。具体的には、cDNAの増幅及び検出用の反応液として、(1)により得られたcDNA 20ngに、Premix Ex TagTM(登録商標)(Perfect Real Time)に添付の2倍濃度の反応液に、配列表の配列番号1に示される塩基配列を有するAPOE−Fプライマー 10pmol、配列表の配列番号2に示される塩基配列を有するAPOE−Rプライマー 10pmol、及び滅菌蒸留水を添加し、さらに、0.0001U、0.001U、0.01U、0.1U、1U、10U、又は100UのThermococcus litralis由来リボヌクレアーゼ H(以下、Tli RNase Hという、国際公開第02/22831号パンフレットの記載に従って調製)を添加したものを加え、Tli RNase Hの含有量がそれぞれ異なる7種類の反応液(各25μL)を調製した。また、Tli RNase Hを含まない以外は上記の反応液と同様の組成を持つ反応液を調製した(計25μL)。上記8種類の反応液について、1段階:95℃、5秒、2段階:60℃、30秒を1Cycleとする40CyclesのPCRに供した(n=2)。このとき、PCRのCycleごとに、SYBR(登録商標) GreenIからの蛍光強度を測定し、増幅産物量の変化を観測した。反応終了後、リアルタイム装置により、Auto設定でCrossing Point法により算出されたCt値を確認し、また、平均値を求めた。
算出されたCt値を表1に示す。また、PCR反応液中のRNase H量とCt値との関係を図1のグラフに示す。
実施例1と同様の装置及び試薬を使用し、熱変性をPCR核酸増幅前に行った場合についても、RNase Hを添加することでCt値が低下することを確認した。
Tli RNaseHの代わりにHybridaseTM(登録商標) Thermostable RNase H(以下、Hybridaseという、Epicentre社製、Thermus属細菌由来耐熱性RNase H)を用いる点、RNase H量を反応液25μL当り0.0001U、0.001U、0.01U、0.1U、及び1Uとする点、並びに95℃、30秒間の初期変性をPCRの前に実施する点以外は、実施例1と同様の方法でcDNAの増幅及び検出を行い、Ct値を確認した。
〔1〕 逆転写反応によって合成されたcDNAを増幅し、前記逆転写反応の鋳型となったRNAを検出するための組成物であって、
耐熱性DNAポリメラーゼ、
耐熱性リボヌクレアーゼ H、及び
インターカレーティング色素
を含有してなる組成物。
〔2〕 耐熱性DNAポリメラーゼが高度好熱菌由来のDNAポリメラーゼである、〔1〕記載の組成物。
〔3〕 耐熱性リボヌクレアーゼ Hが高度好熱菌由来のリボヌクレアーゼ Hである、〔1〕記載の組成物。
〔4〕 高度好熱菌由来のリボヌクレアーゼ Hが、Thermus属細菌由来リボヌクレアーゼ H、及び/又はThermococcus属古細菌由来のリボヌクレアーゼ Hである、〔3〕記載の組成物。
〔5〕 さらに、
少なくとも1種のオリゴヌクレオチドプライマー、
少なくとも1種のデオキシリボヌクレオチド、及び
反応用緩衝液
からなる群より選ばれる少なくとも1つを含有してなる〔1〕記載の組成物。
〔6〕 逆転写反応の鋳型となったRNAを検出し、さらに定量するために使用される、〔1〕〜〔5〕いずれか記載の組成物。
〔7〕 RNAを検出するための方法であって、
(A)逆転写酵素、少なくとも1種のオリゴヌクレオチドプライマー、少なくとも1種のデオキシリボヌクレオチド、及び逆転写反応の鋳型となるRNAを含有する組成物を調製する工程、
(B)工程(A)で調製した組成物をインキュベーションし、cDNAを合成する工程、
(C)工程(B)で合成したcDNA、耐熱性DNAポリメラーゼ、耐熱性リボヌクレアーゼ H、及びインターカレーティング色素を含有する組成物を調製する工程、
(D)工程(C)で調製した組成物を用いてポリメラーゼ連鎖反応を行い、核酸を増幅する工程、並びに
(E)工程(D)において増幅された核酸を、インターカレーティング色素からの蛍光シグナルの強度を測定することによって検出する工程、
を含む方法。
〔8〕 工程(E)が工程(D)におけるポリメラーゼ連鎖反応中に実施される、〔7〕記載の方法。
〔9〕 さらに、(F)工程(E)で測定されたシグナル強度から鋳型となるRNAの定量を行う工程を含む、〔7〕又は〔8〕記載の方法。
〔10〕 RNAを検出するためのキットであって、
耐熱性DNAポリメラーゼ、
耐熱性リボヌクレアーゼ H、及び
インターカレーティング色素
を含有してなるキット。
〔11〕 耐熱性DNAポリメラーゼが高度好熱菌由来のDNAポリメラーゼである、〔10〕記載のキット。
〔12〕 耐熱性リボヌクレアーゼ Hが高度好熱菌由来のリボヌクレアーゼ Hである、〔10〕記載のキット。
〔13〕 高度好熱菌由来のリボヌクレアーゼ Hが、Thermus属細菌由来リボヌクレアーゼ H、及び/又はThermococcus属古細菌由来のリボヌクレアーゼ Hである、〔12〕記載のキット。
〔14〕 さらに、逆転写酵素、
少なくとも1種のプライマー、
少なくとも1種のデオキシリボヌクレオチド、及び
反応用緩衝液
からなる群より選ばれる少なくとも1つを含有してなる〔10〕〜〔13〕いずれか記載のキット。
SEQ ID NO:2 ;Primer to amplify the cDNA fragment of human APOE gene.
SEQ ID NO:3 ;Primer to amplify the cDNA fragment of human SOX18 gene.
SEQ ID NO:4 ;Primer to amplify the cDNA fragment of human SOX18 gene.
SEQ ID NO:5 ;Primer to amplify the cDNA fragment of human NAT14 gene.
SEQ ID NO:6 ;Primer to amplify the cDNA fragment of human NAT14 gene.
Claims (5)
- RNAを検出するための方法であって、
(C)逆転写酵素、少なくとも1種のオリゴヌクレオチドプライマー、少なくとも1種のデオキシリボヌクレオチド、及び逆転写反応の鋳型となるRNAを含有する組成物を逆転写反応に供して得られるcDNAと鋳型となったRNAとで形成されるDNA/RNAハイブリッドと、耐熱性DNAポリメラーゼ、耐熱性リボヌクレアーゼ H、及びインターカレーティング色素を含む成分とを混合して組成物を調製する工程、
(D)工程(C)で調製した組成物を90℃以上、15秒〜10分の熱処理とポリメラーゼ連鎖反応に供し、核酸を増幅する工程、並びに
(E)工程(D)において増幅された核酸を、インターカレーティング色素からの蛍光シグナルの強度を測定することによって検出する工程、
を含む方法。 - 工程(E)が工程(D)におけるポリメラーゼ連鎖反応中に実施される、請求項1記載の方法。
- さらに、(F)工程(E)で測定されたシグナル強度から鋳型となるRNAの定量を行う工程を含む、請求項1又は2記載の方法。
- 請求項1〜3いずれか記載のRNAを検出するための方法において使用する組成物であって、
耐熱性DNAポリメラーゼ、
耐熱性リボヌクレアーゼ H、及び
インターカレーティング色素
を含有してなる組成物。 - さらに、少なくとも1種のオリゴヌクレオチドプライマー、少なくとも1種のデオキシリボヌクレオチド、及び反応用緩衝液からなる群より選ばれる少なくとも1つを含有してなる請求項4記載の組成物。
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