DE19612684A1

DE19612684A1 - Neue Verwendung extrem thermophiler DNA-Polymerasen

Info

Publication number: DE19612684A1
Application number: DE19612684A
Authority: DE
Inventors: Juergen Dr Blusch
Original assignee: Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum fuer Gesundheit und Umwelt GmbH
Current assignee: Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum fuer Gesundheit und Umwelt GmbH
Priority date: 1996-03-29
Filing date: 1996-03-29
Publication date: 1997-10-02
Also published as: WO1997037039A3; WO1997037039A2; JP2000503214A; EP0904404A2; US6251637B1; JP3378255B2

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Zyklus-Sequenzierung von DNA mit einem Marker substituierten Didesoxynukleotiden unter Verwendung von extrem thermophilen DNA-Polymerasen sowie eine neue Verwendung extrem thermophiler DNA-Polymerasen.

Die Sequenzanalyse von DNA ist zwischenzeitlich zu einem uner setzlichen Werkzeug sowohl für die Grundlagenforschung als auch für die Labordiagnostik geworden und wird routinemäßig ange wandt. Die Sequenzierungsprotokolle basieren dabei fast aus schließlich auf der Kettenabbruchsmethode von Sanger unter Ver wendung von radioaktiven oder fluoreszierenden Markern zur Mar kierung der DNA-Ketten. Verschiedene Firmen bieten eine Viel zahl von unterschiedlichen Sequenzierungsprotokollen an. Beson ders häufig wird das Protokoll der Fa. Applied Biosystems (ABI) zur nicht-radioaktiven Sequenzierung unter Verwendung von mit Farbstoffen markierten Didesoxyterminatoren (Dye-Didesoxy-Ter minatoren angewandt.

Bei der Sequenzierung unter Verwendung von Dye-Didesoxy-Termi natoren kopieren die DNA-Polymerasen die zu sequenzierende DNA- Matrize in einer primer-abhängigen Weise. Der Kettenabbruch wird durch Einbau von ddNTPs erreicht, von denen jedes mit ei nem unterschiedlich fluoreszierenden Farbstoff (Dye) markiert ist. Hierdurch wird die Auftrennung der DNA-Sequenz in einer einzigen Spur ermöglicht, während nach der klassischen DNA-Se quenziermethode von Sanger, die unmarkierte ddNTPs verwendet und die die Kettenmarkierung durch den Einbau von radioaktiv markierten α-dATP- oder fluoreszierenden Primern durchführt, ein Vierspursystem und für die Einspuranalyse ein aufwendiges 4-Primer-Verfahren notwendig ist.

Falls die Sequenzierungsreaktion in einem einzigen Zyklus bei 37°C durchgeführt wird, werden üblicherweise thermolabile DNA- Polymerasen, beispielsweise die T7-DNA-Polymerase, verwendet. Für viele Anwendungen ergibt dieses Protokoll ausgezeichnete Ergebnisse; es ist jedoch nachteilig, daß große Mengen von Tem plate-DNA (etwa 5 µg Plasmid-DNA pro Reaktion) notwendig sind. Dieser Nachteil wird besonders deutlich bei der Direktsequen zierung von PCR-Produkten. Unüberwindbare Schwierigkeiten erge ben sich häufig bei der Sequenzierung GC-reicher Templates. Im Gegensatz dazu wird weniger als 1/5 an Template-DNA bei der Zyklus-Sequenzierung unter Verwendung von DNA-Polymerasen aus extrem thermophilen Organismen benötigt. Diese Methode umfaßt verschiedene Zyklen der Denaturierung, Annealing des Sequenzie rungs-Primers und Kettenverlängerung mit anschließendem Einbau der ddNTPs. Gemäß dem Stand der Technik wird dieser zuletzt genannte Schritt bei 60°C durchgeführt, was bei der Sequenzie rung von GC-reichen DNA-Sequenzen und von DNA mit Sekundär strukturen zu wesentlich besseren Ergebnissen führt als die Protokolle, die einen einzigen Zyklus bei 37°C benutzen. Die bei den Protokollen gemäß dem Stand der Technik benutzte Tempe ratur von 60°C liegt jedoch weit unterhalb der optimalen Syn thesetemperatur extrem thermostabiler DNA-Polymerasen.

Im Gegensatz dazu können Dye-Primer-Protokolle die optimale Kettenverlängerungstemperatur von 72°C verwenden. Sie erfordern jedoch die kostspielige Sonder-Synthese fluoreszenzmarkierter Primer: im Falle eines 4-Spurverfahrens von 1 Primer, für die Durchführung einer 1-Spuranalyse sogar von 4 Primern. In beiden Fällen müssen im Gegensatz zur Dye-Terminatorsequenzierung, die in nur einem Ansatz durchgeführt wird, 4 parallele Reaktionen mit jeweils einem ddNTP angesetzt werden, was den Zeit- und Kostenaufwand zusätzlich erhöht.

Protokolle zur Dye-Primer-Sequenzierung werden von verschiede nen Firmen für unterschiedliche, extrem thermostabile DNA-Poly merasen beschrieben. Beispiele für solche Protokolle sind die von ABI/Perkin Elmer, das AmpliTaq®- und AmpliTaqFS® verwendet, von Amersham, das Thermosequenase® verwendet, oder von Epicen tre, das Sequitherm®-DNA-Polymerase verwendet.

Bei Verwendung der Dye-Primer-Sequenzierung als 1-Spur-Technik ist es notwendig, vier verschiedene Primer mit unterschiedli chen Farbmarkierungen zu versehen. Dies erhöht den Zeit- und Kostenaufwand der Sequenzierung jedoch entsprechend.

Aus dem Stand der Technik ist eine erfolgreiche Zyklus-Sequen zierung unter Verwendung von Dye-Terminatoren bisher nur mit einer Kettenverlängerungstemperatur von 60°C bekannt, und zwar für die Enzyme AmpliTaq®, AmpliTaqFS®, Thermosequenase®, Sequi therm® und Tfil-DNA-Polymerase. Protokolle für Temperaturen von über 60°C wurden für die Zyklus-Sequenzierung unter Verwendung von Dye-Terminatoren bisher nicht beschrieben.

Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein neues Ver fahren zur Zyklus-Sequenzierung von DNA unter Verwendung von Dye-Terminatoren bereitzustellen, das auch bei GC-reichen Se quenzen einsetzbar ist und das bei oder nahe bei der optimalen Kettenverlängerungstemperatur arbeitet.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch die im Anspruch 7 nä her gekennzeichneten Merkmale gelöst. Bevorzugte Ausführungs formen des Verfahrens gemäß Anspruch 7 sind in den Unteransprü chen gekennzeichnet.

Weiterhin stellt die vorliegende Erfindung gemäß Anspruch 1 eine neue Verwendung extrem thermostabiler DNA-Polymerasen be reit. Bevorzugte Ausführungsformen sind in den Unteransprüchen näher gekennzeichnet.

Die erfindungsgemäß einsetzbaren, extrem thermostabilen DNA-Polymerasen sind DNA-Desoxynukleotidyl-Transferasen, E.C.2.7.7.7. Bevorzugt sind die nachfolgenden extrem thermosta bilen DNA-Polymerasen verwendbar:

- AmpliTaq® (Perkin Elmer): Stamm Thermus aquaticus YT1;
- Taq® DNA-Polymerase (Gibco): isoliert aus Thermus aquati cus, Stamm YT1;
- Sequitherm®-DNA-Polymerase (Epicentre): speziell für das Zyklus-Sequenzieren entwickelte DNA-Polymerase;
- Tth-DNA-Polymerase (Epicentre): isoliert aus Thermus thermophilus;
- Tth-DNA-Polymerase (Boehringer): E.C. 2.7.7.7, isoliert aus Thermus thermophilus HB8;
- Expand® High Fidelity (Boehringer): Mischung aus Taq®- und Pwo®-DNA-Polymerase, E.C.2.7.7.7;
- Pwo®-DNA-Polymerase (Boehringer): E.C.2.7.7.7, aus Pyro coccus woesei;
- Deep Vent®-DNA-Polymerase (New England Biolabs): DNA-Poly merasegen aus Pyrococcus species, Isolat GB-D, exprimiert in E. coli;
- 9°N DNA-Polymerase (New England Biolabs): Thermococcus species, Stamm 9°N-7;
- Vent® exo^--DNA-Polymerase (New England Biolabs): exo^--DNA- Polymerasegen von Thermococcus litoralis exprimiert in E. coli;
- Replitherm®-DNA-Polymerase (Epicentre): nicht aus T. aqua ticus;
- Goldstar® (Eurogentec): DNA-Polymerasegen aus einer neuen Thermus-Species, exprimiert in E. coli;
- Tfl-DNA-Polymerase (Epicentre): isoliert aus Thermus fla vus;
- Pfu-DNA-Polymerase (Stratagene): aus Pyrococcus furiosus, exprimiert in E. coli, starke 3′-5′-Exonuklease;
- Thermosequenase® (Amersham): speziell für die Zyklusse quenzierung entwickelte extrem thermostabile DNA-Polymera se;
- AmpliTaq FS® (Perkin Elmer): mutierte Form von AmpliTaq® DNA-Polymerase, ohne 5′-3′-Exonuklease.

Erfindungsgemäß besonders bevorzugt werden die Sequitherm® und TTh-DNA-Polymerase. Die Vorteile der Verwendung dieser Polyme rasen bei der Zyklus-Sequenzierung unter Verwendung von Dye- Terminatoren sind u. a. wie folgt:

- geringerer Bedarf an Template-DNA im Vergleich zum Ampli taq®-DNA-Polymerase-Protokoll von ABI;
- geringere Enzymkosten durch Senkung der Enzymmenge;
- kürzere Reaktionszeiten und damit höherer Probendurchsatz;
- höhere Synthesetemperaturen bis 75°C, wodurch ein Arbeiten mit höherer Spezifität und eine "optimale" Denaturierung der Template-DNA ermöglicht wird;
- bessere Ausnützung der Sequenzierungschemikalien und damit Senkung der Kosten.

Aus dem Stand der Technik ist bekannt, daß mitunter extrem GC-reiche Sequenzen nicht in der PCR amplifiziert werden können und noch weniger der Sequenzanalyse zugänglich sind. Experimen tell bedeutsam wurde in diesem Zusammenhang der Unterschied in der Kettenverlängerungstemperatur zwischen PCR und Zyklusse quenzierung. Im Rahmen eines Forschungsprojekts konnte ein be stimmter Bereich aus dem menschlichen S71-Locus wohl in der PCR amplifiziert, aber die erhaltenen Fragmente nicht sequenziert werden. Ein Grund hierfür lag offensichtlich in der Kettenver längerungstemperatur, die im Falle der PCR bei 72°C, in der Zyklussequenzierung hingegen bei 60°C liegt. Experimentell kann die thermische Stabilität bestimmter DNA-Sequenzen dadurch her abgesetzt werden, daß G- und C-Basen durch die weniger fest interagierenden Analoga 7-Deaza-G und 5-Methyl-C ersetzt wer den. Der Versuch, mittels PCR Fragmente herzustellen, in denen alle G- und C-Positionen durch die Analoga ausgetauscht sind, scheiterte am Einbau von 7-Deaza-dGTP. U.a. das Sequitherm-DNA- Polymerase-Protokoll verwendet jedoch dieses G-Analogon in Nicht-Dye-Terminator-Reaktionen als alleinigen G-Baustein bei einer Kettenverlängerungstemperatur von 72°C, um Kompressionen auf Sequenzgelen zu unterdrücken.

Erfindungsgemäß wurde deshalb der Einbau von Dye-Terminatoren bei erhöhten Kettenverlängerungstemperaturen, d. h. bei Tempera turen < 60°C, versucht, wobei anfangs beispielhaft die Sequi therm®-DNA-Polymerase ausgewählt wurde.

Nachfolgend wird die Erfindung anhand von Abbildungen näher erläutert. Die Abbildungen zeigen:

ABBILDUNG 1 Optimiertes Protokoll für die Zyklussequenzierung mit Sepui therm®-DNA-Polymerase

Sequenzen länger als 500 Basen wurden mit Sequitherm®-DNA-Poly merase für das Standard Primer/Template-Paar pS71JB/"β-gal for ward" nach Verbesserung des dNTP/dyeddNTP-Verhältnisses bei einer Kettenverlängerungstemperatur von 72°C für 2 Minuten er reicht. Hierbei wurden ad 21 µl Endvolumen vereint:
0,5 µg Template, 10 pMol Primer, 2 µl 5xTACS-Puffer, 1 µl 30 mM MgCl₂, 0,1 µl 6 mM dITP/je 2 mM dATP/dTTP/dCTP/dGTP, 1 µl ABI-Nukleotid-Mix, je 0,5 µl DyeddA/DyeddG/DyeddT, 0,25 µl Dye ddC, 2,5 U Enzym und Wasser zu einem Endvolumen von 21 µl. Ver wendet wurde das PCR-Protokoll SeqT580 bei Elongationsbedingun gen von 72°C für 2 Minuten.

ABBILDUNG 2 Optimiertes Protokoll für die Zyklussequenzierung mit Tth-DNA- Polymerase

Sequenzen von über 500 Basen konnten mit Tth-DNA-Polymerase für das Standard Primer/Template-Paar pS71JB/"β-gal forward" bei einer Kettenverlängerungstemperatur von 72°C für 2 Minuten er halten werden. Hierbei wurden ad 21 µl Endvolumen vereint:
0,5 µg Template, 10 pMol Primer, 4 µl 5xTACS-Puffer, 1 µl 30 mM MgCl₂, 2 µl je 500 µM dITP/dATP/dTTP/dCTP/100 µM dGTP, 1 µl ABI-Nukleotid-Mix, je 0,5 µl DyeddA/Dyeddg, 0,25 µlDyeddC, 2,5 U Enzym und Wasser zu einem Endvolumen von 21 µl. Wie für die Sequitherm®-DNA-Polymerase wurde das PCR-Protokoll SeqT580 auf Elongationsbedingungen von 72°C für 2 Minuten abgewandelt.

ABBILDUNG 3 Standardzyklussequenzierung ohne (a) und mit (b) Zusatz von Magnesium am Beispiel der Replitherm®-DNA-Polvmerase

Unter Verwendung der ermittelten Standardbedingungen (0,5 µg Template, 10 pMol Primer, 1/2 ABI Prämix, 0,5 µl je 500 µM dITP/dATP/dTTP/dCTP/100 µM dGTP, 2,5 U Enzym, Wasser zu einem Endvolumen von 21 µl, PCR-Protokoll SeqT580 mit 70°C Elonga tionstemperatur) wurde die Replitherm®-DNA-Polymerase ohne (a) und mit (b) Zusatz von 1 µl 30 mM MgCl₂ für das Standard Pri mer/Template-Paar pS71JB1/ "β-gal forward" getestet.

ABBILDUNG 4 Standardzyklussequenzierung ohne (a) und mit (b) Zusatz von Magnesium am Beispiel der Tfl-DNA-Polymerase

Unter Verwendung der ermittelten Standardbedingung (0,5 µg Tem plate, 10 pMol Primer, 1/2 ABI Prämix, 0,5 µl je 500 µM dITP/ dATP/dTTP/dCTP/100 µM dGTP, 2,5 U Enzym, Wasser zu einem End volumen von 21 µl, PCR-Protokoll SeqT580 mit 70°C Elongations temperatur) wurde die TFl-DNA-Polymerase ohne (a) und mit (b) Zusatz von 1 µl 30 mM MgCl₂ für das Standard Primer/Template- Paar pS71JB1/"β-gal forward" getestet.

ABBILDUNG 5 Standard-Sequitherm®-Zyklussequenzierung mit Template-Primer paar pS71JB2/Primer 4612 bei Elongationstemperaturen von a) 72°C und b) 60°C

Standard-Sequithermzyklussequenzierung mit Template-Primerpaar pS71JB2/Primer 4612 bei Elongationstemperaturen von a) 72°C und b) 60°C. Beide Reaktionen wurden nach dem erarbeiteten Stan dardprotokoll angesetzt (0,5 µg Template, 10 pMol Primer, 1/2 ABI Prämix, 0,5 µl je 500 µM dITP/dATP/dTTP/dCTP/100 µM dGTP, 1 µl 30 mM MgCl₂, 2,5 U Sequitherm®-DNA-Polymerase, Wasser zu einem Endvolumen von 21 µl).

In Abb. 5a) ist das Ergebnis der Reaktion bei Verwendung des PCR-Protokolls SeqT580 mit 2 Minuten bei 72°C, in Abb. 5b) bei Verwendung des von ABI vorgeschlagenen Protokolls bei einer Kettenverlängerungstemperatur von 60°C für 4 Minuten (25 Zyklen 15 Sek. 95°C/15 Sek. 50°C/4 Min. 60°C) gezeigt.

ABBILDUNG 6 Parameter zur Übertragung der Sequenzierungsprotokolle auf an dere Primer/Template-Paare durch Anpassung des Übergans von der Annealing- zur Kettenverlängerungstemperatur

a) längere Annealing-Zeiten bei niedrigerer Temperatur.
In Abwandlung zum Standardprotokoll, beschrieben z. B. unter Abb. 5, wurden die Temperatur und die Dauer des Pri merannealingschrittes von 15 Sek. bei 50°C auf 30 Sek. bei 45°C verändert.
b) Vorschaltung eines 60°C-Schrittes vor der Elongation.
Um den Übergang zwischen Annealing und Kettenverlängerung zu verlangsamen, wurde ein 10 Sek. 60°C-Schritt unter Bei behaltung aller anderer Parameter zwischengeschaltet.
c) Zugabe von Spermidin.

Im Unterschied zum Standardprotokoll wurde zur Unterstüt zung der Primer/Template-Interaktion dem Reaktionsansatz 1/10 Vol. 30 mM Spermidin zugesetzt.

Zyklus-Sequenzierung bei Kettenverlängerungstemperaturen über 60°C I. Festlegung eines Basisprotokolls

Bei den ersten Versuchen wurde die Sequitherm®-DNA-Polymerase auf ihre Notwendigkeit für Magnesiumionen untersucht, um über haupt Dye-Terminatoren bei der üblicherweise verwendeten Tempe ratur von 60°C einzubauen, wenn diese Polymerase mit dem ABI- Prämix kombiniert wurde. Es ist bekannt, daß Magnesiumionen für DNA-Polymerasen essentiell sind. Zu diesem Zweck wurde das nachfolgende Sequenzierungsprotokoll von ABI durchgeführt und im folgenden abgewandelt:
Ad 21 µl Endvolumen werden vereint:
9 µl ABI Prämix (4 µl 5xTACS-Puffer/je 1 µl ABI-dNTP-Mix, DyeA, G, C, T)
10 pMol Primer
Template-DNA (1 µg Plasmid, < 0,5 µg PCR-Produkte)
anstatt 0,25 µl AmpliTaq®-DNA-Polymerase wurden 0,5 µl Sequi therm®-DNA-Polymerase verwendet.
Wasser ad 20 oder 21 µl

Anschließend wurde der Reaktionsansatz durch Pheolextraktion oder CTAB-Präzipitation gereinigt.

Das oben beschriebene Protokoll ergab jedoch nur unzureichende Ergebnisse.

Im Unterschied zu dem obigen Protokoll wurden nunmehr unter schiedliche Magnesiumchloridkonzentrationen zugegeben. Parallel hierzu wurde der 10xSequitherm®-Reaktionspuffer zusammen mit den Dye-Terminatoren und Nukleotiden des ABI-Kits getestet. Zufällig ausgewählte Plasmid-Templates, pS71JB1 und pS71JB2, die Teile des S71-Locus enthalten, und ein künstlich herge stelltes 22 mer "β-gal-forward" (CAGCTATGACCATGATTACGCC, Schmelztemperatur 53,9°C), das sich für auf pUC basierende Vek toren als Sequenzierungsprimer eignet, wurden als Modellsysteme ausgewählt.

In diesen grundlegenden Experimenten wurde gefunden, daß die Zugabe von 1 µl 30 mM Magnesiumchlorid zum ABI-Prämix (in End konzentration: 3,43 mM MgCl₂) bei Verwendung der Sequitherm® DNA-Polymerase den Einbau von Dye-Terminatoren bei einer Ket tenverlängerungstemperatur von 60°C ermöglichte. Diese Versuche wurden bei 65°C und 70°C wiederholt; bei einer Kettenverlänge rungstemperatur von über 60°C wurde jedoch vermehrt ein vorzei tiger Kettenabbruch sichtbar. Die hierdurch beobachteten "über höhten, abgeschnittenen" Peaks können auf eine große Menge an Template, ein ungeeignetes dNTP/Terminator-Verhältnis und/oder einen falschen PCR-Zyklus zurückzuführen sein. Durch Halbierung der Template-Menge (auf 0,5 µg Plasmid-Template) in Kombination mit 1/2, 1/3 und sogar 1/4 der Dye-Terminatoren wurden im Prinzip die gleichen Ergebnisse erhalten. Schließlich wurden stabile Ergebnisse dadurch erhalten, daß das dNTP/Dye-Termina tor-Verhältnis austitriert wurde, wobei gefunden wurde, daß sich dieses Verhältnis mit der Dauer der Kettenverlängerung ändert. Der für die nachfolgenden Versuche angewandte PCR-Zy klus wurde als SeqT580 bezeichnet und besteht aus 5 Zyklen 95°C-15 Sek./50°C-15 Sek./80°C-7 Sek./30 Zyklen bei 95°C-15 Sek./50°C-15 Sek.-/70°C-2 Min. Zu diesem Zeitpunkt wurde der Einfachheit halber nicht die Konzentration jedes einzelnen Dye- Terminators titriert, sondern der gesamte ABI-Prämix. Um dies auszugleichen, wurden 5 Zyklen mit 7 Sekunden mit einer Ketten verlängerungstemperatur von 80°C durchgeführt, um den weiterhin hohen Einbau der sehr hoch konzentrierten DyeT- und DyeC-Termi natoren zu vermindern.

Aufgrund dieser Vorversuche wird das nachfolgende grundlegende Protokoll erstellt, das für die weiteren Optimierungen benutzt wurde:
Die nachfolgenden Bestandteile wurden zu einem Endvolumen von 21 µl vereinigt und dem obigen PCR-Zyklus unterzogen:

- 0,5 µg Plasmid-DNA als Template (am besten in Wasser re suspendiert),
- 10 pMol Primer,
- 4,5 µl ABI-Prämix (2 µl 5xTACS-Puffer, 0,5 µl eines jeden Dyes ddA/T/G/C, 0,5 µl ABI dNTP-Mix, der 750 µM dITP und je 150 µM dATP, dTTP, dGTP und dCTP enthält),
- 0,5 µl 500 µM von je dITP/dATP/dTTP/dCTP/100 µM dGTP,
- 1 µl 30 mM MgCl₂,
- 0,5 µl Sequitherm®-DNA-Polymerase (5U) oder eine andere thermostabile DNA-Polymerase,
- dH₂O ad 21 µl.

PCR-Zyklus SeqT580 - wie oben beschrieben.

ABI-Prämix:
1 µl ddA*
1 µl ddG*
1 µl ddC*
1 µl ddT*
1 µl dNTP-Mix
4 µl 5xTACS-Puffer
5xTACS-Puffer:
400 mM Tris-HCl
10 mM MgCl₂
100 mM (NH₄)₂ SO₄, ph 9,0

Nach Einstellung der Magnesiumionenkonzentration war erfin dungsgemäß eine Zyklus-Sequenzierung mit Dye-Terminatoren mit der Sequitherm®-DNA-Polymerase auch bei Kettenverlängerungstem peraturen über 60°C durchführbar. Die Reaktionsbedingungen sind durch Routineversuche so optimierbar, daß die üblicherweise verwendeten Template-Menge und Konzentration an Dye-Terminato ren auf die Hälfte reduzierbar ist. Durch die Verringerung der Dye-Terminatoren-Menge wird eine schnelle CTAB-Aufreinigung ermöglicht.

II. Optimierung der Verfahrensparameter

Die nachfolgenden Parameter wurden systematisch daraufhin ge testet, in welcher Weise sie das Reaktionsgeschehen beeinflus sen:
Template/Primer-Paar pS71JB1/β-gal-forward für Sequitherm®-, teilweise auch für Tth- und AmpliTaq®-DNA-Polymerasen: TACS, MgCl₂, dNTP und Dye-Terminatoren-Erfordernis. Ergebnisse für optimierte Protokolle für Sequitherm®- und Tth-DNA-Polymerase sind in den Abb. 1 und 2 dargestellt.

TACS-Erfordernis

Ausgehend vom oben beschriebenen grundlegenden Protokoll, d. h. bei unveränderten PCR-Zyklus, Dye-Terminatoren, dNTP und Mg²⁺- Konzentration wurden unterschiedliche Konzentrationen an 5x TACS-Puffer von ABI getestet: Für die Sequitherm®-DNA-Polyme rase eine Reihe von 0,5, 2, 3, 4, 6, 7 µl TACS bei einer Ket tenverlängerungstemperatur von 70°C, für Tth-DNA-Polymerase bei einer Kettenverlängerungstemperatur von 72°C mit 0,5, 1, 2, 4, 7 µl TACS pro 21 µl Endvolumen (in Konzentrationen von 0,125x, 0,5x, 0,75x, 1x, 1,5x bzw. 1,75x). Die besten Ergebnisse wurden für die Sequitherm-DNA-Polymerase zwischen 1 und 5 µl 5xTACS- Puffer erhalten; im Gegensatz dazu arbeitete die Tth-DNA-Poly merase über den gesamten Bereich an TACS-Konzentrationen ohne merkliche Unterschiede.

Zusammenfassend tolerieren unter den gegebenen Versuchsbedin gungen beide DNA-Polymerasen einen relativ breiten Bereich an 5xTACS-Puffer.

Dye-Terminatoren

In dieser Versuchsreihe wurde die Menge an Dye-Terminatoren bestimmt, die erforderlich ist, um eine zufriedenstellende Se quenz zu erhalten. Die Versuche wurden mit Sequitherm®-DNA-Po lymerase durchgeführt. Zunächst wurde im obenbeschriebenen grundlegenden Protokoll 1/2, 1/3 und 1/4 des ABI-Prämix verwen det. Sogar mit 1/4 des Prämix konnte eine lesbare Sequenz er halten werden. Überraschenderweise erschienen die C- und T-Pe aks - ihre entsprechenden Dye-Terminatoren sind im ABI-Prämix hochkonzentriert - weiterhin als "überhöht und abgeschnitten", was auf eine zu hohe Konzentration hindeutet. Deshalb wurden die Versuche mit einer höheren dNTP-Konzentration (1 µl ABI dNTP-Mix plus 1 µl 0,5 mM dITP/dATP7dCTP/dTTP/0,1 mM dGTP) und mit 0,5 und 2 µl-Zugabe von 5xTACS-Puffer und nur 25% Dye-T-, Dye-C-Terminatoren oder beiden Terminatoren zusammen durchge führt. Sehr gute Ergebnisse konnten mit einer verminderten Dye- C-Konzentration erreicht werden. Im Gegensatz dazu wurde ohne zusätzlich Zugabe von Nukleotiden nur eine sehr mäßige Sequenz qualität erreicht, und zwar auch dann, wenn die verringerte Menge sowohl an Dye-C als auch Dye-T verwendet wurde. Die halbe Menge des ABI-Prämix wurde als Standardwert ermittelt.

Zusammenfassend können somit die Dye-Terminator-Konzentrationen für beide DNA-Polymerasen drastisch verringert werden, wenn die dNTP-Konzentration und der PCR-Zyklus aufeinander abgestimmt wurden.

Nukleotid-Erfordernis

Die nachfolgenden Versuche wurden mit Sequitherm®- und Tth-DNA- Polymerasen durchgeführt. Auf der Grundlage des oben beschrie benen Protokolls wurden dann Sequenzen mit mehr als 500 Basen erhalten, wenn 1 µl ABI dNTP-Mix (0,75 mM dITP, je 0,15 mM dAT- P/dTTP/dCTP)/0,1 µl 6 mM dITP/0,5 mM dATP/dTTP/dCTP/0,1 mM dGTP zusammen mit je 0,5 µl Dye-AGT/0,25 µl DyeC zugegeben wurden. Bei Zugabe von 0,5 µl letzter Nukleotidmischung konnten weiter hin sehr lange Sequenzen erzeugt werden, wobei jedoch bei etwa den ersten 50 Basen die G-Termination unzureichend war, während mit 1 µl keine Sequenz-Leiter erhalten wurde. (Die entsprechen den Konzentrationen sind für die erste Versuchsreihe etwa 64 µM für dITP/17 µM dATP/-dCTP/dTTP/0,48 µM dGTP; für die zweite Versuchsreihe 178,5 µM für dITP/54,75 µM für dATP/dCTP/dTTP/2,4 µM dGTP und für die dritte Versuchsreihe 321,4 µM für dITP/102,3 µM für dATP/dCTP/dTTP/4,8 µM dGTP).

Für die Tth-DNA-Polymerase wurde im Gegensatz zu dem oben be schriebenen grundlegenden Protokoll 1 µl ABI dNTP-Mix mit un terschiedlichen Mengen (1, 2 und 5 µl) 1. 0,5 mM dITP/dATP/ dTTP/dCTP (Endkonzentrationen von etwa 1,59 µl dITP/30,9 µM dATP/dTTP/dCTP), 2. 93,3 µM dITP/64,75 µM dATP/dTTP/dCTP, 3. 154,7 µM dITP/126,1 µM dATP/dTTP/dCTP in 4 µl 5xTACS-Puffer getestet. Mit den zuletzt genannten zwei Konzentrationen wurden Sequenzen mit bis zu 400 Basen erhalten. Man erhielt Kettenlän gen von über 500 Basen, wenn 1 oder 2 µl einer dNTP-Mischung, bestehend aus 0,5 mM dITP/dATP/dCTP/0,1 mM dGTP (Endkonzentra tionen von dGTP von 4,8, 9,6 bzw. 24 µM), zugegeben wurden.

Zusammenfassend ergab die entsprechende Einstellung des dNTP/ Dye-ddNTP-Verhältnisses Sequenzlängen, die so hoch waren, daß die Auflösungsgrenze des verwendeten 6% Polyacrylamidgels er reicht wurde. Im allgemeinen ergaben dNTP-Mischungen, die dITP zur Signalkompression in Polyacrylamidgelen verwendeten, bes sere Ergebnisse als gleichmäßig konzentrierte Mischungen mit 7- Deaza-dGTP.

Magnesium-Erfordernis

Für die Sequitherm®-DNA-Polymerase wurde das Mg²⁺-Erfordernis systematisch getestet. 0,5, 1, 2, 3, 5 und 10 µl 30 mM MgCl₂ (Endkonzentrationen von etwa 2, 3,4, 4,85, 6,3 bzw. 9,1 mM) wurden hinzugegeben, wobei der Rest des grundlegenden Proto kolls unverändert blieb. Die besten Ergebnisse wurden im Be reich von 1-5 µl 30 mM MgCl₂ erhalten, wobei bei Zugabe von 0,5 µl 30 mM MgCl₂ nur eine geringfügige Verschlechterung er halten wurde. Für die Tth-Polymerase war die Reaktion sogar bei Versuchen mit 1 und 10 µl 30 mM MgCl₂ und sogar ohne MgCl₂ er folgreich.

Zusammenfassend tolerierten beide Polymerasen unter der gegebe nen Reaktionsbedingungen breite Magnesiumchlorid-Konzentratio nen. Für die Sequitherm®-DNA-Polymerase liegt das Optimum hier bei etwa 2,5 mM, für die AmpliTaq®- und die Tth-DNA-Polymerase bei < 2 mM MgCl₂.

Zyklus-Bedingungen mit unterschiedlichen Parametern

Bei gleichbleibender Magnesiumionen-Konzentration wurden ver schiedene Parameter in einem Versuch verändert. Bei einer Ket tenverlängerungszeit von nur 1 Min. wurden nicht zufrieden stellende Ergebnisse erhalten, insbesondere dann, wenn eine Reihe von 1, 2, 3 µl TACS mit Zugabe von 1 µl ABI-Nukleotidmix oder 1 µl 15 µM dNTP getestet wurde. Wenn die Kettenverlänge rungszeit auf 90 Sekunden verlängert wurde, konnten sowohl bei den unterschiedlichen TACS-Zugabemengen als auch bei der dNTP- Zugabe klare Wirkungen erkannt werden (1 µl ABI dNTP-Mix, End konzentration 35,71 µM dITP/7,14 µM dATP/dTTP/dCTP). Schließ lich konnten drastische Unterschiede festgestellt werden, wenn die Sequitherm®-DNA-Polymerase mit der oben beschriebenen "lan gen Sequenz" dNTP-Konzentration (1 µl ABI dNTP plus 0,1 µl 6 mM dITP/0,5 mM dATP/dTTP/dCTP/0,1 mM dGTP) in Amplifizierungszy klen mit einer Verlängerungszeit von 2 Min. bei 72°C im Ver gleich zu 3 Min. bei 70°C getestet wurde. Beim ersten Fall konnten Sequenzleitern von mehr als 500 Basen erhalten werden, während beim zweiten Fall nur 200 Basen erhalten wurden, wo durch die Verbindung zwischen dem PCR-Zyklus und der dNTP-Kon zentration unterstrichen wird. Weiterhin wurden für die Tth- DNA-Polymerase mit 2 µl 0,5 mM dITP/dATP/dTTP/dCTP/0,1 mM dGTP (Endkonzentration 57,6 µM dATP/dTTP/dCTP/9,6 µM dGTP) noch bes sere Ergebnisse (< 500 Basensequenzlänge) bei einer Kettenver längerungszeit von 2 Minuten bei 72°C erhalten im Vergleich zu 3 Minuten bei 70°C.

Diese Versuche machen deutlich, daß die Polymerasen niemals die "Standardgeschwindigkeit" der PCR von 1 Kb pro Minute in einem Zyklus-Sequenzierungsprotokoll unter Verwendung von Dye-Termi natoren erreichen. Aus der PCR ist bekannt, daß die Magnesium ionen-Konzentration und die dNTP-Gesamtkonzentration miteinan der in Beziehung stehen; hier konnte gezeigt werden, daß es weiterhin eine Wechselwirkung zwischen der Kettenverlängerungs zeit und dem Dye-Terminator/dNTP-Verhältnis gibt.

Kettenverlängerungstemperatur

Ein sehr guter Einbau von Dye-Terminatoren wurde auch dann ge funden, wenn das obenbeschriebene grundlegende Protokoll bei einer Kettenverlängerungstemperatur von 72°C durchgeführt wur de. Die Sequitherm- und insbesondere die TtH-DNA-Polymerasen arbeiteten auch bei 75°C sehr gut. Jedoch wurden bei einer Ket tenverlängerungstemperatur von 80°C deutlich schlechtere Er gebnisse erhalten.

Bei der Zyklus-Sequenzierung mit Dye-Terminatoren zeigen somit die extrem thermophilen DNA-Polymerasen ähnliche Temperatur- Optima wie für PCR, jedoch ohne die Reaktionsgeschwindigkeit der klassischen PCR zu erreichen.

Zugabe "katalytischer Mengen" anderer DNA-Polymerasen, teilwei se mit Proofreading-Aktivität

Für "lange PCRs" ist bekannt, daß die vorzeitige Kettentermina tion durch falsch eingebaute Nukleotide verursacht wird. Des halb wurde die Zugabe einer "katalytisch" aktiven Menge von DNA-Polymerasen mit geringer (AmpliTaq®) und vollständig funk tionierender 3′,5′-Exonuclease-Aktivität ausgetestet. In Ver suchen mit nur einminütiger Verlängerungszeit ergaben "kataly tische" Mengen von 0,5 U Pfu oder 0,5 U AmpliTaq® bessere Se quenzen als 1/1-Mischungen. Durch die Verwendung von Enzymmi schungen können deshalb die Sequenzprotokolle optimiert werden.

Additive

Die Detergenzien Tween® 20 und TritonX® und die "Co-Lösungsmit tel" DMSO und Glyzerin wurden zur Verbesserung der PCR und der DNA-Sequenzierung verwendet, wobei teilweise die thermische Stabilität der Template-DNA-Doppelhelix beeinflußt wird. Die zur Verbesserung der DNA-Sequenzierung mit AmpliTaq®-DNA-Poly merase bei 60°C verwendeten Additivzugaben wurden auch für die Sequitherm® und die Tth-DNA-Polymerase bei 72°C getestet. Die Ergebnisse zeigen, daß die üblicherweise eingesetzten Additive das Sequenzierungsergebnis mit den Sequitherm®- und Tth-DNA- Polymerasen für das verwendete Primer/Template-Paar nicht noch weiter verbessern lassen.

III. Verwendung weiterer, extrem thermophiler DNA-Polymerasen bei Kettenverlängerungstemperaturen von über 60°C

Bei den nachfolgenden Versuchen wurde überprüft, ob außer der Sequitherm®-DNA-Polymerase auch andere extrem thermophile DNA- Polymerasen zur Zyklus-Sequenzierung mit Dye-Didesoxy-Termina toren bei Kettenverlängerungstemperaturen von über 60°C ver wendbar sind.

Unter Verwendung des oben beschriebenen grundlegenden Sequen zierungsprotokolls (PCR-Zyklus SeqT580, pS71JB1 als Template, β-gal-forward als Primer) wurden die nachfolgenden extrem ther mophilen DNA-Polymerasen auf ihre Fähigkeit zum Einbau von Dye- Terminatoren bei einer Kettenverlängerungstemperatur von 70°C mit und ohne Zugabe von 1 µl 30 mM MgCl₂ getestet. Es wurde gefunden, daß die nachfolgenden extrem thermophilen DNA-Polyme rasen nach Zugabe von 1 µl 30 mM MgCl₂ bei einer Kettenverlän gerungstemperatur von 70°C arbeiten: Sequitherm (Epicentre), Tth (Epicentre, Boehringer), TaqPlus (Stratagene), Expand HIFI (Boehringer), Tfl (Epicentre), Replitherm (Epicentre) und Gold star (Eurogentec). Trotz schlechterer Gesamtergebnisse sind auch Deep Vent, Vent-exo^- und 9°N-DNA-Polymerasen grundsätzlich durch MgCl₂-Zugabe bei einer Kettenverlängerungstemperatur von 70°C einsetzbar. Überraschenderweise wurde sogar gefunden, daß die nachfolgenden extrem thermophilen DNA-Polymerasen sogar ohne Zugabe von 1 µl 30 mM MgCl₂, d. h. mit der bereits im Aus gangsprotokoll verwendeten MgCl₂-Menge, bei Kettenverlänge rungstemperaturen < 60°C einsetzbar sind: Goldstar®, Boehringer HIFI, TaqPlus®, Tth, TFl und AmpliTaq® Dies zeigt, daß viele DNA-Polymerasen aus extrem thermophilen Organismen generell Dye-Terminatoren bei der Zyklus-Sequenzierung einbauen können.

Für das untersuchte Primer/Template-Paar wurde somit gefunden, daß alle untersuchten DNA-Polymerasen in der Lage sind, Dye- Terminatoren bei einer Kettenverlängerungstemperatur von 70°C einzubauen. Diese Befunde werden beispielhaft anhand der Repli therm®- und Tfl-DNA-Polymerasen in Abb. 3 und 4 darge stellt.

IV. Übertragung der Ergebnisse auf weitere Primer-Template- Paare

Um festzustellen, daß die Verwendung extrem thermophiler DNA- Polymerasen bei der Zyklus-Sequenzierung mit Dye-Terminatoren bei Temperaturen über 60°C auch bei anderen Primer-Template- Paaren funktioniert, wurden Versuche mit pS71JB2 und dem Primer β-gal for und mit pS71JB4 mit dem S71-spezifischen Primer 4935 durchgeführt. Es zeigte sich, daß insbesondere der Übergang vom Primer-Annealing zur Kettenverlängerung für das erfindungsgemä ße Verfahren kritisch ist. U.a. die Zugabe von Spermidin beein flußte das erfindungsgemäße Verfahren positiv.

Erfindungsgemäß wurde somit festgestellt, daß extrem thermosta bile DNA-Polymerasen bei der Zyklus-Sequenzierung mit Dye-Ter minatoren auch bei Kettenverlängerungstemperaturen von über 60°C, insbesondere bei Temperaturen im Bereich von 70°C bis 75°C, optimalerweise bei 72°C, verwendbar sind. Besonders be vorzugt werden die Sequitherm® und Tth-DNA-Polymerase erfin dungsgemäß eingesetzt. Aber auch andere, an sich bekannte, ex trem thermophile DNA-Polymerasen sind einsetzbar. In Abhängig keit vom verwendeten Primer-Template-Paar und der verwendeten DNA-Polymerase sind die Versuchsbedingungen für die Zyklus-Se quenzierung mit Dye-Terminatoren in üblicher Weise zu optimie ren. Es handelt sich hierbei um routinemäßige, dem Fachmann bekannte Abänderungen des Zyklus-Sequenzierungs-Verfahrens mit Dye-Terminatoren, wobei erfindungsgemäß für die Kettenverlänge rung Temperaturen von über 60°C eingesetzt werden.

Insbesondere sollten bei der Optimierung der Zyklus-Sequenzie rung die nachfolgenden Bedingungen in Abhängigkeit vom benutz ten Primer-Template-Paar und der verwendeten DNA-Polymerase aufeinander eingestellt und optimiert werden:

- Magnesiumionen-Konzentration,
- Pufferzusammensetzung,
- Ersatz der Magnesiumionen durch andere Metallionen,
- Nukleotid-Konzentration,
- Konzentration der extrem thermophilen DNA-Polymerase
- PCR-Bedingungen, insbesondere die Bedingungen zum Primer- Annealing und die Übergangsbedingungen von Primer-Annea ling zur Kettenverlängerungstemperatur, die immer über 60°C, bevorzugt im optimalen Bereich von 70°C-75°C, liegt,
- geeignete Auswahl von Additiven zur Stimulierung des Pri mer-Annealings, der Kettenverlängerung und der Enzymakti vität, beispielsweise durch Zugabe von PEG und von Stabi lisatoren der DNA-Struktur wie Spermidin.

Mit der vorliegenden Erfindung wird erstmals gezeigt, daß ex trem thermostabile DNA-Polymerasen generell zum Einbau modifi zierter Didesoxy-Nukleotide wie zum Beispiel der Dye-Terminato ren bei Temperaturen < 60°C fähig sind. Dieser Befund hat weit reichende Konsequenzen für die Optimierung von Sequenzierungs- und Amplifizierungsprotokolllen, die solche Nukleotidanaloga verwenden wollen. So machen die erhaltenen Ergebnisse deutlich, daß die Übertragbarkeit der bisherigen Protokolle, die nur bei 60°C arbeiten können, über Anpassung der Reaktionsbedingungen für das jeweilig verwendete Primer/Template-Paar optimiert wer den müssen. So zeigen gerade die Versuche mit pS71JB2/Primer 4612 bei 60°C und 72°C, daß ein entscheidender Punkt im Über gang vom Annealing zur Kettenverlängerung liegt.

Unterstützt wird dieser Befund dadurch, daß die Abwandlung des PCR-Zyklusses auf tiefere Annealing-Temperaturen (45°C statt 50°C) bei verlängerten Annealing-Zeiten (30 Sek. statt 15 Sek.) sowie die Zwischenschaltung eines 10 Sek. Schrittes bei 60°C zwischen Annealing bei 50°C und Extension bei 72°C zu stark verbesserten Ergebnissen führen. Unterstützt man die Primer/- Template-Interaktion durch Additive wie Spermidin, werden im Vergleich zum 72°C Basis-Protokoll ebenso stark verbesserte Ergebnisse erhalten. Besonders die Verwendung von Spermidin ist eine weitere Neuheit der vorliegenden Erfindung. Es wurde bei spielsweise zur Unterstützung von Restriktionsverdaus und DNA- Protein-Interaktionen bei Gelshift-Experimenten eingesetzt, aber niemals als Hilfsmittel für die DNA-Sequenzierung mit Dye- Terminatoren.

Eine Anwendung dieser Forschung zeigte z. T. bereits sehr gute Erfolge bei der Anpassung der Thermosequenase®-DNA-Polymerase an den neuen Zyklussequenzierungskit der Firma ABI, der mit stark verminderten Dye-Terminatorkonzentrationen unter Verwen dung der AmpliTaqFS® angeboten wird. Durch Zugabe von Additiven wie Spermidin konnten sogar Sequenzen mit der durch die Ampli- Taq FS® "abgelösten" AmpliTaq®-DNA-Polymerase erhalten werden. Gut übertragbare 60°C-Protokolle konnten des weiteren bei im Vergleich zur AmpliTaq® vermindertem Dye-Terminatorbedarf durch die einfache Zugabe von Magnesium für Tth®- und Sequitherm®-DNA- Polymerasen etabliert werden; wie bereits oben angedeutet, kön nen die Reaktionsbedingungen für die AmpliTaq®-DNA-Polymerase auch noch stark verbessert werden.

Zusammenfassend beschreibt die Erfindung neben einer neuen Ver wendung extrem thermophiler DNA-Polymerasen Parameter und Ad ditive zur Etablierung und Optimierung von Protokollen unter Verwendung extrem thermophiler DNA-Polymerasen und substituier ter Nukleotide. Eine erfindungsgemäß besonders wichtige und für die Durchführung der Erfindung entscheidende Erkenntnis liegt darin, daß die nachfolgenden Parameter in Abhängigkeit vonein ander eingestellt werden müssen, um die Zyklus-Sequenzierung von DNA mit mit einem Marker substituierten Didesoxynukleotiden bei einer Temperatur < 60°C durchzuführen. Diese Parameter sind:

- Reaktionspuffer;
- Desoxy-Nukleotide;
- mit einem Marker substituierte Didesoxynukleotide;
- Primer- und Template-DNA;
- Additive;
- Ramping-Zeit zwischen den einzelnen Temperaturstufen in Abhängigkeit von der verwendeten DNA-Polymerase, vom Tem plate/Primer-Paar und vom Reaktionspuffer.

Claims

1. Verwendung von extrem thermostabilen DNA-Polymerasen (E.C.2.7.7.7.) bei der Zyklus-Sequenzierung mit min einem Marker substituierten Didesoxynukleotiden bei einer Ket tenverlängerungstemperatur im Bereich von < 60°C bis 80°C.

2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Kettenverlängerungstemperatur im Bereich von 65°C bis 75°C liegt.

3. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Kettenverlängerungstemperatur im Bereich von 68°C bis 73°C liegt.

4. Verwendung nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Polymerase ausgewählt wird aus mindestens ei nem Element der Gruppe, umfassend die nachfolgenden DNA- Polymerasen: AmpliTaq-DNA-Polymerase; Taq-DNA-Polymerase; Sequitherm-DNA-Polymerase; Tth-DNA-Polymerase; Expand- High-Fidelity-DNA-Polymerase; Pwo-DNA-Polymerase; Deep Vent-DNA-Polymerase; 9°N-DNA-Polymerase; Vent Exo⁻-DNA- Polymerase; Replitherm-DNA-Polymerase; Goldstar-DNA-Poly merase; Tfl-DNA-Polymerase; Thermosequenase; AmpliTaq FS- DNA-Polymerase; Pfu-DNA-Polymerase.

5. Verwendung nach einem oder mehreren der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Didesoxynukleotide mit einem Farbstoff als Marker substituiert sind.

6. Verwendung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Didesoxynukleotide mit einem fluoreszierenden Farbstoff als Marker substituiert sind.

7. Verfahren zur Zyklus-Sequenzierung von DNA mit mit einem Marker substituierten Didesoxynukleotiden mit den nach folgenden Schritten:

a) Vermischen von mindestens einem Reaktionspuffer, der Desoxy-Nukleotide, der mit einem Marker substituier ten Didesoxy-Nukleotide, der Primer- und Template- DNA, Wasser und gegebenenfalls weiteren Additiven und Einstellen ihrer Konzentration in Abhängigkeit voneinander;
b) Zugabe mindestens einer extrem thermostabilen DNA- Polymerase;
c) Durchführen der PCR-Sequenzierungs-Zyklen mit minde stens den nachfolgenden Schritten:
- - Denaturierung der Template-DNA bei einer geeig neten Temperatur;
- - Annealing des Primers bei einer geeigneten Tem peratur;
- - Kettenverlängerung bei einer geeigneten Tempe ratur;
- - Einstellen der Ramping-Zeit zwischen den ein zelnen Temperaturstufen in Abhängigkeit von der verwendeten DNA-Polymerase, vom Template/Pri mer-Paar und vom Reaktionspuffer;
d) Reinigung des Reaktionsansatzes;
e) Auftrennung der DNA-Ketten und Detektion zur Bestim mung der DNA-Sequenz,

dadurch gekennzeichnet,
daß im Schritt c) die Kettenverlängerung bei einer Tempe ratur von < 60°C bis 80°C durchgeführt wird.

8. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß im Schritt a) Additive zur Stimulierung des Primer- Annealings, der Kettenverlängerung, zur Beeinflussung der DNA-Struktur und/oder der Enzymaktivität zugegeben wer den.

9. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden An sprüche, dadurch gekennzeichnet daß im Schritt b) die DNA-Polymerase aus mindestens einem Element der nachfolgenden Gruppe ausgewählt wird: AmpliTaq-DNA-Polymerase; Tag-DNA-Polymerase; Sequitherm- DNA-Polymerase; Tth-DNA-Polymerase; Expand-High-Fidelity- DNA-Polymerase; Pwo-DNA-Polymerase; Deep Vent-DNA-Polyme rase; 9°N-DNA-Polymerase; Vent Exo⁻-DNA-Polymerase; Repli therm-DNA-Polymerase; Goldstar-DNA-Polymerase; Tfl-DNA- Polymerase; Thermoseguenase; AmpliTaq FS-DNA-Polymerase; Pfu-DNA-Polymerase.

10. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden An sprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Puffer Alkalimetallionen oder Erdalkalimetallio nen enthält.

11. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß als Erdalkimetallionen Magnesiumionen verwendet wer den.

12. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden An sprüche, dadurch gekennzeichnet daß im Schritt c) die Kettenverlängerung bei einer Tempe ratur im Bereich von 68°C bis 73°C durchgeführt wird.

13. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet daß im Schritt c) die Kettenverlängerung bei einer Tempe ratur im Bereich von 70°C bis 72°C durchgeführt wird.

14. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden An sprüche, dadurch gekennzeichnet, daß im Schritt a) PEG und/oder Stabilisatoren der DNA- Struktur zugegeben werden.

15. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß mit einem Farbstoff als Marker substituierte Di desoxyynukleotide verwendet werden.

16. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß mit einem fluoreszierenden Farbstoff als Marker sub stituierte Didesoxynukleotide verwendet werden.

17. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß als Stabilisator der DNA-Struktur Spermidin zugegeben wird.