JP2009011259A - 逆転写反応液の処理方法 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明は、ＲＮＡを鋳型としたその相補的な配列を持つＤＮＡの合成反応、すなわち、逆転写反応に関する。
【解決手段】鎖長が５００ｂｐ以下の配列を標的とした定量ポリメラーゼ連鎖反応（ＱＰＣＲ）の鋳型として精製せずにＱＰＣＲ反応液中に添加することができる相補ＤＮＡの調製方法であって、次のステップを含む方法である。（１）鋳型ＲＮＡ、プライマー、金属イオン、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを全て含み、実質的にＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性のみを示すＤＮＡポリメラーゼを含まない反応混合物であって、２５℃〜６５℃の範囲内において逆転写反応を行うこと、（２）前記逆転写反応混合物を、９７℃より高い温度で処理して、合成された相補ＤＮＡに相補的に結合している鋳型ＲＮＡを相補ＤＮＡから除去すること
【選択図】なし

Description

本発明は、ＲＮＡを鋳型としたその相補的な配列を持つＤＮＡの合成反応、すなわち、逆転写反応に関する。

逆転写反応は、通常の転写反応、即ちＤＮＡを鋳型としたその相補的な配列を持つＲＮＡの合成反応の逆方向の反応であり、ＲＮＡを鋳型としたその相補的な配列を持つＤＮＡの合成反応である。逆転写反応を触媒する活性を持つ酵素、即ち逆転写酵素は、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼとも呼ばれ、ＲＮＡからその相補的な配列を持つＤＮＡ（相補ＤＮＡ）を合成するために広く利用されている。特に分子生物学や遺伝子工学の分野においては、逆転写により得られる相補ＤＮＡを利用した相補ＤＮＡライブラリーの作成や、ＲＮＡポリメラーゼと組み合わせた核酸増幅法（ＮＡＳＢＡ法）、逆転写反応とポリメラーゼ連鎖反応を組み合わせたＲＴ−ＰＣＲ法、ＲＡＣＥ解析法、メッセンジャーＲＮＡのディファレンシャルディスプレイ法などの目的に広く用いられている。

逆転写酵素は、ＲＮＡウィルス（レトロウィルス）が自身の増殖を行う為に必須の酵素として単離された。マウス白血病ウィルスから発見されたＭ−ＭＬＶ（Ｍｏｌｏｎｅｙ Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ） ＲＴａｓｅや、ＡＭＶ （Ａｖｉａｎ Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ Ｖｉｒｕｓ） ＲＴａｓｅはその一例であり、野生型酵素や、野生型酵素として、あるいは分子生物学的な改変を加え、高温反応性、伸長性、反応効率を向上させたものが、前述のような目的に使用する為に市販されている。これらの酵素は、野生型においては鋳型ＲＮＡを除去する為のＲＮａｓｅ Ｈ活性を有し、この活性は合成された相補ＤＮＡに結合した鋳型ＲＮＡを除去する機能を担っている。しかしながら、この活性は時として逆転写反応の伸長先にある鋳型ＲＮＡの領域を、相補ＤＮＡが合成されていないにも関わらず分解してしまうことがあり、その場合、逆転写反応はその部位で停止してしまうこととなる。この活性は、長鎖の相補ＤＮＡの合成を必要とする場合などには阻害的に作用するため、これまで様々な回避方法が試みられてきた。中でも代表的なのは、逆転写酵素に対して分子生物学的な改変を加えＲＮａｓｅ Ｈ活性を欠失させるものであり、これら改変型の逆転写酵素も既に広く市販され、容易に入手し、利用することができる。

ところで、逆転写反応後の相補ＤＮＡは、前述のように様々な下流の実験に広く用いられているが、その中で最も代表的な方法といえるのが、ＲＴ−ＰＣＲ法である。ＲＴ−ＰＣＲ法では、合成された相補ＤＮＡを精製して、もしくは逆転写反応終了液を未精製のまま鋳型として供し、ＰＣＲを実施する。現状では、専ら後者の方法が広く用いられているが、この際、逆転写反応液に含まれる幾つかの因子が、ＰＣＲにおける反応阻害要因となることが知られている。その一つは、逆転写酵素自身である。逆転写酵素は、鋳型となるＲＮＡ鎖上を、その相補的な配列をもつＤＮＡを合成しながら進んでいくが、その合成終了地点において酵素が解離せず、ＲＮＡ−ＤＮＡ鎖上に残留するという性質があることが知られている。この性質がその合成された相補ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲにおいて阻害的に作用することがあり、酵素を変性・除去すべく、熱処理による酵素失活処理が行われている。その熱処理の条件は、最も緩やかなもので８５℃近辺・３秒間程度で実施され、これらの条件で酵素は容易に失活する。ただし、用いる酵素や反応バッファーにより最適な熱処理条件は若干変化するが、おおよそ８５℃〜９５℃、反応時間は最長５分程度で実施されている。それ以上の高い温度で熱処理を実施した場合、検出対象となる相補ＤＮＡ鎖が熱によって加水分解を受ける可能性があることから、９５℃より高い温度での熱失活処理は、その意義が薄いとして実施されていない。

一方、もう一つの阻害要因として、逆転写反応の鋳型となったＲＮＡの残存が挙げられる。一般に、ＲＮＡ−ＤＮＡの相補的な結合は、ＤＮＡ同士の結合と比べて強固であり、鋳型となったＲＮＡの残存により、相補ＤＮＡを鋳型としたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において、プライマーの結合に対する拮抗阻害が発生し、反応効率の低下を来たす原因となっていた。
Ｋｉｔａｂａｙａｓｈｉ他、２００３、「Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．」２４７４−２４７６

逆転写反応産物からの鋳型ＲＮＡの除去については、ＤＮＡと相補的に結合したＲＮＡのみを選択的に分解する活性を持つＲＮａｓｅ Ｈを、逆転写反応終了後に反応液へ添加するという方法が用いられてきた。しかしながらこの方法では、逆転写酵素とは別にＲＮａｓｅ Ｈを準備する必要があり、また酵素の添加ステップが追加的に必要とされることから、操作面でも煩雑であり、多サンプルの同時処理には適していないという問題があった。一方、本来備わっているＲＮａｓｅ Ｈ活性が保持された野生型の逆転写酵素を使用する方法も近年用いられており、操作面では上記の方法と比較して簡便であるが、前述のようにＲＮａｓｅ Ｈ活性は逆転写反応において阻害的に作用することがあるため、反応産物の収量や品質を低下させる恐れがあり、可能であればＲＮａｓｅ Ｈ活性は逆転写反応終了後に作用させることがより好ましいとされてきた。そのため、操作面で簡便であり、なおかつ逆転写反応へ影響を及ぼさない鋳型ＲＮＡの除去方法が求められていた。

本発明者らは、上記事情に鑑み、鋭意研究の結果、逆転写反応終了液を酵素失活温度よりも更に高温で処理することにより、最も簡便に鋳型ＲＮＡの除去を行うことが出来る手法を開発し、本発明を完成させるに至った。

近年、ＰＣＲを実施する工程において、同時に増幅された核酸を検出する「リアルタイムＰＣＲ」が広く実施されるようになってきた。その理由として、検出時間の短縮とともに、定量性の確保が挙げられる。ＰＣＲでは最終の増幅核酸量は基質量などで上限が規定されるが、ＰＣＲは極めて効率よく核酸を増幅させるため、一定以上の標的核酸では上限に達してしまい、最終の増幅核酸の量がもとの標的核酸の量に必ずしも比例しない事態が発生する。そこでＰＣＲを実施しながら増幅核酸を検出し、一定量以上の増幅核酸が検出されたサイクル数を指標とする定量方法が考案された。この方法によれば、４０サイクルのＰＣＲでは、理論上は最大２の３９乗（１０桁以上）のダイナミックレンジを確保することができる。

本発明者らは、（１）この方法では、必ずしも標的配列の全長を増幅する必要はなく、通常は５００ｂｐ以下、より頻繁には５０〜２５０ｂｐ程度の配列を標的とすること、（２）このため、標的核酸を含む試料においては、必ずしもその核酸が全長を完全に保持している必要はなく、加水分解による核酸鎖の分断が、本方法における検出感度にはほとんど影響を及ぼさないこと、に着目することにより、特に、鎖長の短い標的配列の検出において相補ＤＮＡの加水分解による影響を無視できる程度に抑えながら最も簡便に鋳型ＲＮＡの除去を行うことが出来る方法を開発することができた。

すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
［項１］
鎖長が５００ｂｐ以下の配列を標的とした定量ポリメラーゼ連鎖反応（ＱＰＣＲ）の鋳型として精製せずにＱＰＣＲ反応液中に添加することができる相補ＤＮＡの調製方法であって、次のステップを含む方法。
（１）（ａ）鋳型ＲＮＡ、
（ｂ）プライマー、
（ｃ）金属イオン、
（ｄ）ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ
を全て含み、実質的にＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性のみを示すＤＮＡポリメラーゼを含まない反応混合物であって、２５℃〜６５℃の範囲内において逆転写反応を行うこと
（２）前記逆転写反応混合物を、９７℃より高い温度で処理して、合成された相補ＤＮＡに相補的に結合している鋳型ＲＮＡを相補ＤＮＡから除去すること
［項２］
高温の熱処理が、１分以上で行われる、項１記載の方法。
［項３］
高温の熱処理が、４分以上で行われる、項３記載の方法。
［項４］
ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼが、ウィルス由来である、項１記載の方法。
［項５］
ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼが、モロニーマウス白血病ウィルス（Ｍ−ＭＬＶ）、トリ芽球症ウイルス（ＡＭＶ）より選択されるウィルス由来のＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼである、項４記載の方法。
［項６］
ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼが、ＲＮａｓｅ Ｈ活性を欠失した変異型ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼである、項４または５記載の方法
［項７］
プライマーが、ランダムな配列からなるオリゴヌクレオチドの混合物と、デオキシチミジンのみからなるオリゴヌクレオチドを同時に使用する項１に記載の方法

本発明により、逆転写反応における残存した鋳型ＲＮＡの除去を従来の方法に比べて迅速、簡便に実施することができる。
特に、鎖長の短い標的配列の検出において相補ＤＮＡの加水分解による影響を無視できる程度に抑えながら最も簡便に鋳型ＲＮＡの除去を行うことが出来る。

本発明の一つの態様は、ＲＮＡを鋳型として、該ＲＮＡの塩基配列と相補的な塩基配列を持つＤＮＡを合成する方法、すなわち逆転写反応に関連する。好ましくは、これらの方法は次のステップを含む。
鎖長が５００ｂｐ以下の配列を標的とした定量ポリメラーゼ連鎖反応（ＱＰＣＲ）の鋳型として精製せずにＱＰＣＲ反応液中に添加することができる相補ＤＮＡの調製方法であって、次のステップを含む方法である。
（１）（ａ）鋳型ＲＮＡ、
（ｂ）プライマー、
（ｃ）金属イオン、
（ｄ）ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ
を全て含み、実質的にＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性のみを示すＤＮＡポリメラーゼを含まない反応混合物であって、２５℃〜６５℃の範囲内において逆転写反応を行うこと
（２）前記逆転写反応混合物を、９７℃より高い温度で処理して、合成された相補ＤＮＡに相補的に結合している鋳型ＲＮＡを相補ＤＮＡから除去すること

本発明における鎖長が５００ｂｐ以下の配列を標的とした定量ポリメラーゼ連鎖反応（ＱＰＣＲ）とは、いかなる方法を用いることが可能であるが、標的とする核酸の好ましくは部分配列を標的とし、該部分配列を持つ核酸の存在を検出ならびに定量する方法であって、リアルタイムＰＣＲなどが例示される。

本発明における逆転写とは、ＲＮＡを鋳型とし、その配列に相補的なＤＮＡを合成する反応を言い、合成する範囲は、ＲＮＡ分子の一部または全部である。またその範囲は制御できる場合もあるが、特に限定せず、ランダムである場合もある。

本発明で逆転写の鋳型となるＲＮＡが含有される試料は、何ら制限されない。各種生物やその分泌物などの試料を精製せずにＱＰＣＲの反応液に添加することが可能であるし、また、種々の公知の核酸精製方法を用いて精製したものであっても良い。

本発明のプライマーは、プライマー伸長開始条件下に置いたときに合成起点として機能しうるオリゴヌクレオチドをいい、天然、合成を問わない。プライマーは好ましくは１本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドである。プライマーの適正な長さは意図するプライマーの用途次第であるが、一般に５〜３５ヌクレオチドの範囲である。プライマーは正確な鋳型配列を反映する必要はないが、鋳型とハイブリダイズしてプライマーの伸長を起こすためには鋳型に対して十分に相補的でなければならない。また本発明で使用されるプライマーには、ランダムな配列を持つ短鎖長のプライマー（ランダムプライマー）や、メッセンジャーＲＮＡのポリＡの部分に特異的にハイブリダイズするオリゴｄＴプライマーなどの、検出する遺伝子を特定しないユニバーサルプライマーや、あるいは特定の遺伝子のみにハイブリダイズすることを意図した遺伝子特異的プライマーのいずれを用いることも可能であるが、より好適に用いることができるのはランダムプライマーおよび／またはオリゴｄＴプライマーであり、更に好適にはランダムプライマーとオリゴｄＴプライマーの混合物を用いることができる。

プライマーは任意の適当な方法により調製することができる。
この調製方法にはたとえば、然るべき配列のクローニングと制限および直接化学合成などが含まれ、直接化学合成にはＮａｒａｎｇ他、１９７９、「Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ．」６８：９０−９９のリン酸トリエステル法、Ｂｒｏｗｎ他、１９７９、「Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ．」６８：１０９−１５１のリン酸ジエステル法、Ｂｅａｕｃａｇｅ他、１９８１、「Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．」２２：１８５９−１８６２のジエチルホスホラミダイト法、および米国特許第４，４５８，０６６号の固相担体法などがある。シアノエチルホスホラミダイト化学を使用する自動合成が好ましい。試薬と器具はたとえばＡｐｐｌｅｒａ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ−カリフォルニア州フォスターシティー）やＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（ニュージャージー州ピスカタウェイ）などから市販されている。

逆転写の反応組成は、逆転写酵素の活性を発現しうる反応組成であればいかなる組成を用いることも可能であるが、好ましくは逆転写酵素の活性を発現するのに可能な限り最適化した条件であり、かつ鋳型ＲＮＡのリボヌクレアーゼによる分解を可能な限り最小限に抑制する条件であり、かつ精製せずにＱＰＣＲ反応液に添加した際にＰＣＲの反応または蛍光シグナルの発現に対して可能な限り影響を及ぼさない条件であって、より具体的には１０−１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．５−９．０）、５０−２００ｍＭの塩化カリウム、１−４０Ｕ／反応のＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒを含んだ反応組成が例示される。

また、本発明における金属イオンとは、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）の活性を発現させるのに必須とされるイオンであり、好ましくは２価の陽イオン、より好ましくは２価のマグネシウムイオン（Ｍｇ^２＋）を用いることができる。溶液中におけるマグネシウムの検出には、蛍光Ｘ線分析法を用いた方法、ベンジジンを用いた化学的方法、呈色反応を用いた方法などにより行うことができる。

また本発明におけるＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）は、いかなる種類のものを用いても良く、例えばＭ−ＭＬＶ（Ｍｏｌｏｎｅｙ Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ） ＲＴａｓｅや、ＡＭＶ （Ａｖｉａｎ Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ Ｖｉｒｕｓ） ＲＴａｓｅなどのウィルス由来の逆転写酵素に加え、ジオバシラス・ステアロサーモフィラスなどの好熱性細菌に由来するもの、あるいはマンガンイオン（Ｍｎ^２＋）存在下でＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を示すＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼであるＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼも例示できる。

また本発明における実質的にＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性のみを示すＤＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を全く、あるいはそのＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性と比較して極めて微弱な活性しか示さないもので、上記のＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを除く大半のＤＮＡポリメラーゼを含み、またＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼなどの好熱性細菌由来のＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼなどの好熱性始原菌由来のＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌由来のＤＮＡポリメラーゼＩなどの市販され用意に入手可能なＤＮＡポリメラーゼ等を含む。

なお、ＤＮＡポリメラーゼの活性測定には、通常用いられるどのような方法を用いても測定することが可能であるが、最も多く用いられる方法としては、そのＤＮＡポリメラーゼの至適温度、より具体的には、３７℃〜５０℃付近で、３０分間に１０ナノモルの全ヌクレオチドを酸不溶性画分に取り込む酵素量を１Ｕとして測定する方法を用いることができる。（本願明細書における酵素活性値はこの方法で測定した。）

本発明の逆転写反応方法の第一ステップにおいては、（ａ）鋳型となりうるＲＮＡ、（ｂ）プライマー、（ｃ）金属イオン、および、（ｄ）ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを含む逆転写反応混合物を用意する。
逆転写反応は通常２５〜６５℃の範囲内で行う。好ましくは３７〜５５℃である。

本発明の逆転写反応方法の第二ステップにおいては、前記逆転写反応混合物を、合成された相補ＤＮＡから鋳型ＲＮＡを除去するのに足る温度で処理して、前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを不可逆的に活性化させる。「合成された相補ＤＮＡから鋳型ＲＮＡを除去するのに足る温度」とは、相補ＤＮＡと鋳型ＲＮＡが結合した二本鎖核酸が変性によりそれぞれの鎖が解離し、更にＲＮＡが高熱の作用により部分的に加水分解するのに足る温度であり、ＲＮａｓｅ Ｈ処理を実施することにより得られる試料と比較して同等もしくはそれ以上に残存ＲＮＡの阻害効果を除去するのに足る温度であって、好ましくは９７℃より高い温度、さらに好ましくは９８℃以上である。またその反応時間は、好ましくは１分以上、より好ましくは４分以上、さらに好ましくは５分以上である。

以下、実施例に基づき本発明をより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。

実施例１ 逆転写反応、熱処理、および比較対照としてのＲＮａｓｅ Ｈ処理の実施
ＨｅＬａ細胞由来のＴｏｔａｌ ＲＮＡ（ストラタジーン社製）をサンプルとして、逆転写酵素ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ（東洋紡績製）を用いて逆転写を行った。反応液は以下のように調製した。即ち、ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ添付の５ｘＲＴ Ｂｕｆｆｅｒを１ｘ濃度、１０ｍＭ ｄＮＴＰｓを１ｍＭ、２５μＭ Ｒａｎｄｏｍ Ｐｒｉｍｅｒ（東洋紡績製）を１．２５μＭ、１０μＭ Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２０（東洋紡績製）を０．５μＭ、１００Ｕ／μＭ ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ（東洋紡績製）を５Ｕ／μｌ、ＨｅＬａ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ（ストラタジーン社製）を１０ｎｇ／μｌでそれぞれ添加し、Ｎｕｃｌｅａｓｅ−ｆｒｅｅ水を添加して合計液量を２０μｌとし、よく混合した。逆転写反応は以下の温度条件で実施した。即ち、３７℃・１５分間インキュベート後、８５℃、９５℃、９８℃、９９℃のいずれかの温度で５分間の熱処理を行った後、氷上で保存した。また別途、同様の条件で逆転写反応および熱処理を行った後の液に、ＲＮａｓｅ Ｈ（インビトロジェン社製）を１μｌ添加したものを調製し、２５℃で３０分間インキュベートしてＲＮＡの除去反応を行った後、氷上で保存した。

実施例２ リアルタイムＰＣＲ実施による検出感度の比較（１）
実施例１で作製した逆転写反応液をそれぞれ用いて、リアルタイムＰＣＲによるβ―Ａｃｔｉｎ 相補ＤＮＡの検出感度の比較を行った。リアルタイムＰＣＲは、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（東洋紡績製）を用いて実施した。リアルタイムＰＣＲの反応液は以下のように調製した。即ち、実施例１の逆転写反応液を滅菌水で４０倍希釈したものを調製し、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを５μｌ、β−Ａｃｔｉｎ遺伝子を検出するフォーワードプライマー（配列番号１）およびリバースプライマー（配列番号２）をそれぞれ最終濃度０．４μＭ、および上記の希釈逆転写反応後液を４μｌ添加し、滅菌水を添加して合計液量を１０μｌとしてよく混合した。リアルタイムＰＣＲの反応と検出は、ＬｉｎｅＧｅｎｅ（バイオフラックス社）を使用し、９５℃１分→（９５℃１５秒→６０℃１５秒→７２℃３０秒（ｄａｔａ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ））ｘ４０サイクルで行った。その結果を図１に示す。図１はリアルタイムＰＣＲの結果得られたＣｔ値（Ｃｙｃｌｅ ｏｆ Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）を縦軸にとったもので、Ｃｔ値が低いほど検出感度が高いことを示す。図１に示した通り、熱処理後にＲＮａｓｅ Ｈ処理を行わなかったサンプルについては、熱処理温度と検出感度には相関が見られ、熱処理温度が高いほど検出感度も高いことが示唆された。また、熱処理後にＲＮａｓｅ Ｈ処理を行ったものに関しては、熱処理温度に関わらず一定の検出感度が得られていることがわかった。更に、熱処理を９８℃以上で実施した場合、ＲＮａｓｅ Ｈ処理を行った場合と行わなかった場合とで検出感度には有意な差が見られなかった。このことから、熱処理を９８℃以上で行うことにより、ＲＮａｓｅ Ｈ処理を行わなくとも、ＲＮａｓｅ Ｈ処理を行った場合と同程度のＲＮＡ除去効果が得られることが示唆された。

実施例３ リアルタイムＰＣＲ実施による検出感度の比較（２）
実施例１で作製した逆転写反応液をそれぞれ用いて、リアルタイムＰＣＲによるＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ ε 相補ＤＮＡの検出感度の比較を行った。リアルタイムＰＣＲは、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（東洋紡績製）を用いて実施した。リアルタイムＰＣＲの反応液は以下のように調製した。即ち、実施例１の逆転写反応液を滅菌水で４０倍希釈したものを調製し、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを５μｌ、Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ε遺伝子を検出するフォーワードプライマー（配列番号３）およびリバースプライマー（配列番号４）をそれぞれ最終濃度０．４μＭ、および上記の希釈逆転写反応後液を４μｌ添加し、滅菌水を添加して合計液量を１０μｌとしてよく混合した。リアルタイムＰＣＲの反応と検出は、ＬｉｎｅＧｅｎｅ（バイオフラックス社）を使用し、９５℃１分→（９５℃１５秒→６０℃１５秒→７２℃３０秒（ｄａｔａ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ））ｘ４０サイクルで行った。その結果を図２に示す。図２はリアルタイムＰＣＲの結果得られたＣｔ値（Ｃｙｃｌｅ ｏｆ Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）を縦軸にとったもので、Ｃｔ値が低いほど検出感度が高いことを示す。図２に示した通り、熱処理後にＲＮａｓｅ Ｈ処理を行わなかったサンプルについては、熱処理温度と検出感度には相関が見られ、熱処理温度が高いほど検出感度も高いことが示唆された。また、熱処理後にＲＮａｓｅ Ｈ処理を行ったものに関しては、熱処理温度に関わらず一定の検出感度が得られていることがわかった。更に、熱処理を９８℃以上で実施した場合、ＲＮａｓｅ Ｈ処理を行った場合と行わなかった場合とで検出感度には有意な差が見られなかった。このことから、熱処理を９８℃以上で行うことにより、ＲＮａｓｅ Ｈ処理を行わなくとも、ＲＮａｓｅ Ｈ処理を行った場合と同程度のＲＮＡ除去効果が得られることが示唆された。

実施例４ リアルタイムＰＣＲによる至適熱処理条件の詳細検討
実施例１で用いた方法と同様にして、ＨｅＬａ細胞由来のＴｏｔａｌ ＲＮＡ（ストラタジーン社製）をサンプルとして、逆転写酵素ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ（東洋紡績製）を用いて逆転写を行った。反応液は以下のように調製した。即ち、ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ添付の５ｘＲＴ Ｂｕｆｆｅｒを１ｘ濃度、１０ｍＭ ｄＮＴＰｓを１ｍＭ、２５μＭ Ｒａｎｄｏｍ Ｐｒｉｍｅｒ（東洋紡績製）を１．２５μＭ、１０μＭ Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２０（東洋紡績製）を０．５μＭ、１００Ｕ／μＭ ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ（東洋紡績製）を５Ｕ／μｌ、ＨｅＬａ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ（ストラタジーン社製）を１０ｎｇ／μｌでそれぞれ添加し、Ｎｕｃｌｅａｓｅ−ｆｒｅｅ水を添加して合計液量を２０μｌとし、よく混合した。逆転写反応は以下の温度条件で実施した。即ち、３７℃・１５分間インキュベート後、９５℃、９６℃、９７℃、９８℃のいずれかの温度でそれぞれ２分間、３分間、５分間の熱処理を行った後、氷上で保存した。得られた逆転写反応液を用いて、実施例２と同様の方法で、β―Ａｃｔｉｎを標的としたリアルタイムＰＣＲを実施し、逆転写産物の定量を行った。その結果を図３に示す。図３はリアルタイムＰＣＲの結果得られたＣｔ値（Ｃｙｃｌｅ ｏｆ Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）を縦軸にとったもので、Ｃｔ値が低いほど検出感度が高いことを示す。Ｃｔ値が１高いと、感度は２倍高い。図３に示した通り、熱処理条件は温度が高いほどよく、また時間が長いほど良いことがわかった。一方、本実施例において最も良い結果が得られた９８℃、５分間処理の条件は、実施例２および３に示したとおり、ＲＮａｓｅ Ｈ処理を実施した場合と同様のＲＮＡ除去効果が得られることが判明している為、熱処理条件は、９８℃、５分で十分であり、最大の効果が得られることが示された。
一般にＰＣＲにおいては、反応のサイクルが進捗するごとにＤＮＡポリメラーゼの活性が漸減的に失われ、またプライマーダイマーなどの非特異的増幅産物が出現する可能性が高まるため、ある標的分子の検出に要する反応サイクル数を減らすことは、定量の正確性を高めることができ、特に存在量の少ない標的分子に関しては検出自体の成功率を高めることが可能となる。

本発明の方法は従来の方法に比べて極めて迅速、簡便に実施することができ、逆転写により得られる相補ＤＮＡを利用したリアルタイムＰＣＲを実施するものに経済的に多大の利益をもたらす。
本発明は、遺伝子発現解析に際して特に有用であり、研究のみならず臨床診断や環境検査等にも利用できる。

ＲＮＡ除去の為の熱処理の条件とＲＮＡ除去効率の検討結果を示す図（β―Ａｃｔｉｎ）。熱処理後、追加的にＲＮａｓｅ Ｈ処理をした場合と比較した。 ＲＮＡ除去の為の熱処理の条件とＲＮＡ除去効率の検討結果を示す図（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ε）。熱処理後、追加的にＲＮａｓｅ Ｈ処理をした場合と比較した。 リアルタイムＰＣＲによる至適熱処理条件の詳細検討。熱処理温度と時間について検討した。

Claims (7)

1. 鎖長が５００ｂｐ以下の配列を標的とした定量ポリメラーゼ連鎖反応（ＱＰＣＲ）の鋳型として精製せずにＱＰＣＲ反応液中に添加することができる相補ＤＮＡの調製方法であって、次のステップを含む方法。
   （１）（ａ）鋳型ＲＮＡ、
   （ｂ）プライマー、
   （ｃ）金属イオン、
   （ｄ）ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ
   を全て含み、実質的にＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性のみを示すＤＮＡポリメラーゼを含まない反応混合物であって、２５℃〜６５℃の範囲内において逆転写反応を行うこと
   （２）前記逆転写反応混合物を、９７℃より高い温度で処理して、合成された相補ＤＮＡに相補的に結合している鋳型ＲＮＡを相補ＤＮＡから除去すること
2. 高温の熱処理が、１分以上で行われる、請求項１記載の方法。
3. 高温の熱処理が、４分以上で行われる、請求項３記載の方法。
4. ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼが、ウィルス由来である、請求項１記載の方法。
5. ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼが、モロニーマウス白血病ウィルス（Ｍ−ＭＬＶ）、トリ芽球症ウイルス（ＡＭＶ）より選択されるウィルス由来のＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼである、請求項４記載の方法。
6. ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼが、ＲＮａｓｅ Ｈ活性を欠失した変異型ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼである、請求項４または５記載の方法
7. プライマーが、ランダムな配列からなるオリゴヌクレオチドの混合物と、デオキシチミジンのみからなるオリゴヌクレオチドを同時に使用する請求項１に記載の方法