JP2008245641A - 核酸の検出方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】下記のヌクレオチド鎖:(1)検出対象となるターゲット塩基を有する鋳型ヌクレオチド鎖;(2)鋳型ヌクレオチド鎖の当該ターゲット塩基と近接する塩基を有し、当該近接塩基から鋳型ヌクレオチド鎖の3’側に向かってハイブリダイズ可能な、第1の相補鎖;(3)上記ターゲット塩基に対して相補的な塩基を有し、当該相補的塩基から鋳型ヌクレオチド鎖の5’側に向かってハイブリダイズ可能であり、3’側に向かってはハイブリダイズできない、第2の相補鎖;(4) (1)〜(3)のヌクレオチド鎖をハイブリダイズさせて、上記の鋳型ヌクレオチド鎖(1)のターゲット塩基部分に部分的三重鎖構造を形成させた場合に、当該三重鎖構造を形成した第2の相補鎖(3)の3’側を特異的に切断するエンドヌクレアーゼ;(5)鋳型ヌクレオチド鎖 (1)のターゲット塩基を挟んで、3’方向側と5’方向側にそれぞれハイブリダイズ可能な、組としてなる第3の相補鎖;(6) Thermus aquaticus 由来の耐熱性DNAポリメラーゼ; (7)DNA構成塩基;を、特定の条件下にて温度サイクルを行い、上記ターゲット塩基の検出を行うことで、上記の課題を解決し得ることを見出した。
【選択図】なし
Description
(1)検出対象となるターゲット塩基を有する鋳型ヌクレオチド鎖;
(2)鋳型ヌクレオチド鎖の当該ターゲット塩基と近接する塩基を有し、当該近接塩基から鋳型ヌクレオチド鎖の3’側に向かってハイブリダイズ可能な、第1の相補鎖;
(3)上記ターゲット塩基に対して相補的な塩基を有し、当該相補的塩基から鋳型ヌクレオチド鎖の5’側に向かってハイブリダイズ可能であり、3’側に向かってはハイブリダイズできない、第2の相補鎖;
(4) (1)〜(3)のヌクレオチド鎖をハイブリダイズさせて、上記の鋳型ヌクレオチド鎖(1)のターゲット塩基部分に部分的三重鎖構造を形成させた場合に、当該三重鎖構造を形成した第2の相補鎖(3)の3’側を特異的に切断するエンドヌクレアーゼ;
(5)鋳型ヌクレオチド鎖(1)のターゲット塩基を挟んで、3’方向側と5’方向側にそれぞれハイブリダイズ可能な、組としてなる第3の相補鎖;
(6)Thermus属に属する微生物由来の耐熱性DNAポリメラーゼ;
(7)DNA構成塩基;
を、マグネシウムイオン濃度が0.01〜35mMの緩衝液中にて共存させて、50〜72℃の低温と90〜98℃の高温を交互に繰り返し、この過程により得られる、上記のエンドヌクレアーゼ(4)の作用により遊離した第2の相補鎖(3)のハイブリダイズしない側のヌクレオチド鎖を検出することにより、鋳型ヌクレオチド鎖(1)のターゲット塩基を検出することを特徴とする、核酸の検出方法(以下、本検出方法ともいう)を提供する発明である。
[A]=α1×[T]×t
(式中、[ ]は系中の濃度を示し、Aは遊離の検出用部分132’(フラップ)の量を示し、α1は一次反応で部分的三重鎖構造にて開裂する割合を示し、Tは検体遺伝子量を示し、tは反応経過時間を示す)にて表される。
d[A]/t=α1×[T]
にて表される。
[S]=α2×[A]×t+β1×[X]×t
(式中、Sは二次反応産物量(遊離の蛍光色素151による蛍光量により表される)を示
し、α2は二次反応で部分的三重鎖構造にて開裂する割合を示し、tは反応経過時間を示し、β1は非特異で開裂する割合を示し、Xは非特異産物量を示す)にて表される。
d[S]/t=α2×[A]+β1×[X]
にて表される。
d[S]/t=α2×[A]+β1×[X]
d[S]/t=α2×α1×[T]×t+β1×[X]
d[S]/t=α1α2[T]t+β1[X]
にて表される。これを、tで積分すると、
[S]=1/2α1α2[T]t2+β1[X]t
ここで、β1[X]tは、検体遺伝子量にかかわらず一定とみなすことができるので、 二次反応産物量を示す蛍光量Sは、
[S]=At2+B(式中、AとBは定数)
にて表される。
Y=AX2+B(2次方程式)のAとして表される。
[基本反応系の構築]
まず菌種間のDNA配列の相違を調べるためにデータベースから主な口腔内細菌の16S rRNA遺伝子領域配列66例を入手した。これらをアライメントし、P.i.菌特異的な配列部分にPCR増幅用のプライマー、Invader反応用のプローブを設計した。P.i.菌ゲノムの16SrRNA遺伝子領域91〜191を増幅するセンスプライマー(5’-CGTATCCAACCTTCCCTCCA-3’:配列番号1:第3の相補鎖の一方に相当)とアンチセンスプライマー(5’-CCGATGAATCTTTGGTCCACGT-3’:配列番号2:第3の相補鎖の他方に相当)の間に位置133を切断点とするPrimary probe(5’-CGCGCCGAGGACGGCCTAATACCCG <アミノ>-3’:配列番号3:第1の相補鎖に相当)と、Invader oligo(5’-CCTCCACTCGGGGATACCCCGTTGAAAGT-3’:配列番号4:第2の相補鎖に相当)を設計した。
Cleavase XIFRET mix (Genomic DNA) 3.5
Cleavase XI Enzyme(100ng/μl) 1.0(検討対象:(4))
Invader oligo (1pmol/μl) 1.05
Primary probe (10pmol/μl) 1.05
10mM MOPS buffer 0.90
DNA polymerase (10U/μl) 0.5(検討対象(1))
2.0mM dNTP 2.5
Primer mix (20pmol/μl) 1.0
MgCl2 solution 設定量(検討対象(3))
D.W. UP TO 13.0
本試験における好適なDNAポリメラーゼを選択するために、
(a)Thermus aquaticus由来(AmpliTaq Stoffel fragment)
(b)Thermococcus kodakaraensis由来(KOD -Plus-)
(c)Pyrococcus species由来(Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity)
(d)Pyrococcus furiosus由来(PfuTurbo DNA Polymerase)
(e)Thermus thermophilus由来(rTth DNA polymerase)
を用いて検討したところ、最も検出感度が高く、かつ、非特異反応が実質的にみとめられなかったものは、Thermus aquaticus由来のAmpliTaq Stoffel fragmentであった(図2)。図2において、横軸は、プラスミドベクターのコピー数であり、縦軸はThreshold Cycle(Ct値)、すなわち、蛍光強度が閾値に達したサイクル数、を示している。また、図2において、St.fragはAmpliTaq stoffel fragmentの略称であり、KODはKOD -Plus-の略称であり、Pt.HighはPlatinum Taq DNA Polymerase の略称であり、High Fidelity Pfu turboはPfuTurbo DNA Polymeraseの略称であり、rTthはrTth DNA polymeraseの略称である。
(5’<FAM>−TGTGGACAACATCGGGTATTAGGCCG−<TAMRA>3’:配列番号5)、2×Universal PCR Master mix(アプライドバイオシステムズ)を使用して、リアルタイムPCR法を行った。反応条件は、サーマルサイクラーABI 7900を用いて、50℃・2分間、95℃・10分間、の前処理を行った後、95℃・15秒間、60℃・1分間の2-stepPCRを40サイクル行った。反応試薬は、下記の内容のものを用いた。
2×Universal PCR Master Mix(アプライドバイオシステムズ) 7.5
センスプライマー(20pmol/μl) 0.5
アンチセンスプライマー(20pmol/μl) 0.5
TaqMan-Probe(2.5 pmol/μl) 1.0
D.W. 13.0
被験サンプル 2.0
本検出方法の温度サイクルにおける95℃(高温部)の保持時間を、1、10、15秒;63℃の保持時間を、30秒、60秒、120秒;としてそれぞれの条件で検出を行い、その結果を考
察した。その結果、95℃については、保持時間によって検出に差異は認められず、63℃については、60秒、120秒には差は認められなかったが、30秒では検出感度が低下した。以上の結果から、同一反応にかかる時間は可能な限り短いことが効率的であることを考慮すると、本発明ではDNAポリメラーゼにAmpli Taq stoffel fragmentを使用し、反応時間の最小単位を1秒とすると、温度サイクルを、95℃・1秒、63℃・60秒で行うと好適であることが明らかになった。
本検出方法は、Invader反応が、PCR反応と交互に進行することを特徴とするものであるので、反応溶液に一定濃度のマグネシウムイオンを共存させることが必要となる。
本検出方法においてInvader反応が、確かに内包されて進行していることを確認するために、上記(1)の本検出方法において、Invader反応の進行に不可欠な三重鎖切断酵素(エンドヌクレアーゼ)であるCleavaseXI(上述)を、反応系に加えずに反応の進行を試みたところ、所望する反応は全く進行しなかった。よって、確かに、本検出方法においてInvader反応が進行していることが認められた。
次に、相関性試験として、歯周ポケットのプラークを採用したペーパーポイント懸濁液および唾液から抽出したDNA溶液35例を、上記した要領にてリアルタイムPCR法および本検出方法で検出した。その結果、陽性35例における両法の相関係数は2r=0.953と良好であった。さらにリアルタイムPCR法で3.9×10の3乗コピー/2μlおよび4.5×10の5乗コピー/2μlとなった唾液DNA溶液を用いて、同時・日差再現性試験を行った。同時再現性試験はn=5、日差再現性試験はn=3で3回行った。この結果、C.V. (%)は0.6〜2.5%となり、高い再現性を示した。以上の結果から、本発明はリアルタイムPCR法と同等の検出感度、再現性をもつ検出法であることが明らかになった。
本検出方法において、PCR反応とInvader反応が交互に進行することの有用性を検討するために、上記(1)の試験系において、まずは、PCR反応のみを先行して行い、検出対象となる鋳型ヌクレオチド鎖を遺伝子増幅産物として得て、その後、インベーダー・アッセイ法のみを行う比較例を実施した。
Claims (8)
- 下記のヌクレオチド鎖(1)〜(7):
(1)検出対象となるターゲット塩基を有する鋳型ヌクレオチド鎖;
(2)鋳型ヌクレオチド鎖の当該ターゲット塩基と近接する塩基を有し、当該近接塩基から鋳型ヌクレオチド鎖の3’側に向かってハイブリダイズ可能な、第1の相補鎖;
(3)上記ターゲット塩基に対して相補的な塩基を有し、当該相補的塩基から鋳型ヌクレオチド鎖の5’側に向かってハイブリダイズ可能であり、3’側に向かってはハイブリダイズできない、第2の相補鎖;
(4)(1)〜(3)のヌクレオチド鎖をハイブリダイズさせて、上記の鋳型ヌクレオチド鎖(1)のターゲット塩基部分に部分的三重鎖構造を形成させた場合に、当該三重鎖構造を形成した第2の相補鎖(3)の3’側を特異的に切断するエンドヌクレアーゼ;
(5)鋳型ヌクレオチド鎖(1)のターゲット塩基を挟んで、3’方向側と5’方向側にそれぞれハイブリダイズ可能な、組としてなる第3の相補鎖;
(6)Thermus属に属する微生物由来の耐熱性ポリメラーゼ;
(7)DNA構成塩基;
を、マグネシウムイオン濃度が0.01〜35mMの緩衝液中にて共存させて、50〜72℃の低温と90〜98℃の高温を交互に繰り返し、この過程により得られる、上記のエンドヌクレアーゼ(4)の作用により遊離した第2の相補鎖(3)のハイブリダイズしない側のヌクレオチド鎖を検出することにより、鋳型ヌクレオチド鎖(1)のターゲット塩基を検出することを特徴とする、核酸の検出方法。 - 上記検出方法において、Thermus属に属する微生物由来の耐熱性ポリメラーゼが、Thermus aquaticus 由来の耐熱性DNAポリメラーゼであることを特徴とする、請求項1に記載の核酸の検出方法。
- 上記検出方法において、(1)〜(7)を共存させる緩衝液におけるマグネシウムイオン濃度が0.1〜16mMであることを特徴とする、請求項1又は2に記載の核酸の検出方法。
- 上記検出方法において、第1の相補鎖が、鋳型ヌクレオチド鎖(1)におけるターゲット塩基(当該塩基を含まない)から3’側に向かって少なくとも9塩基分の塩基配列からなるヌクレオチド鎖(相補的両塩基配列を含む)に対して相補的なヌクレオチド鎖を、鋳型ヌクレオチド鎖(1)のターゲット塩基と近接する塩基と連続して有し、かつ、当該第1の相補鎖の総塩基数が10〜50塩基であることを特徴とする、請求項1〜3のいずれかに記載の核酸の検出方法。
- 上記検出方法において、第2の相補鎖の鋳型ヌクレオチド鎖(1)とハイブリダイズさせる部分の配列が、鋳型ヌクレオチド鎖(1)におけるターゲット塩基(当該塩基を含む)から5’側に向かって少なくとも10塩基分の塩基配列からなるヌクレオチド鎖(相補的両塩基配列を含む)に対して相補的なヌクレオチド鎖であり、かつ、当該第2の相補鎖のハイブリダイズ部分の総塩基数が10〜30塩基であることを特徴とする、請求項1〜4のいずれかに記載の核酸の検出方法。
- 上記検出方法において、組としてなる第3の相補鎖それぞれの総塩基数が
10〜150塩基であることを特徴とする、請求項1〜5のいずれかに記載の核酸の検出方法。 - 上記検出方法において、遊離した、第2の相補鎖(3)のハイブリダイズしない側のヌクレオチド鎖(A)の検出を、当該ヌクレオチド鎖(A)、及び、加水分解プローブを共存させて、当該加水分解プローブが当該ヌクレオチド鎖(A)とハイブリダイズして加水分解する際に認められるシグナルを指標にして行うことを特徴とする、請求項1〜6のいずれかに記載の核酸の検出方法。
- 上記検出方法において、加水分解プローブが、下記のプローブ(B):
(B):1本のヌクレオチド鎖が3’末端と5’末端を両端として、折れ曲がってハイブリダイズしてなり、かつ、3’末端側のヌクレオチド鎖の一部が一本鎖として突出してなる構造であり、(a)3’末端側の突出部分が、上記の遊離のヌクレオチド鎖とハイブリダイズ可能であり、かつ、当該突出部分の最も5’側の塩基に隣り合うさらに5’側の一塩基がターゲット塩基(B1)であり、(b)5’末端の近傍に蛍光色素(B2)が標識され、当該蛍光色素の3’側近傍に蛍光消光物質(B3)が標識されてなる、プローブ;
であり、プローブ(B)の3’末端側の突出部分の一部又は全部と、ヌクレオチド鎖(A)とを、ヌクレオチド鎖(A)の3’末端のターゲット塩基に対して相補的な塩基(A1)とターゲット塩基(B1)を含めてハイブリダイズさせ、当該相補的塩基(A1)、ターゲット塩基(B1)及びプローブ(B)の5’末端近傍の塩基、からなる部分的三重鎖構造を形成させて、当該三重鎖構造の3’側を特異的に切断するエンドヌクレアーゼの作用により、プローブ(B)の5’末端を、当該末端部分に標識した蛍光色素(B2)と共に、プローブ(B)から遊離させることにより、蛍光消光物質(B3)の消光作用から開放された蛍光色素(B2)の蛍光強度を指標として行うことを特徴とする、請求項7記載の核酸の検出方法。
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