WO2006106930A1

WO2006106930A1 - Ｅｕ３＋錯体を含有してなる核酸プローブ、及びそれを用いた核酸解析方法

Info

Publication number: WO2006106930A1
Application number: PCT/JP2006/306852
Authority: WO
Inventors: Koichi Fukui; Yoshitaka Kageyama; Masanori Horie; Minjue Xie; Kazuko Matsumoto
Original assignee: Japan Science And Technology Agency
Priority date: 2005-04-01
Filing date: 2006-03-31
Publication date: 2006-10-12
Also published as: JPWO2006106930A1

Abstract

　本発明は、高感度のＳＮＰｓ解析方法を提供することを目的し、微量の被検体ＤＮＡにより大量のＳＮＰｓを迅速に解析することができるＳＮＰ解析方法を提供することを目的としている。さらに、本発明は、ＳＮＰｓ解析法において、高感度の発色色素と消光物質で構成されたフレットプローブなどの高感度核酸プローブ、及びこれを用いた時間分解蛍光測定による最も高感度なＳＮＰ解析法を提供することにある。　本発明は、Ｅｕ３＋錯体及び蛍光消光物質を核酸に結合させたことを特徴とする核酸プローブに関する。より詳細には、本発明は、ターピリジル又はジピラゾリルピリジン骨格を有するテトラキス酢酸型の配位子を有するＥｕ３＋錯体、及びアゾベンゼン型の蛍光消光物質を核酸に結合させたことを特徴とする高感度の核酸プローブに関する。さらに、本発明は、これらの核酸プローブを用いた核酸の解析方法、より詳細にはＳＮＰｓの解析方法、及びそのための解析用のキットに関する。

Description

明細書

Eu³⁺錯体を含有してなる核酸プローブ、及びそれを用いた核酸解析方法技術分野

[0001] 本発明は、 Eu³⁺錯体及び蛍光消光物質を核酸に結合させたことを特徴とする核酸プローブに関する。より詳細には、本発明は、ターピリジル又はジピラゾリルビリジン骨格を有するテトラキス酢酸型の配位子を有する Eu³⁺錯体、及びァゾベンゼン型の蛍光消光物質を核酸に結合させたことを特徴とする高感度の核酸プローブに関する。さらに、本発明は、これらの核酸プローブを用いた核酸の解析方法、より詳細には S NPsの解析方法、及びそのための解析用のキットに関する。

背景技術

[0002] ヒトゲノム DNAの 1塩基多型（SNPsと略す）の解析は、遺伝病などだけでなく薬の効きやすさや副作用の違いといった個人差を考慮に入れた医療 (テーラーメード医療)の基礎となる技術であり、今後の発展が期待される分野である。従来から、 SNPs の解析法として、 TaqMan PCR法、 MALDI—TOF/MS法、 DNAチップ法、ィンベーダー（Invader)法、 UCAN法（特許文献 1参照。）、 RCA(rolling circle amplifi cation)を利用した方法などの方法がある。これらの方法はそれぞれの特徴を持ち、様々な SNPs解析に用いられて!/、る。

TaqMan PCR法は、 PCR反応を用いた SNPs解析法であり、解析のステップが少ないという利点がある（非特許文献 1及び 2参照)。しかし、この方法では 1種類の S NPsを解析するには、 2種類の蛍光標識プローブが必要であるため、標識プローブ作製のコストが高、と、う欠点がある。

MALDI— TOF/M¾ (Matrix assisted laser aesorptionハ onization— time of flignt/ mass spectrometry)法は、 ISNPs解析にあたり 1本の標識不要のプライマーを使うだけで済むという利点があるが (非特許文献 3及び 4参照。；)、作業のステップは、ターゲット領域の PCR増幅、 PCR産物の精製、プライマー伸長反応、プライマー伸長反応産物の精製、質量測定試料のスポット、質量分析など非常に多いという欠点がある。

DNAチップ法は、一度に大量の SNPsを解析することができるという利点がある (非特許文献 5〜7参照。 )oこの方法は、 DNAチップ上でハイブリダィゼーシヨンを行う前に、 PCRが必要なので、大量の SNPsを解析するには、大量の PCRを事前に行わなければならな!/、と!/、う欠点がある。

インベーダー法 (特許文献 2及び 3、並びに非特許文献 8参照。）は、 SNPs解析のステップが少なぐ PCRと蛍光標識アレル特異オリゴが必要でなぐ各アレル特異オリゴに共通のフラップ (flap)をカ卩えるだけでよ、。

図 1にインベーダー法による核酸一塩基多型解析法の概略を模式図として示す。この方法は、被検体 DNA (target DNA)のなかに図 1に示されるように「N」の位置で S NPsになって!/、る塩基が存在して!/、ることを判定する方法である。このためにレポ一ターブローブ rimary probe)とインベータ一プローブ (secondary probe)、及び検出用のフレットプローブ（FRET probe) (蛍光共鳴エネルギー移動プローブ（FRET (Fio rescence Resonance Energy Transfer)プロ ~~フ J )を用ヽる。フフィマリ ~~フ—口 ~~フ (レポータープローブ）は被検体 DNAの SNPsの位置から 5'側において相補的な塩基配列を有し、さらに「フラップ (flap)」と呼ばれる塩基配列部分を有している。このフラップの部分の塩基配列は、フレットプローブの 3 '側の塩基配列と相補的な塩基配列となっている。また、インベーダープローブ（セカンダリープローブ）は被検体 DNAの 3，側にぉ、て相補的な塩基配列を有するものである。 SNPsの位置（第 1図中の「N 」で示されている位置。）における被検体 DNAの塩基「N」は 1塩基多型部位の塩基、 A、 T、 G、 Cのひとつであり、プライマリープローブの塩基「N」は?^と正常な塩基対を形成できる塩基であり、そして、インベーダープローブの塩基「N」は任意な塩基で

2

ある。

フレットプローブは、 3'側にフラップ部分が結合するための 1本鎖部分を有するプローブであり、フレットプローブの 5 '側はその全部又は一部が 2本鎖を形成するようになって、る。図 1では 5 '側の全部が 2本鎖を形成するように示されて、るが必ずしも全部が 2本鎖になる必要はないが、ここでは説明のために図 1に従って説明する。そして、フレットプローブの 5'側の末端部分には発光色素「Ln」及び消光物質「Q」が結合されて、る。消光物質「Q」が発光色素「Ln」の一定の距離内に存在して、るときは、発光色素の発光が消光され、発光を観察することはできない。インベーダー法では、まず、被検体 DNAにプライマリープローブ及びインベーダープローブが結合するが、この際にプライマリープローブの塩基「N Iと被検体 DNAの塩基「N」との塩基対の間にインベーダープローブの塩基「N」がインベーダー（侵入

2

者)のように割り込んでくるようになる。このような状態を示して、るのが図 1の最上段に示している状態である。

このような 3塩基が力らんでいる状態に特異的に作用する解裂酵素（structure- spec ific 5' nuclease)を作用させると、この解裂酵素はプライマリープローブを塩基「N」の位置で切断して、フラップ部分のみの断片を形成させる。そして、このフラップ部分はフレットプローブの 3'側に結合する。この状態を示しているの力図 1の中段である。このとき、フラップ部分の塩基「N」を含む先端部分力フレットプローブの 2本鎖の部分に割り込むような状態になる。この状態は先程のインベーダーの状態と同様であり、解裂酵素による特異的な切断位置になる。そして、当該解裂酵素によりフレットプローブの 5'末端側がフラップ部分に割り込まれた部分力切断される。

切断されたフレットプローブの 5'側には、発光色素「Ln」が結合されており、この切断により発光色素「Ln」は消光物質「Q」から離れることになり、その結果発光色素「L n」の発光を観察することができるようになる。このような状態を示しているのが第 1図の最下段に示している状態である。発光色素「Ln」は消光物質「Q」から開放され、本来の発光を示すことになる。

プライマリープローブの塩基「N」が被検体 DNAの塩基「N」と正常な塩基対を形成することができない場合には、インベーダーのような状態にならないので、解裂酵素による切断は起こらない。したがって、被検体 DNAの塩基「N」がプライマリープローブの塩基「N」と正常な塩基対を形成することができる塩基である力否かを発光により半 IJ定することができること〖こなる。

このように、インベーダー法では、被検体 DNAは勿論のこと、プライマリープローブもインベーダープローブにも標識ィヒは必要でなぐ標識ィヒを必要とするものはフレットプローブのみである。そして、当該フレットプローブは、フラップ部分の塩基配列だけと関わり、とりわけフラップ部分の塩基「N」とも無関係であり、被検体 DNAの塩基配列に全く影響されず、被検体と関係無く任意に決定できるフラップ部分の塩基に基づくものであることから、大量生産ができ、プローブ作製コストを大幅に減少することができるという利点がある。

[0005] しかし、従来の方法では、測定感度が不充分なため、 1個の SNPsを解析するために、数十ナノグラムのゲノム DNAが必要であり、大量の SNPを解析するには、大量のゲノム DNAが必要となるという欠点があった。例えば、現在幾つか巿場に出ている SNPs解析技術では、フルォレツセインやレッドモンドレッドと、つた有機蛍光色素が使われて、るが、フルォレツセインの信号 (S)とバックグランド信号強度 (B)の比（SZ B)の最大値は 5〜6であり、十分な感度は得られていない。また、本発明者らは、より高感度な SNPsの解析のための方法を開発してきており（特許文献 4参照。）、特に、 Tb³⁺錯体で、 SZBが最大 30と良好な結果を与えていた力 Eu³⁺錯体では、 SZB が最大でも約 5と満足の行く結果ではな力つた。

[0006] また、蛍光消光物質として図 2に示されるような BHQ™ (Black Hole Quencher)が開発されてきている (特許文献 5、及び非特許文献 9参照。 ) ₀ BHQ™は効率よい蛍光消光剤といわれており消光のみの目的では非常に有効であるとされている。しかし、インベーダー法や、 Taqman法、及び UCAN法等に代表される SNPs解析法では酵素を用いるため、この酵素の働きに干渉を与えないことが必要であり、このような酵素に対する影響については予測性が無ぐいかに優れた蛍光消光物質であるとしても、酵素に対して悪影響を与える場合には、これらの方法に使用することはできなくなる。

さらに、 SNPsタイピングでは、 SNPs部位の塩基の違いを色の違いとして観測することが良く行われており（例えば、非特許文献 10参照）、最低 2色の使用が必要であつたが、これまで希土類蛍光錯体の中で十分な信号 Zバックランド比 (SZB)が実現していたものは、前記した Tb³⁺錯体しかなぐ緑色の 1色による解析しかできな力つた

[0007] 特許文献 1：特開 2004— 298200号公報

特許文献 2：特表 2001— 518805号公報

特許文献 3 :特表 2002— 515737号公報

特許文献 4:WO 03Z076615号公報特許文献 5 : WO 01Z86001号公報

非特許文献 1 : T. Morris, et al, J. Clin. Microbiol, 1996, 34, 2933.

非特許文献 2 : K. J. Livak, et al" Genet. Anal, 1999, 14, 143

非特許文献 3 : L, A. Haff, et al., Genome Res., 1997, 7, 378.

非特許文献 4 : P. Ross, et al., Nat. BiotechnoL, 1998, 16, 1347

非特許文献 5 : D. G. Wang, et al., Science, 1998, 280, 1077.

非特許文献 6 : J. G. Hacia, et al., Nat. Genet., 1999, 22, 164.

非特許文献 7 : P. N. Gilles, et al., Nat. BiotechnoL, 1999, 17, 365

非特許文献 8 : J. G. Hall, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2000, 97, 8272-8277 非特許文献 9 : M. Katherine, et al" J. Am. Chem. Soc, 2004, 126, 16451-16455 非特許文献 10 :中村祐輔著、「改訂先端のゲノム医学を知る」羊土社、 2000年 9月

10日第 1版

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0008] 本発明は、高感度の SNPs解析方法を提供することを目的とし、微量の被検体 DN Aにより大量の SNPsを迅速に解析することができる SNP解析方法を提供することを目的としている。より詳細には、本発明は、高感度の Eu³⁺錯体発光色素と消光物質からなる蛍光発色組成物を提供することを目的とし、使用する酵素に悪影響を与えることなく、し力も従来の Tb³⁺錯体とは異なる色を発色し、少なくとも 2色による SNPs解析を可能とする蛍光発色組成物を提供することを目的としている。さらに、本発明は、 SNPs解析法にぉ、て、高感度の発色色素と消光物質で構成されたフレットプロ一ブなどの高感度核酸プローブ、及びこれを用いた時間分解蛍光測定による最も高感度な SNP解析法、そのための解析用キットを提供することにある。

課題を解決するための手段

[0009] 本発明者らは、希土類蛍光錯体ラベル剤と蛍光クェンチヤ一ラベル剤との組み合わせによる発光の制御について検討してきており（特許文献 4参照。）、これを用いた SNPsの効率的な解析法を開発してきた。しかし、従来の方法では、高感度の錯体としては緑色の Tb³⁺錯体し力得られておらず、他の色のもの、特に赤色又は青色のような光の三原色を構成する色による錯体の開発が求められていた。また、本発明者らが開発してきた Tb³⁺錯体の信号 (S)とバックグランド信号強度 (B)の比 (SZB)の最大値は 30と比較的良好なものではあった力さらに高感度に錯体が求められていたそこで、本発明者らは、（1)蛍光寿命が長い、（2)スト一タスシフトが大きい、という特徴を持ち、夾雑物や迷光に影響されな!ヽ高感度かつ信頼性の高!ヽ遺伝子解析が可能となる錯体及びその消光物質の開発を行ってきたところ、特定の Eu³⁺錯体では SZBの最大値が 50となることを見出し、また、この錯体が赤色の蛍光出すこと、さらに、この錯体と図 2に示されるようなるような BHQ™ (Black Hole Quencher)を消光物質として使用することにより、赤色による高感度かつ信頼性の高い遺伝子解析が可能となる特定の希土類蛍光錯体ラベル剤と特定の蛍光クェンチヤ一ラベル剤との組み合わせを見出した。

[0010] 即ち、本発明は、 Eu³⁺錯体及び蛍光消光物質を核酸に結合させたことを特徴とする核酸プローブに関する。より詳細には、本発明は、 Eu³⁺錯体が、次の一般式（1) [0011] [化 1]

[0012] (式中、 Rは置換基を有してもよいァリール基を示し、 Qは— C = C又は— Nを示し、 Y ェ〜丫³はそれぞれ独立して— OH基、又は— 0—基、 Y⁴は— OH基、— 0—基、又は— Z基を示し、 Zは核酸との結合のためのリンカ一基を示す。 )

で表される配位子を有する錯体であって、蛍光消光物質が、次の一般式 (4)

[0013] [化 2]

[0014] (式中、 Xは核酸との結合のためのリンカ一基を示す。 )

で表される化合物、又は次の一般式（5)

[0015] [化 3]

[0016] (式中、 1^〜1^は、それぞれ独立して、水素原子、炭素数 1〜6のアルキル基、炭素数 1〜6のアルコキシ基、又は-トロ基を示し、 Xは核酸との結合のためのリンカ一基を示す。）

で表される化合物である核酸プローブに関する。

また、本発明は、前記した本発明の核酸プローブを用いて核酸を解析する方法、及びそのための核酸解析用キットに関する。

さらに、本発明は、前記した本発明の核酸プローブを用いて、一塩基多型（SNPs) を検出若しくは同定、又はタイピングする方法、及びそのためのキットに関する。

[0017] 本発明は、核酸の解析に使用される核酸プローブ、特にフレットプローブを用いるインベーダー法や、ヘアピン構造のプローブを用いるモレキュラービーコン（molecula r beacon)法などに使用される核酸プローブ、より詳細にはこのような解析用核酸プローブに結合して使用される高感度蛍光錯体及び当該蛍光の消光物質、さらに詳細には、当該高感度蛍光錯体と消光物質の組合せに関する。

本発明は、図 1に示されるフレットプローブなどの核酸プローブにおける発光色素「 Ln」と、消光物質「Q」との新規な特定の組合せを提供するものである。図 1のフレットプローブは本発明の核酸プローブの例を示すものである。この例では発光色素「Ln」はプローブの 5 '末端に示されており、消光物質「Q」が発光色素「Ln」による蛍光を消光するに十分な近傍に位置しており、発光色素「Ln」による蛍光は消光物質「Q」により消光されている。そして、インベーダー状態になったときに両者が分離され、発光色素「Ln」による蛍光を消光することができなくなり、発光色素「Ln」の蛍光を外部から観察することができるようになる。本発明は、このような発光と消光による標識ィ匕ができる核酸プローブを提供するものである。

[0018] 次に示す塩基配列を有する 39merの核酸を例にして本発明をより具体的に説明する。

5，- GCTTG TCTCG GTTTT TCCGA GACAA GCGTG CGCCT CGTT -3，この核酸の 5'末端には—C H を介してァミノ基が結合しており、また、 5'末端

6 12

力 3番目の塩基 (この例では、 T)には、次式

[0019] [化 4]

[0020] で示されるようにリンカ一基を介した Dabcyl基、又は次式

[0021] [化 5]

[0022] で示されるようにリンカ一基を介した BHQ2が結合して!/、る。

この例ではチミン (T)の 5—メチル—ゥラシル基のメチル基にリンカ一基が結合している場合を示している。以下、前記核酸の 5'—末端から 3番目の塩基 (この例では、 T)に前記した式で示されるリンカ一基を介した Dabcyl基が結合した核酸プローブを「N6— 3— DBL」と称し、前記核酸の 5'—末端から 3番目の塩基 (この例では、 T)に前記した式で示される BHQ2が結合した核酸プローブを「N6— 3— BHQ2Jと称するこれらの核酸プローブの 5'—末端に次式

[0023] [化 6]

[0024] で示されるようにリンカ一基を介した BTTAの Eu錯体、又は次式

[0025] [化 7]

で示されるようにリンカ一基を介して DTBTAの Eu錯体が結合した核酸プローブをそれぞれ調製した。

前記した核酸の 5'—末端に BTTAの Eu錯体が結合した核酸プローブを、それぞれ「Eu - BTTA -N6- 3- DBLJ及び「Eu - BTTA— N6— 3— BHQ2Jと称し、前記した核酸の 5'—末端に DTBTAの Eu錯体が結合した核酸プローブを、それぞれ「Eu— DTBTA— N6— 3— DBLJ及び「Eu— DTBTA— N6— 3— BHQ2Jと称する。

これらの核酸プローブを用いて、標的の核酸として 43merの次の塩基配列（T)及び (C)

5， - GTGTC TGCGG GAGTC GATTT CATCA TCACG CAGCT TTTCT TTG -3， (T)

5， - GTGTC TGCGG GAGCC GATTT CATCA TCACG CAGCT TTTCT TTG -3， (C)

についてインベーダー法による解析を行った。（T)と (C)では、 5，—末端から 14番目の塩基が 1塩基だけ相違している。

プライマリープローブとして 26merの次の塩基配列

5' - AACGA GGCGC ACACT CCCGC AGACA C - 3'

を有する核酸を使用し、インベーダープローブとして、 30merの次の塩基配列

5' - CAAAG AAAAG CTGCG TGATG ATGAA ATCGC - 3，

を有する核酸を使用した。

[0027] まず、フレットプローブとして「Eu— BTTA— N6— 3— DBL」を用いたインべーダ一アツセィを行った。標的の核酸濃度は、 InMで固定して、 4時間反応させた。結果を図 3に示す。図 3中、 Bはターゲット DNAの濃度がゼロ（Blank)を示し、 Tは標的の DNAが前記した (T)のものである場合を示し、そして Cは標的の DNAが前記した (C)のものであることを表す。標的の DNAが (T)の場合に解裂酵素による切断が起こり、蛍光が観測されるよう他のプローブ配列を設計している。

フレットプローブが、「Eu— BTTA— N6— 3— DBL」の場合には、信号とバックグランドの比は、 TZB = 3. 6で、 TZC=4. 7であり、 SNPsアツセィに使用可能ではある力検出感度は必ずしも十分ではな力つた。ちなみに、市販のフルォレツセインで同様の実験を行った場合には、 TZB及び TZCの比は 5〜6であった。

[0028] 次にフレットプローブとして、「Eu— DTBTA— N6— 3— DBL」を用いたインべ一ダーアツセィを同様な方法で行った。この結果を図 4に示す。図 4における、 B、 T、及び Cは前記した図 3と同じである。

このフレットプローブ「Eu— DTBTA— N6— 3— DBLJを用いた場合の信号とバックグランドの比は、前記とほぼ同様に、 TZB=4. 8、 T/C = 3. 5であった。

[0029] 同様に、フレットプローブとして「Eu— DTBTA— N6— 3— BHQ2」を用いてインべーダーアツセィを行った。この結果を図 5に示す。図 5における、 B、 T、及び Cは前記した図 3と同じである。

「Eu— DTBTA— N6— 3— BHQ2」をフレットプローブとして使用した場合には、信号とバックグランドの比として、 ΤΖΒ=48. 3、TZC=43. 4となり、大幅な感度の向上を達成することができることがわ力つた。

これらの結果をまとめて次の表 1に示す。

[0030] [表 1]

[0031] 注： 1)フレットプローブとして「N6— 3— DBL」を用いた結果の平均。 2)フレットプローブとして「Eu— DTBTA— N6— 3— BHQ2Jを用いた結果。 3)前二者の比。この結果、フレットプローブとして「Eu— DTBTA— N6— 3— BHQ2」を用いた場合には、信号 (S)とバックグランド信号強度 (B)の比（SZB)の値が、 48. 3となり驚異的な高感度となることがわかる。また、このプローブでは約 10倍以上の感度の向上ができたことがわ力た。

[0032] さらに、フレットプローブとして「Eu— DTBTA— N6— 3— BHQ2」を用いたインべーダーアツセィで、標的の DNAの濃度を変えて行うことにより、一塩基変異の検出限界の評価を行った。標的の DNAの濃度は、塩基配列 (T)の DNA、及び塩基配列（ C)の DNAともに、 100fM (0. ΙρΜ)から ΙηΜ (ΙΟΟΟρΜ)まで変化させ、インキュベーシヨン時間も 2時間、 4時間、およびオーバーナイトと変化させた。測定数は各実験点につき 4回行った (n=4)。結果を図 6に示す。図 6は、上からインキュベーション時間が 2時間の場合、 4時間の場合、及びオーバーナイトの場合を示している。図 6 の各グラフの縦軸は蛍光強度を示し、横軸は標的 DNAの濃度 (pM)を示す。各ダラフの丸印（參）は塩基配列が (T)の DNAを標的した場合を示し、三角印（▲)は塩基配列が（C)の DNAを標的とした場合を示し、横線は標的 DNAが存在しない場合を示す。

これらのデータに基づいて検出限界を検討した。検出限界は以下の式により計算した。

<T> < C > ≥ 3 σ (C)

ここで、 <T> は塩基配列が (Τ)の DNAに対する検量線を示す一次式を示し、 < C >は塩基配列が（C)の DNAに対する平均値、そして σ (C)は塩基配列が（C) の DNAに対するプールされた標準偏差である。

比較のために、現在のインベーダーアツセィによく使われる有機色素である FAM を用いたフレットプローブ「FAM— Ν6— 3— DBLJで同様な実験を行った。

これらの結果をまとめて次の表 2に示す。

[0033] [表 2]

[0034] 表 2の検出限界の数値の単位は pMである。

この結果、本発明のプローブ「Eu— DTBTA— N6— 3— BHQ2」は、 FAM— N6 3— DBLと同程度の検出限界が得られた。この実験はモデル実験であるので、夾雑物等のな、系でのアツセィである。夾雑物の含まれる系でアツセィを行った場合は、希土類蛍光錯体の特長が生カゝされ、有機色素を使った場合より検出感度の低い測定が可能であると期待される。

次に、前記した核酸プローブ「N6— 3— DBL」の 5 '—末端に次式

[0035] [化 8]

[0036] で表される Tbの BPTA錯体が結合した核酸プローブ「Tb— BPTA-N6 3— DBL 」を、 Tb³⁺を含むフレットプローブとして用い、そして、前記した本発明の「Eu— DTB TA— N6— 3— BHQ2」を Eu³⁺を含むフレットプローブとして用いた場合の赤（Eu³⁺ )および緑 (Tb³⁺)による二色のインベーダーアツセィを同様にして行った。結果を図 7に示す。図 7の左側は Tb³⁺ (緑色）の場合を示し、右側は Eu³⁺ (赤色）の場合を示す。図 7の各グラフの 3つの柱はそれぞれ左側力 B、 T、及び Cを示し、これは図 3における B、 T、及び Cと同じである。

これらの核酸プローブの塩基配列は両プローブとも同じなので同じように信号が観測されるはずである。実際、二つのプローブ由来の蛍光が観測され、希土類蛍光錯体を用いた二色インベーダーアツセィが可能であることが示された。

[0037] 以上のように、本発明の Eu³⁺錯体、特に一般式（1)で表される配位子を有する Eu³ +錯体は核酸解析用の核酸プローブにおける蛍光標識として極めて優れた特性を有していることが明らかにされた。

本発明の好ましい Eu³⁺錯体としては、前記した一般式（1)で表される化合物又はその塩を配位子とするものである。一般式（1)におけるァリール基としては、フエ-ル基、ナフチル基、ビフヱニル基などの炭素数 6〜30、好ましくは 6〜 12の炭素環式芳香族基や、環中に 1〜3個の窒素原子、酸素原子又は硫黄原子を有する 5〜7員の複素環式芳香族基が挙げられる。これらのァリール基は単環式、多環式、又は縮合環式のものであってもよい。好ましいァリール基としては、フエ-ル基、ビフエ-ル基、チェニル基、ピリジル基などが挙げられる。当該ァリール基は 1個以上の置換基を有していてもよぐこのような置換基としては、炭素数 1〜6のアルキル基、炭素数 1〜6 のアルコキシ基などの炭化水素基やその誘導体であってもよいが、アミノ基、水酸基

、カルボキシル基、スルホン酸基、イソチオシァネト基などの極性の官能基が好ましい。また、これらの官能基のアルキル誘導体やハロゲン化誘導体であってもよい。より好ましい置換基としては、アミノ基、カルボキシル基、イソチオシァネト基、これらのァルキル置換体などが挙げられる。また、当該ァリール基の置換基は、後述するリンカ一基 Zに結合する置換基、例えば、アミノ基ゃ水酸基やカルボキシル基であってもよい。このように、ァリール基の置換基がリンカ一基を介して核酸に結合する場合には、一般式（1)における Rは、 R— Z 核酸という化学結合を形成することになる。

一般式（1)における Qは、 C = C又は一 Nを示す。即ち、 Qが一 C = Cの場合には、ピリジン環を形成し、 2—ピリジル基となり、 Qがー Nの場合にはピラゾール環を形成し、 1—ピラゾリル基となる。一般式（1)における Υ〜Υ⁴は、いずれもカルボキシル基の残基であり、 Υ Υ³はそれぞれ独立して— ΟΗ基、又は— 0—基 (即ち、カルボキシル基の塩であるカルボキシレート）を示し、 Υ⁴も同様に— ΟΗ基、又は— 0—基である力 Υ4は核酸に結合するためのリンカ一基 Ζであってもよい。

核酸に結合するためのリンカ一基 Ζとしては、一般式（1)で表される配位子を核酸に固定するための適度な長さと固定ィヒのための反応性の基を有するものであればよぐ核酸の種類に応じて適宜選択することができる。このようなリンカ一基としては炭素数 3〜30、炭素数 5〜20、好ましくは炭素数 5〜15の直鎖状のアルキレン基によつて目的の核酸に結合するものであって、これらのアルキレン基の 1個又は 2個以上の炭素原子が、酸素原子、窒素原子、硫黄原子などの他の原子で置換されていてもよぐまた、これらのアルキレン基の 1個又は 2個以上の炭素原子、窒素原子、又は硫黄原子に結合する水素原子は、ォキソ基（ = 0)、ハロゲン原子、水酸基、アミノ基、アルキル基などで置換されていてもよい。また、このようなアルキレン鎖中に 1, 3, 5 —トリアジン環ゃピリミジン環などの複素環 (これらの複素環は、水酸基、アミノ基、ォキソ基などで置換されて、てもよ、。 )を含有することもできる。一般式（1)で表される配位子を核酸に結合する場合には、これを核酸プローブの 5 '—末端や 3 '—末端に結合させるときには、当該末端の核酸のリン酸エステルとして結合させればよぐ末端の核酸ではなく途中の核酸に結合させるときには、核酸の塩基部分と結合させることもできる。

本発明の Eu³⁺錯体における、より好ましい配位子としては次の一般式（2) [0039] [化 9]

[0040] (式中、 R及び〜丫⁴は、前記の一般式（1)と同じである。 )

で表される配位子、又は次の一般式（3)

[0041] [化 10]

(式中、 R及び〜丫⁴は、前記の一般式（1)と同じである。 )

で表される配位子が挙げられるが、前記の一般式 (2)で表される配位子がさらに好ましい。本発明の Eu³⁺錯体の特に好ましい配位子としては、一般式（2)で表される配位子のうちで、 Rがリンカ一基 Zに結合する置換基を有するァリール基であり、 Ύ^Υ〜Ύ が、それぞれ独立して— OH基、又は—0_基 (即ち、カルボキシル基の塩である力ルボキシレート）を示すものが挙げられる。

本発明の好ましい Eu³⁺錯体としては、次式

[0042] [化 11]

[0043] (式中、 Y⁴は— OH基、又は— 0—基を示し、 Zは核酸との結合のためのリンカ一基を示す。）

で表される錯体が挙げられる。この配位子を含有する Eu³⁺錯体を、本明細書では「E u— DTBTA」と称する。また、本発明の「Eu— 0丁丁八」錯体をリンカ一基 Zをより具体的に表すと、例えば、次式

[0044] [化 12]

[0045] (式中、 Y⁴は— OH基、又は—O—基を示し、 Baseは核酸プローブ中のヌクレオチドとの結合を示す。 )

で表される Eu³⁺錯体が挙げられる。

本発明の核酸プローブに結合する蛍光消光物質としては、前記した本発明の Eu³⁺ 錯体による蛍光を消光することができる物質であれば特に制限はな、が、好まし、蛍光消光物質としては、次の一般式 (4)

[0046] [化 13]

[0047] (式中、 Xは核酸との結合のためのリンカ一基を示す。 )

で表される化合物 (本明細書では、これを「DBL」と称する。）、又は、次の一般式（5) [0048] [化 14]

R⁶ R⁵ R⁴ R° R² R¹ [0049] (式中、！^〜尺¹³は、それぞれ独立して、水素原子、炭素数 1〜6のアルキル基、炭素数 1〜6のアルコキシ基、又は-トロ基を示し、 Xは核酸との結合のためのリンカ一基を示す。）

で表される化合物 (本明細書では、これを「BHQ」と称する。）が挙げられるが、より好まし、蛍光消光物質としては、前記した一般式（5)で表される化合物が挙げられる。一般式（5)におけるアルキル基としては、炭素数 1〜6の直鎖状又は分枝状のアルキル基であり、好ましいアルキル基としてはメチル基、ェチル基、イソプロピル基などが挙げられる。アルコキシ基としては、炭素数 1〜6の直鎖状又は分枝状のアルコキシ基であり、好ましいアルコキシ基としてはメトキシ基、エトキシ基、イソプロポキシ基などが挙げられる。また、一般式 (4)及び (5)におけるリンカ一基 Xとしては、一般式 (4 )又は（5)で表される蛍光消光物質を核酸に固定するための適度な長さと固定ィ匕のための反応性の基を有するものであればよぐ核酸の種類に応じて適宜選択することができる。このようなリンカ一基としては炭素数 3〜30、炭素数 5〜20、好ましくは炭素数 5〜 15の直鎖状のアルキレン基によって目的の核酸に結合するものであって、これらのアルキレン基の 1個又は 2個以上の炭素原子が、酸素原子、窒素原子、硫黄原子などの他の原子で置換されていてもよぐまた、これらのアルキレン基の 1個又は 2個以上の炭素原子、窒素原子、又は硫黄原子に結合する水素原子は、ォキソ基（ = 0)、ハロゲン原子、水酸基、アミノ基、アルキル基などで置換されていてもよい。一般式 (4)又は（5)で表される蛍光消光物質を核酸に結合する場合には、これを核酸プローブの 5'—末端や 3'—末端に結合させるときには、当該末端の核酸のリン酸エステルとして結合させればよぐ末端の核酸ではなく途中の核酸に結合させるときには、核酸の塩基部分と結合させることもできる。

本発明の好ましい蛍光消光物質としては、次式

[0050] [化 15]

[0051] (式中、 Xは核酸との結合のためのリンカ一基を示す。 )

で表される物質が挙げられる。この蛍光消光物質を、本明細書では「BHQ2」と称する。また、本発明の「BHQ2」のリンカ一基 Xをより具体的に表すと、例えば、次式

[0052] [化 16]

[0053] (式中、 Baseは核酸プローブ中のヌクレオチドとの結合を示す。）

で表される蛍光消光物質が挙げられる。

本発明の Eu³⁺錯体と蛍光消光物質との組み合わせでは、前記してきた一般式（1) で表される配位子を有する Eu³⁺錯体と、一般式 (4)又は（5)で表される蛍光消光物質とを適宜組み合わせ使用することができる力なかでも、 Eu³⁺錯体として「Eu— D TBTA」i体を、蛍光消光物質として一般式（5)で表される化合物、なかでも「BHQ 2」との組み合わせが特に好まし、。

本発明の Eu³⁺錯体及び蛍光消光物質を核酸に結合させた核酸プローブの調製法は何れも自体公知の核酸プローブの調製法に準じてこれを行うことができる。例えば、オリゴヌクレオチドの合成は何れもホスホロアミダイト法により DNA自動合成装置を用いて行うことができる。精製は逆相 HPLCにより行うことができる。また、蛍光消光物質の導入は、例えば下記の化学式

[0054] [化 17]

で示される BHQ2— dTなどのように常法に従ってこれを行うことができる。

また、 Eu³⁺錯体の導入は、 5'末端などにアミノ修飾したオリゴヌクレオチドを用いて、一般式（1)などで表される配位子と Euイオンとからなる Ει 十錯体との反応を行えばよぐ精製は逆相 HPLCや電気泳動、ゲル濾過クロマトグラフィーにより行うことができる。

[0058] 本発明の核酸プローブにおける核酸としては、 DNAでも RNAのいずれであってもよい。核酸の長さとしては、プローブとして使用することができる長さであれば特に制限はなぐ通常は 10〜150mer、好ましくは 10〜100mer、より好ましくは 10〜50m erが挙げられる。このような核酸の塩基配列もプローブとして使用することができれば特に制限はなぐ任意の塩基配列を選定することができる。本発明の核酸プローブをインベーダー法におけるフレットプローブ、又はタックマン法におけるタックマンプローブなどとして使用する場合には、 5'—末端側又は 3'—末端側のいずれかにループを形成できるような相補的な塩基配列を有するものが好ましい。

また、本発明の Eu³⁺錯体と蛍光消光物質 (タエンチヤー)の相対位置は充分な消光が得られるように適宜選定することができるが、好ま、蛍光消光物質 (タエンチヤ一）の相対位置としては、 Eu³⁺錯体が結合された塩基を 1番目としたときに、 3〜6番目の塩基、より好ましくは 3〜5番目の塩基、さらに好ましくは 4番目の塩基が挙げられる。後述する実施例 9に示されるように、例えば Eu— DTBTA— BHQの組み合わせでは、 4番目の塩基に蛍光消光物質 (タエンチヤー）の BHQを結合させた場合が極めて優れた効果を奏することがわ力つた。

[0059] 本発明の核酸プローブは、極めて高感度であり、極めて少量の試料であっても確実な測定が可能である。また、 SNPsなどのアツセィでは酵素を用いるため、核酸プローブに結合される錯体ゃ消光物質がアツセィで使用される酵素の働きに干渉を与えないことが必要であり、これは先験的に予期することができない。例えば、タックマン（Taqman) 5，→3，—エタソヌクレアーゼ活性については、 Tb錯体を使ったプロ一ブ (但し、このプローブには蛍光消光剤は付いていない。 )に対して有効であることが報告されているが（Nucleic Acids Research, 2000, 28, e28)、それ以外については報告例はない。本発明の錯体ゃ消光物質、例えば Eu— DTBTA— BHQの組み合わせでは、酵素作用への干渉はほとんど観察されず、仮にあったとしても問題にならな Vヽレベルであることが確認された。そして、本発明のさらに重要な点は、 Tb錯体 (特許文献 4参照）に続いて、本発明により Eu錯体の遺伝子解析法への適用が現実的に可能であることが示されたことである。これにより、例えば、希土類錯体として Tb— BPTA (特許文献 4参照）を含む核酸プローブと、本発明の Eu— DTBTAを含むもうひとつのプローブを同時に用いることにより、 Tb³⁺ (緑色）および Eu³⁺ (赤色）の 2色の蛍光発色を用いた遺伝子解析が実現可能となったのである。 SNPsタイピングでは、 SNPs部位の塩基の違いを色の違いとして観測することが良く行われており（例えば、非特許文献 10参照）、最低 2色の蛍光発色をする錯体の使用が必要とされてヽたが、これまで希土類蛍光錯体の中で十分な信号 Zバックランド比（SZB)が実現していたものは、 Tb錯体しかなぐ希土類蛍光錯体による 2色の SNPsの解析はできな力つた。しかし、本発明により、今後は Tb³⁺ (緑色）および Eu³⁺ (赤色）の 2色を使うことにより、ある SNPs (仮に塩基が A 力 Bかの SNPsとする。 )について、 AZAのホモ接合型であれば赤色（Eu³⁺)、 BZB のホモ接合型なら緑色 (Tb³⁺)、そして、 AZBのへテロ接合型であれば黄色 (Eu³⁺ +Tb³⁺)に発色するというような発色の色による判定が可能となり、核酸プローブを用いた SNPsの解析が少量の試料で極めて簡便に行うことができるようになる。

したがって、本発明の核酸プローブは、 SNPs解析などの核酸の解析用の核酸プローブとして使用することができる。本発明の核酸プローブの使用例としては、例えば、インベーダー法におけるフレットプローブ、モレキュラービーコン法におけるヘアピン構造をとるプローブ、タックマン (TaqMan) PCR法におけるタックマンプローブなどが挙げられる力これに限定されるものではない。

したがって、本発明は、前記してきた本発明の核酸プローブを用いて核酸を解析する方法、より詳細には、標的となる核酸の塩基配列を解析する方法を提供するものである。また、本発明の核酸プローブをモレキュラービーコン法のようにループ状の状態で使用し、これが他の核酸にハイブリダィズしたときには線状となることや、又はハイブリダィズしない部分を酵素的に解裂させることにより、本発明の核酸プローブにおける錯体と消光物質の距離を変化させて、遺伝子の発現などを解析することも可能となる。また、インベーダー法などの方法により、標的となる核酸中の特定の位置の特定の塩基の存在又は不存在を解析することも可能となる。これらの解析方法のなかでも、本発明の核酸プローブは、インベーダー法などによる一塩基多型（SNPs)の解析のためのプローブ、特にフレットプローブとして極めて有用なものである。前記した具体例、及び後述する具体例に記載されているように、本発明の核酸プローブは、インベーダー法において使用される酵素の活性に悪影響を与えるものではなぐ本発明の核酸プローブの存在下においても十分な酵素活性が確認できたことから、本発明の核酸プローブは、インベーダー法などによる一塩基多型（SNPs)を検出若しくは同定、又はタイピングする方法に使用することができる。

さらに、本発明の核酸プローブは、希土類蛍光錯体として赤色の蛍光を発色する E u³⁺錯体を使用していることから、 Eu³⁺錯体とは異なる色の蛍光を発色する蛍光物質が結合した核酸プローブと組み合わせて使用することにより、観測される蛍光の色によりさらに簡便な SNPsの解析が可能となる。 Eu³⁺錯体とは異なる色としては、目視して色の相違が確認できるものであれば特に制限はないが、好ましくは光の三原色を構成する他の色、即ち、緑色又は青色が挙げられる。また、蛍光物質としては、蛍光錯体が好ましいが、これに限定されるものではなぐ有機色素などの有機蛍光物質などであってもよい。例えば、本発明の Eu³⁺錯体が結合した核酸プローブと、緑色の蛍光を発色する従来の Tb³⁺錯体が結合した核酸プローブを組み合わせて使用することにより、赤色の蛍光、緑色の蛍光、及びこれらが混合してできる黄色の発色により、より効率的な核酸の解析が可能となる。

また、本発明は、本発明の核酸プローブを含有してなる核酸解析用キットを提供するものである。本発明の核酸解析用キットは、本発明の核酸プローブ、又はその場で本発明の核酸プローブを形成することができる材料 (例えば、本発明の配位子が結合した核酸プローブと、 Eu³⁺錯体を形成するためのユーロピウム化合物）を含有していることを特徴とするものであり、その余に核酸解析用の各種の材料、例えば、ノッファー溶液や各種の酵素などを含有することができる。このような核酸解析用キットとしては、遺伝子発現の解析用のキット、一塩基多型 (SNPs)を検出若しくは同定、又はタイピングするためのキットなどが挙げられる。本発明の核酸プローブは、インべーダ一法におけるフレットプローブとして有用であり、インベーダー法用のフレットプロ一ブとして本発明の核酸プローブを含有するキットは、本発明の好ましい核酸解析用キットのひとつである。

さらに、本発明の核酸解析用キットは、本発明の核酸プローブに結合している Eu³⁺ 錯体とは異なる色の蛍光を発色する蛍光物質が結合した核酸プローブを、さらに含有するもの核酸解析用キットが好ましい。このような、 Eu³⁺錯体とは異なる色の蛍光を発色する蛍光物質としては、蛍光錯体が好ましいが、これに限定されるものではなぐ有機色素などの有機蛍光物質などであってもよい。好ましい蛍光錯体としては、緑色の蛍光を発色する Tb³⁺錯体などが挙げられる。

発明の効果

[0062] 本発明は、 Eu³⁺錯体及び蛍光消光物質を核酸に結合させた新規な核酸プローブを提供するものである。本発明の核酸プローブは、 Eu³⁺錯体という希土類蛍光錯体を使用しているものであり、蛍光の測定に当たっては高感度の時間分解蛍光測定法を採用することができる。さらに、本発明の核酸プローブは、従来の有機色素を用いた核酸プローブに比べて約 10倍もの高感度であり、極めて少量の試料による核酸の解析が可能となった。また、本発明の核酸プローブは、核酸の解析において使用される酵素に対して悪影響を与えるものではなぐ各種の酵素を使用した核酸の解析に適用が可能である。さらに、本発明の核酸プローブは、蛍光発色用の錯体として E u³⁺錯体を使用していることから、光の三原色のひとつである赤色の蛍光を発色し、他の色を発色する蛍光錯体との組み合わせ使用が容易である。

以上のように、本発明の核酸プローブにより、標的とする核酸に対する解析が極めて容易となり、特にインベーダー法による SNPsの解析が極めて簡便かつ容易となり、本発明はヒトゲノムにおける SNPsの解析や診断において極めて重要な素材を提供するものである。

図面の簡単な説明

[0063] [図 1]図 1は、インベーダー法による SNP解析法の概要を模式的に示したものである

[図 2]図 2は、本発明の核酸プローブで使用される蛍光消光物質を例示したものである。 [図 3]図 3は、本発明の核酸プローブEu—BTTA—N6— 3— DBLを使用したときの、 SZB比をグラフにして示したものである。図 3中の Bは標的 DNAの濃度がゼロ（B1 ank)の場合を示し、 Tは標的の DNAが標的 (T)の場合を示し、そして Cは標的の D NAが標的 (C)の場合を示す。

[図 4]図 4は、本発明の核酸プローブ Eu— DTBTA— N6— 3— DBLを使用したときの、 SZB比をグラフにして示したものである。図 4中の Bは標的 DNAの濃度がゼロ（ Blank)の場合を示し、 Tは標的の DNAが標的 (T)の場合を示し、そして Cは標的の DNAが標的（C)の場合を示す。

[図 5]図 5は、本発明の核酸プローブEu—DTBTA— N6— 3— BHQ2を使用したときの、 SZB比をグラフにして示したものである。図 5中の Bは標的 DNAの濃度がゼロ (Blank)の場合を示し、 Tは標的の DNAが標的 (T)の場合を示し、そして Cは標的の DNAが標的（C)の場合を示す。

[図 6]図 6は、本発明の核酸プローブEu—DTBTA—N6— 3— BHQ2を使用して、標的の DNAの濃度を 0. ΙρΜから ΙΟΟΟρΜまで変化させたときの各々の蛍光強度の変化を示すグラフである。図 6は、上力もインキュベーション時間が 2時間の場合、 4時間の場合、及びオーバーナイトの場合を示している。図 6の各グラフの縦軸は蛍光強度を示し、横軸は標的 DNAの濃度 (pM)を示す。各グラフの丸印（參）は塩基配列が (T)の DNAを標的した場合を示し、三角印（▲)は塩基配列が（C)の DNAを標的とした場合を示し、横線は標的 DNAが存在しな、場合を示す。

[図 7]図 7は、本発明の「Eu— DTBTA— N6— 3— BHQ2」を Eu³⁺を含むフレットプローブとして用い、 Tbの BPTA錯体が結合した核酸プローブ「Tb— BPTA—N6— 3 - DBLJを Tb³⁺を含むフレットプローブとして用いた場合の赤（Eu³⁺)および緑 (T b³⁺)による二色のインベーダーアツセィの結果をグラフ化して示したものである。図 7 の左側は Tb³⁺ (緑色）の場合を示し、右側は Eu³⁺ (赤色）の場合を示す。図 7の各グラフの 3つの柱はそれぞれ左側力 B、 T、及び Cを示し、これは図 3における B、 T、及び Cと同じである。

[図 8]図 8は、本発明の Eu— DTBTA錯体による蛍光、及び従来の Tb— BPTA錯体による蛍光のそれぞれの蛍光の発光色、及びこれらを混合したときの蛍光の発光色を写した結果を示す図面に代わるカラー写真である。図 8の左側は Tb— BPTAによるものであり、緑色の蛍光であることがわかる。図 8の中央は Tb— BPTAと Eu— DT BTAを混合したときの蛍光で黄色になっているのがわかる。図 8の右側は Eu— DTB TAによるもので赤色の蛍光であることがわ力る。

[図 9]図 9は、本発明の「Eu— DTBTA— N6— n— BHQ2」 (n= 3, 4, 5, 6)それぞれについて、標的 DNAの濃度を 0. 1〜1000ρΜの範囲で変化させインベーダーァッセィを行った時の蛍光強度の変化を示すグラフである。ここでインキュベーション時間は 1時間である。各グラフの縦軸は Eu³⁺の蛍光強度を、横軸は標的 DNAの濃度（ pM)を示す。各グラフの黒丸印（參）は標的 DNAが (T)の時、および白三角印（△) は標的 DNA力 S (C)の時の結果を示す。また、バーは標準偏差 (N = 4)を示す。式より算出した検出限界を矢印で示した。

発明を実施するための最良の形態

以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。

以下に記載する実施例において共通する操作は以下のように行った。

(1)逆相 HPLC

機器：日本分光製 GULLIVERシリーズ HPLC装置

溶離液

A:酢酸トリェチルアンモ -ゥム（TEAA)バッファー（lOOmM, pH = 7. 0) B :ァセトニトリル

溶出時間が 0〜2分は、 A: Bが 95 : 5の溶出液を使用し、溶出時間が 2〜45分は、 A: Bが 97— (t/min) : 3+ (tZmin)とした (tは時間（分））。

流量： lmLZ分

カラム： Waters社製 Xterra MSC18カラム

カラム温度： 60°C

検出

紫外可視： 260nm吸光度

蛍光: Tb³⁺錯体または Tb³⁺を含むプローブの場合は、 320nmで励起、 545 n m発光

： Eu³⁺錯体または Eu³⁺を含むプローブの場合は、 340nmで励起、 615 nm 発光

(2)ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE)

機器:バイオラッド社製ミニプロティアン 3 (0. 75mm又は 1. 5mm厚ゲル）泳動バッファー： TBバッファー（TRIS10. 8gZL、ホウ酸 5. 5g/L,及び純水よりなるバッファー）

ゲル組成：ポリアクリルアミド濃度 = 20%

尿素 40%

ノッファー： TBノッファー

泳動方式：定電流 10mA

(3)プレートリーダーによる蛍光測定

機器：パーキンエルマ一社製 Wallacl420ARVOTM SX蛍光プレートリーダー測定条件：

1. Tb³⁺錯体または Tb³⁺を含むプローブの場合は、励起波長 320nm;検出波長 545nm、時間分解測定（遅延時間（Delay time) 500 s；ウィンドウ時間（Window ti me) 1000 μ s；サイクル時間（Cycle Time) 2000 μ s)

2. Eu³⁺錯体または Eu³⁺を含むプローブの場合は、励起波長 340nm;検出波長 615nm、時間分解測定（遅延時間（Delay time) 100 μ s ;ウィンドウ時間（Window ti me) 1500 μ s；サイクル時間（Cycle Time) 2000 μ s)

3. FAMまたは FAMを含むプローブの場合は、励起波長 485nm;検出波長 53 5nm、連続波測定（測定時間（Measurement time) 1. Os)

実施例 1

フレットプローブ「Eu— BTTA— N6— 3— DBLJの合成と精製

まず、 5，一末端に C H を介しアミノ基が結合したヌクレオシドと、 Dabcylで修飾し

6 12

た DNAオリゴヌクレオチドを DNA自動合成装置により合成したオリゴヌクレオチド N 6— 3— DBLを製造した。

次式 [0066] [化 19]

[0067] で表される H BTTAの Eu 錯体 0, 71mg(0.876 mol)を真空ラインで良く乾燥

4

し、アルゴン雰囲気下で、これに乾燥 DMF50/zLをカ卩えて溶解し、この溶液に N— ヒドロキシスクシンイミド（HOSu) 0. lOmg (0.876 μ mol)、及びジシクロへキシノレ力ルボジイミド（DCC)O.18mg(0.876 mol)を加え、この溶液をー晚攪拌した。得られた反応混合物 11. に、純水 26.2μ 炭酸バッファー（500mM, pH =9. 1)12. O/zL、及びオリゴヌクレオチド N6— 3— DBLの 100/zM水溶液 10.0 μ Lを加え、これを再び一晩反応させた。

ー晚反応後、 TRISバッファー（lOOmM, pH=7.4) 120 Lをカ卩えた後、限外濾過（ミリポア社 YM— 3)を行った。得られた粗生成物を逆相 HPLCにより精製し、最終的に 20.5pmolの Eu— BTTA— N6— 3— DBLを得た。

実施例 2

[0068] フレットプローブ「Eu - DTBTA -N6-3- DBLJの製造

N6— 3— DBLの ΙΟΟ Μ水溶液 5;zLと、次式

[0069] [化 20]

H4DTBTA で表される H DTBTAを用いて製造された Eu— DTBTA錯体の 2. OmMの DMSO

4

溶液 5 ;z Lとを、 N6— 3— DBL:Eu— DTBTA= 1 : 20のモル比で、炭酸バッファー (500mM, pH = 9. 1) 2. 5 Lと共に混合し、それを一昼夜室温で攪拌した。

一昼夜反応後、反応混合物を陰イオン交換樹脂で精製し、塩化ナトリウム (0. 5M) 含有 TRISバッファー（10mM、 pH = 8. 0)で榭脂に吸着された核酸プローブを溶出させた。溶出液を濃縮した後、少量の純水に再溶解し限外濾過（ミリポア社 YM— 3)した。得られた溶液を、さらにポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE)で精製した。約 1時間の泳動の後、 UVシャドウイングによりバンドを確認し、 Eu— DTBTA— N6 — 3— DBLのバンドを切り出した。切り出したゲルを、 TRISバッファー（50mM、 pH = 7. 8)に懸濁させ、その上清部を濾過により取り出し、当量の EuClと、炭酸バッフ

3

ァー（100mM、 pH = 9. 1)中又は TRISバッファー（100mM、 pH = 8. 0)中で混合した。一時間攪拌後、限外濾過 (ミリポア製 YM— 3)を行い、過剰の EuClを含む浸

3 出液の蛍光強度を蛍光プレートリーダーでチェックした。限外濾過膜上に残った液には、 TRISバッファー（10 mM、pH = 7. 4)を加え、再び限外濾過を行った。この操作は、得られた浸出液の蛍光強度が一定となるまで繰り返した。最終的に、約 25 %収率で目的物 Eu - DTBTA -N6- 3- DBLが得られた。実施例 3

[0071] フレットプローブ「Eu— DTBTA— N6— 3— BHQ2」の製造

まず、 5，一末端用の末端の C H を介しアミノ基が結合したヌクレオシドと、 BHQ2

6 12

で修飾した DNAオリゴヌクレオチドを DNA自動合成装置により合成したオリゴヌタレォチド N6— 3— BHQ2を製造した。

この N6— 3— BHQ2を用いて、実施例 2と同様の方法で、 N6— 3— BHQ2 : Eu— DTBTA= 1： 20のモル比の条件で反応させ、実施例 2と同様に精製して目的の Eu — DTBTA—N6— 3— BHQ2を収率約 25%で製造した。

[0072] 参考例 1

フレットプローブ Tb - BPTA-N6 - DBLゝ及び Tb - BPTA— N6— BHQ2の製造

実施例 1で製造した N6— 3— DBL又は実施例 3で製造した N6— 3— BHQ2、及び実施例 1と同様にして製造したスクシンイミド化 BPTA (BPTA- OSu)の Tb³⁺錯体を用いて、実施例 1又は実施例 3と同様にして、目的の Tb— BPTA— N6— DBL 、及び Tb— BPTA— N6— BHQ2をそれぞれ製造した。

実施例 4

[0073] Eu— BTTA— N6— 3— DBLを用いたインベーダーアツセィ

フレットプローブとして Eu— BTTA— N6— 3— DBLを用い、インベーダーアツセィを行った。

( 1)インベーダーアツセィ用バッファー（インベーダーバッファー）の調製

インベーダーアツセィに用いるインベーダーバッファーの 10倍濃縮液 10 Xインべーダーバッファ一は以下のように調製した。

TRISノッファー（200mM、 pH= 7. 4) 500mL

MgCl ( 150mM

2 )Z純水 500mL

Tween20 5g

を混合し、 0. 2 μ mフィルター（ナルゲン）で滅菌濾過した。

(2)インベーダーアツセィ

典型的には、 1ゥエル（20 L)当たり以下の割合でプローブ類、酵素、バッファー等を混合した。

(終濃度）

標的オリゴヌクレオチド（10 X x M)Z純水 (X M)

フレットプローブ（1. 25 M)Z純水 ( 125nM)

10 X PIミックス 2 μ Ι^

プライマリープローブ（250ηΜ)

インベーダープローブ（50ηΜ)

tRNA ( 100ngZ w L)Z純水 1 L (5ng/ μ L)

フラップエンドヌクレアーゼ（200ngZ μ L)溶液 1 L(10ngZ μ L)

10 Xインベーダーバッファー 2 ;z L

純水 lO ^ L

ここで、標的オリゴヌクレオチドとして、次の塩基配列 (T)又は (C)

5， - GTGTC TGCGG GAGTC GATTT CATCA TCACG CAGCT TTTCT TTG - 3， (T)

5， - GTGTC TGCGG GAGCC GATTT CATCA TCACG CAGCT TTTCT TTG - 3， (C)

を有するオリゴヌクレオチドを用いた。以下では、それぞれのオリゴヌクレオチドを標的 (T)及び標的 (C)とそれぞれ称する。それぞれ、様々な終濃度 Xにつヽてアツセィを行った。また、プライマリープローブ及びインベーダープローブは、それぞれ次に示す、

プライマリープローブ： 5， - AACGA GGCGC ACACT CCCGC AGACA C -3 ' インベーダープローブ： 5， - CAAAG AAAAG CTGCG TGATG ATGAA ATCG C -3，

配列を有する、 HPLCグレードのオリゴヌクレオチドを用いた。解裂酵素としては、ァエルピルムペルニックス（Aeropyrum pernix)由来フラップエンドヌクレアーゼを用いた。上記の組成の溶液を、 63°Cで 2時間又は 4時間インキュベートした後、蛍光プレートリーダーにて、使用したフレットプローブに対応して Tb、 Eu,または FAM由来の蛍光を測定することにより行った。 [0074] この例では、標的オリゴヌクレオチドの濃度は、 InMで固定し、 4時間反応させた。結果を図 3に示す。図中、 BはターゲットDNAの濃度がゼロ（Blank)、Tは標的DN Aが標的 (T)、そして Cは標的 DNAが標的 (C)であることを表す。 Tの場合に解裂酵素による切断が起こり、蛍光が観測されるよう他のプローブ配列を設計している。このフレットプローブ Eu— BTTA— N6— 3— DBLは、特許文献 4 (WO 03/076 615号公報参照）に好まし、例として記載されてヽる希土類蛍光錯体一消光剤の組み合わせに対応し、かつ当該特許文献 4に記載の実施例に準じた方法で製造した。し力し、信号とバックグランドの比は、 ΤΖΒ= 3. 6、及び TZC=4. 7であり、 SNPs アツセィに使用可能ではあるが、検出感度は必ずしも十分ではな力つた。ちなみにフルォレツセインで同様の実験を行ったところ、 TZB=TZC = 5〜6であった。

実施例 5

[0075] Eu - DTBTA— N6— 3— DBLを用ヽたインベーダーアツセィ

フレットプローブとして Eu— DTBTA— N6— 3— DBLを用い、実施例 4と同様にしてインベーダーアツセィを行った。実施例 4と同様に、標的オリゴヌクレオチドの濃度は InMで固定し 4時間反応させた。結果を図 4に示す。

このフレットプローブ Eu— DTBTA— N6— 3— DBLは、実施例 4で使用した Eu—

BTTA—N6— 3— DBLと比べて、錯体と核酸を結ぶリンカ一分子および錯体上でリンカーの結合する位置が異なっている。しかし、信号とバックグランドの比は、実施例

4とほぼ同じで、 ΤΖΒ=4. 8、及び TZC = 3. 5であった。

実施例 6

[0076] Eu - DTBTA— N6— 3— BHQ 2を用ヽたインベーダーアツセィ

フレットプローブとして Eu— DTBTA— N6— 3— BHQ2を用い、実施例 4と同様にしてインベーダーアツセィを行った。標的オリゴヌクレオチドの濃度は、同じく InMで固定し、 4時間反応させた。結果を図 5に示す。

このフレットプローブでは、信号とバックグランドの比として、 ΤΖΒ=48. 3、及び T

/C=43. 4が得られ、大幅な感度の向上が達成された。これらの結果をまとめて前 ti表 1にし 7こ。

実施例 7 [0077] Eu - DTBTA— N6— 3— BHQ 2を用、たインベーダーアツセィの検出限界実施例6で行ったEu—DTBTA—N6— 3— BHQ2を用ぃて実施例4と同様な方法によるインベーダーアツセィで、標的オリゴヌクレオチドの濃度を変えて行うことにより、一塩基変異の検出限界の評価を行った。

標的オリゴヌクレオチドの濃度は、標的 (T)と標的（C)の、ずれも、それぞれ lOOf Mから InMまで変化させ、インキュベーション時間も 2時間、 4時間、及びオーバーナイトと変化させて実験を行った。測定数は各実験点につき 4回である (n=4)。結果を図 6に示す。これらの結果から、検出限界を計算した。

また、比較のため、インベーダーアツセィによく使われる有機色素である FAMを用いて、同様な実験を行った。

これらの結果をまとめて前記した表 2に示した。

実施例 8

[0078] 二色（Eu - DTBTA— N6— 3— BHQ 2及び Tb - BPTA— N6— 3— DBL)を用 V、たインベーダーアツセィ

Eu³⁺錯体を含むフレットプローブとして Eu— DTBTA— N6— 3— BHQ2を、そして、 Tb³⁺錯体を含むフレットプローブとして Tb— BPTA— N6— 3— DBL を用い、赤 (Eu³⁺)および緑 (Tb³⁺)による二色インベーダーアツセィを行った。結果を図 7に示す (標的オリゴヌクレオチドの濃度は 1ηΜ)。また、それぞれの蛍光の発光色、及びこれらを混合したときの蛍光の発光色を写したカラー写真を図 8として添付する。図 8の左側は Tb— BPTAによるものであり、緑色の蛍光であることがわかる。図 8の中央は Tb— BPTAと Eu— DTBTAを混合したときの蛍光で黄色になっているのがわ力る。図 8の右側は Eu— DTBTAによるもので赤色の蛍光であることがわ力る。これらの結果、希土類蛍光錯体を用いた二色インベーダーアツセィが可能であることが確認された。

実施例 9

[0079] クェンチヤ一の最適位置

クェンチヤ一の結合する塩基の位置がそれぞれ異なるプローブ Eu— DTBTA— N 6-n-BHQ2 (n= 3, 4, 5, 6)を製造し、クェンチヤ一の結合する塩基の位置による感度を試験した。これらのプローブの製造は、前記した Eu— DTBTA— N6— 3— BHQ2の製造法と同じ方法で行った。ここで、プローブはそれぞれ以下のような配列を有する。下記の式における配列中の「t」は、 BHQ 2化デォキシチミジンを示す。

EU-DTBTA-N6-3-BHQ2:

5，- Eu-DTBTA - GCtTG TCTCG GTTTT TCCGA GACAA GCGTG CGCCT CGTT -3，

EU-DTBTA-N6-4-BHQ2:

5，- Eu-DTBTA - GCTtG TCTCG GTTTT TCCGA GACAA GCGTG CGCCT CGTT -3，

Eu-DTBTA-N6-5-BHQ2:

5，- Eu-DTBTA - GCTGt TCTCG GTTTT TCCGA GACAA GCGTG CGCCT CGTT -3，

Eu-DTBTA-N6-6-BHQ2:

5，- Eu-DTBTA - GCTTG tCTCG GTTTT TCCGA GACAA GCGTG CGCCT CGTT -3，

以上のプローブそれぞれをフレットプローブとして用いインベーダーアツセィを行つた。インベーダーアツセィ条件は、フレットプローブの種類が異なる以外、実施例 4と同じである。標的 DNA(T)および（C)の濃度を 0. 1〜： LOOOpMの範囲で変化させた時の、インキュベーション時間 1時間後に観測された Eu蛍光強度の変化を図 9に示す。これらのデータ力算出した検出限界もあわせて図 9中に示した。検出限界は先の実施例と同じく以下の式力計算した。

<T> 一 < C> ≥ 3 σ (C)

ここで、 <Τ>は標的 DNA(T)に対する検量線を示す一次式、 < C>は標的 DN A (C)に対する平均値、そして σ (C)は標的 DNA(C)に対するプールされた標準偏差である。 Eu-DTBTA-N6-n-BHQ2 (n= 3, 4, 5, 6)をフレットプローブとして用、たインベーダーアツセィの検出限界 (検出限界標的 DNA濃度 ΖρΜ)の結果を次の表 3に示す。

[表 3]

η= 5 23.53 10.49 9.16 7.34 η=6 41.74 9.95 8.98 7.39

[0081] なお、 Eu—DTBTA—N6— 3— BHQ2に対する検出限界の値力先の実施例 7 の表 2に示した値と少し異なっている力これは二つの実施例に対応する実験が全く違う日に違うロットのプローブを用いて行われたからである。逆に、この二つの実験結果の差が少ないことから、アツセィ間のばらつきは小さぐ再現性も良いと言える。フレットプローブ Eu—DTBTA—N6—n—BHQ2 (n= 3, 4, 5, 6)の検出限界を比較すると、 n= 3, 5,および 6に対する検出限界は三つとも 10— 40pM程度で、大きな差異は見られないが、 n=4の場合だけ特異的に検出限界が一桁近く下がっている。インキユーべーシヨン時間を 2— 4時間と変えて実験を行った力同じような傾向であつた (表 3参照)。

これらの結果から Eu— DTBTA— N6— 4— BHQ2をフレットプローブとして用いた時の検出限界が特異的に低ぐ性能が良いことが分力つた。以上のことより、タエンチヤーの最適位置は Eu錯体力 4番目の塩基の位置であると結論された。

産業上の利用可能性

[0082] 本発明は、 SNPsなどの核酸の解析に有用な核酸プローブを提供するものであり、ヒトゲノムにおける SNPsの検出や同定のための試薬として産業上利用されるものである。また、本発明の核酸プローブは、極めて高感度であるだけでなぐ核酸の解析において使用される酵素類の活性を阻害することもなぐかつ従来の希土類蛍光錯体とは異なる色の蛍光を発色するものであり、従来の希土類蛍光錯体と組み合わせて使用することにより、さらに高感度で、簡便かつ確実な核酸の解析が可能となり、産業上極めて有用なものである。

配列表フリーテキスト

[0083] 配列番号 1 ：本明細書に記載の試験例においてフレットプローブとして使用した 39merのオリゴヌクレオチドを示す。

5，- GCTTG TCTCG GTTTT TCCGA GACAA GCGTG CGCCT CGTT -3，配列番号 2 ：本明細書に記載の試験例において標的 (T)として標的プローブとして使用した 43merのオリゴヌクレオチドを示す。

5， - GTGTC TGCGG GAGTC GATTT CATCA TCACG CAGCT TTTCT TTG -

3，

配列番号 3 ：本明細書に記載の試験例において標的（C)として標的プローブとして使用した 43merのオリゴヌクレオチドを示す。

5， - GTGTC TGCGG GAGCC GATTT CATCA TCACG CAGCT TTTCT TTG - 3，

配列番号 4 ：本明細書に記載の試験例においてプライマリープローブとして使用した 26merのオリゴヌクレオチドを示す。

5' - AACGA GGCGC ACACT CCCGC AGACA C - 3'

配列番号 5 ：本明細書に記載の試験例においてインベーダープローブとして使用した 30merのオリゴヌクレオチドを示す。

5' - CAAAG AAAAG CTGCG TGATG ATGAA ATCGC—3，

Claims

請求の範囲

[1] Eu³⁺錯体及び蛍光消光物質を核酸に結合させたことを特徴とする核酸プローブ。

[2] Eu³⁺錯体が、次の一般式 (1)

[化 21]

(式中、 Rは置換基を有してもよいァリール基を示し、 Qは— C = C又は— Nを示し、 Y ェ〜丫³はそれぞれ独立して— OH基、又は— O—基、 Y⁴は— OH基、— 0—基、又は— Z基を示し、 Zは核酸との結合のためのリンカ一基を示す。 )

で表される配位子を有する錯体である請求項 1に記載の核酸プローブ。

Eu³⁺錯体の配位子が、次の一般式 (2)

[化 22]

(式中、 Rは置換基を有してもよいァリール基を示し、丫¹〜？³はそれぞれ独立して—

OH基、又は— 0—基を示し、 Y⁴は— OH基、— 0—基、又は— Z基を示し、 Zは核酸との結合のためのリンカ一基を示す。）

で表される配位子である請求項 2に記載の核酸プローブ。 [4] Eu^d+錯体の配位子が、次の一般式 (3)

[化 23]

で表される配位子である請求項 2に記載の核酸プローブ。

[5] 蛍光消光物質が、次の一般式 (4)

[化 24]

(式中、 Xは核酸との結合のためのリンカ一基を示す。 )

で表される化合物である請求項 1〜4のいずれかに記載の核酸プローブ。

[6] 蛍光消光物質が、次の一般式 (5)

[化 25]

(5)

(式中、！^〜尺¹³は、それぞれ独立して、水素原子、炭素数 1〜6のアルキル基、炭素数 1〜6のアルコキシ基、又は-トロ基を示し、 Xは核酸との結合のためのリンカ一基を示す。）

Eu³⁺錯体の配位子が、次の一般式 (2)

[化 26]

(式中、 Rは置換基を有してもよいァリール基を示し、丫¹〜？³はそれぞれ独立して— OH基、又は— 0—基を示し、 Y⁴は— OH基、— 0—基、又は— Z基を示し、 Zは核酸との結合のためのリンカ一基を示す。）

で表される配位子であり、蛍光消光物質が、次の一般式 (5)

[化 27]

(式中、！^¹〜!^³は、それぞれ独立して、水素原子、炭素数 1〜6のアルキル基、炭素数 1〜6のアルコキシ基、又は-トロ基を示し、 Xは核酸との結合のためのリンカ一基を示す。）

で表される化合物である請求項 1に記載の核酸プローブ。

一般式（2)における R力 Z基 (Zは、核酸との結合のためのリンカ一基を示す。 ) で置換されたァリール基であり、 ^〜Υ³はそれぞれ独立して— OH基、又は— 0—基であり、 Υ⁴は ΟΗ基、又は 0—基である請求項 7に記載の核酸プローブ。

[9] 一般式（5)において、 R7が-トロ基であり、 R4及び R11がメトキシ基であり、 R\ R² 、 R³、 R⁵、 R⁶、 R⁸、 R⁹、 R¹⁰, ¹、 R¹²、及び R¹³が水素原子である請求項 7又は 8に記載の核酸プローブ。

[10] 核酸プローブが、インベーダー法による SNPs解析用のフレットプローブである請求項 1〜9にいずれかに記載の核酸プローブ。

[11] 請求項 1〜10のいずれかに記載の核酸プローブを用いて核酸を解析する方法。

[12] 核酸の解析が、遺伝子発現の解析である請求項 11に記載の方法。

[13] 核酸の解析が、核酸中の特定の塩基の存在又は不存在の解析である請求項 11に記載の方法。

[14] 核酸の解析が、一塩基多型（SNPs)の解析である請求項 11又は 13に記載の方法

[15] 一塩基多型（SNPs)の解析が、インベーダー法によるものである請求項 14に記載の方法。

[16] 請求項 1〜10のいずれかに記載の核酸プローブを用いて、一塩基多型（SNPs)を検出若しくは同定、又はタイピングする方法。

[17] 一塩基多型（SNPs)の検出若しくは同定、又はタイピングする方法力インべーダ一法によるものである請求項 16に記載の方法。

[18] 一塩基多型（SNPs)の検出若しくは同定、又はタイピングする方法力請求項 1〜

8のいずれかに記載の Eu³⁺錯体とは異なる色の蛍光を発色する蛍光物質をさらに用いるものである請求項 16又は 17に記載の方法。

[19] 蛍光物質が、蛍光錯体である請求項 18に記載の方法。

[20] 請求項 1〜10のいずれかに記載の Eu³⁺錯体とは異なる色の蛍光を発色する蛍光錯体力緑色の蛍光を発色する Tb³⁺錯体である請求項 19に記載の方法。

[21] 請求項 1〜： L0のいずれかに記載の核酸プローブを含有してなる核酸解析用キット

[22] 核酸解析用キットが、遺伝子発現の解析用である請求項 21に記載の核酸解析用キット。

[23] 核酸解析用キットが、一塩基多型 (SNPs)を検出若しくは同定、又はタイピングするためのキットである請求項 21に記載のキット。

[24] 核酸解析用キットが、請求項 1〜10のいずれかに記載の Eu³⁺錯体とは異なる色の蛍光を発色する蛍光物質をさらに含有するものである請求項 21又は 22に記載のキッ卜。

[25] 蛍光物質が、蛍光錯体である請求項 24に記載のキット。

[26] 請求項 1〜10のいずれかに記載の Eu³⁺錯体とは異なる色の蛍光を発色する蛍光錯体力緑色の蛍光を発色する Tb³⁺錯体である請求項 25に記載のキット。

[27] 一塩基多型（SNPs)の検出若しくは同定、又はタイピングする方法力インべーダ一法によるものである請求項 23〜26のいずれかに記載のキット。