JP2010158183A - Dna定量方法、及び遺伝子解析方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】まず、標的DNA10を含むサンプルと、前記標的DNA10上に多数存在する所定の反復配列を特異的に検出するためのシグナルプローブ21a、インベーダーオリゴ31a、フレットプローブ41a、及び酵素クリベースを有するインベーダー反応液と、を含む混合液を調製する。その後、前記混合液の温度を制御することによりインベーダー反応を行い、該インベーダー反応による蛍光シグナルの強度を予め作成した検量線と照合することにより前記混合液中における標的DNA量を推定する。
【選択図】図1
Description
a) 標的DNAを含むサンプルと、インベーダー反応によって前記標的DNA上の所定の反復配列を特異的に検出するためのインベーダー反応液と、を含む混合液を調製する調製工程と、
b) 前記混合液の温度を制御することによりインベーダー反応を行う反応工程と、
c) 前記インベーダー反応による、前記所定の反復配列の検出結果に基づいて前記混合液中における標的DNA量を推定するDNA量推定工程と、
を有することを特徴としている。
本方法では、まず、反応容器に定量対象とする標的DNA10を含むサンプルとインベーダー反応液を所定量ずつ添加し、これらを混合した混合液を調製する。
続いて、上記混合液をインベーダー反応の至適温度(例えば63℃)に維持することによってインベーダー反応を行わせる。
このようなサイクルを所定の回数繰り返すことにより、前記SNP判定用の反応容器内において、プライマー対51、52で挟まれる標的DNA10上の領域が増幅される。なお、DNA定量用の反応容器にはPCR反応液が添加されていないため、前記温度サイクルによる処理の間もPCR反応は起こらず、標的DNA10は増幅されない。
本実験例は、合成オリゴヌクレオチド(以下、「合成オリゴ」と略称する)をテンプレートとしてインベーダープラス法の検出感度を調べたものである。
まず、インベーダープラス法における標的DNAとするため、以下の配列1、2から成る2種類の合成オリゴからPCRによって2本鎖のDNAを合成した。
配列1:AAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCTGTGTCATGTCAAGCAGACTGAGCTCGATGGCTAGACGAACTGT
配列2:AGAAAGGAGGTGATCCAGCCGCAGCTGTGAGAGTGTCGCCGACATGAGACAGTTCGTCTAGCCATCGA
PCRは、10mM Tris-HCl、50mM KCl、5mM MgCl2、各0.8μMの合成オリゴ、各160μMのdATP、dCTP、dGTP、及びdTTP、2.5 unitsのHybriPol DNA Polymerase(バイオライン社、英国)を含む反応液を使用し、94℃で1分間のプレヒーティングの後、94℃で5秒間、59℃で5秒間、72℃で5秒間の条件で20サイクル、最後に72℃で1分間のポリメライゼーションを行った。上記2種類の合成オリゴの3'端側には、相補的な配列が含まれており、PCR反応によって、互いを鋳型及びプライマーとしたDNA合成が行われ、反応液中の合成オリゴの数だけ2本鎖のPCR産物が得られる。
以上により得られたPCR産物をDW(蒸留水)で10の10乗倍希釈及び10の11乗倍希釈したものを、それぞれ後述のインベーダープラス法におけるPCR反応及びインベーダー反応(以下、インベーダープラス反応と呼ぶ)のサンプルとした。
反応液は、10mM Tris-HCl、50mM KCl、10mM MgCl2、各0.5μMのプライマー、各0.6μMのシグナルプローブ、各0.3μMのインベーダーオリゴ、各40μMのdATP、dCTP、dGTP及びdTTP、0.3 unitsのHybriPol DNA Polymerase(バイオライン社、英国)、90unitsのCleavase、FRETプローブ(Third Wave Technologies社)を含んだ反応液(2.5μl)を用いた。なお、FRETプローブは蛍光色素(FAM)で標識されている。
プライマーは、それぞれ以下の配列3,4のものを合成して使用した。
配列3:AAACTCAAAGGAATTGACGGGGGC
配列4:AGAAAGGAGGTGATCCAGCCGCA
上記プライマーによるPCR産物を検出するためのシグナルプローブ、インベーダーオリゴとしては、Universal Invader(Third Wave Technologies社、米国)プログラムにて設計したものをそれぞれ使用した。
マイクロプレートの各ウェルに上記反応液とサンプル0.1μlを加えて全量2.5μlの混合液とし、95℃、1分間のプレヒーティングの後、94℃ 3秒間、68℃ 5秒間の条件で32サイクルでPCR反応を行った。その後、ポリメラーゼを失活させるために、99℃で3分間処理を行った後、63℃でインベーダー反応させた。なお、インベーダープラス反応及び蛍光測定には、MX3000P(ストラタジーン社)を使用した。
本実験例は、インベーダープラス反応によるSNP判定において標的DNAが低濃度の場合に、サンプルがヘテロ接合体であるのに一方のシグナルしか上がらず、ホモ接合体のようになる現象が起こることを示したものである。
サンプルには、コリエル研究所のDNAパネルのうち、PD35、PD18を選択して使用した。前者はCYP2C9の*2アレルを、後者はCYP2C9の*3アレルをそれぞれへテロで持つものである。各サンプルの吸光度を測定してDNA濃度がそれぞれ1.9ng/μl、及び7.8ng/μlであることを確認し、これらをそれぞれ5倍ずつ段階希釈したものをインベーダープラス反応のサンプルとして使用した。
本実験例では1つのウェルで2種類の塩基配列(すなわち、各SNP部位の野生型と変異型)を同時に検出できるよう、各反応液には、2種類のシグナルプローブ、及びインベーダーオリゴと、各シグナルプローブに対応した異なる蛍光物質(FAM、RED)を含む2種類のFRETプローブとを添加した。それ以外の点は、実験例1と同様にして反応液を調製した。
プライマーは、CYP2C9*2の検出用として以下の配列5、6のものを、CYP2C9*3の検出用として以下の配列7、8のものをそれぞれ合成して使用した。
配列5:TCCTGTTAGGAATTGTTTTCAGCAATGGAAAGAA
配列6:AGTAGTCCAGTAAGGTCAGTGATATGGAGTAGGG
配列7:GGAGCCCCTGCATGCAAGACAGGA
配列8:TGGGGACTTCGAAAACATGGAGTTGCAG
CYP2C9*2検出用、及びCYP2C9*3の検出用のシグナルプローブ及びインベーダーオリゴは、実験例1と同様のプログラムにて設計したものを使用した。
マイクロプレートの各ウェルに上記反応液とサンプル0.1μlを加えて全量2.5μlの混合液とした。インベーダープラス反応は、95℃、10秒間のプレヒーティングの後、94℃ 1秒間、68℃ 1秒間の条件で32サイクルのPCR反応を行い、その後、ポリメラーゼを失活させるために99℃で3分間処理を行った後、63℃でインベーダー反応を行った。なお、インベーダープラス反応及び蛍光測定は実験例1と同様の装置にて行った。
本実験例では、インベーダープラス反応を利用したSNP判定において、PCRによるDNA増幅が多すぎる場合に正しい判定が困難になる例を示す。
血液10μlを界面活性剤を含む前処理液100μlと混合することによって前処理(詳細は特開2001-299356号を参照)を行い、これを水で20倍に希釈したものをサンプルとした。なお、本例では、後述の各SNP部位が野生型のホモ接合体である2名のボランティアの血液を使用した。
本実験例ではサンプルとして上記のような血液の希釈液を使用するため、反応液としては、10mM Tris-HCl、50mM KCl、10mM MgCl2 、各0.5μMのプライマー、各0.6μMのプローブ、各0.3μMのインベーダーオリゴ、各40μM のdATP、dCTP、dGTPm及びdTTP、0.3 units のHybriPol DNA Polymerase(バイオライン社、英国)、90 unitsのCleavase、FRETプローブ(Third Wave Technologies社)に加え、ポリアミン、硫酸化多糖、界面活性剤、及びDTTを含む反応液を使用した。
VKORC1のSNP部位(rs9934438)を増幅するためのプライマーとしては、以下の配列9、10のものを合成して使用した。
配列9:TGGACCCTGCCCGAGAAAGGTGATT
配列10:CATGGAATCCTGACGTGGCCAAAGG
また、このSNP部位(rs9934438)を検出するためのシグナルプローブ及びインベーダーオリゴは、実験例1と同様のプログラムにて設計したものを使用した。
上記の反応液にサンプル1μlを加えて全量2.5μlとし、実験例1に準じてインベーダープラス反応及び測光を行った。
本実験例では、インベーダープラス法における標的DNA量と反応液量の関係に着目した試験を行った。サンプルとしては前述のPD35を使用し、CYP2C9*2を標的SNPとした。
本実験例では、標的DNAの濃度によって、インベーダープラス法の反応速度が変化する例を示す。
界面活性剤を含む前処理液100μlに血液を5μl、3μl又は、1μl添加して前処理を行い、それぞれを水で20倍に希釈したものをサンプルとした。なお、血液は実験例3の2名のボランティアのうちの1名のものを使用した。
反応液は実験例3に準じて調製した。標的SNPとしては、VKORC1のSNP(rs9923231)と上述のCYP2C9*3を使用し、CYP2C9*3部位を増幅、又は検出するためのプライマー、シグナルプローブ、及びインベーダーオリゴとしては、実験例2と同様のものを使用した。
VKORC1のSNP部位(rs9923231)を増幅するためのプライマーとしては、以下の配列11と配列12のものを合成して使用した。
配列11:CACCTCGGCCTCCCAAAATGCTAGG
配列12:GGGATCCCTCTGGGAAGTCAAGCAA
また、このSNP部位(rs9923231)を検出するためのシグナルプローブ及びインベーダーオリゴは、実験例1と同様のプログラムにて設計したものを使用した。
上記の反応液にサンプル1μlを加えて総量2.5μlの混合液とし、インベーダープラス反応を行った。インベーダープラス反応は、まずPCRとして、95℃ 10秒間プレヒーティングの後、94℃ 3秒間、68℃ 5秒間の条件で30サイクル行い、その後、ポリメラーゼを失活させるために、99℃ 3分間処理した後、63℃でインベーダー反応させた。測光は、実験例1に準じて行った。
本実験例は、実験例5と同様の実験をサンプルの濃度を変えて行ったものである。なお、ここでは標的SNPとして、VKORC1の2種類のSNP(rs9923231及びrs9934438)を使用した。
界面活性剤を含む前処理液100μlに実験例5と同一人の血液を10μl添加して前処理を行い、それぞれを水で20倍に希釈したもの(これを「基本サンプル」と呼ぶ)、及びこれを更に、2倍、10倍、40倍に希釈したものをサンプルとした。
反応液の調製及びインベーダープラス反応は実験例5に準じて行った。但し、上記2つの標的SNPの領域を増幅するためのプライマー、及びこれらを検出するためのシグナルプローブ、及びインベーダーオリゴとしては、それぞれ実験例3、5に記載のものを使用した。
本実験例は、本発明に係るDNA定量方法の効果を検証するために行ったものである。
標的DNAとしてコリエル研究所のDNAパネルのうちPD22を使用し、該DNAの濃度が3000pg/μl、600pg/μl、125pg/μl、25pg/μlとなるよう調製した4種類のDNA溶液を本実験例におけるサンプルとして使用した。
反応液の組成は実験例2に準じるが、プライマー、ポリメラーゼ、及びdNTPは含まないものとした。
Alu配列(配列13): GGCCGGGTGCGGTGGCTCACGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCCGAGGCGGGCGGATCACGAGGTCAAGAGATCGAGACCATCCCGGCTAAAACGGTGAAACCCCGTCTCTACTAAAAATACAAAAAAATTAGCCGGGCGTAGTGGCGGGCGCCTGTAGTCCCAGCTACTTGGGAGGCTGAGGCAGGAGAATGGCGTGAACCCGGGAGGCGGAGCTTGCAGTGAGCCGAGATCCCGCCACTGCACTCCAGCCTGGGCGACAGAGCGAGACTCCGTCTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGAAAAAAAA
の中からランダムに選択した下記の2つの部位(Alu1、Alu2)を使用した。
Alu1(配列14):GGCCGGGCGCGGTGGCTCACGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCCGAGGCGGGCGGA
Alu2(配列15):GCCTGTAGTCCCAGCTACTTGGGAGGCTGAGGCAGGAGAATGGCGTG
配列16:Flap-CGCGCCGAGGATCCCAGCACTTTGG
配列17:GGTGGCTCACGCCTGTAA
また、前記のAlu 2を検出するためのシグナルプローブ、インベーダーオリゴは、それぞれ前記プログラムにて設計した以下の配列18、19のものを合成して使用した。
配列18:Flap-CGCGCCGAGGGGCTGAGGCAGGA
配列19:TGTAGTCCCAGCTACTTGGGAG
なお、FRETプローブは、FAM標識されたものを使用し、Alu1の検出とAlu2の検出はそれぞれ異なる反応容器で行った。
マイクロプレートの各ウェルに上記の反応液とサンプル0.1μlを加えて全量2.5μlの混合液とし、実験例2と同様の温度条件で処理し、インベーダー反応の開始時点から10秒おきにFAMシグナルを測定した。なお、ここではインベーダープラス反応の温度条件で処理をおこなっているが、本例の反応液中にはPCR用の試薬類は含まれていないため、実際には、PCR反応は起こらずにインベーダー反応のみが進行する。
本実験例は、実験例7と同様の実験をサンプルのDNA濃度をより細かく設定して行ったものである。
11…標的DNA由来のPCR産物
21a、21b…シグナルプローブ
22a、22b…フラップ断片
31a、31b…インベーダーオリゴ
41a、41b…フレットプローブ
51、52…プライマー
F…蛍光物質
Q…消光剤
配列2:合成オリゴヌクレオチド
配列3:PCRプライマー
配列4:PCRプライマー
配列5:PCRプライマー
配列6:PCRプライマー
配列7:PCRプライマー
配列8:PCRプライマー
配列9:PCRプライマー
配列10:PCRプライマー
配列11:PCRプライマー
配列12:PCRプライマー
配列16:インベーダー反応用のシグナルプローブ
配列17:インベーダー反応用のインベーダーオリゴ
配列18:インベーダー反応用のシグナルプローブ
配列19:インベーダー反応用のインベーダーオリゴ
Claims (6)
- a) 標的DNAを含むサンプルと、インベーダー反応によって前記標的DNA上の所定の反復配列を特異的に検出するためのインベーダー反応液と、を含む混合液を調製する調製工程と、
b) 前記混合液の温度を制御することによりインベーダー反応を行う反応工程と、
c) 前記インベーダー反応による、前記所定の反復配列の検出結果に基づいて前記混合液中における標的DNA量を推定するDNA量推定工程と、
を有することを特徴とするDNA定量方法。 - 前記所定の反復配列がSINE(short interspersed nuclear element)であることを特徴とする請求項1に記載のDNA定量方法。
- 前記SINEがAluファミリーの配列であることを特徴とする請求項2に記載のDNA定量方法。
- 前記DNA量推定工程が、前記インベーダー反応における所定の反復配列の検出信号に基づいて、所定時点における信号強度、又は信号強度の上昇速度から前記標的DNA量を推定するものであることを特徴とする請求項1〜3のいずれかに記載のDNA定量方法。
- 標的DNAを含むサンプルを複数の反応容器に分注し、一部の反応容器においてインベーダープラス法による該標的DNAの遺伝子解析を行うと共に、他の反応容器において請求項1〜4のいずれかに記載のDNA定量方法による標的DNAの定量を行い、該定量結果に基づいて前記遺伝子解析の信頼性を評価することを特徴とする遺伝子解析方法。
- 前記一部の反応容器と前記他の反応容器とを同時に温度制御することにより、前記一部の反応容器においてPCR反応及びインベーダー反応を行うと共に前記他の反応容器においてインベーダー反応を行うことを特徴とする請求項5に記載の遺伝子解析方法。
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