KR101536039B1 - 역전사 및 증폭반응에서 핵산 오염을 제거하는 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 역전사 반응 및 핫 스타트 PCR로부터 핵산 오염을 제거하는 방법을 제공하는 것으로서, 상기 핫 스타트 PCR은 배리어 핫 스타트 PCR 셋업이고 및/또는 핫 스타트 DNA 폴리머라제를 포함하며, 상기 방법은 약 50℃의 온도에서 5분간 가열함으로써 실질적으로 비가역적으로 불활성화되며 및 실질적으로 이중쇄 DNA에 특이적인 DNase를 사용하는 것을 포함한다. 본 발명은 또한 약 50℃의 온도에서 5분간 가열함으로써 실질적으로 비가역적으로 불활성화되며 실질적으로 이중쇄 DNA에 특이적인 DNase, 상기 DNase를 암호화하는 핵산, 및 상기 DNase 또는 상기 핵산을 포함하는 키트 또는 조성물을 제공한다.

Description

역전사 및 증폭반응에서 핵산 오염을 제거하는 방법{A method of removing nucleic acid contamination in reverse transcription and amplification reactions}
본 발명은 DNase를 사용하여 역전사 반응 혼합물, 핫-스타트 DNA 폴리머라제 제조물, 및 PCR 반응 혼합물로부터 오염 DNA를 제거하는 것에 관한 것이다. 본 발명은 또한 DNase 사용하여, 핵산 증폭반응, 특히 타겟 서열의 역전사, 핫 스타트 DNA 폴리머라제 및/또는 배리어 핫 스타트 PCR 셋업을 포함하는 증폭반응에서 위양성 (false-positive) 결과를 방지하는 것에 관한 것이다. 본 발명은 또한 그러한 방법에 사용하기 적절한 극이열성 (extremely thermolabile) DNase에 관한 것이다.
폴리머라제 사슬 반응 (PCR)과 같은 핵산 증폭 기술은 생명공학기술에서 사용할 수 있는 가장 강력한 도구의 하나로서, 소량의 핵산만을 포함하는 샘플로부터 표적 서열을 많은 수로 복제할 수 있게 한다. PCR의 경우, 이중 본쇄 표적 서열의 각 본쇄에 상보적인 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 상기 표적 서열 및 자유 뉴클레오타이드를 함유하는 반응 혼합물에 첨가한다. DNA 폴리머라제 존재하에서 열적 순환반복 (cycling)은 상기 프라이머들 사이의 서열이 증폭되는 결과를 낳는다. PCR 과정에 의해 생성된 증폭된 단편물들의 후속 PCR 사이클에 대한 주형으로서 작용하는 능력으로 인하여 상기 표적 서열의 상당한 양을 빠르게 생성할 수 있게 된다. 상기 표적 서열이 한 가닥만 있어도 예를 들어, 표지된 프로브와의 혼성화 (hybridization) 또는 32P 표지된 데옥시뉴클레오타이드 트리포스페이트를 증폭된 조각에 혼입함에 의해 검출할 수 있는 충분한 핵산을 산출할 수 있다.
PCR 처럼, 리가제 사슬 반응 (LCR)로도 알려져 있는 리가제 증폭반응 (LAR)은 반복적인 사이클과 교호적인 온도를 사용하여 표적 서열의 복제수를 기하급수적으로 증가시킨다. 이 방법에 있어서, DNA 리가제는 표적 DNA 본쇄 중 하나의 인접 부위에 상보적인 두 개의 올리고뉴클레오타이드를 접합하는 것을 촉매한다. 나머지 본쇄에 상보적인 두 개의 다른 올리고뉴클레오타이드들 또한 결찰될 수 있다. 변성후, 원래의 주형 본쇄들 및 두 개의 결찰된 쌍은 추가의 혼성화 및 결찰에 대한 주형으로서 작용할 수 있다.
나선 치환 (Strand displacement) 증폭 (SDA)은 DNA 이중나선에서의 DNA의 끊어진 단일 나선을 새롭게 합성된 나선으로 치환하는 DNA 적출 DNA 수선에 참여하는 효소들의 특성을 이용한다. 끊어진 단일 나선을 반복적으로 생성하기 위해, 그의 인식 부위의 하나의 나선 상에 있는 DNA를, 다른 나선이 헤미포스포로티올화되어 있을 때, 끊기만 하는 엔도뉴클레아제 제한효소, 예를 들어, HindI 또는 BsoBI를 사용한다. 이러한 방법에 사용된 프라이머들은 적절한 인식 부위를 함유하고 있고 dATPαS가 이러한 중합화 반응에 사용된다.
3SR (SeIf-Sustaining Sequence Replication)로도 공지되어 있는 핵산 서열에 기반한 증폭 (NASBA)은 본질적으로 천연 레트로바이러스성 전사의 시험관 내 버전이다. 3SR은 RNA 주형으로부터 반복적인 역전사를 하여 cDNA 주형을 형성하는 것을 포함한다. 상기 cDNA 주형으로부터, RNA 폴리머라제는 상응하는 RNA를 생성한다.
루프 매개 등온 증폭법(LAMP; Notomi, T., 등., Nuc. Acid Res. 2000 VoI 28 (12) e63)은 자동사이클링 나선 치환 DNA 합성의 원리에 기반하고 있다. 고도의 나선 치환 활성을 가진 DNA 폴리머라제 (예를 들어, Bst DNA 폴리머라제 대 단편물)를 특이적으로 계획된 프라이머들과 사용한다. 이러한 방법은 나선 용융없이 새로운 표적 서열을 밝히기 위한 나선 분리를 포함한다 (그래서 이러한 방법은 등온적이라고 한다).
역전사법은 단일쇄 RNA (ssRNA) 주형이 상보적인 단일쇄 DNA로 전사되는 방법이다. 상기 단일쇄 DNA는 이중나선 DNA (dsDNA)를 형성하는데 사용된다. 특정 효소들은 첫번 DNA 나선을 생성하며 두번째 나선을 합성하여 dsDNA를 형성할 수 있고 다른 것들은 상기 두 단계중 하나에 대해서만 특이성이 있다. 상기 ssDNA 및 dsDNA를 다양한 분자생물 분야에 적용할 수 있다. 예를 들어, 프로브 기반 검출분석법 (예, 서던 블랏팅), 시퀀싱 실험 또는 클로닝 프로토콜에 직접 사용될 수 있다. 매우 빈번하게, 상기 cDNA는 PCR, LCR, SDA, LAMP 또는 3SR과 같은 증폭반응에서 더 증폭되어 예를 들어, 상기 실험용의 더 많은 물질을 재공하거나 원래 샘플에 존재하는 RNA 주형의 양을 정량할 수 있게 된다.
역전사 연계 증폭반응들은 "일단계" 또는 "이단계" 과정일 수 있다. 일단계 방법에서, 역전사 반응 및 핵산 증폭반응의 성분들은 단일 반응 용기에 존재하며 일반적으로 초기 반응 조건은 상기 역전사 반응이 끝까지 진행되도록 선택하고 난 후 다음 반응조건을 핵산 증폭반응이 수행되기에 적절한 조건으로 전환시킨다.
이단계 방법에서, 먼저 역전사 반응의 성분들을 혼합하고 역전사 반응을 수행한다. 상기 역전사 생성물을 증폭반응의 성분들과 혼합하고 증폭반응을 행한다. "한 개 튜브"이단계 방법에서, 증폭반응 성분들을 역전사 반응이 수행된 동일한 반응 용기에 첨가한다. "두 개 튜브"이단계 방법에서, 증폭반응은 새로운 반응용기에서 수행된다.
일 또는 이단계 방법에서 역전사는 임의의 PCA, LAMP, LCR, SDA 또는 BSR과 조합될 수 있다. SDA의 경우, 열안정 나선 치환효소 및 열안정 제한효소 (예, BsoB1 )가 선택된다.
표적서열의 작은 양을 증폭하는 이러한 증폭 기술의 능력으로 인해, RNA 표적 서열의 경우(예, 역전사 후 또는 역전사를 사용하는 증폭반응) 게놈성 DNA에 의한, 및 이전의 증폭반응으로부터 얻은 DNA 서열에 있는 표적 서열에 의한 오염에 매우 취약하게 하고, 이들 둘 다는 시약 (예, 폴리머라제, 프라이머, 반응 완충액 등), 피펫팅 장치, 실험실 장치 표면, 장갑 및 분무주입화로 수행된다. 에어로졸은 엎질러지는 중에서처럼 같은 용액이 교란되거나 뚜껑을 열었을 때, 에어로졸화될 수 있는 플라스틱 튜브 뚜껑의 내부표면 상에 있는 잔류물과 같은 소량의 물질이 교란됨으로써 발생된다. 상기 샘플 핵산이 의학 진단 또는 검시 원인으로 조사될 때, 표적 서열을 포함할 수 있는 핵산의 반응 혼합물로 우연히 도입됨으로써 야기되는 위양성 결과의 영향은 광범위하다.
정량적 PCR 기술이 20개 미만의 DNA 서열 복제물을 정량할 수 있는 능력이 있기 때문에, 이 기술은 핵산 오염의 유해한 효과에 대한 특별한 감수성을 가진 증폭반응이다. 따라서, 가장 작은 수준의 핵산 오염일지라도 qPCR 기술에서는 오류적 결과를 나타낸다. 또한, 이러한 방법들은 불가피한 배경 신호를 넘어 증폭된 표적 핵산으로부터 신호를 검출하는 것을 요구한다. 오염 핵산은 이러한 배경 신호에 기여할 수 있고 따라서 상기 기술의 민감도를 감소시킨다. 그러한 것으로서, 오염 핵산을 최소화하는 것은 정량적 PCR 실험의 민감도를 최대화시킨다. 적은 복제수의 표적 핵산들이 검출되는 실험, 예를 들어, 정량적 PCR-기반 병원균 진단 및 병원균 적재량 정량화 실험에서, 정량적 PCR의 민감도를 최대로 하고 위양성 결과를 최소로 하는 것이 가장 중요하다. 고도로 보존된 세균 DNA의 분절체(segment)(예 16SrRNA 또는 23SrRNA 유전자)가 qPCR 기술로 표적되는 세균 동정 및 진단의 분야에서, DNA 폴리머라제 제조로부터 일어나는 핵산 오염 (이것은 일반적으로 세균 및 세균 발현 시스템으로부터 얻어진다)은 주요한 문제이다. 그러므로 DNA 폴리머라제 제조물로부터 세균성 핵산 오염물을 효과적으로 제거하는 방법이 필요하다. 특별히 구하는 것은 하부 증폭반응에 대한 유해한 충격을 가지지 아니하고 또한 폴리머라제를 손상시키지 않고 이를 얻어내는 것이다.
이첩(carry-over)의 효과를 방지하거나 제한하는 여러 기술들이 개발되었다. PCR의 경우, 이러한 것들은 PCR을 시작하는 데 사용되는 두 개 프라이머들의 어닐링 영역 내의 표적 서열에 어닐하는 프라이머들인 네스티드 프라이머들을 포함한다 (K.B. Mullis 등, Cold Spring Harbour Symposia Vol. Ll, pp 263-273, 1986). 네스티드 프라이머들의 더 짧은 PCR 증폭 산물은 출발 프라이머들과 어닐할 수 없고 그래서 이것은 이첩되는 그러한 산물이라면, 상기 출발 프라이머의 사용은 이러한 이첩물을 증폭하지 않을 것이다. 그러나, 상기 이첩물은 제거되지 않았고 동일한 네스티드 프라이머들이 후속 PCR에서 사용된다면, 네스티드 프라이머들의 이전 증폭된 산물들이 증폭될 것이다.
데옥시티미딘 트리포스페이트 (dTTP)대신에 뉴클레오타이드 데옥시우리딘 트리포스페이트 (dUTP)를 역전사된/증폭된 핵산서열로 도입하는 것을 포함하는 방법들이 개발되었다. 데옥시우리딘 (dU)은 통상 천연 DNA에서는 발견되지 않기 때문에, 이러한 염기는 새로운 표적 서열을 이전에 생성된 증폭물과 구별하게 한다. 추가의 역전사/증폭반응 실행전에, 증폭반응 혼합물을 우라실 염기를 제거하는 우라실 DNA 글리코실라제 (UNG) 효소로 처리하여, 당-포스포디에스테르 백본을 온전히 남기고 단일 나선 (ss) 및 이중 나선 (ds) DNA에 무염기 부위를 생성할 수 있다 (미국 특허번호 5,418,149). 상기 증폭반응 혼합물의 온도를 증가시켜 무염기 부위에서 DNA를 절단하여 이첩물의 분해를 야기한다.
역전사/증폭 산물에 dUTP 도입이, 예를 들어, 제한효소 절단 또는 PCR에 의한 상기 산물의 후속 분석을 방해하기 때문에 (중합화 효율은 감소될 수 있고 교정 폴리머라제들은 배제된다), 이 방법 역시 문제가 없는 것이 아니다. 또한, UNG는 불가역적으로 불활성화되어야 되며, 그렇지 않으면, 후속 역전사/PCR 반응의 산물들이 분해될 것이다. 온도상승은 UNG 효소를 불활성화하는 통상적인 기작이지만, 오늘날 상업적으로 이용가능한 많은 UNG 효소들은 PCR 반응의 온도로 노출된 후라도 성공적으로 불활성화되지 않는다. 잔류 UNG 활성의 충격을 최소화하고자, 증폭반응에 사용된 온도 단계는 54℃를 넘어야 되고 반응 용기는 고온에서 보관하거나 즉시 냉동시켜서, 우라실을 또한 포함할 것인 새롭게 생성된 증폭물이 분해되는 것을 방지해야 한다. 최근에, 대구로부터 얻은 UNG가 50℃에서 10분간 처리될 때 완벽하게 불가역적으로 불활성화된다는 것이 밝혀졌고 이것으로 인해 UNG 기반 방법이 더욱 광범위하게 적용될 수 있다.
그러나, 임의의 UNG 시스템에 대한 다른 한계는 게놈 DNA가 우라실 변형을 가지지 않기 때문에 게놈 DNA를 오염시키는 반응 혼합물을 제거할 수 없다는 것이다. 따라서, UNG 시스템은 역전사 반응물의 게놈 DNA 오염을 다룰 수 없다.
개별 PCR 반응 혼합물들을 표적 DNA 및 Taq DNA 폴리머라제를 첨가하기전에, 표적서열의 내부에서 절단하는 DNaseI 또는 제한 엔도뉴클레아제로 처리하여 오염 DNA의 증폭을 방지하는 것이 또한 제안되었다 (Furrer 등, Nature. Vol. 346, 페이지 324, 1990). 유사하게, 역전사 반응 혼합물을 역전사 효소 첨가 전에 이러한 방식으로 처리할 수 있다. 이러한 방법은 30 분의 탈오염 시간을 요하며, 탈오염 후에 DNaseI 또는 제한 엔도뉴클레아제를 불활성화시키기 위해, 그 반응 혼합물을 끓이게 된다. 이러한 비등 단계로 인해, DNA 폴리머라제 또는 또는 역전사효소를 탈오염 후에 첨가하는 것이 필요하다. 물론, 이것은 예비-증폭/예비-역전사 혼합물로 이첩물이 도입되는 다른 위험을 가지며, DNA 폴리머라제 자체의 탈오염을 배제시킨다. 이 방법에서는 단일 나선 DNA에 대한 DNaseI 활성 때문에, 1 μM의 프라이머 농도를 사용하여야 한다.
더욱 이열성 (thermolabile)인 DNase들이 설명되어 있다. WO99/007887는 판달루스 보레알리스에서 분리한, 2 분간 94℃로 가열하면 실질적으로 비가역적 불활성화되는 DNase를 나타낸다. 이 효소는 또한 15 분간 65℃에서 가열하면 실질적으로 비가역적으로 불활성화된다. 아니시모바 (Anisimova)등은 (Biotechnology Letters; 2009, 31 : 251 내지 257) 실제 불활성화 첨가제 DTT (1, 4 디티오트레이톨) 및 EDTA를 사용한다면 55℃와 같은 낮은 온도에서 10분간 가열하면 불활성화될 수 있지만, 65℃에서 10분간 가열후에 불활성화되는 왕게 DNase (캄차카 게, 파라리토데스 캄차티쿠스(파랄리소데스 캄차카티쿠스))의 무작위적으로 변이된 종을 설명하고 있다.
EDTA는 금속 이온 킬레이트제이고 그래서 금속 이온 농도에 민감한 효소의 활동을 방해할 수 있다. 아니시모바는 왕게 DNase의 활성이 Mg2+ 이온에 의해 양성적으로 영향을 받고 따라서 EDTA는 이러한 활성화제를 격리시킴으로써 그의 불활성화에 기여한다고 서술하고 있다. DNA 폴리머라제들은 또한 금속 이온 농도에 매우 민감하고, 특히 폴리머라제 반응 혼합물의 Mg2+ 함유량은 조심스럽게 관리되어야 한다. 그 결과, DNase 불활성화 단계에서 EDTA의 사용은 하부 폴리머라제 반응들의 활성을 직접적으로 저해시키는 능력을 가진다. 따라서, 폴리머라제 반응에 선행하는 단계에서 (예. 역전사, PCR, SDA, 3SR) EDTA를 사용하지 않는 것이 바람직하다.
아니시모바에 의해 제공되는 변이 왕게 DNase는 65℃이하의 온도에서 불활성화가 일어나도록 하기 위해 EDTA를 요구함에 따라, 이러한 DNase는 역전사 반응 (약 50℃에서 전형적으로 수행되는)에 선행하는 DNA 오염물 제거 단계에서 사용하기에 적절하지 않다. 이러한 효소가 하부 단계의 EDTA 저해 위험없이 사용되기 위해서는, 그 혼합물이 65℃ 이상으로 가열되어야 되는 불활성화 단계가 있어야 한다. 이것은 전형적인 역전사 반응 온도 이상이기 때문에, 이 단계는 역전사 단계와 분리되고 추가되는 것이다. 이것은 이 과정에 추가의 단계를 더하게 되고, 그래서 복잡성과 노동 집약도를 높이게 되며 또한 그러한 과정이 여러번 반복될 수 도 있는 분자생물학의 분야에서, 에너지 비용 및 장비 사용 시간의 관점에서 심각한 약점을 또한 나타낸다. 더구나, 상기 역전사 효소가 DNase 처리 및 불활성화 후에 첨가되지 않는다면, 그 DNase는 역전사 단계 동안 활성적으로 있을 것이고 따라서 cDNA 산물이 분해되는 위험이 있다. 역전사 효소를 나중에 반응 혼합물에 첨가하게 되는 것은 오염이 발생하는 기회 및 전체적으로 비용관계가 연계된 복잡함을 야기할 수 있다.
본 발명자들은 역전사 단계의 온도에서 실질적으로 불가역적으로 불활성화될 수 있고 및 이중 나선 DNA에 실질적으로 특이적인 DNase가 고도로 효과적이고 효율적인 방법을 제시할 수 있다는 것을 실현하였다. 그러나, 이러한 특성을 가진 현재 이용가능한 DNase가 없다. 그러한 DNase 역전사 반응 직전에 역전사 반응 혼합물(예, RNA 분자의 역전사가 일어나는 데 필요한 모든 기초 성분을 가지는 반응 혼합물)을 탈오염화하는 데 사용될 수 있고, 역전사 반응 개시때 (즉, 반응 혼합물의 온도를 선택된 역전사 효소의 작동 온도, 예, 50℃ 이상으로 올릴 때), DNase는 역전사 반응의 과정에 걸쳐 실질적으로 가역적으로 불활성화된다 (불활성화의 대부분은 이상적으로는 상기 반응의 처음 몇 분 간에 걸쳐 발생한다). 불활성화의 시간 과정은 새롭게 형성된 cDNA가 DNase에 의해 분해되지 않을 것이라는 것을 의미하기 때문에 중요하다. 더 높은 불활성화 온도를 가지는 DNase와는 달리, 그러한 DNase는 별도의 불활성화 단계 및/또는 역전사효소의 나중 첨가를 요하지 않는다.
본 발명자들은 이러한 독특한 특성을 가진 효소를 생성하였다. 모든 DNase들에서와 같이, 본 발명의 극이열성 DNase는 당 인산염 핵산 백본의 포스포디에스테르 연결을 절단함으로써 DNA를 분해한다.
따라서, 본 발명에 따라서, 약 50℃의 온도에서 5 분간 가열함으로써 실질적으로 가역적으로 불활성화되며 이중 나선 DNA에 실질적으로 특이적인 DNase의 사용을 포함하는, 역전사 반응물에서 핵산 오염을 제거하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 이러한 불활성화 특성이 EDTA 부재하에서 얻어진다.
본 발명의 DNase는 역전사 반응 혼합물에 존재하거나 또는 이의 개별 성분에 존재하는 오염 이중 나선을 분해하는 데 사용되며, 이로 인해 역전사 산물 (이 역전사 산물이 사용되어 증폭됨으로써 위양성 결과를 제시할 수 있다)에 있는 오염 DNA가 감소되거나 회피될 수 있고 비특이적 역전사가 또한 감소되거나 회피될 수 있다.
특히, 본 방법은 역전사 반응 혼합물 또는 이의 개별 성분을 본 발명의 DNase와, 그 속의 임의의 이중 나선 DNA를 절단하도록 허용하는 조건하에서 접촉하는 단계 및 상기 반응 혼합물 또는 이의 개별 성분을 가열하여 상기 DNase를 불활성화시키는 단계를 포함한다.
바람직하게는, 상기 반응 혼합물은 완전 반응 혼합물이고 (예, DNA 프라이머들을 포함), 바람직하게는 상기 완전 반응 혼합물은 그 속에 포함된 역전사 효소의 작동 온도에 상응하는 온도로 가열된다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 역전사 반응 후에 핵산 증폭반응 (예, PCR, LCR, SDA1 3SR1 LAMP)을 실시한다. 바람직하게는, PCR, LCR 또는 LAMP이 상기 역전사 반응 후에 실시된다. 가장 바람직한 구체예에서, 상기 증폭반응은 PCR이다.
본 발명의 다른 구현예에서, 상기 역전사 반응 및 상기 증폭반응은 일 단계 과정으로서 수행된다. 즉, 반응 용기는 상기 역전사 반응 및 상기 증폭반응용 성분들 모두를 동시에 가지고 있다. 그러나, 이 단계 과정 또한 사용될 수 있다. 그러한 구체예에서, 상기 반응물 및 부분적 반응 혼합물의 다양한 성분들은 개별적으로 본 발명의 DNase로 처리될 수 있다.
다른 관점에서, 본 발명은 약 50℃의 온도에서 5 분간 가열함으로써 실질적으로 불활성화되고 및 이중 나선 DNA에 실질적으로 특이적인 DNase를 역전사 반응으로부터, 바람직하게는 역전사 반응 이후로 핵산 증폭반응이 수행되는, 예를 들어, 역전사 - PCR로부터 핵산 오염을 제거하는 데 사용하는 용도를 제공한다. 바람직하게는, 상기 DNase의 이러한 불활성화 특성은 EDTA의 부재에서 이루어진다.
전술한 바와 같이, 본 발명은 게놈 DNA로 오염 및 이첩을 방지하고 제한하는 데, 및 특히, 이첩물 및/또는 게놈 DNA에 의한 오염으로 인한 위양성 결과를 방지하고 감소시키는 데 특히 유용하다.
다른 관점에서, 본 발명은 또한 역전사 반응물에서 게놈 DNA 오염 및/또는 이첩물로 인한 위양성 결과를 방지하거나 감소시키는 방법에 있어서, 약 50℃의 온도에서 5 분간 가열함으로써 실질적으로 불활성화되고 이중 나선 DNA에 실질적으로 특이적인 DNase을 사용하여 상기 역전사 효소 반응 혼합물 또는 이의 개별 성분에 존재하는 오염 게놈 DNA 및/또는 이첩된 이중 나선 DNA를 분해하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 바람직하게는 상기 DNase의 이러한 불활성화 특성은 EDTA 부재에서 얻어진다.
본 발명의 DNase는 또한 모든 증폭반응에서 이첩물을 제거하거나 감소시키는 데 사용하기 적합하다. 이것은 DNase의 불활성화 온도가 낮을수록 증폭 과정 동안 이것을 불활성화시키는 것이 더 쉽고 및 불활성화 단계에서 사용되는 임의의 주어진 온도, 즉 편리하게는, dsDNA 증폭 프로토콜에 따라서는 DNA 변성 단계 (즉 94℃에서 5 분간)일 수 있는 것에서 성취될 수 있는 불활성화 정도가 더 크기 때문이다.
또한 본 발명은 본 발명의 DNase의 사용을 포함하는, 핵산 증폭반응에서 핵산 오염을 제거하는 방법을 제공한다.
본 발명의 DNase는, 상기 증폭반응 혼합물 또는 이의 개별 성분에 존재하는 미표적 이중 나선 DNA를 분해하는 데 사용되며, 이로 인해 비특이적 증폭이 감소되거나 회피될 수 있다.
특히, 상기 방법은 증폭반응 혼합물 또는 이의 개별 성분을 본 발명의 DNase와, 그 속에 포함된 임의의 이중나선 DNA의 절단을 허용하는 조건 하에서 접촉시키는 단계; 상기 반응 혼합물, 또는 이의 개별 성분을 가열하여 상기 DNase를 불활성화시키는 단계 및 이후 상기 혼합물 또는 이의 개별 성분들을 증폭될 표적 핵산과 접촉시키는 단계를 포함한다.
대안적인 관점에서, 본 발명은 증폭반응 혼합물로부터 핵산 오염을 제거하는 데 본 발명의 DNase를 사용하는 용도를 제공한다.
전술한 바와 같이, 본 발명은 핵산 증폭반응에서 이첩을 방지하고 제한하는 데, 및 특히, 이첩물로 인한 위양성 결과를 방지하고 감소시키는 데 특히 유용하다.
다른 관점에서, 본 발명은 또한 핵산 증폭반응에서 이첩물로 인한 위양성 결괄를 방지하거나 감소시키는 방법에 있어서, 본 발명의 DNase를 사용하여 상기 증폭 반응 혼합물 또는 이의 개별적 성분에 존재하는 이첩된 비표적 이중 나선을 분해하는 것을 포함한다.
본 발명의 DNase는 DNA 폴리머라제 제조물로부터 핵산 오염물을 제거하는 데 사용될 뿐 아니라 DNA 폴리머라제를 포함하는 증폭반응 혼합물로부터 핵산 오염물을 제거하는 데 사용될 수 있다. 본 발명의 DNase의 낮은 불활성화 온도는 탈오염화 후 상기 DNase의 불활성화가 폴리머라제에 유해한 충격을 주지 않고 또는 최소한의 충격을 주면서 성취될 수 있다는 것을 의미한다.
본 발명은 특히 소위 핫 스타트 DNA 폴리머라제로부터 핵산 오염을 제거하는 데 적합하다. 많은 핫 스타트 폴리머라제들이 개발되었다. 핫 스타트 DNA 폴리머라제 뒤에 있는 목적은 폴리머라제를 변형하여 그 효소가 DNA 폴리머라제로서 작용(프라이머 처리된 폴리뉴클레오타이드 서열을 연장시키는 능력)하는 것을 방지하기 위한 것으로, 상기 증폭반응 혼합물이 DNA 폴리머라제의 최적 촉매 온도에, 또는 프라이머 어닐링이 충분히 서열 특이적이 되어서 비특이적 증폭을 피하거나 최소화시키는 적어도 그러한 온도에 근접한 온도에 도달할 때까지이다. 이것은 더 낮은 온도에서, 프라이머들은 핵산 샘플에 비특이적으로 어닐되어서 비특이적 증폭 산물을 야기하여 오결과를 나타내고 및/또는 반응에 저해적인 효과를 부여하기 때문이다. 또한, 특정의 경우, 상기 폴리머라제 활성은 덜 정교하고 서열 에러들이 증폭 산물에서 발생할 수 있다. 이러한 증가된 특이성으로 인해, 핫 스타트 폴리머라제가 정량적 PCR에 사용하는 데 특히 적합하다.
핫 스타트 DNA 폴리머라제를 창출하는 한가지 방법은 이열기 (thermolabile group)를 폴리머라제에 부착하는 것으로, 부착되어 있는 동안에는 폴리머라제의 촉매 활동을 저해하거나 방지하지만, 폴리머라제의 최적 촉매 온도에 또는 프라이머 어닐링이 충분히 서열 특이적이 되어 비특이적 증폭을 피하거나 최소화시키는 최소한 그러한 온도에 접근한 온도에서 폴리머라제로부터 분리된다.
적절한 이열기는 폴리머라제 특이적 항체와 애피바디, 다른 특이적 폴리머라제 결합 단백질, 특이적 올리고뉴클레오타이드 앱타머, 비특이적 코팅 (예, 왁스), 및 폴리머라제의 아미노산의 공유 화학 변형물 (예, 활성부위내의 아미노산)을 포함한다. 핫 스타트 폴리머라제의 핫 스타트 활성화 온도 위에서 불활성화되는 DNase를 가진 그러한 폴리머라제의 탈오염은 핫 스타트 폴리머라제의 핫 스타트 특성이 유해하게 영향을 받을 수 있다는 것을 의미한다. 본 발명은 핫 스타트 폴리머라제의 제조물에 있는 DNA 오염물을 DNase로 제거하는 것 및 전형적인 핫 스타트 폴리머라제들의 핫 스타트 활성화 온도 아래인 온도에서 DNase의 후속적인 불활성화를 가능하게 하며, 따라서 핫 스타트 폴리머라제의 핫 스타트 특성에 유해한 충격을 피할 수 있다.
전술한 핫 스타트 폴리머라제들은 핫 스타트 PCR을 수행하는 데 단지 하나의 접근법이다. 다른 접근법들은 하나 이상의 PCR 반응 혼합물 성분들이 잔류하는 성분들과 접촉하게되는 것을 예방한다. 전형적으로, 상기 폴리머라제 또는 표적 핵산은 상기 폴리머라제의 최적 촉매 온도에 근접한 온도 또는 프라이머 어닐링이 효과적으로 서열 특이적이 되어 비특이적 증폭을 피하거나 최소화하는 최소한 그러한 온도에서 용융점을 가지는 물질 (일반적으로는 지질, 예, 왁스) 뒤로 또는 그 내부로 고립된다. 본 발명의 DNase는 따라서 이러한 소위 "배리어" 핫 스타트 PCR 셋업의 핵산 오염이 이러한 유형의 핫 스타트 PCR 상에 유해한 충격없이 제거될 수 있게 한다.
따라서, 본 발명은, 핫 스타트 PCR로부터 핵산 오염을 제거하는 방법에 있어서, 상기 반응이 배리어 핫 스타트 PCR 셋업이고 및/또는 핫 스타트 DNA 폴리머라제를 포함하며, 본 발명의 DNase의 사용을 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명의 DNase는 따라서, 핫 스타트 PCR 반응 셋업/혼합물에 존재하는 비표적 이중나선 DNA를 분해하는 데 사용된다. 이럼으로써, 비특이적 증폭이 감소되거나 회피될 수 있다.
특히, 상기 방법은 상기 핫 스타트 PCR 반응 셋업/혼합물을 본 발명의 DNase와, 그 속에 포함된 임의의 이중 나선 DNA의 절단을 허용하는 조건에서 접촉시키는 단계; 상기 반응 셋업/혼합물을 가열하여 상기 DNase를 불활성화 시키는 단계, 및 다음, 상기 증폭될 표적 핵산을 상기 반응 셋업/혼합물의 나머지 성분과 접촉하게 하는 단계를 포함한다.
다른 관점에서, 본 발명은 본 발명의 DNase를, 핫 스타트 PCR 반응물으로부터 핵산 오염을 제거하는 것에 사용하는 용도에 있어서, 상기 반응물은 배리어 핫 스타트 반응물이고 및/또는 핫 스타트 폴리머라제를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 또한 핫 스타트 PCR 반응에서 이첩물을 방지하거나 제한하는 것에서 특히 유용하며, 상기 반응은 배리어 핫 스타트 반응이고 및/또는 핫 스타트 DNA 폴리머라제를 포함하는 것을 특징으로 하며, 특히 이첩물로 인한 위양성 결과를 방지하고 감소시키는 데 유용하다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 또한 핫 스타트 PCR 반응에서 이첩물로 인한 위양성 결과를 방지하거나 감소시키는 방법에서, 상기 반응은 배리어 핫 스타트 반응이고 및/또는 핫 스타트 DNA 폴리머라제를 포함하는 것을 특징으로 하며, 상기 방법은 본 발명의 DNase를 사용하여 상기 핫 스타트 PCR 반응 셋업/혼합물에 존재하는 이첩된 비표적 이중 나선 DNA를 분해하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 핫 스타트 DNA 폴리머라제 제조물로부터 핵산 오염을 제거하는 방법으로서, 본 발명의 DNase을 사용하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다. 이 방법에서 본 발명의 DNase의 사용하는 용도가 또한 제공된다.
본 발명의 DNase는 따라서 핫 스타트 DNA 폴리머라제 제조물에 존재하는 이중 나선 DNA를 분해하는 데 사용된다. 특히, 상기 방법은 상기 핫 스타트 DNA 폴리머라제 제조물을 본 발명의 DNase와, 상기 DNA 폴리머라제 제조물에 존재하는 임의의 이중 나선 DNA의 절단을 허용하는 조건하에서 접촉시키는 단계 및 다음 상기 제조물을 가열하여 상기 DNase를 불활성화시키는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 표적 핵산의 시험관 내 증폭, 역전사 또는 핫 스타트 PCR 증폭의 방법에 있어서, 상기 핫 스타트 PCR은 배리어 핫 스타트 반응이고 및/또는 핫 스타트 DNA 폴리머라제를 포함하며, 상기 방법은 상기 반응 혼합물, 상기 반응 셋업 또는 이의 개별 성분들을 본 발명의 DNase로 실질적인 증폭 또는 역전사 반응의 개시 전에 처리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.
"역전사"는 RNA-의존성 DNA 폴리머라제가 RNA 주형에 상보적인 DNA 분자 (cDNA)의 형성을 촉매하는 과정이다. 더 상세하게는, 상기 폴리머라제는 프라임된 주형 RNA 서열에 상보적인 (예, 왓슨-크릭 염기 쌍 법칙을 따르는) 서열에서 데옥시리보뉴클레오시드 트리포스페이트의 중합을 촉매한다.
이러한 반응을 촉매하는 능력을 가진 수 많은 효소들이 확인되었고 그 예는, HIV 역전사효소, AMV 역전사효소, M-MLV 역전사효소, C therm, 폴리머라제, 및 Tth 폴리머라제를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 이러한 효소들은 일정 범위의 최적 작동 온도를 가진다. 동물 숙주에 감염하는 바이러스와 같은 유기체로부터 분리한 것들은 약 37℃의 최적 작동 온도를 가진다. 그러나 열안정성 역전사효소들이 확인되었고 또한 야생형 역전사효소들을 변이시킴으로써 생성되었으며, 실험실에서 역전사효소 반응에 일반적으로 사용되는 효소들은 이러한 열안정성 효소들이다. 그러한 스펙트럼의 끝에 있는 것이, 42 내지 60℃의 작동 범위를 가지는 AMV이고, 반면 Tth DNA 폴리머라제 및 C.therm. DNA 폴리머라제의 역전사효소 활성은 각각 55 내지 70℃ 및 60 내지70℃의 작동 범위를 가진다.
가장 기본적으로, 완전 역전사 반응 혼합물은 역전사 효소, RNA 주형, 상기 주형에 결합할 수 있고 또한 역전사효소가 그로부터 중합화를 개시하는 적절한 프라이머, dNTP들, 및 적절한 완충핵을 포함한다. 역전사효소의 작동 온도에서 상기 혼합물의 항온처리는 cDNA 생성을 결과한다. 역전사 반응 완료시, 상기 cDNA를 직접 시퀀싱 또는 유전자유형화 실험에 사용될 수 있거나 또는 클로닝 또는 검출 방법에 사용될 수 있다.
"역전사 효소"는 역전사효소 활성을 가지는 임의의 효소를 의미한다 (예, 프라이머 부착된 RNA 주형 서열에 상보적인 DNA 상대편의 중합화를 촉매하는 능력 또는 RNA 의존성 DNA 폴리머라제 활성). 이러한 활성은 상기 효소의 유일한 활성일 수 있고 또는 좀더 일반적으로는 효소 성분의 활성일 수 있다 (예, HIV 역전사효소, M-MLV 역전사효소, AMV 역전사효소, Tth DNA 폴리머라제, C. therm, 폴리머라제). 상기 폴리머라제의 전형적인 추가의 활성들은 RNaseH, DNA 지향 DNA 폴리머라제, DNA-RNA 풀림 활성, Mn2+ 의존성 엔도뉴클레아제를 포함한다. 그러나, 바람직하게는 RNaseH 및/또는 엔도뉴클레아제 활성이 최소화되거나 없어질 것이다.
"역전사 효소 제조물"은 역전사 효소를 포함하는 임의의 물질, 전형적으로는 용액, 일반적으로 수용액이다. 특히, 그것은 역전사 효소의 상업적 제조물, 즉, 실험실 효소의 상업적 공급자에 의해 공급된 역전사 효소 시약을 지칭하며, 그러한 제조물의 희석, 조절 및/또는 변형물 또한 이러한 용어에 포함된다. 상기 역전사 효소 제조물은 또한 역전사 효소를 천연적으로 발현하는 세균성 원천으로부터 얻은 역전사 효소의 제조물 및/또는 역전사 효소를 암호화하는 발현 카세트를 포함하는 역전사 효소의 제조물일 수 있다. 상기 제조물은 세균성 원천으로부터 직접적으로 얻은 시초 역전사 효소 제조물과 비견되는 정도로 정제될 수 있다.
용어 "핵산 증폭반응"은 핵산의 표적 서열의 복제수를 증가시키는 임의의 시험관내 수단을 지칭한다. 바람직하게는, "열적 순환 반복", 즉 고온 순환을 반복하는 방법을 포함한다. 증폭 방법은 PCR과 이의 변형인 3SR, SDA, LAR이나 LCR 및 LAMP 및 이의 변형을 포함하나 이에 한정되지 않는다. PCR, LAMP과 LCR 및 이들의 변형들은 열적 순환 반복 방법이다. 이러한 방법들은 표적 서열의 복제수를 선형적으로 또는 기하급수적으로 증가하는 결과를 낳는다. "변형"은, 실시간 증폭, 정량적 및 반-정량적 증폭, 경쟁 증폭 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
표적 핵산은 선택된 증폭 방법에 따라서 DNA 또는 RNA일 수 있다. 예를 들어, PCR의 경우, 비록 역전사 단계와 조합할 때는 표적이 RNA 서열인 것으로 간주될 수 있지만, 표적은 DNA이다. 3SR는 RNA 표적 서열을 직접적으로 증폭시킨다.
용어 "증폭/역전사 반응 혼합물"은 표적 핵산을 증폭/역전사하는데 사용되는 여러가지 시약을 포함하는, 임의의 용액, 일반적으로는 수용액을 지칭한다. 이것은 효소, 수성 완충액, 염 및 뉴클레오시드 삼인산염을 포함한다. 성공적인 증폭 반응을 수행하는 데 필요한 모든 성분을 포함하는 용어를 혼합물로 및 불완전하며 따라서 필요한 성분의 몇가지만 (예, 적어도 2, 3, 또는 4개)를 포함하는 용어를 혼합물로 지칭한다. "완전"이라는 용어가 접두된다면, 반응 혼합물은 역전사 및/또는 증폭에 필요한 성분 모두를 포함하는 것이다.
"핫 스타트 DNA 폴리머라제"는 프라이머가 붙은 DNA 폴리뉴클레오타이드의 검출성 중합화를 수행하는 온도를 증가시키기 위해, 전형적으로는 이열성 분자 분체를 첨가하여 변형된 DNA 폴리머라제이다. 상기 핫 스타트 DNA 폴리머라제가 검출할 수 있는 수준의 DNA 중합화를 수행하는 온도는 바람직하게는 폴리머라제의 최적 촉매 온도에 근접한다.
용어 "핫 스타트 DNA 폴리머라제 제조물"은 핫 스타트 DNA 폴리머라제를 포함하는 임의의 물질, 전형적으로는 용액, 일반적으로는 수용액을 지칭한다. 특히, 핫 스타트 DNA 폴리머라제의 상업적 제조물, 즉, 실험실 효소의 상업적 공급자로부터 공급된 핫 스타트 DNA 폴리머라제 시약을 지칭하는 것으로, 그러한 제조물의 희석, 조절 및/또는 변형물 또한 그 용어에 포함된다. 핫 스타트 DNA 폴리머라제 제조물은 폴리머라제를 천연적으로 발현하는 세균성 원천으로부터 얻어진 및/또는 폴리머라제를 암호화하는 발현 카세트를 포함하는 핫 스타트 DNA 폴리머라제의 제조물일 수 있다. 상기 제조물은 세균성 원천으로부터 직접적으로 얻은 처음 폴리머라제 제조물과 비견될 정도로 정제될 수 있다. 일반적으로, 상기 제조물은 핫 스타트 차단 분체를 폴리머라제에 적용하도록 처리될 것이다.
"핫 스타트 PCR 반응"은 프라이머가 부착된 DNA 폴리뉴클레오타이드로부터의 검출가능성 중합화가 폴리머라제의 최적 촉매 온도에 근접한 온도에서 발생하는 PCR 증폭반응이다. 검출가능한 중합화의 바람직한 온도는 핫 스타트 DNA 폴리머라제를 논의한 것과 일치되게 설정되어야 한다.
"핫 스타트 PCR 혼합물"은 핫 스타트 폴리머라제를 포함하는 상기 정의한 바와 같은 PCR 반응 혼합물이다.
"배리어 핫 스타트 PCR 셋업"은 PCR 반응 혼합물의 두 개 이상의 성분을 포함하는 것으로서, 적어도 한 개 성분이, 상기 정의한 바와 같은 검출가능한 DNA 중합화의 온도에 상응하는 융점을 가진 물질 뒤 또는 내로 다른 성분으로부터 분리되는 반응 용기이다.
바람직하게는 상기 물질은 지질, 즉 왁스이다.
"오염"은 역전사 및/또는 증폭에 대한 주형으로서 작용하는 핵산의 반응 혼합물에 존재하는 것으로서, 상기 핵산 집단의 부분이 아니면서 역전사/증폭에 표적이되는 것을 지칭한다. 상기 반응 혼합물에 사용되고 있는 프라이머들은 오염물이 아니다.
용어 "핵산 오염 제거"는 핵산 오염의 방지와 감소 둘 다를 담당하는 것으로 사용된다.
용어 "이첩물"은 반응 혼합물에 우발적으로 또는 의도되지 않게 도입된 임의의 핵산, 특히 이전의 증폭 또는 역전사 반응에 이첩된 표적 서열을 나타내는 데 사용된다.
용어 "위양성 결과"는 조사중인 핵산 샘플이 표적서열을 포함하는 것을 나타낸느 것으로 보이지만 상기 증폭 산물은 이첩물로부터 유래되었고 및/또는 역전사 기반 증폭반응의 경우, 가능하게는 게놈 DNA로부터 유래된 것을 나타내는 결과를 지칭한다. 본 발명이 제공하는 위양성 결과에서의 감소는 명백히 검시 및 진단 분야에서 특히 유익한 것이다. 본 발명의 방법은 핵산 증폭의 특이성을 증가시킨다.
용어 "DNase"는 DNA 백본에서 포스포디에스테르 결합을 가수분해하지만 뉴클레오타이드 서열 특이성은 아닌 효소를 지칭한다.
"실질적으로 불가역적 불활성화"는, 가열시, 효소가 적어도 95%, 바람직하게는 98%, 더욱 바람직하게는 100% 불활성화되는 것을 의미한다. 불활성화 백분율은 DNA 샘플 (예, 500bp PCR 산물)을 불활성화된 DNase 또는 비불활성화된 DNase 적절한 완충액(예, Tris, HEPES, PBS)에서 3 시간 동안 37℃에서 처리하고; 반응 산물을 에티디움 브로마이드 아가로즈 겔에서 전기영동으로 분리하고 UV광 하에서 DNA 밴드의 상대적인 형광 세기를 측정함으로써 측정될 수 있다 (실시예 2).
불활성화된 및 비불활성화된 DNase의 상대적인 활성을 측정하는 다른 방법이 숙련자에 의해 고안될 수 있다. 예를 들어, SYBR 그린 함유DNA 샘플들의 형광의 상대적인 변화를 사용할 수 있다. 다른 방법은 쿤니츠 검정법 (Kunitz, M; 1950, S. Gen Physiol, 33:363 및 실시예 1)이고 변형된 쿤니츠 검정법이 야마모토에 의해 고안되었다 (Yamamoto, M; 1971, Biochim Biophys Acta, 228:95 및 실시예 4).
반응 혼합물의 온도가 실온으로 되돌아갈 때라도, DNase는 그것의 활성을 다시 얻지 않고, 실질적으로 잔류 활성이 없다; 특히, 5% 미만, 바람직하게는 2% 미만, 가장 바람직하게는 어떤 검출가능한 DNase 활성도 남아있지 않다.
실질적으로 비가역 불활성화는 바람직하게는 50℃ 또는 그 주위의 온도, 즉 48 내지 52℃에서 처리시 5 분 이내에 발생한다. 예를 들어, 50℃에서 처리시 1, 2 또는 3 분 내에 발생한다. 본 발명의 DNase는 더 낮은 온도에서 또는 더 짧은 기간 동안 실질적으로 비가역적으로 불활성화될 수 있지만, 본 발명에 따라서, 5 분간 약 50℃에서 가열하는 것이 상기 효소의 실질적 비가역적 불활성화에 유효적이다. 이러한 두 가지 매개 변수중 한가지에 대한 조절은 다른 것을 조절함으로써 보상될 수 있다는 것은 숙련자에게는 명백하다. 예를 들어, 불활성화 온도를 높이면 처리 기간을 감소시킬 수 있다. 역으로, 처리 기간을 늘리면 더 낮은 불활성화 온도가 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 DNase는 55℃에서 1 또는 2분 처리로, 52℃에서 3분 처리로, 51℃에서 4분 처리로, 49℃에서 10분 처리로, 또는 48℃에서 1015분 처리로 불활성화될 수 있다. 물론, 숙련자에게 명백하고 실시예에서 나타난 바와 같이, 본 발명의 DNase가 본 발명의 방법에 사용될 때, 실제적으로 5 분보다 긴 처리 기간이 사용될 수 있고 약 50℃보다 높은 불활성화 온도가 사용될 수 있다 (예, 불활성화는 50℃, 55℃, 65℃ 또는 94℃의 각 온도에서 15, 30 또는 60 분; 60℃에서 15 분; 또는 95℃에서10 분 처리시 발생할 수 있다). 그러나, 본 발명에 따라서, 50℃ 또는 그 주위에서 5 분간 처리된다면, DNase는 실질적 불활성화를 나타내게 될 것이다.
DNase에 대한 불활성화 온도와 시간은 일반적인 PCR 또는 역전사효소 완충액 (예, 25mM Tris/HCl, pH 8.5, 5mM MgCl2)을 모사한 용액에서 DNase를 항온처리함으로써 산정될 수 있다. EDTA은 바람직하게는 없어야 한다. DNase는 약 0.01 U/μl 내지 10 U/μl, 바람직하게는 0.05 내지 5 U/μl, 예를 들어 0.5 및 1.5 U/μl 농도로 존재하여야 한다.
임의의 주어진 온도에서 불활성화는 불활성화 완충액에서 디설파이드 결합 환원제 (예, 단백질에서 두 개 이상의 시스테인 잔기 사이의 디설파이드 결합을 저해하고 및/또는 방해하는 제제)의 존재로 인하여 정도 및/또는 속도 면에서 향상될 수 있다. 그러한 제제의 예는, DTT, 2-머캅토에탄올, 2-머캅토에틸아민 HCl, TCEP HCl (트리스(2-카르보에틸)포스파인 염산염), N-에틸말레이디드를 포함하나 이에 한정되지 않는다. DTT가 바람직하다. 대안적으로, 상기 디설파이드 결합 환원제 (예, DTT)를 사용하여 불활성화 단계의 특정 기간 동안에 요구되는 불활성화 온도를 감소시킬 수 있다. 숙련자는 그의 필요에 따라, 불활성화를 향상시키지만 그 하류 반응에 위해가 되지 않는 디설파이드 결합 환원제의 적절한 농도를 결정할 수 있을 것이다. 예를 들어, DTT는 0.05 내지 50 mM의 농도에서 불활성화 단계에 사용될 수 있다. DTT는 역전사 반응에서 1 내지 10 mM농도로 보통 사용되면 때때로 PCR 반응에서 사용된다.
바람직하게는, 본 발명의 방법에서 DNase의 불활성화는 0.1 내지 10mM, 바람직하게는 0.5 내지 5mM 및 가장 바람직하게는 1 내지 2mM의 DTT 농도에서 일어난다. 불활성화 온도의 표준 평가에서, 25 mM Tris/HCl, pH 8.5, 5mM MgCl2 및 1 mM DTT을 함유한 완충액이 바람직하게 사용된다.
선형 이중 나선 DNA 및 초나선 원형 DNA는 둘 다 본 발명에 따른 효소의 주형이다. 이 효소는 증폭/역전사효소 프라이머와 같은 단일쇄 DNA에 대하여, 적은, 무시할만한, 또는 기본적으로 검출되지 않는 활성을 가진다. 환언하면, DNase는 이중본쇄 DNA에 대해서는 실절적으로 특이적이다.
"이중쇄 DNA에 대해 실질적으로 특이적"은 DNase가 이중쇄 DNA를 절단하나, 0.01 내지 0.05 U/μl의 농도에서 단일쇄 DNA에 대한 활성은 거의 없거나, 무시할 만 하거나 또는 기본적으로 없는 것을 의미한다. 바람직하게는, 그러한 농도에서, 단일쇄 DNA에 대한 활성을 검출할 수 없는 것이다. 숙련자는 단일 및 이중쇄 DNA에 대한 상대적인 DNase 활성을 비료할 수 있는 실험을 용이하게 고안할 수 있을 것이다. 아니시모바 등 (BMC Biochemistry, 2008, 9:14)은 그러한 실험을 개시하고 있다. 간략히, 시험중인 DNase의 2 쿤니츠 단위량을 50 mM Tris-HCl, pH7.5, 5mM MgCl2 (30 μl 최종 반응 부피)에서 한 시간 동안 M13 파지 DNA (단일쇄) 또는 람다 파지 DNA (이중쇄)와 항온 처리하고 생성물을 에티디움 브로마이드 아가로즈 겔에서 분리하였다. 단일쇄 및/또는 이중쇄 DNA에 대한 활성은 미처리 대조군에 상대적인 밴드 위치에 의해 관측될 수 있었다. 다른 접근방법은 실시예 6에 더 상세히 설명되어 있다. 이러한 접근법에서, DNase의 이중 및 단일쇄 DNA에 대한 특이성은 5" 말단에서 형광단(fluoropore) FAM(플루오레세인) 및 3" 말단에서 TAMRA 표지된 올리고뉴클레오타이드에서의 형광 증가를 측정함으로써 시험될 수 있다. 두 개 표지물이 근접해 있을 때 FAM로부터의 방출광은 흡수된다 (소멸된다). DNase에 의한 올리고뉴클레오타이드 절단은 FAM을 TAMRA로부터 분리하는 결과를 가져오며 여기 파장 485 nm 및 방출 파장 520 nm을 구비한 형광기기에서 측정할 수 있는 FAM의 형광 증가를 나타낸다. 이중쇄 DNA 기질은 표지된 올리고뉴클레오타이드를 표지된 올리고뉴클레오타이드에 상보적인 제2 올리고뉴클레오타이드와 혼합함으로써 제조될 수 있다. 물론 다른 적절한 형광단 쌍을 유사하게 사용할 수 있다.
역전사 반응의 경우, 이러한 특성들로 인해 RNA 샘플, 프라이머, 뉴클레오타이드, 역전사효소 및 완충액을 포함하는 역전사 반응 혼합물 내에 DNase를 함유하게 하며 (예, 완전 반응 혼합물), 예를 들어, 실온에서 이첩물 및 게놈 DNA를 빠르게 분해할 수 있게 한다. 이러한 특성은 또한 완전 일단계, 역전사 기반 증폭반응 혼합물 내에 DNase를 포함할 수 있게 한다.
이러한 특성들은 또한 프라이머, 뉴클레오타이드, DNA 폴리머라제 및 완충액을 포함하는 증폭반응 혼합물에 DNase를 첨가할 수 있게 하며 예를 들어, 실온에서 이첩물의 빠른 분해하게 한다.
유리하게도, 본 발명의 이열성 DNase는 완전 증폭반응 혼합물에서 완전히 기능적이고, 및 시험관내 표준 증폭 반응물 및 조건과 양립할 수 있다. 효소는 또한 반응 혼합물로부터 오염 게놈 DNA 및/또는 이첩물의 적절한 양을, 통상 fg- 또는 pg-수준 그러나 바람직하게는 1 ng까지 제거할 수 있어야 한다. 바람직하게는, DNase는 모든 이첩물을 실온에서 5 분, 더욱 바람직하게는 3 분, 가장 바람직하게는 2 분 이내에 분해하여야 한다.
반응 혼합물의 온도를 본 발명의 DNase의 불활성화 온도 (약 50℃)로 단기간 (예 5 분)에 증가시키면 본 발명의 DNase를 비가역적으로 불활성화 시킨다.
역전사 반응의 경우, 이것은 편리하게도 역전사 단계와 동시적이다. DNA 증폭반응의 경우 (핫 스타트 PCR을 위시한), 증폭 및 분석될 핵산 샘플(예, 표적 핵산)을 첨가하고 증폭을 시작한다. 반응 혼합물의 온도가 열적 순환 반복 중에 및 증폭이나 역전사후에 하강할 때라도, 표적 서열의 복제수는, DNase가 비가역적으로 불활성화되었기 때문에 열악해지지 않을 것이다. 역전사효소 및/또는 DNA 폴리머라제가 역전사 및/또는 증폭반응 혼합물에 포함될 수 있는 상황에서 탈오염 및 후속 불활성화 단계가 발생하는 것은 본 발명의 특별한 장점이다. 이는 DNase의 불활성화를 결과하는 완화된 조건 (약 50℃에서 5 분간)의 결과로서, 따라서 오염의 다른 잠재적 원천도 제거된다.
바람직하게는, DNA:RNA 이중 나선의 DNA 본쇄를 향한 최소한의 뉴클레아제 활성을 가진다. "최소한"은 DNA:RNA 이중나선의 DNA 본쇄에 대한 뉴클레아제 활성이 이중쇄 DNA를 향한 원래 활성의 40% 미만인 것을 의미한다. 바람직하게는 DNase는 DNA:RNA 이중나선에 대한 활성이 이중쇄 DNA에 대한 활성의 30% 미만 또는 20% 미만이다.
이러한 DNase들을 일단계 역전사 증폭 방법의 탈오염에 뛰어나게 적합하게 만드는 것은 본 발명의 바람직한 DNase들의 이러한 특별한 특성이다 (예, 빠른 실질적으로 비가역적인 불활성화, 이중쇄 특이성 및 바람작하게는 최소한의 DNA:RNA 이중나선 뉴클레아제 활성). 이것은 전체적인 반응 혼합물이, 증폭이나 역전사 산물의 원치 않는 분해의 두려움없이 일단계로 탈오염될 수 있고 추가의 물질이 첨가될 필요가 없기 때문이다. 이것은 처음 역전사 산물 및/또는 증폭 산물의 원치않는 절단을 통한 민감도를 희생하지 않고 오염 위험 (게놈 DNA의 것도 포함하는)을 최소화시킨다.
상기 방법에 사용된 DNase 효소 자체는 또한 본 발명의 다른 관점을 구성한다. 본 발명의 이러한 관점은 따라서, 약 50℃에서 5 분간 가열함으로써 실질적으로 비가역적으로 불활성화되며 이중쇄 DNA에 실질적으로 특이적인 DNase를 제공한다. 바람직하게는 이러한 불활성화 특성은 EDTA의 부재시에 달성된다.
전술한 특성을 가진 임의의 이열성 DNase는 본 발명에 따른 방법에 사용하기에 적절할 수 있다는 것이 명백할지라도, 판달루스 보레알리스의 DNase로부터 유래된, 또는 다른 해양 유기체로부터 유래된, 특정의 프롤린 잔기가 변형, 삭제 또는 치환된 DNase는 본 발명의 다른 관점을 형성한다. 상기 유기체는 원생 또는 진핵생물일 수 있다. "원생생물"은 세포핵이 없는 임의의 유기체, 예를 들어, 세균 또는 고세균류 역의 임의의 유기체를 의미한다. 바람직하게는 상기 유기체는 세균이다. 더욱 바람직하게는 상기 유기체는 진핵생물, 예를 들어, 분류계로서, 동물계, 식물계, 진균계 또는 원생생물계로 분류된 유기체, 예를 들어, 구두동물문, 무장동물문, 환형동물문, 절지동물문, 완족동물문, 태형동물문, 모악동물문, 척삭동물문, 자포동물문, 유즐동물문, 구륜동물문, 극피동물문, 의충동물문, 내항동물문, 복모동물문, 악구동물문, 반색동물문, 동문동물문, 동갑동물문, 미악동물문, 연체동물문, 선형동물문, 유선형동물문, 유형동물문, 유조동물문, 직유동물문, 추형동물문, 판형동물문, 편형동물문, 해면동물문, 새예동물문, 능형동물문, 윤형동물문, 성구동물문, 진와충동물문, 각태식물문, 선태식물문, 우산이끼문, 석송식물문, 양치식물문, 양치종자식물문, 송백식물문, 소철문, 은행나무문, 마황문, 속씨식물문 (또는 피자식물문), 병꼴군문, 불완전균문, 접합균문, 내생균근균문, 자낭균문 또는 담자균문으로 분류되는 유기체이다. 동물계, 예를 들어 무척추 및 척추 동물로부터 온 유기체가 특기할 만하다. 더욱 바람직하게는 상기 유기체는 절지동물문에 속한 생물, 예를 들어, 갑각아문, 육각아문, 협각아문 또는 다지아문에 속한 생물, 예를 들어, 갑각아문의 새각강, 요지강, 두판강, 소악강, 패충강이나 연갑강에 속한 유기체, 바람직하게는 연갑강 및 더욱 바람직하게는 십각목에 속한 유기체로부터 선택된다. 상기 유기체는 도화새우과, 예를 들어, 아나클로로쿠르티스, 아틀란토판달루스, 오스트로판달루스, 칼리판달루스, 켈로니카, 클로로쿠르티스, 클로로토셀라, 클로로토쿠스, 디첼로판달루스, 도로도테스, 헤테로카르푸스, 미로판달루스, 노토판달루스, 판달리나, 판달롭시스, 판달루스, 판토무스, 페리판달루스, 플레시오니카, 프로시에테스, 수도판달루스 또는 스타이오판달루스의 속; 왕게과, 예를 들어, 크립토리소데스, 글립토리소데스, 리소데스, 로포리소데스, 네오리소데스, 파랄리소데스, 파랄로미스, 피롤리소데스 또는 리놀리소데의 속; 또는 보리새우과, 예를 들어, 파르판테페나에우스, 페네로페나에우스, 리토페나에우스 또는 마르수펜나에우스의 속으로 분류될 수 있다. 상기 유기체는 바람직하게는 차가운 환경, 예를 들어, 차가운 해양 또는 수생 환경에 거주하도록 진화되어온 유기체이다. 상기 유기체는 바람직하게는 예를 들어, 파랄리소데스 캄차티쿠스 (왕게), 마르수페나에우스 자포니쿠스 (보리새우) 또는 페나에우스 자포니쿠스로부터 선택될 것이다. 다른 구체예에서, 상기 DNase는 원핵생물이 아닌, 예를 들어, 세균이 아닌, 예를 들어, 저온 세균이 아닌 유기체 종으로부터 유래된 것이다.
본 발명의 범위에 또한 내포되는 것은 이러한 변형된 DNase들의 효소적 활성 단편물이다.
따라서, 다른 관점에서, 본 발명은 DNase 또는 이의 효소적 활성 단편물을 제공하며, 상기 DNase은 서열번호 1의 서열, 또는 이것과 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 70%, 80%, 90% 또는 95%, 예를 들어, 적어도 98% 동일한 서열을 가지나, 서열번호 1의 237 위치에 있는 프롤린 잔기 또는 다른 서열에서는 상응하는 프롤린이 변형, 삭제 또는 치환되어 있고, 상기 DNase 또는 이의 효소적 활성 단편물은 약 50℃에서 5 분간 가열함으로써 실질적으로 비가역적으로 불활성화되고 및 이중쇄 DNA에 대하여 실질적으로 특이적인 것을 특징으로 한다.
서열번호 1은 판달루스 보레알리스 DNase에 대한 cDNA의 번역된 부분의 아미노산 서열이다. 상기 cDNA 서열은 서열번호 2에 나타나 있다. 서열번호 1은 신호 펩타이드 서열 MIGRTTFIALFVKVLTIWSFTKG을 포함한다 (서열번호:13). 판달루스 보레알리스 DNase의 성숙 형태는 서열번호 7에 나타나 있다 (즉, 신호 펩타이드 (서열번호 13)이 없는 서열번호1의 서열). 따라서, 서열번호 1의 잔기 237의 프롤린은 서열번호 7의 잔기 214의 프롤린과 동일한 위치이다.
따라서, 본 발명은 또한 DNase 또는 이의 효소적 활성 단편물을 제공하는 데, 상기 DNase는 서열번호 7의 서열 또는 이와 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 70%, 80%, 90% 또는 95%, 예를 들어 적어도 98% 동일한 서열을 가지나, 서열번호 7의 214 위치에 있는 프롤린 잔기 또는 다른 서열에서 상응하는 프롤린이 변형, 삭제 또는 치환되어 있고, 상기 DNase 또는 이의 효소적 활성 단편물은 약 50℃에서 5 분가 가열함으로써 실질적으로 비가역적으로 불활성화되고 및 이중쇄 DNA에 대해 실질적으로 특이적이다.
서열번호 1의 효소적 활성 단편물 및 변이체는 서열번호 7의 성숙 효소의 효소 기능(즉, 뉴클레오타이드 서열 특이성없이 DNA 백본에서 포스포디에스테르 결합을 가수분해하는 능력)의 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 85%, 더욱 바람직하게는 적어도 95% 및 가장 바람직하게는 적어도 99%를 나타낸다. 이전에 논의된 바와 같이, DNase의 활성은 일상적인 기술을 사용하여 용이하게 산정될 수 있다.
본 발명에 따른 백분율 서열 동일성은 널리 이용가능한 알고리즘 중 하나 (예, 클러스탈 W2 다중 서열 정렬 프로그램 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalW2을 사용하는)를 사용하여 기본 매개변수 (DNA Gap Open Penalty = 15.0; DNA Gap Extension Penalty = 6.66; DNA Matrix = Identity; Protein Gap Open Penalty = 10.0; Protein Gap Extension Penalty = 0.2; Protein matrix = Gonnet; Protein/DNA ENDGAP = -1 ; Protein/DNA GAPDIST = 4)에서 계산될 수 있다.
서열번호 1 또는 7이 아닌 "다른 서열에서의 상응하는 프롤린 잔기"는 Clustal W2와 같은 표준 서열 정렬 기술을 사용하여 도 11에서 나타난 바와 같은 정렬을 생성함으로써 용이하게 확인될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 DNase 또는 이의 단편물은 전술한 분류학상의 군들 중 임의의 군으로 분류된 종으로부터, 예를 들어, 절지동물문 또는 갑각아문, 육각아문, 협각아문 및 다족아문, 예를 들어, 판달루스 보레알리스, 파랄리소데스 캄차카티쿠스 (왕게), 마르수페나에우스 자포니쿠스 (보리새우) 또는 페나에우스 자포니쿠스로부터 선택되나, 서열번호 1의 237 위치에 있는 프롤린과 상응하는 프롤린 잔기가 변형, 삭제 또는 치환된 것이다. 서열번호 1의 237 위치에 있는 프롤린과 상응하는 프롤린 잔기가 변형, 삭제 또는 치환된 판달루스 보레알리스 유래 DNase가 바람직하다.
가장 바람직한 구체예에서, 본 발명의 DNase는 서열번호 4 또는 10의 아미노산 서열을 가진다.
상기 프롤린(예를 들어, 서열번호 1의 잔기 237 / 서열번호 7의 잔기 214)의 "치환"은 프롤린 잔기가, 일반적으로 유전적 암호화된 다른 천연 발생 아미노산에 의해서, 또는 아미노산 유사체에 의해 교체된 것을 의미한다. 바람직하게는 상기 프롤린은 알라닌, 글리신, 세린 또는 시스테인에 의해 교체된다.
상기 프롤린의 "변형"" 상기 프롤린 잔기가 그의 측쇄를 상이한 기로 대체함으로써, 상기 측쇄 자체의 조성을 변형시킴으로써 또는 상기 측쇄 반대편의 수소를 상이한 기로 치환함으로써 그것의 통상적인 입체화학적 특성을 변경한 것을 의미한다.
본 발명은 또한 본 발명의 DNase들을 암호화하는 핵산 분자를 제공한다. 서열번호 4과 10의 아미노산 서열에 상응하는 뉴클레오타이드 서열들이 서열번호 5와 11에 개시된다. 유전 코드의 축퇴성은 서열번호 5와 11이 많은 가능한 뉴클레오타이드 서열들 중 두 개일 뿐이라는 것을 의미한다.
본 발명은 또한 전술한 특정 DNase들을 핵산의 증폭 방법에서 탈오염화 제제로서 사용하는 용도를 제공한다. 전술한 특정 DNase들의 용도는 본 발명의 특정 바람직한 구체예를 나타낸다.
전술한 DNase 및 이의 효소적 활성 단편물을 분리하고 정제하는 방법은 본 발명의 다른 관점을 나타낸다. 따라서, 이러한 관점에서, 본 발명은 상기 DNase 또는 이의 단편물을 적절한 숙주 세포 (예를 들어, 피치아 파스토리스; E. coli; S. 세레비지아에, 바큘로바이러스 감염된 곤충 세포)에서 발현시키고, 및 후속적으로 상기 DNase를 상기 숙주 세포 및/또는 상기 세포가 배양되어온 배지로부터 분리하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
상기 DNase 또는 이의 단편물의 발현은 적절한 숙주 세포에 상기 DNase 또는 이의 단편물을 암호화하는 발현 벡터, 예를 들어 서열번호 4과 10의 아미노산 서열들을 암호화하는 핵산 분자, 예를 들어, 서열번호 5 또는 11의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터를 혼입함으로써 얻을 수 있다. 이러한 발현 카세트 및 핵산 분자를 포함하는 숙주세포는 본 발명에 포함된다.
DNase 효소는 당해분야에 공지되고 문헌에 널리 설명된 임의의 단백질 정제 기술 또는 기술들의 임의의 조합을 사용하여 숙주 세포/배양 배지로부터 분리 또는 정제될 수 있다. 그러한 기술들은 예를 들어, 침전, 한외여과, 투석, 다양한 크로마토그래피 기술, 예를 들어, 겔 여과, 이온 교환 크로마토그래피, 친화력 크로마토그래피, 전기영동, 원심분리 등을 포함한다.
유사하게, 숙주 세포의 추출물 또한 당해분야에 공지된 기술, 예를 들어, 균질화파쇄, 냉동-해동 등을 사용하여 제조할 수 있고, 이 추출물로부터 본 발명의 DNase를 정제할 수 있다.
이온 교환 크로마토그래피 및 친화력 크로마토그래피의 조합, 예를 들어, 세파로즈 컬럼, 예를 들어, 레드 세파로즈 (Pharmacia Biotech, Sweden) 또는 블루 세파로즈 (GE Healthcare) 컬럼으로 상기 효소를 분리할 수 있는 정제 프로토콜이 발견되었다.
더욱 상세히는, 추출물을 이온 교환 크로마토그래피로 처리하고 단백질을 NaCl 구배로 용출한다. DNase 활성을 함유하는 분획물을 투석하고 다음 친화 컬럼에 적용한 후 마지막으로 NaCl로 용출한다.
본 발명은 또한 적어도 본 발명에 따른 DNase를 포함하는 키트를 제공한다. 상기 키트는 또한 핵산 증폭 및/또는 역전사 반응을 수행하는 데 필요한 시약, 완충액, 효소 등의 일부 또는 전부를 포함할 수 있다. 더 상세히는, 상기 키트는 뉴클레오타이드 삼인산염류 (SDA용 dNTPαS를 위시한), 올리고뉴클레오타이드 프라이머, 역전사효소, 바람직하게는 약 50℃에서 기능할 수 있는 것인 DNA 폴리머라제, 바람직하게는 Taq 폴리머라제 또는 Bst 폴리머라제 (및 이의 핫 스타트 버전)와 같은 열안정성 폴리머라제 또는, LAR의 경우, DNA 리가제 (바람직하게는 Ampligage®　또는 파이로코커스 퓨리오서스로부터 분리된 미국특허번호 6280998에 개시된 것과 같은 열안정성 DNA 리가제) 또는 제한효소 (바람직하게는 BsoB1와 같은 열안정성 제한효소)를 포함할 수 있다. 상기 DNase는 역전사효소, DNA 폴리머라제, 나선 치환 폴리머라제 또는 LCR 리가제와 함께 하나의 분실에 제공될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 DNase, 및 핵산 증폭 및/또는 역전사 반응 및 방법을 수행하는 데 필요한 시약들의 하나 또는 그 이상, 예를 들어, 전술한 성분들을 포함하는 조성물을 제공한다. 일반적으로, 그러한 조성물은 수성이고 및 Tris, HEPES, 등과 같은 표준 완충액으로 완충될 수 있다.
역전사 방법들은 당연히 현재 당해 분야에서는 표준이되었고 임의의 공지 또는 표준 시약과 기술을 사용하여 수행될 수 있다.
일반적인 역전사 방법에서, 탈오염 단계는 단순히 DNase를 포함하는 역전사 반응 혼합물을 실온에서 단기간, 예를 들어, 1 내지 30분, 편리하게는 2 내지 15분간 배양하는 것을 포함한다. 이러한 배양 시간은 결정적인 것이 아니고 반응 시스템의 정밀한 DNase와 사용된 농도 및 다른 성분에 따라 변할 수 있다. 상기 온도는 상기 효소가 활성인 임의의 온도 즉 불활성화 온도 이하의 온도 (예 37℃)일 수 있지만, 실온이 편리하다.
그러한 반응 혼합물은, 전술한 바와 같이, 역전사 반응에 필요한 반응물 모두를 포함할 수 있다.
전형적인 대표 역전사 혼합물은 예를 들어 하기를 포함할 수 있다:
성분 최종 농도
dATP 50-200 μM
dCTP 50-200 μM
dGTP 50-200 μM
dTTP 50-200 μM
프라이머 0.05-0.2 μM
AMV 역전사효소 10-200 유닛
서열번호 10의 ds DNase 0.1-2 유닛
역전사 완충액 1X
멸균 증류수 최종 50-100 μl까지
실험 주형 50 pg-100 ng
총 혼합물 25-50 μl
상기 대표적인 예에서, 상기 반응물 (완충액, dNTP, 프라이머, 효소 및 MgCl2 용액 포함)의 최종 부피가 50-100 μl인 한, 멸균 증류수와 실험 주형 부피들의 임의의 조합을 사용할 수 있다. 그러나, 선택에 따라서, 예를 들어, 반응물들의 유사한 또는 다른 원하는 최종 농도를 달성하기 위해 대안적인 최종 부피를 사용할 수 있다. 임의의 편리한 또는 상업적 이용가능한 역전사 완충액을 사용할 수 있다. 적절한 5X 역전사 완충액은 250 mM Tris-HCl (pH 8.5, 25℃에서), 40 mM MgCl2, 150 mM KCl, 5 mM DTT일 수 있다. 역전사 완충액은 Fermentas로부터 구입할 수 있다.
잠재적 오염의 수준에 따라서, 필요한 DNase의 양이 달라질 수 있다. 짧은 배양 단계(실온에서 0-15 분)로는, 2.0 유닛/50μl 반응 혼합물이 일반적으로 충분한 양 이상이다. 0.1 내지 2.0 유닛/50 μl 반응 혼합물이 적합하고 및 약 0.5 유닛/50 μl 반응 혼합물 (예를 들어, 0.2 내지 1.0 유닛/50μl 반응 혼합물)이 바람직하다. 2.0 유닛/50μl 반응 혼합물에서, 특정 ssDNase 활성이 관찰되고 및 그러므로, 전술한 활성이 바람직하다. 효소의 일 유닛은 쿤니츠 검정 또는 야마모토의 변형된 쿤니츠 검정(둘 다 전술된)에 있어서, 260 nm에서 분당 0.001의 흡광도를 증가시키는 양으로 정의된다. 항온처리후, DNase는 반응 혼합물을 가열함으로써 불활성화된다. 편리하게, 이것은 역전사 단계에서, 예를 들어, 약 50℃에서 30 분간 가열함으로써 얻어진다.
편리하게는, 본 발명의 DNase를 사용하는 탈오염 단계를 포함하는 상기 증폭 방법은 PCR을 포함하든지 이에 기반을 두고 있다. PCR 방법은 당해 분야에 표준이 되어 있고 임의의 공지 또는 표준 시약과 기술을 사용하여 수행될 수 있다.
전형적인 PCR 반응 방법에서, 탈오염 단계는 DNase를 포함하는 증폭반응 혼합물을 실온에서 단기간, 예를 들어, 1 내지 10분, 편리하게는 2 내지 15분간 단순히 배양하는 것을 포함한다. 이러한 배양 시간은 결정적인 것이 아니고 반응 시스템의 정밀한 DNase와 사용된 농도 및 다른 성분에 따라 변할 수 있다. 상기 온도는 상기 효소가 활성인 임의의 온도 즉 불활성화 온도 이하의 온도 (예 37℃)일 수 있다.
그러한 반응 혼합물은, 전술한 바와 같이, 주형, 즉 증폭될 표적 핵산을 제외하고 증폭 반응에 필요한 반응물 모두를 포함할 수 있다.
전형적인 대표 PCR 증폭반응 혼합물은 예를 들어 다음을 포함한다:
성분 최종 농도
dATP 50-200 μM
dCTP 50-200 μM
dGTP 50-200 μM
dTTP 50-200 μM
프라이머 1 0.05-0.2 μM
프라이머 2 0.05-0.2 μM
DNA 폴리머라제 1-2.5 Units
서열번호 10의 ds DNase 0.1-2 Units
MgCl2 1.5-3.0 mM
PCR 완충액 1X
멸균수 최종 50-100 μl까지
실험 주형 50 pg-100 ng
(DNase의 불활성화 이후에 첨가될)
총 혼합물 25-50 μl
상기 대표적인 예에서, 상기 반응물 (완충액, dNTP, 프라이머, 효소 및 MgCl2 용액 포함)의 최종 부피가 25-50 μl인 한, 멸균 증류수와 실험 주형 부피들의 임의의 조합을 사용할 수 있다.
그러나, 선택에 따라서, 예를 들어, 반응물들의 유사한 또는 다른 원하는 최종 농도를 달성하기 위해 대안적인 최종 부피를 사용할 수 있다. 임의의 편리한 또는 상업적 이용가능한 PCR 완충액을 사용할 수 있다.
탈오염 후, DNase는 반응 혼합물을 가열함으로써 불활성화된다. 편리하게도, 이것은 첫번째 PCR 사이클에서 가열함으로써 성취될 수 있다.
PCR 과정의 최적 수행은 온도, 온도의 시간 및 반복순환에서 각 단계 별 온도간의 시간의 선택에 의해 영향을 받는다. 새로이 첨가된 표적 핵산의 PCR 증폭 전에, 오염 ds DNA를 분해하는 데 DNase를 이용하는 일반적인 배양 반복 순환은 다음과 같다: (a) 실온에서 0 내지 10 분간 DNase 처리; (b) 94℃에서 2 분간 DNase 불활성화; (c) 주형 첨가; 94℃에서 1 분간 DNA 용융; (d) 50-65℃에서 15 초간 프라이머 어닐릴; (e) 72℃에서 30초간 프라이머 연장; (f) 94℃에서 10 초간 DNA 용융; 및 단계 (d)-(f)를 원하는 수준의 증폭을 얻기에 필요한 만큼 반복.
전술한 바와 같이, 본 발명의 DNase는 일단계 역전사 증폭반응, 예를 들어, 역전사 PCR에 특히 적합하다. 그러한 방법은 당해 분야에 잘 설정되어 있으나, 완전하게 하기 위해, 일반적인 대표 역전사 PCR 혼합물은 예를 들어, 하기를 포함할 수 있다:
성분 최종 농도
dATP 50-200 μM
dCTP 50-200 μM
dGTP 50-200 μM
dTTP 50-200 μM
프라이머 1 0.05-0.2 μM
프라이머 2 0.05-0.2 μM
AMV 역전사효소 10-200 유닛
DNA 폴리머라제 1-2.5 유닛
서열번호 10의 ds DNase 0.1-2 Units
MgCl2 3.0-6.O mM
PCR 완충액 1X
멸균수 최종 25-50 μl까지
실험 RNA 주형 50 pg-100 ng
총 혼합물 25-50 μl
역전사 및 PCR 반응에서 부피와 완충액에 대하여 상기 논의한 것은 본 발명에 적용할 수 있다. 탈오염후에, 역전사효소 반응은 DNase가 불활성화되는 온도 (예 50℃에서 1시간)에서 수행된다. 이러한 단계 동안, DNase는 불활성화된다. 이것은 cDNA 산물이 생성되면서 분해되지 않으며, PCR 반응이 개시될 때, 그러한 생성물의 분해도 없다는 것을 의미한다. 역전사 반응후, PCR 반응은 반응 혼합물에 더 첨가하지 않고, 반응 용기를 전술한 바와 같은 열적 프로파일과 같은 열처리 반복 순환 프로파일에 노출시킴으로써 수행된다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 약 50℃의 온도에서 5 분간 가열시 실질적으로 비가역적으로 불활성화되며 이중쇄 DNA에 대하여 실질적으로 특이적인 DNase를 사용하는 것을 포함하는, 역전사 반응으로부터 핵산 오염을 제거하는 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 핫 스타트 PCR로부터 핵산 오염을 제거하는 방법에 있어서, 상기 반응은 배리어 핫 스타트 PCR 셋업 및/또는 핫 스타트 DNA 폴리머라제를 포함하며, 상기 방법은 약 50℃의 온도에서 5 분간 가열함으로써 실질적으로 불활성화되고 및 이중 나선 DNA에 실질적으로 특이적인 DNase를 사용하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 역전사 반응 혼합물, 핫 스타트 PCR 셋업, 핫 스타트 PCR 혼합물, 또는 이들의 개별성분들의 임의의 것을 임의의 오염 이중쇄 DNA를 절단하게 하는 조건에서 DNase와 접촉시키고 그 후 결과된 반응 혼합물을 가열하여 상기 DNase를 불활성화시키는 것이다.
또한 본 발명은 역전사 반응 혼합물을 약 50℃의 온도에서 5 분간 가열시 실질적으로 비가역적으로 불활성화되며 이중쇄 DNA에 대하여 실질적으로 특이적인 DNase로, 실제적인 역전사 반응 개시 전에, 처리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 표적 핵산의 시험관내 역전사 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 역전사 반응 혼합물은 완전 혼합물이고 역전사 효소의 작동 온도에서 가열되어 DNase를 불활성화시키는 것이다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 방법은 하기 단계의 하나 이상을 포함하는 하나 이상의 사이클을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법으로서, (i) 프라이머 어닐링 (ii) 프라이머 부착된 폴리뉴클레오타이드로부터 사슬 연장 (iii) 폴리뉴클레오타이드 이중나선 용융을 포함한다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 역전사 반응 후에 핵산 증폭반응이 실시되는 것이다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 핵산 증폭반응은 PCR, LCR, SDA, 3SR 또는 LAMP이고, 바람직하게는 PCR인 것이다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 역전사 반응 및 상기 증폭반응은 단일 반응 용기 내에서 수행되는 것이다.
또한 본 발명은 핫 스타트 PCR의 방법에 있어서, 상기 반응은 배리어 핫 스타트 PCR 셋업및/또는 핫 스타트 DNA 폴리머라제를 포함하며, 상기 방법은 핫 스타트 PCR 셋업/혼합물 또는 핫 스타트 DNA 폴리머라제를, 약 50℃의 온도에서 5 분간 가열함으로써 실질적으로 불활성화되고 이중 나선 DNA에 실질적으로 특이적인 DNase로, 상기 핫 스타트 PCR의 개시전에 처리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 방법은 하나 이상의 하기 단계를 포함하는 복수개의 사이클을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법으로서, (i) 폴리뉴클레오타이드 나선 용융 (ii) 프라이머 어닐링 (iii) 프라이머 부착된 폴리뉴클레오타이드로부터 사슬 연장을 포함한다.
또한 본 발명은 약 50℃의 온도에서 5 분간 가열함으로써 실질적으로 불활성화되고 및 이중 나선 DNA에 실질적으로 특이적인 DNase를 제공한다.
이에 더하여 본 발명은 상기 DNase는 서열번호 1의 서열 또는 이와 적어도 60% 동일한 서열을 가지나, 서열번호 1의 237 위치에서의 프롤린 잔기 또는 다른 서열에서 동등한 프롤린이 변형, 삭제 또는 치환된 서열을 가지며, 상기 DNase 또는 이의 효소적 활성 단편물은 약 50℃의 온도에서 5분간 가열함으로써 실질적으로 비가역적으로 불활성화되고 및 이중쇄 DNA에 대하여 실질적으로 특이적인 것을 특징으로 하는 DNase 또는 이의 효소적 활성 단편물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 DNase는 서열번호 7의 서열 또는 이와 적어도 60% 동일한 서열을 가지나, 서열번호 7의 214 위치에서의 프롤린 잔기 또는 다른 서열에서 동등한 프롤린이 변형, 삭제 또는 치환된 서열을 가지며, 상기 DNase 또는 이의 효소적 활성 단편물은 약 50℃의 온도에서 5분간 가열함으로써 실질적으로 비가역적으로 불활성화되고 및 이중쇄 DNA에 대하여 실질적으로 특이적인 것이다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 DNase는 절지동물문의 종으로부터 얻을 수 있는 DNase의 서열을 가지지만, 서열번호 1의 237 위치에 있는 프롤린에 상응하는 프롤린 잔기가 변형, 삭제 또는 치환된 것이다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 DNase는 갑각아문, 육각아문, 협각아문 또는 다지아문으로부터 선택되는 아문의 종으로부터 얻을 수 있는 DNase의 서열을 가지지만, 서열번호 1의 237 위치에 있는 프롤린에 상응하는 프롤린 잔기가 변형, 삭제 또는 치환된 것이다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 DNase는 판달루스 보레알리스, 파랄리소데스 캄차카티쿠스 (왕게), 마르수페나에우스 자포니쿠스 (보리새우) 또는 페나에우스 자포니쿠스로부터 선택된 종에서 얻을 수 있는 DNase의 서열을 가지지만, 서열번호 1의 237 위치에 있는 프롤린에 상응하는 프롤린 잔기가 변형, 삭제 또는 치환된 것이다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 DNase는 판달루스 보레알리스로부터 얻을 수 있는 서열을 가지지만, 서열번호 1의 237 위치에 있는 프롤린에 상응하는 프롤린 잔기가 변형, 삭제 또는 치환된 것이다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 DNase는 서열번호 4 또는 서열번호 10의 서열을 가지는 것이다.
본 발명의 또 다른 구현예로, DNase를 암호화하는 핵산 분자를 포함한다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 핵산 분자는 서열번호 5 또는 서열번호 11의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것이다.
또한 본 발명은 DNase를 핵산을 증폭하는 방법에 탈오염화 제제로서 사용하는 용도를 제공한다.
본 발명의 또 다른 구현예로, DNase는 상기 방법들에 사용하는 용도인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 DNase 또는 이의 단편물을 분리하고 정제하는 방법에 있어서, 상기 DNase 또는 이의 단편물을 적절한 숙주 세포에서 발현 시키는 단계, 및 후속적으로 상기 DNase를 상기 숙주 세포 및/또는 상기 세포가 배양되어진 배지로부터 분리하는 단계를 포함하는 것이다.
이에 더하여 본 발명의 또 다른 구현예로, DNase 및/또는 이에 따른 핵산; 및 조건적으로 (i) 뉴클레오타이드 삼인산염; (ii) 올리고뉴클레오타이드 프라이머; (iii) 역전사 효소; (iv) DNA 폴리머라제; (v) DNA 리가제; 및 (Vi) 제한효소 중 하나 이상을 포함하는 방법을 수행하기 위한 키트 또는 조성물을 제공한다.
본 발명은 약 50℃의 온도에서 5분간 가열함으로써 실질적으로 비가역적으로 불활성화되며 실질적으로 이중쇄 DNA에 특이적인 DNase, 상기 DNase를 암호화하는 핵산, 및 상기 DNase 또는 상기 핵산을 포함하는 키트 또는 조성물을 제공할 수 있는 효과가 있다.
본 발명은 하기 도면을 참조하여 비제한적 실시예의 방식으로 설명될 것이다.
도 1은 DTT 존재 또는 부존재하 50, 55, 65 또는 94℃에서 15, 30 또는 60 분간 불활성화된 서열번호 10의 DNase 및 자연발생형 판달루스 보레알리스 DNase (서열번호 8)의 플라즈미드 DNA에 대하여 37℃에서 3 시간 처리한 활성을 나타내는 여러 아가로즈 겔의 사진을 보여준다.
도 2는 DTT 존재하 55℃에서 서열번호 10의 DNase 불활성화의 추이를 나타낸다.
도 3 DTT 존재하 50℃에서 서열번호 10의 DNase 불활성화의 추이를 나타낸다.
도 4는 본 발명의 판달루스 보레알리스 DNase의 성숙 형태의 아미노산 서열을 나타낸다 (서열번호 10).
도 5는 판달루스 보레알리스 DNase의 성숙 형태의 P214A 돌연변이체의 암호화 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다 (서열번호 11).
도 6은 본 발명의 판달루스 보레알리스 DNase의 P237A 돌연변이체의 뉴클레오타이드 서열과 아미노산 서열을 나타낸다 (서열번호 4와 5). 이러한 아미노산 서열은 신호 펩타이드 MIGRTTFIALFVKVLTIWSFTKG를 포함한다 (서열번호 13).
도 7은 판달루스 보레알리스 DNase의 성숙 형태의 아미노산 서열을 나타낸다 (서열번호 7).
도 8은 판달루스 보레알리스 DNase의 성숙 형태의 암호화 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다 (서열번호 8).
도 9는 판달루스 보레알리스 DNase의 cDNA 뉴클레오타이드 서열과 번역된 아미노산 서열을 나타낸다 (서열번호 1과 2). 이러한 아미노산 서열은 신호 펩타이드 MIGRTTFIALFVKVLTIWSFTKG를 포함한다 (서열번호 13).
도 10은 자연발생형 판달루스 보레알리스 DNase 및 P214A 돌연변이체의 일단계 RT-PCR 효율에 대한 효과를 나타낸다.
도 11은 왕게 (파랄리소데스 캄차카티쿠스) DNase (서열번호 19) 및 판달루스 보레알리스 DNase (서열번호 7)의 아미노산 서열 정렬을 나타낸다. 379개 잔기에서 65.7% 동일성이 중첩된다; 스코어: 1384.0; 갭 빈도: 0.0%.
도 12는 정량적 PCR 방법에 대한 P214A 돌연변이체의 증가하는 농도의 효과를 나타낸다.
도 13은 정량적 PCR protocol에 대한 열처리된 효소의 저해 효과를 측정함으로써 DNase I 및 P214A 돌연변이체의 이열성을 비교한 것이다.
도 14는 P214A 돌연변이체의 양을 증가시킴에 따라 정량적 PCR 반응 혼합물로부터의 스파이크된 DNA의 제거 정도를 나타낸다.
도 15는 P214A 돌연변이체 농도 증가에 따른 일단계 RT-PCR 반응에 대한 효과를 나타낸다.
도 16은 P214A 돌연변이체의 무 주형 qPCR 대조군에 대한 효과를 나타낸다.
도면에서,
서열번호 1은 판달루스 보레알리스 DNase의 cDNA 뉴클레오타이드 서열의 번역된 부분에 해당하는 아미노산 서열이다.
서열번호 2는 판달루스 보레알리스 DNase의 cDNA 뉴클레오타이드 서열이다.
서열번호 4는 P237A 돌연변이 판달루스 보레알리스 DNase의 아미노산 서열이다.
서열번호 5는 P237A 돌연변이 판달루스 보레알리스 DNase의 암호화 뉴클레오타이드 서열이다.
서열번호 7은 판달루스 보레알리스 DNase의 성숙 형태의 아미노산 서열이다.
서열번호 8은 판달루스 보레알리스 DNase의 성숙 형태의 암호화 뉴클레오타이드 서열이다.
서열번호 10은 판달루스 보레알리스 DNase의 성숙형태의 P214A 돌연변이의 아미노산 서열이다.
서열번호 11은 판달루스 보레알리스 DNase의 성숙 형태의 P214A 돌연변이의 암호화 뉴클레오타이드 서열이다.
서열번호 13은 판달루스 보레알리스 DNase의 신호 펩타이드의 아미노산 서열이다.
서열번호 14는 DNase 활성을 측정하기 위한 5' FAM 및 3' TAMRA 표지된 올리고뉴클레오타이드이다.
서열번호 15는 서열번호 14의 상보 서열이다.
서열번호 16은 E, coli 23SrRNA 유전자의 부분을 증폭하기 위한 순방향 프라이머이다.
서열번호 17은 E. coli 23SrRNA 유전자의 부분을 증폭하기 위한 역방향 프라이머이다.
서열번호 18은 서열번호 17과 서열번호 18에 상보적인 부위 사이의 E. coli 23SrRNA gene의 부분에 상보적인 5' FAM 및 3' BHQ 표지된 올리고뉴클레오타이드 프로브이다.
서열번호 19는 왕게 (파랄리소데스 캄차카티쿠스) DNase의 아미노산 서열이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
DNase 활성의 측정
쿤니츠 분석
DNase 활성을 쿤니츠의 방식에 따라 시험하였다 (Kunitz, M., 1950, Crystalline Deoxyribonuclease, II, Digestion of Thymus Nucleic Acid. The Kinetics of Reaction. J. Gen. Physiol., 33, 363-377). 효소 제조물 10 μl를 50 μg 송아지 흉선 DNA이 포함된 100 mM 소듐 아세테이트, pH 5.0, 5 mM MgCl2에 첨가하여 최종 농도 1 ml를 만들었다. 상기 혼합물을 25℃에서 처리하고 흡광도 증가를 260 nm에서 측정하였다. 1 U = 0.001 OD260 증가 x min-1.
야마모토의 변형된 쿤니츠 분석
야마모토에 의해 기술된, 종결점 분석법인 변형된 쿤니츠 분석법 (Yamamoto, M. 1971. Purification and some properties of an acid deoxyribonuclease from testes of Chinook salmon Oncorhynchus tshawytscha. Biochim Biophys Acta, 228, 95-104)은 쿤니츠 분석법의 더 고감도의 버전이고 불활성화 이후, 잔류 DNase 활성의 측정에 더 적합한 것으로 간주되고 있다. 효소 10 μl를 200 μg 송아지 흉선 DNA를 함유한 20 mM Tris/HCl, pH 8.0, 5 mM MgCl2에 첨가하여 최종 농도 1 ml를 만든다. 혼합물을 37℃에서 20 분간 처리한다. 다음 0.5 ml 빙냉 12% HClO4를 첨가하고, 완전히 혼합한 후, 얼음에 20분간 방치한다. 튜브를 에펜도르프 원심분리로 최대 속도로 10분간 원심분리한다. 260 nm에서 흡광도를 측정하고 여기서 유닛을 계산한다. 1 U = 0.001 OD260 증가 x min-1.
판달루스 보레알리스 DNase 의 변이
Invitrogen의 Quick-change™ 돌연변이 생성 키트를 제조사 지침에 따라 사용하여 판달루스 보레알리스 DNase (서열번호 7)를 잔기 214(서열번호 1에서 잔기 237에 상응)에서 변이시켰다. 프롤린은 자연발생형 잔기이고 알라닌은 치환 잔기이다. 도 4 내지 9는 판달루스 보레알리스 DNase의 자연발생형과 변이 버전의 아미노산과 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
돌연변이체를 서열분석하여 정확한 것으로 발견되어 피치아 파스토리스로 형질전환시켰다. 자연발생형과 유사한 양호한 발현을 나타내는 형질전환체를 얻었다. P214A 돌연변이체에 대한 처음 불활성화 시험은 변이체가 55℃에서 자연발생형 DNase보다 더 쉽게 불활성화된다는 것을 나타낸다.
변이 P214A DNase 발현 카세트를 가지는 재조합 피치아 파스토리스 클론을 1 리터 발효기에서 발현시켰다. 발효는 Invitrogen의 피치아 발효 공정 가이드라인에 설명된 대로 실행되었다. 발효물(약 1 리터)을 4500 g에서 15 분간 원심분리하여 세포를 제거하고 상등액을 새로운 병에 쏟았다. 다음0.5 M NaOH를 첨가하여 pH를 8로 조정한 후 4500 g에서 15 분간 원심분리하여 침전된 염을 제거하였다. 새로운 상청액을 최종적으로 Whatman GF/F 필터를 통해 여과하였다.
먼저 음이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 P214A DNase 단백질을 정제하였다. pH 조절되고 여과된 상청액 (1150 ml) 25 mM Tris/HCI pH 8, 5 mM MgCl2, 0.25 M NaCl (완충액 A)로 평형화시킨 Q-세파로즈 FF 컬럼 (2.6/10)에 적용하였다. 다음 이 컬럼을 컬럼 부피의 19배 완충액 A로 세척한 후, P214A 단백질을 완충액 25 mM Tris/HCl pH 8, 5 mM MgCl2, 0.5 M NaCl로 용출하였다. 10 ml 분획물을 수집하였다. 사용된 유동속도는 10 ml/min이었다. 실시예 1에서 설명된 쿤니츠 방법에 따라 활성을 측정하여 P214A 단백질을 함유한 분획물을 선택하였다.
선택된 분획물들을 혼합하고 4℃에서 10 mM Tris/HCl, pH 7.5, 5 mM MgCl2 (완충액 B). 동일한 완충액을 사용하여 투석된 샘플의 부피를 200 ml로 조정한 후 완충액 B로 평형화한 블루 세파로즈 FF 컬럼(5.0/10)에 적용하였다. 컬럼을 컬럼부피 2배의 완충액 B로 세척하고 P214A DNase 단백질을 완충액 B + 0.25 M NaCl을 사용하여 용출하고, 10 ml의 분획물을 수집하였다. 사용된 유동 속도는 10 ml/min이었다. 마지막으로, 전술한 바와 같이, 활성을 측정하여 P214A 함유 분획물을 선택하고, 혼합하고, 농축하였다.
상이한 온도에서 불활성화 후 잔류 활성 측정
P214A 돌연변이체가 열에 의해 완전히 불활성화 되었는 지를 결정하기 위해, 열불활성화 P214A 돌연변이체 또는 야생형 효소의 존재하에서 PCR 산물이 온전한가를 평가하였다.
효소 (0.8 U P214A, 또는 1.5 U wt)를 25 mM Tris/HCl, pH 8, 5 mM MgCl2 ± 1 mM DTT 완충액의 총 20 μl 부피를 함유하는 PCR 튜브에 첨가하였다. 효소들을 다양한 온도에서 15, 30 및 60 분간 열 불활성화시키고, 다음 튜브를 얼음 위에 두었다. 0.5 ㎍의 정제된 ~500 bp PCR 산물을 첨가하고 반응물을 37℃에서 3 시간 처리하였다. 마지막으로 아가로즈 겔 전기영동을 사용하여 반응물을 분석하였다. 음성 대조군 (무 효소) 및 양성 대조군 (열-불활성화 단계 후 첨가된 100x 희석된 효소)을 상기 반응과 동일한 방법으로 처리하였다.
도 1은 야생형 효소와 비교한 P214A 돌연변이체의 50℃, 55℃, 65℃ 및 94℃에서 열 불활성화 실험을 요약하고 있다. 무 효소 대조군(-)은 온전한 PCR-산물을 나타내는 반면 양성 대조군(+), 즉 열불활성화되지 않은 100 배 희석된 효소는 1% 잔류 활성의 효과를 나타낸다.
대조군 실험으로부터, PCR 산물의 가시적 분해가 없으면, 0.01 %미만의 잔류 활성을 나타내는 것이고 (결과 미도시), 이는 상기 분석에서 ~1 U 효소를 사용할 때의 검출 한계이다. 50℃ 및 55℃에서, 상기 P214A 돌연변이체만이 완전히 열-불활성화되었고, 이는 P214A 치환의 효과를 나타내는 것이다. DTT (이 실험에서 1 mM) 첨가는 양 쪽 효소의 완전 불활성화에 필요하다. 60 분간 94℃에서 처리할 때만, DTT 부재에서 완전 열-불활성화가 나타났다.
50℃ 및 55℃에서 P214A 의 불활성화에 대한 추이
DNase가 완전 역전사효소 반응 혼합물을 탈오염시키는 데 사용될 때, 그것을 역전사효소 단계에서 조기에 불활성화시키는 것은 중요하다. 뉴클레아제가 즉각적으로 불활성화되지 않는다면, 이것은 cDNA를 절단하기 시작하고 역전사 생성물에 유해한 효과를 가지게 될 것이다. 이는, 역전사가 정량적 분석의 일부분으로 샘플내의 RNA 양을 측정하는 경우 특히 중요하다. 따라서, P214A 돌연변이체 DNase의 불활성화를 50℃ 및 55℃에서 더 짧은 시점에서 시험하였다.
P214A, 12.5-125 U 를 일반적인 RT-완충액 (50 mM Tris/HCI, pH 8.3, 50 mM KCI, 5 mM MgCI2, 5 mM DTT)에 희석하여 총 25 μl의 부피로 만들었다. 샘플을 PCR 기계에서 50 및 55℃로 0-5 분간 처리하였다. 다음, 잔류 활성을 실시예 1에서 설명한 변형 쿤니츠 분석법을 사용하여 측정하였다.
도 2와 3에서 나타난 바와 같이, P214A 돌연변이체는 55℃에서 1분내에 완전히 불활성화 되었고 50℃에서는 1분내에 거의 완전히 불활성화 되었다.
일단계 RT - PCR 의 효율에 대한 자연발생형과 판달루스 보레알리스 DNase 및 P214A 돌연변이체의 효과
Brilliant QRT-PCR Master Mix kit 1-step (Stratagene)을 사용하고, Smart Cycler II (Cepheid)에서 열처리 반복순환 및 검출함으로써 일단계qRT-PCR 증폭반응을 수행하였다.
상기 반응 믹스(25 μl)에는 12.5 μl 2X QRT-PCR 마스터 믹스, 1.25 μl 20x 프라이머/프로브 믹스 (GAPDH HS99999905_m1, Applied Biosystems), 0.1 μl Stratascript 역전사효소, 및 1 μl DNase 효소가 포함된다. 주형으로서, 1 μl (1 ng/μl) Stratagene QPCR Human Reference Total RNA (Stratagene)를 사용하였다. 각 반응 혼합물을 30℃에서 15 분간 예비처리하였다. 다음, 일-단계 역전사 PCR을 50℃에서 30분, 95℃에서 10분간 수행한 후 94℃에서 15초, 60℃에서 1분간의 45 사이클을 수행하였다.
도 10에 나타난 바와 같이, P214A 돌연변이체를 함유한 샘플에서 RT-PCR 효율에 대하여 효과가 거의 없거나 아무 효과도 관찰되지 않는다. 한편, 자연발생형 뉴클레아제는 RT-PCR의 효율에 상당한 영향을 끼쳤다.
P214A 에 대한 ds / ssDNA 특이성의 분석
5' 말단에서 형광단 FAM (플루오레세인) 및 3' 말단에서 TAMRA로 표지된 올리고뉴클레오타이드로부터 형광을 측정함으로써 P214A에 대한 이중 및 단일쇄 DNA의 특이성을 시험하였다. 뉴클레아제에 의한 올리고뉴클레오타이드 절단은 FAM으로부터 형광 증가를 결과하며 이는 여기 파장 485 nm 및 방출 파장 520 nm를 구비한 형광기기에서 측정된다. 표지된 올리고뉴클레오타이드를 이 표지된 올리고뉴클레오타이드와 상보적인 제2 올리고뉴클레오타이드와 혼합함으로써 이중쇄 DNA 기질을 제조하였다.
37 유닛의 P214A 돌연변이체를 50 mM Tris/HCl, pH 8.0, 5 mM MgCl2 및 0.2 μM 표지된 올리고뉴클레오타이드 (DNAsub)를 함유한 반응혼합물 (총 부피 100 μL)에 첨가하였다. 상기 혼합물을 형광현미경용 백색 웰 마이크로타이터플레이트에서 25℃로 처리하였다.
유사하게, 0.2 μM 상보적 올리고뉴클레오타이드, compDNAsub를 상기 반응 혼합물에 첨가하여 이중쇄 DNA 기질을 제조하였다. 다음 0.01 Unit P214A 돌연변이체를 상기 반응 혼합물에 첨가하였다.
시간에 따른 형광을 Victor3 기기에서 측정하고 활성을 분당 형광 처음 증가로서 계산하되 뉴클레아제가 없는 (블랭크 반응) 형광의 증가에 대해 교정하고, (형광 유닛/분)/군니츠 유닛으로 표시하였다.
이중쇄 DNA 기질에 대해서는, 그 결과는 211,922 (형광 유닛/분)/쿤니츠 유닛이었고, 단일쇄 DNA 기질에 대해서는 10.4 (형광 유닛/분)/쿤니츠 유닛이었다. 따라서, 이중쇄 DNA 기질은 단일쇄 DNA보다 20,366 빠른 속도로 분해되었다.
올리고뉴클레오타이드:
DNAsub: 5'-FAM-CGCCATCGGAGGTTC-TAMRA-S3' [서열번호 14]
compDNAsub: 5'-GAACCTCCGATGGCG-3' [서열번호 15]
P214A 돌연변이체를 이용한 qPCR 오염제거
재료 및 방법
에스케리키아 콜리 TOP10 게놈 DNA를 DNeasy Blood and Tissue Kit (Qiagen)를 사용하여 분리하였고, Quant-iT dsDNA BR assay kit 및 Qubit fluoremeter (Life Technologies)를 사용하여 DNA 농도를 측정하였다. 정량적 PCR (qPCR)을 사용하여 E. coli 게놈 DNA를 검출 및 정량하기 위해, 고도로 보존된 23S rRNA 유전자의 적은 부위를 사용하여 (Smith GJ III 등; 1999; Biotechniques 26(3):518-22, 524, 526)에 설명된 프라이머/프로브 세트를 고안하였다. 이러한 유전자는 E. coli 게놈 내에 7 개 복제수로 존재한다.
일반적으로, 12.5 μl 2x Brilliant qPCR master mix (Stratagene) 또는 TaqMan Gene Expression master mix(Applied Biosystems), 3 μM 각 프라이머 및 1 μM 프로브, 1 mM DTT, 1 또는 10 pg E. coli 게놈 DNA, 및 다양한 양의 P214A 돌연변이체 효소나 DNasel (Sigma)를 포함하는 25 μl 반응을 사용하여 Smart Cycler II (Cepheid)에서 qPCR을 수행하였다. qPCR 반응은 하기와 같이 수행하였다: 95℃에서 10 분간 후, 95℃에서 15초간 및 60℃에서 1 분간의 40 사이클.
프라이머/프로브:
Ecoli_23S_fwd: 5'-GAAAGGCGCGCGATACAG -3' [서열번호 16]
Ecoli_23S_rev: 5'-GTCCCGCCCTACTCATCG A-3'[서열번호 17]
Ecoli_23S_프로브: 5'-FAM-CCCCGTACACAAAAATGCACATGCTG-BHQ-S3'[서열번호 18]
프라이머/프로브 온전성 (ssDNA)에 대한 P214A 돌연변이체의 효과
본 실험은 P214A 돌연변이체가 qPCR mix에 있는 프라이머/프로브를 분해하여 (즉 단일쇄 DNA의 분해) qPCR 방법에 저해 효과를 가지는 것인가를 시험하였다.
전술한 반응 믹스들 (Brilliant qPCR master mix)을 주형 (E. coli 게놈성) DNA 없이 설정하고 37℃에서 10 분간 배양하였다. 95℃에서 10 분간 불활성화 단계 후, 10 pg E. coli 게놈 DNA을 주형으로서 첨가하였다. 다음, 전술한 바와 같이 qPCR 증폭하였다.
상기 37℃ 배양 단계는 P214A 돌연변이체가 DNA 분해를 촉매하게 한다. 95℃에서 10 분간 열처리는 상기 돌연변이체를 완전히 불활성화하게 한 후, 주형 DNA를 첨가한다. 따라서, qPCR 결과를 저해하는 것은 오로지 ssDNA에 대한 뉴클레아제 활성 때문일 수 있다 (상기 프라이머/프로브는 이전에 분해되었다). 도 12에 나타난 바와 같이, qPCR 결과는 P214A 돌연변이체를 1 U까지 첨가하여도 영향을 받지 않고, 이는 qPCR 반응 믹스에 있는 프라이머/프로브에 대하여 측정할만한 활성을 가지지 않는다는 것을 나타낸다.
DNasel 및 P214A 돌연변이체의 이열성에 대한 qPCR 방법상의 비교
전술한 반응 믹스를 주형 DNA없이 DNasel (1U) 또는 P214A (1 U) 존재 또는 부존재하에서 설정하였다. 37℃에서 10 분간 배양후 50℃ 또는 55℃에서 15 분간 불활성화 단계를 실시하였다. 1 pg의 E. coli 게놈 DNA을 상기 혼합물에 첨가하고 qPCR를 전술한 바와 같이 실시하였다.
가변적 반응 설정-시간을 qPCR 실험으로 설명하기 위해, 상기 반응 믹스들을 실온에서 15분간 처리한 후 증폭하였다. 반응 믹스에서 임의의 잔류 활성으로 인해 주형 DNA가 분해되며 qPCR 결과가 저해될 것이다.
도 13에 설명된 바와 같이, P214A 돌연변이체는 대조군 반응물 (대조군 (-Enz); 효소 무첨가)에 비해 qPCR를 저해하지 않고, 따라서 이 실험에서, 15 분 50℃ 배양 단계에 의해 완전히 불활성화된 것으로 간주될 수 있다. DNasel 효소는 불활성화되지 않았고, Ct는 8 이상을 전이하였고, 이는 불활성화 단계 이후에 높은 잔류 활성 또는/및 반응 믹스에 있는 프라이머/프로브에 대한 활성을 나타낸다.
qPCR 반응 혼합물로부터 스파이크된 DNA의 제거
"오염" DNA를 제거하는 P214A 돌연변이체의 능력을 시험하기 위해, 전술한 qPCR 반응 믹스(TaqMan Gene Expression master mix)에 대한 다양한 양의 P214A 돌연변이체를 spiked with 1 pg의 E. coli 게놈 DNA로 스파이크하였다. 다음, 반응 혼합물을 10 분간 37℃에서, 배양후 60℃에서 15 분간 배양하였다. 결과를 도 14에 도시하고 있다. 나타난 바와 같이, 25μl 반응 혼합물당 0.25 U 이상의 P214A 돌연변이체는 Ct를 8이상 만큼 증가시키게 한다. 이것은 스파이크된 DNA의 농도를 >250 배 감소시키는 것을 가르킨다.
전술한 개별 결과에 더하여, 무 주형 대조군 (NTC)은 Brilliant qPCR master mix (Stratagene), 및 TaqMan Gene Expression Master mix (Applied Biosystems) 둘 다에 대하여 양성 결과를 나타내는 것에 주목해야 한다. 이것은 세균을 검출하거나 진단하기 위한 세균 또는 E. coli DNA를 표적하는 통상의 프라이머를 사용할 때 qPCR 믹스에서 오염 DNA의 문제를 보여주는 것이다.
일단계 RT - PCR 의 효율에 대한 P214A 돌연변이체의 효과
실시예 5에 설명된 실험을 몇 가지 농도의 P214A 돌연변이체를 사용하여 반복하여 효소의 증가하는 양이 어떻게 RT-PCR 반응의 민감도에 영향을 끼치는 지를 조사하였다. DNase의 0 내지 1 U 범위의 5 개 다른 농도를 시험하였고 결과를 도 15에 도시하였다. 0.1-0.5 U의 DNase 를 사용하는 것은 RT-PCR의 민감도에 영향을 끼치지 않았다. 1 U의 효소를 사용하는 것은 민감도를 1.5의 Ct 만큼 감소시켰다.
상업적 PCR 생성물로부터 세균성 DNA 의 오염물 제거
미량의 세균성 DNA가 종종 상업적 핵산 증폭반응 혼합물 (소위 "마스터 믹스")에 존재하는 것이 보여졌다 (실시예 7). 병원균을 검출하는 qPCR 실험에서, 이러한 오염물의 증폭이 무 주형 대조군들(NTCs)을 위시한 위양성 결과로 이어지기 때문에 종종 문제가 된다. 본 실험에서는, 1 U의 P214A 돌연변이체 DNase를 4 개 상이한 공급사로부터 수득한 qPCR 마스터 믹스들에 첨가하고 10분간 37℃에서 예비배양하였다. 이후, 마스터 믹스를 60℃에서 15분간 배양하고 실시예 7에서 설명한 바와 같이, 비처리 마스터 믹스와 qPCR 반응에서 비교하였다. 아무런 주형도 어떠한 반응에 첨가하지 않았다. 결과를 도 16에 도시하였고 상기 효소로 예비 배양된 마스터 믹스만이 음성 NTC를 나타내고 있다.
<110> Biotec Pharmacon ASA <120> A method of removing nucleic acid contamination in reverse transcription and amplification reactions <130> PIA01382GB <150> PCT/GB 10/01384 <151> 2010-07-21 <150> GB 0912637.6 <151> 2009-07-21 <150> US 61/235177 <151> 2009-08-19 <160> 19 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 404 <212> PRT <213> Pandalus borealis <220> <221> SIGNAL <222> (1)..(23) <400> 1 Met Ile Gly Arg Thr Thr Phe Ile Ala Leu Phe Val Lys Val Leu Thr 1 5 10 15 Ile Trp Ser Phe Thr Lys Gly Glu Asp Cys Val Trp Asp Asn Asp Val 20 25 30 Asp Tyr Pro Glu Tyr Pro Pro Leu Ile Leu Asp Ser Ser Phe Gln Leu 35 40 45 Val Leu Pro Val Leu Glu Gly Asp Gln Arg Ile Thr Ser Val Gln Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Leu Ile Leu Ala Cys Pro Gly Arg Gly Ile Ser Ala Leu 65 70 75 80 Gly Ser Glu Asp Ala Gln Ala Thr Cys Leu Gly Gly Lys Leu Val Glu 85 90 95 Val Asp Gly Lys Glu Trp Asn Ile Val Glu Leu Gly Cys Thr Lys Met 100 105 110 Ala Ser Glu Thr Ile His Arg Asn Leu Gly Gln Cys Gly Asp Gln Asp 115 120 125 Leu Gly Ile Tyr Glu 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agt aag ctg atc ttg gct tgt 238 Gln Arg Ile Thr Ser Val Gln Ser Gly Ser Lys Leu Ile Leu Ala Cys 60 65 70 cct ggg agg gga att tca gcc ctg ggg tca gag gat gca caa gcc act 286 Pro Gly Arg Gly Ile Ser Ala Leu Gly Ser Glu Asp Ala Gln Ala Thr 75 80 85 tgt ctt ggt ggc aag ctc gtc gaa gtc gat ggc aaa gaa tgg aat ata 334 Cys Leu Gly Gly Lys Leu Val Glu Val Asp Gly Lys Glu Trp Asn Ile 90 95 100 gtc gaa ctc ggc tgc aca aaa atg gca tct gaa acc atc cat aga aac 382 Val Glu Leu Gly Cys Thr Lys Met Ala Ser Glu Thr Ile His Arg Asn 105 110 115 120 ctt gga caa tgt ggt gat caa gac ctg gga att tac gaa gtc att ggt 430 Leu Gly Gln Cys Gly Asp Gln Asp Leu Gly Ile Tyr Glu Val Ile Gly 125 130 135 ttc gac ctt cca aca acg gga cac ttc tat gaa ttg ata cga gtt tgc 478 Phe Asp Leu Pro Thr Thr Gly His Phe Tyr Glu Leu Ile Arg Val Cys 140 145 150 ttt gac ccg gca aat gag acc act att ttt tcc gag aac atc gtt cac 526 Phe Asp Pro Ala Asn Glu Thr Thr Ile Phe Ser Glu Asn Ile Val His 155 160 165 gga gcc agc atc gcc gcc aaa gac 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acggcatgtt tcattcagaa gttttcaaga 1550 tattgattgc cattctcgat ttcttgaaag atgtgcacac atgtggagaa gaaatgtaaa 1610 catcttaaaa ttcatactct ggatatccag atattatgca cacaaaatgt caagtctcct 1670 gcctgcttct ttggaaagat gtgcatatgc acgcacatgt aaccatgaga ttcacaaaat 1730 gtaatcatct cttaatcaaa acctaatcag tcattcaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1790 a 1791 <210> 7 <211> 381 <212> PRT <213> Pandalus borealis <400> 7 Glu Asp Cys Val Trp Asp Asn Asp Val Asp Tyr Pro Glu Tyr Pro Pro 1 5 10 15 Leu Ile Leu Asp Ser Ser Phe Gln Leu Val Leu Pro Val Leu Glu Gly 20 25 30 Asp Gln Arg Ile Thr Ser Val Gln Ser Gly Ser Lys Leu Ile Leu Ala 35 40 45 Cys Pro Gly Arg Gly Ile Ser Ala Leu Gly Ser Glu Asp Ala Gln Ala 50 55 60 Thr Cys Leu Gly Gly Lys Leu Val Glu Val Asp Gly Lys Glu Trp Asn 65 70 75 80 Ile Val Glu Leu Gly Cys Thr Lys Met Ala Ser Glu Thr Ile His Arg 85 90 95 Asn Leu Gly Gln Cys Gly Asp Gln Asp Leu Gly Ile Tyr Glu Val Ile 100 105 110 Gly Phe Asp Leu Pro Thr Thr Gly His Phe Tyr Glu Leu Ile Arg Val 115 120 125 Cys Phe Asp Pro Ala Asn Glu Thr Thr Ile Phe Ser Glu Asn Ile Val 130 135 140 His Gly Ala Ser Ile Ala Ala Lys Asp Ile Asp Pro Gly Arg Pro Ser 145 150 155 160 Phe Lys Thr Ser Thr Gly Phe Phe Ser Val Ser Met Ile Ser Val Tyr 165 170 175 Ser Gln Arg Ser Gln Leu Glu Leu Met Lys Asn Leu Leu Gly Asp Asp 180 185 190 Glu Leu Ala Ala Thr Ile Ile Asp Pro Ser Glu Gln Phe Tyr Phe Ala 195 200 205 Lys Gly His Met Ala Pro Asp Ala Asp Phe Val Thr Val Val Glu Gln 210 215 220 Asp Ala Thr Tyr Tyr Tyr Ile Asn Ala Leu Pro Gln Trp Gln Ala Phe 225 230 235 240 Asn Asn Gly Asn Trp Lys Tyr Leu Glu Tyr Asp Thr Arg Asp Leu Ala 245 250 255 Glu Lys His Gly Thr Asp Leu Thr Val Tyr Ser Gly Gly Trp Gly Val 260 265 270 Leu Glu Leu Glu Asp Ile Asn Gly Asn Pro Val Glu Ile Tyr Leu Gly 275 280 285 Leu Ala Gln Asp Lys Lys Val Val Pro Ala Pro Ala Leu Thr Trp Lys 290 295 300 Val Ile Tyr Glu Lys Asp Thr Asn Arg Ala Ala Ala Ile Val Gly Ile 305 310 315 320 Asn Asn Pro His Ile Thr Thr Ala Pro Glu Pro Leu Cys Thr Asp Ile 325 330 335 Cys Ser Ser Leu Thr Trp Leu Asp Phe Asp Phe Gly Asp Leu Val His 340 345 350 Gly Tyr Thr Tyr Cys Cys Ser Val Ala Asp Leu Arg Ala Ala Ile Pro 355 360 365 Asn Val Pro Asp Leu Gly Asp Val Asp Ile Leu Asp Glu 370 375 380 <210> 8 <211> 1146 <212> DNA <213> Pandalus borealis <220> <221> CDS <222> (1)..(1143) <400> 8 gag gac tgt gtc tgg gac aat gat gta gac tat cct gag tat cct cct 48 Glu Asp Cys Val Trp Asp Asn Asp Val Asp Tyr Pro Glu Tyr Pro Pro 1 5 10 15 ctg atc ctg gat tca tcc ttt cag ctg gtt ctg cca gtg ttg gaa gga 96 Leu Ile Leu Asp Ser Ser Phe Gln Leu Val Leu Pro Val Leu Glu Gly 20 25 30 gac caa agg ata acc agt gtc caa tct ggg agt aag ctg atc ttg gct 144 Asp Gln Arg Ile Thr Ser Val Gln Ser Gly Ser Lys Leu Ile Leu Ala 35 40 45 tgt cct ggg agg gga att tca gcc ctg ggg tca gag gat gca caa gcc 192 Cys Pro Gly Arg Gly Ile Ser Ala Leu Gly Ser Glu Asp Ala Gln Ala 50 55 60 act tgt ctt ggt ggc aag ctc gtc gaa gtc gat ggc aaa gaa tgg aat 240 Thr Cys Leu Gly Gly Lys Leu Val Glu Val Asp Gly Lys Glu Trp Asn 65 70 75 80 ata gtc gaa ctc ggc tgc aca aaa atg gca tct gaa acc atc cat aga 288 Ile Val Glu Leu Gly Cys Thr Lys Met Ala Ser Glu Thr Ile His Arg 85 90 95 aac ctt gga caa tgt ggt gat caa gac ctg gga att tac gaa gtc att 336 Asn Leu Gly Gln Cys Gly Asp Gln Asp Leu Gly Ile Tyr Glu Val Ile 100 105 110 ggt ttc gac ctt cca aca acg gga cac ttc tat gaa ttg ata cga gtt 384 Gly Phe Asp Leu Pro Thr Thr Gly His Phe Tyr Glu Leu Ile Arg Val 115 120 125 tgc ttt gac ccg gca aat gag acc act att ttt tcc gag aac atc gtt 432 Cys Phe Asp Pro Ala Asn Glu Thr Thr Ile Phe Ser Glu Asn Ile Val 130 135 140 cac gga gcc agc atc gcc gcc aaa gac att gac ccg ggt cgt cca tct 480 His Gly Ala Ser Ile Ala Ala Lys Asp Ile Asp Pro Gly Arg Pro Ser 145 150 155 160 ttc aaa aca tcc act ggg ttc ttc agt gta tcg atg ata tct gtc tat 528 Phe Lys Thr Ser Thr Gly Phe Phe Ser Val Ser Met Ile Ser Val Tyr 165 170 175 tcg caa aga agt cag ctg gag ctc atg aag aac ctc tta gga gat gat 576 Ser Gln Arg Ser Gln Leu Glu Leu Met Lys Asn Leu Leu Gly Asp Asp 180 185 190 gaa tta gct gcg aca atc atc gat cct tca gag cag ttc tac ttt gct 624 Glu Leu Ala Ala Thr Ile Ile Asp Pro Ser Glu Gln Phe Tyr Phe Ala 195 200 205 aaa gga cat atg gct cct gac gcg gac ttt gtg aca gta gtt gag cag 672 Lys Gly His Met Ala Pro Asp Ala Asp Phe Val Thr Val Val Glu Gln 210 215 220 gac gca aca tac tat tac atc aac gcg ttg cct caa tgg cag gcc ttt 720 Asp Ala Thr Tyr Tyr Tyr Ile Asn Ala Leu Pro Gln Trp Gln Ala Phe 225 230 235 240 aac aat gga aac tgg aag tac ttg gaa tac gac acc cgt gac ctg gct 768 Asn Asn Gly Asn Trp Lys Tyr Leu Glu Tyr Asp Thr Arg Asp Leu Ala 245 250 255 gaa aaa cat ggc act gac ctg acc gtc tac agt ggt ggc tgg ggg gtt 816 Glu Lys His Gly Thr Asp Leu Thr Val Tyr Ser Gly Gly Trp Gly Val 260 265 270 cta gag ctt gaa gac atc aac gga aac ccc gtt gaa atc tat ctt ggc 864 Leu Glu Leu Glu Asp Ile Asn Gly Asn Pro Val Glu Ile Tyr Leu Gly 275 280 285 ctc gcc cag gac aaa aaa gtt gtc cct gct cct gca tta aca tgg aag 912 Leu Ala Gln Asp Lys Lys Val Val Pro Ala Pro Ala Leu Thr Trp Lys 290 295 300 gtg atc tat gag aag gac act aac cga gct gct gct att gtt gga ata 960 Val Ile Tyr Glu Lys Asp Thr Asn Arg Ala Ala Ala Ile Val Gly Ile 305 310 315 320 aac aac ccc cac atc acc acg gca cca gaa cct ctt tgt acc gac atc 1008 Asn Asn Pro His Ile Thr Thr Ala Pro Glu Pro Leu Cys Thr Asp Ile 325 330 335 tgc tcc agc ctc aca tgg ctg gac ttt gat ttt ggg gac ctt gtc cat 1056 Cys Ser Ser Leu Thr Trp Leu Asp Phe Asp Phe Gly Asp Leu Val His 340 345 350 ggc tac acc tac tgc tgc tct gta gct gat ctc agg gca gcc att ccc 1104 Gly Tyr Thr Tyr Cys Cys Ser Val Ala Asp Leu Arg Ala Ala Ile Pro 355 360 365 aat gtt cca gat tta gga gac gtt gat atc tta gac gaa taa 1146 Asn Val Pro Asp Leu Gly Asp Val Asp Ile Leu Asp Glu 370 375 380 <210> 10 <211> 381 <212> PRT <213> Pandalus borealis <220> <221> MUTAGEN <222> (214) <400> 10 Glu Asp Cys Val Trp Asp Asn Asp Val Asp Tyr Pro Glu Tyr Pro Pro 1 5 10 15 Leu Ile Leu Asp Ser Ser Phe Gln Leu Val Leu Pro Val Leu Glu Gly 20 25 30 Asp Gln Arg Ile Thr Ser Val Gln Ser Gly Ser Lys Leu Ile Leu Ala 35 40 45 Cys Pro Gly Arg Gly Ile Ser Ala Leu Gly Ser Glu Asp Ala Gln Ala 50 55 60 Thr Cys Leu Gly Gly Lys Leu Val Glu Val Asp Gly Lys Glu Trp Asn 65 70 75 80 Ile Val Glu Leu Gly Cys Thr Lys Met Ala Ser Glu Thr Ile His Arg 85 90 95 Asn Leu Gly Gln Cys Gly Asp Gln Asp Leu Gly Ile Tyr Glu Val Ile 100 105 110 Gly Phe Asp Leu Pro Thr Thr Gly His Phe Tyr Glu Leu Ile Arg Val 115 120 125 Cys Phe Asp Pro Ala Asn Glu Thr Thr Ile Phe Ser Glu Asn Ile Val 130 135 140 His Gly Ala Ser Ile Ala Ala Lys Asp Ile Asp Pro Gly Arg Pro Ser 145 150 155 160 Phe Lys Thr Ser Thr Gly Phe Phe Ser Val Ser Met Ile Ser Val Tyr 165 170 175 Ser Gln Arg Ser Gln Leu Glu Leu Met Lys Asn Leu Leu Gly Asp Asp 180 185 190 Glu Leu Ala Ala Thr Ile Ile Asp Pro Ser Glu Gln Phe Tyr Phe Ala 195 200 205 Lys Gly His Met Ala Ala Asp Ala Asp Phe Val Thr Val Val Glu Gln 210 215 220 Asp Ala Thr Tyr Tyr Tyr Ile Asn Ala Leu Pro Gln Trp Gln Ala Phe 225 230 235 240 Asn Asn Gly Asn Trp Lys Tyr Leu Glu Tyr Asp Thr Arg Asp Leu Ala 245 250 255 Glu Lys His Gly Thr Asp Leu Thr Val Tyr Ser Gly Gly Trp Gly Val 260 265 270 Leu Glu Leu Glu Asp Ile Asn Gly Asn Pro Val Glu Ile Tyr Leu Gly 275 280 285 Leu Ala Gln Asp Lys Lys Val Val Pro Ala Pro Ala Leu Thr Trp Lys 290 295 300 Val Ile Tyr Glu Lys Asp Thr Asn Arg Ala Ala Ala Ile Val Gly Ile 305 310 315 320 Asn Asn Pro His Ile Thr Thr Ala Pro Glu Pro Leu Cys Thr Asp Ile 325 330 335 Cys Ser Ser Leu Thr Trp Leu Asp Phe Asp Phe Gly Asp Leu Val His 340 345 350 Gly Tyr Thr Tyr Cys Cys Ser Val Ala Asp Leu Arg Ala Ala Ile Pro 355 360 365 Asn Val Pro Asp Leu Gly Asp Val Asp Ile Leu Asp Glu 370 375 380 <210> 11 <211> 1146 <212> DNA <213> Pandalus borealis <220> <221> CDS <222> (1)..(1143) <220> <221> mutation <222> (640) <400> 11 gag gac tgt gtc tgg gac aat gat gta gac tat cct gag tat cct cct 48 Glu Asp Cys Val Trp Asp Asn Asp Val Asp Tyr Pro Glu Tyr Pro Pro 1 5 10 15 ctg atc ctg gat tca tcc ttt cag ctg gtt ctg cca gtg ttg gaa gga 96 Leu Ile Leu Asp Ser Ser Phe Gln Leu Val Leu Pro Val Leu Glu Gly 20 25 30 gac caa agg ata acc agt gtc caa tct ggg agt aag ctg atc ttg gct 144 Asp Gln Arg Ile Thr Ser Val Gln Ser Gly Ser Lys Leu Ile Leu Ala 35 40 45 tgt cct ggg agg gga att tca gcc ctg ggg tca gag gat gca caa gcc 192 Cys Pro Gly Arg Gly Ile Ser Ala Leu Gly Ser Glu Asp Ala Gln Ala 50 55 60 act tgt ctt ggt ggc aag ctc gtc gaa gtc gat ggc aaa gaa tgg aat 240 Thr Cys Leu Gly Gly Lys Leu Val Glu Val Asp Gly Lys Glu Trp Asn 65 70 75 80 ata gtc gaa ctc ggc tgc aca aaa atg gca tct gaa acc atc cat aga 288 Ile Val Glu Leu Gly Cys Thr Lys Met Ala Ser Glu Thr Ile His Arg 85 90 95 aac ctt gga caa tgt ggt gat caa gac ctg gga att tac gaa gtc att 336 Asn Leu Gly Gln Cys Gly Asp Gln Asp Leu Gly Ile Tyr Glu Val Ile 100 105 110 ggt ttc gac ctt cca aca acg gga cac ttc tat gaa ttg ata cga gtt 384 Gly Phe Asp Leu Pro Thr Thr Gly His Phe Tyr Glu Leu Ile Arg Val 115 120 125 tgc ttt gac ccg gca aat gag acc act att ttt tcc gag aac atc gtt 432 Cys Phe Asp Pro Ala Asn Glu Thr Thr Ile Phe Ser Glu Asn Ile Val 130 135 140 cac gga gcc agc atc gcc gcc aaa gac att gac ccg ggt cgt cca tct 480 His Gly Ala Ser Ile Ala Ala Lys Asp Ile Asp Pro Gly Arg Pro Ser 145 150 155 160 ttc aaa aca tcc act ggg ttc ttc agt gta tcg atg ata tct gtc tat 528 Phe Lys Thr Ser Thr Gly Phe Phe Ser Val Ser Met Ile Ser Val Tyr 165 170 175 tcg caa aga agt cag ctg gag ctc atg aag aac ctc tta gga gat gat 576 Ser Gln Arg Ser Gln Leu Glu Leu Met Lys Asn Leu Leu Gly Asp Asp 180 185 190 gaa tta gct gcg aca atc atc gat cct tca gag cag ttc tac ttt gct 624 Glu Leu Ala Ala Thr Ile Ile Asp Pro Ser Glu Gln Phe Tyr Phe Ala 195 200 205 aaa gga cat atg gct gct gac gcg gac ttt gtg aca gta gtt gag cag 672 Lys Gly His Met Ala Ala Asp Ala Asp Phe Val Thr Val Val Glu Gln 210 215 220 gac gca aca tac tat tac atc aac gcg ttg cct caa tgg cag gcc ttt 720 Asp Ala Thr Tyr Tyr Tyr Ile Asn Ala Leu Pro Gln Trp Gln Ala Phe 225 230 235 240 aac aat gga aac tgg aag tac ttg gaa tac gac acc cgt gac ctg gct 768 Asn Asn Gly Asn Trp Lys Tyr Leu Glu Tyr Asp Thr Arg Asp Leu Ala 245 250 255 gaa aaa cat ggc act gac ctg acc gtc tac agt ggt ggc tgg ggg gtt 816 Glu Lys His Gly Thr Asp Leu Thr Val Tyr Ser Gly Gly Trp Gly Val 260 265 270 cta gag ctt gaa gac atc aac gga aac ccc gtt gaa atc tat ctt ggc 864 Leu Glu Leu Glu Asp Ile Asn Gly Asn Pro Val Glu Ile Tyr Leu Gly 275 280 285 ctc gcc cag gac aaa aaa gtt gtc cct gct cct gca tta aca tgg aag 912 Leu Ala Gln Asp Lys Lys Val Val Pro Ala Pro Ala Leu Thr Trp Lys 290 295 300 gtg atc tat gag aag gac act aac cga gct gct gct att gtt gga ata 960 Val Ile Tyr Glu Lys Asp Thr Asn Arg Ala Ala Ala Ile Val Gly Ile 305 310 315 320 aac aac ccc cac atc acc acg gca cca gaa cct ctt tgt acc gac atc 1008 Asn Asn Pro His Ile Thr Thr Ala Pro Glu Pro Leu Cys Thr Asp Ile 325 330 335 tgc tcc agc ctc aca tgg ctg gac ttt gat ttt ggg gac ctt gtc cat 1056 Cys Ser Ser Leu Thr Trp Leu Asp Phe Asp Phe Gly Asp Leu Val His 340 345 350 ggc tac acc tac tgc tgc tct gta gct gat ctc agg gca gcc att ccc 1104 Gly Tyr Thr Tyr Cys Cys Ser Val Ala Asp Leu Arg Ala Ala Ile Pro 355 360 365 aat gtt cca gat tta gga gac gtt gat atc tta gac gaa taa 1146 Asn Val Pro Asp Leu Gly Asp Val Asp Ile Leu Asp Glu 370 375 380 <210> 13 <211> 23 <212> PRT <213> Pandalus borealis <220> <221> SIGNAL <222> (1)..(23) <400> 13 Met Ile Gly Arg Thr Thr Phe Ile Ala Leu Phe Val Lys Val Leu Thr 1 5 10 15 Ile Trp Ser Phe Thr Lys Gly 20 <210> 14 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' FAM and 3' TAMRA labelled oligonucleotide probe for measuring DNase activity <400> 14 cgccatcgga ggttc 15 <210> 15 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> complementary sequence of SEQ ID No. 10 <400> 15 gaacctccga tggcg 15 <210> 16 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for amplifying a section of the E. coli 23SrRNA gene <400> 16 gaaaggcgcg cgatacag 18 <210> 17 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for amplifying a section of the E. coli 23SrRNA <400> 17 gtcccgccct actcatcga 19 <210> 18 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' FAM and 3' BHQ labelled oligonucleotide probe complementary to a section of the E. coli 23SrRNA gene between the regions complementary to SEQ ID No. 13 and SEQ ID No. 14 <400> 18 ccccgtacac aaaaatgcac atgctg 26 <210> 19 <211> 381 <212> PRT <213> Paralithodes camtschatica <400> 19 Gln Asp Cys Val Trp Asp Lys Asp Thr Asp Phe Pro Glu Asp Pro Pro 1 5 10 15 Leu Ile Phe Asp Ser Asn Leu Glu Leu Ile Arg Pro Val Leu Glu Asn 20 25 30 Gly Lys Arg Ile Val Ser Val Pro Ser Gly Ser Ser Leu Thr Leu Ala 35 40 45 Cys Ser Gly Ser Glu Leu Ile Asn Leu Gly Met Glu Ala Val Glu Ala 50 55 60 Lys Cys Ala Gly Gly Val Met Leu Ala Ile Glu Gly Thr Glu Trp Glu 65 70 75 80 Ile Trp Ser Leu Gly Cys Ser Asn His Val Lys Glu Thr Ile Arg Arg 85 90 95 Asn Leu Gly Thr Cys Gly Glu Ala Asp Gln Gly Asp Arg His Ser Ile 100 105 110 Gly Phe Glu Tyr Tyr Gly Gly Ser Ile Tyr Tyr Glu Leu Ile Ser Val 115 120 125 Cys Phe Gly Pro Val Ser Glu Thr Thr Leu Arg Thr Glu His Val Leu 130 135 140 His Gly Ala Asn Ile Ala Ala Lys Asp Ile Glu Thr Ser Arg Pro Ser 145 150 155 160 Phe Lys Thr Ser Thr Gly Phe Phe Ser Val Ser Met Ser Thr Val Tyr 165 170 175 Ser Gln Ala Ser Gln Leu Gln Leu Met Thr Asp Ile Leu Gly Asp Ser 180 185 190 Asp Leu Ala Asn Asn Ile Ile Asp Pro Ser Gln Gln Leu Tyr Phe Ala 195 200 205 Lys Gly His Met Ser Pro Asp Ala Asp Phe Val Thr Val Ala Glu Gln 210 215 220 Asp Ala Thr Tyr Tyr Phe Ile Asn Ala Leu Pro Gln Trp Gln Ala Phe 225 230 235 240 Asn Asn Gly Asn Trp Lys Tyr Leu Glu Tyr Ala Thr Arg Asp Leu Ala 245 250 255 Glu Ser His Gly Ser Asp Leu Arg Val Tyr Ser Gly Gly Trp Ser Leu 260 265 270 Leu Gln Leu Asp Asp Ile Asn Gly Asn Pro Val Asp Ile Leu Leu Gly 275 280 285 Leu Ser Glu Gly Lys Glu Val Val Pro Val Pro Ser Leu Thr Trp Lys 290 295 300 Val Val Tyr Glu Glu Ser Ser Ser Lys Ala Ala Ala Ile Val Gly Ile 305 310 315 320 Asn Asn Pro His Ile Thr Thr Ala Pro Ser Pro Leu Cys Ser Asp Leu 325 330 335 Cys Ser Ser Leu Thr Trp Ile Asp Phe Asn Leu Asp Asp Leu Ala His 340 345 350 Gly Tyr Thr Tyr Cys Cys Ala Val Asp Asp Leu Arg Gln Ala Ile Pro 355 360 365 Tyr Ile Pro Asp Leu Gly Asn Val Gly Leu Leu Thr Asn 370 375 380

Claims (38)

  1. DNase 또는 이의 효소적 활성 단편물에 있어서, 상기 DNase는 서열번호 1 또는 이와 적어도 90% 동일한 서열로 이루어지고, 상기 서열번호 1의 237 위치의 프롤린 잔기 또는 서열번호 1과 적어도 90% 동일한 다른 서열에서 서열번호 1의 237 위치의 프롤린 잔기에 상응하는 프롤린 잔기는 변형, 삭제 또는 치환되며, 상기 DNase 또는 이의 효소적 활성 단편물은 (ⅰ) 25mM TrisHCl, pH 8.5, 5mM MgCl2 및 1mM DTT 을 함유한 완충액에서 50℃의 온도로 5분간 가열함으로써 적어도 95% 비가역적으로 불활성화, 및 (ⅱ) 이중쇄 DNA를 자르지만 0.01 내지 0.05 U/μl의 농도에서 단일쇄 DNA에 대한 활성이 없는 것을 특징으로 하는, DNase 또는 이의 효소적 활성 단편물.
  2. DNase 또는 이의 효소적 활성 단편물에 있어서, 상기 DNase는 서열번호 7 또는 이와 적어도 90% 동일한 서열로 이루어지고, 상기 서열번호 7의 214 위치의 프롤린 잔기 또는 서열번호 7과 적어도 90% 동일한 다른 서열에서 서열번호 7의 214 위치의 프롤린 잔기에 상응하는 프롤린 잔기는 변형, 삭제 또는 치환되며, 상기 DNase 또는 이의 효소적 활성 단편물은 (ⅰ) 25mM TrisHCl, pH 8.5, 5mM MgCl2 및 1mM DTT 을 함유한 완충액에서 50℃의 온도로 5분간 가열함으로써 적어도 95% 비가역적으로 불활성화, 및 (ⅱ) 이중쇄 DNA를 자르지만 0.01 내지 0.05 U/μl의 농도에서 단일쇄 DNA에 대한 활성이 없는 것을 특징으로 하는, DNase 또는 이의 효소적 활성 단편물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 DNase는 서열번호 1의 서열과 적어도 95% 동일한 서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는, DNase 또는 이의 효소적 활성 단편물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 DNase는 서열번호 1의 서열과 적어도 98% 동일한 서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는, DNase 또는 이의 효소적 활성 단편물.
  5. 제2항에 있어서, 상기 DNase는 서열번호 7의 서열과 적어도 95% 동일한 서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는, DNase 또는 이의 효소적 활성 단편물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 DNase는 서열번호 7의 서열과 적어도 98% 동일한 서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는, DNase 또는 이의 효소적 활성 단편물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 DNase는 절지동물문의 종으로부터 얻을 수 있는 DNase의 서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는, DNase 또는 이의 효소적 활성 단편물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 DNase는 갑각아문, 육각아문, 협각아문 또는 다지아문으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아문의 종으로부터 얻을 수 있는 DNase의 서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는, DNase 또는 이의 효소적 활성 단편물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 DNase는 판달루스 보레알리스, 파랄리소데스 캄차카티쿠스 (왕게), 마르수페나에우스 자포니쿠스 (보리새우) 및 페나에우스 자포니쿠스로 이루어진 군으로부터 선택된 종에서 얻을 수 있는 DNase의 서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는, DNase 또는 이의 효소적 활성 단편물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 DNase는 판달루스 보레알리스로부터 얻을 수 있는 DNase의 서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는, DNase 또는 이의 효소적 활성 단편물.
  11. 제1항에 있어서, 상기 DNase는 서열번호 4의 서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는, DNase 또는 이의 효소적 활성 단편물.
  12. 제2항에 있어서, 상기 DNase는 서열번호 10의 서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는, DNase 또는 이의 효소적 활성 단편물.
  13. 제1항 또는 제2항의 DNase 또는 이의 효소적 활성 단편물을 사용하는 것을 포함하는, 역전사 반응으로부터 핵산 오염을 제거하는 방법.
  14. 배리어 핫 스타트 PCR 셋업 또는 핫 스타트 DNA 폴리머라제를 이용한 핫 스타트 PCR로부터 핵산 오염을 제거하는 방법에 있어서, 상기 방법은 제1항 또는 제2항의 DNase 또는 이의 효소적 활성 단편물을 사용하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  15. 제13항에 있어서, 역전사 반응 혼합물 또는 이의 개별성분을 오염 이중쇄 DNA를 절단하는 조건에서 상기 DNase 또는 이의 효소적 활성 단편물과 접촉시킨 후 반응 혼합물을 가열하여 상기 DNase 또는 이의 효소적 활성 단편물을 불활성화시키는 것을 특징으로 하는, 방법.
  16. 제14항에 있어서, 핫 스타트 PCR 셋업, 핫 스타트 PCR 혼합물 또는 이의 개별성분을 오염 이중쇄 DNA를 절단하는 조건에서 상기 DNase 또는 이의 효소적 활성 단편물과 접촉시킨 후 반응 혼합물을 가열하여 상기 DNase 또는 이의 효소적 활성 단편물을 불활성화시키는 것을 특징으로 하는, 방법.
  17. 표적 핵산의 시험관내 역전사 방법에 있어서, 상기 방법은 역전사 반응 개시 전에 역전사 반응 혼합물을 제1항 또는 제2항의 DNase 또는 이의 효소적 활성 단편물로 처리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  18. 제15항에 있어서, 상기 역전사 반응 혼합물은 완전 혼합물이고, 역전사 효소의 작동 온도에서 가열되어 DNase 또는 이의 효소적 활성 단편물을 불활성화시키는 것을 특징으로 하는, 방법.
  19. 제17항에 있어서, 상기 역전사 반응 혼합물은 완전 혼합물이고, 역전사 효소의 작동 온도에서 가열되어 DNase 또는 이의 효소적 활성 단편물을 불활성화시키는 것을 특징으로 하는, 방법.
  20. 제17항에 있어서, 상기 방법은 하기 단계를 포함하는 한 번 이상의 사이클을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법:
    (ⅰ) 프라이머 어닐링 단계;
    (ⅱ) 프라이머 부착된 폴리뉴클레오타이드로부터 사슬 연장 단계; 및
    (ⅲ) 폴리뉴클레오타이드 이중나선 용융 단계.
  21. 제13항에 있어서, 상기 역전사 반응 후에 핵산 증폭반응이 실시되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 핵산 증폭반응은 PCR, LCR, SDA, 3SR 또는 LAMP 인 것을 특징으로 하는, 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 핵산 증폭반응은 PCR 인 것을 특징으로 하는, 방법.
  24. 제22항에 있어서, 상기 역전사 반응 및 상기 증폭반응은 단일 반응 용기 내에서 수행되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  25. 배리어 핫 스타트 PCR 셋업 또는 핫 스타트 DNA 폴리머라제를 이용한 핫 스타트 PCR의 방법에 있어서, 상기 방법은 핫 스타트 PCR의 개시 전에 핫 스타트 PCR 셋업, 핫 스타트 혼합물 또는 핫 스타트 DNA 폴리머라제를 제1항 또는 제2항의 DNase 또는 이의 효소적 활성 단편물로 처리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  26. 제22항에 있어서, 상기 방법은 하기 단계를 포함하는 복수개의 사이클을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법:
    (ⅰ) 폴리뉴클레오타이드 나선 용융 단계;
    (ⅱ) 프라이머 어닐링 단계; 및
    (ⅲ) 프라이머 부착된 폴리뉴클레오타이드로부터 사슬 연장 단계.
  27. 제25항에 있어서, 상기 방법은 하기 단계를 포함하는 복수개의 사이클을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법:
    (ⅰ) 폴리뉴클레오타이드 나선 용융 단계;
    (ⅱ) 프라이머 어닐링 단계; 및
    (ⅲ) 프라이머 부착된 폴리뉴클레오타이드로부터 사슬 연장 단계.
  28. 제1항 또는 제2항의 DNase 또는 이의 효소적 활성 단편물을 암호화하는 핵산 분자.
  29. 제28항에 있어서, 상기 핵산 분자는 서열번호 5 또는 서열번호 11의 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는, 핵산 분자.
  30. 제1항 또는 제2항의 DNase 또는 이의 효소적 활성 단편물을 분리하고 정제하는 방법에 있어서, 상기 방법은 제1항 또는 제2항의 DNase 또는 이의 효소적 활성 단편물을 암호화하는 핵산 분자를 숙주 세포에서 발현시킨 후 상기 DNase 또는 이의 효소적 활성 단편물을 상기 숙주 세포 또는 상기 세포가 배양되어진 배지로부터 분리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  31. 역전사 반응으로부터 핵산 오염을 제거하기 위한 키트 또는 조성물에 있어서, 상기 키트 또는 조성물은 제1항 또는 제2항의 DNase 또는 이의 효소적 활성 단편물, 또는 이를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 것을 특징으로 하는, 키트 또는 조성물.
  32. 제31항에 있어서, 상기 키트 또는 조성물은 하기 중 하나 이상을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 키트 또는 조성물:
    (ⅰ) 뉴클레오타이드 삼인산염;
    (ⅱ) 올리고뉴클레오타이드 프라이머;
    (ⅲ) 역전사 효소;
    (ⅳ) DNA 폴리머라제;
    (ⅴ) DNA 리가제; 또는
    (ⅵ) 제한효소.
  33. 핫 스타트 PCR로부터 핵산 오염을 제거하기 위한 키트 또는 조성물에 있어서, 상기 키트 또는 조성물은 제1항 또는 제2항의 DNase 또는 이의 효소적 활성 단편물, 또는 이를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 것을 특징으로 하는, 키트 또는 조성물.
  34. 제33항에 있어서, 상기 키트 또는 조성물은 하기 중 하나 이상을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 키트 또는 조성물:
    (ⅰ) 뉴클레오타이드 삼인산염;
    (ⅱ) 올리고뉴클레오타이드 프라이머;
    (ⅲ) 역전사 효소;
    (ⅳ) DNA 폴리머라제;
    (ⅴ) DNA 리가제; 또는
    (ⅵ) 제한효소.
  35. 표적 핵산의 시험관내 역전사를 수행하기 위한 키트 또는 조성물에 있어서, 상기 키트 또는 조성물은 제1항 또는 제2항의 DNase 또는 이의 효소적 활성 단편물, 또는 이를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 것을 특징으로 하는, 키트 또는 조성물.
  36. 제35항에 있어서, 상기 키트 또는 조성물은 하기 중 하나 이상을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 키트 또는 조성물:
    (ⅰ) 뉴클레오타이드 삼인산염;
    (ⅱ) 올리고뉴클레오타이드 프라이머;
    (ⅲ) 역전사 효소;
    (ⅳ) DNA 폴리머라제;
    (ⅴ) DNA 리가제; 또는
    (ⅵ) 제한효소.
  37. 핫 스타트 PCR을 수행하기 위한 키트 또는 조성물에 있어서, 상기 키트 또는 조성물은 제1항 또는 제2항의 DNase 또는 이의 효소적 활성 단편물, 또는 이를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 것을 특징으로 하는, 키트 또는 조성물.
  38. 제37항에 있어서, 상기 키트 또는 조성물은 하기 중 하나 이상을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 키트 또는 조성물:
    (ⅰ) 뉴클레오타이드 삼인산염;
    (ⅱ) 올리고뉴클레오타이드 프라이머;
    (ⅲ) 역전사 효소;
    (ⅳ) DNA 폴리머라제;
    (ⅴ) DNA 리가제; 또는
    (ⅵ) 제한효소.
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