ES2562155T3 - Un método para eliminar contaminación de ácidos nucleicos en reacciones de transcripción inversa y amplificación - Google Patents

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Abstract

Una ADNasa o un fragmento enzimáticamente activo de la misma, teniendo dicha ADNasa la secuencia de SEC ID Nº: 1 o una secuencia que es al menos el 60 % idéntica a ella, pero en la que el resto prolina en la posición 237 de SEC ID 5 Nº: 1, o la prolina equivalente en otras secuencias, se ha modificado, suprimido o sustituido, en la que dicha ADNasa o fragmento enzimáticamente activo de la misma es (i) inactivada de forma irreversible en al menos el 95 % mediante calentamiento a una temperatura de 50 ºC durante min en un tampón que consiste en Tris/HCl 25 mM, pH 8,5, MgCl2 5 mM y DTT 1 mM; y (ii) sustancialmente específica para ADN bicatenario.

Description

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arranque en calientes típicas y, así, puede evitarse el impacto perjudicial sobre las propiedades de arranque en caliente de las polimerasas de arranque en caliente.
Las polimerasas de arranque en caliente discutidas anteriormente son solo una estrategia para realizar PCR de arranque en caliente. Otras estrategias evitan que uno o más componentes de la mezcla de reacción de PCR se pongan en contacto con los componentes restantes. Normalmente la polimerasa o el ácido nucleico diana están aislados detrás de, o en, un material (normalmente lípido, por ejemplo una cera) con un punto de fusión a una temperatura que se aproxima a la temperatura catalítica optima de la polimerasa, o al menos a una temperatura a la que la hibridación del cebador es suficientemente específica de secuencia como para evitar o minimizar la amplificación no específica. Por lo tanto, la ADNasa de la invención también permite eliminar contaminación de ácidos nucleicos de estas así llamadas preparaciones de PCR de arranque en caliente “barrera”, sin impacto perjudicial sobre este tipo de PCR de arranque en caliente.
Por lo tanto, la invención proporciona un método para eliminar contaminación de ácidos nucleicos de una PCR de arranque en caliente, en el que dicha reacción es una preparación de PCR de arranque en caliente barrera y/o implica una ADN polimerasa de arranque en caliente, cuyo método comprende el uso de la ADNasa de la invención.
Por lo tanto, la ADNasa de la invención se utiliza para degradar ADN bicatenario que no sea diana presente en la preparación/mezcla de reacción de PCR de arranque en caliente. De este modo se puede reducir o evitar la amplificación no específica.
En particular, el método implica poner en contacto la preparación/mezcla de reacción de la PCR de arranque en caliente con la ADNasa de la invención en condiciones que permitan la digestión de cualquier ADN bicatenario en la misma; calentar dicha preparación/mezcla de reacción para inactivar dicha ADNasa, y posteriormente provocar que dicho ácido nucleico diana a amplificar se ponga en contacto con los restantes componentes de la preparación/mezcla de reacción.
Visto de forma alternativa, este aspecto de la invención proporciona el uso de la ADNasa de la invención en la eliminación de la contaminación de ácidos nucleicos de una reacción de PCR de arranque en caliente, en el que dicha reacción es una reacción de arranque en caliente barrera y/o implica a una polimerasa de arranque en caliente.
La invención también tiene particular utilidad en evitar o limitar la contaminación por arrastre en reacciones de PCR de arranque en caliente, en el que dichas reacciones son reacciones de arranque en caliente barrera y/o implican a una ADN polimerasa de arranque en caliente, y en particular en evitar o reducir resultados positivos falsos debidos a contaminación por arrastre.
En un aspecto adicional la invención también proporciona un método para evitar o reducir resultados positivos falsos debidos a contaminación por arrastre en reacciones de PCR de arranque en caliente, en el que dichas reacciones son reacciones de arranque en caliente barrera y/o implican a una ADN polimerasa de arranque en caliente, comprendiendo dicho método utilizar la ADNasa de la invención para degradar ADN bicatenario que no sea diana arrastrado, presente en la preparación/mezcla de reacción de PCR de arranque en caliente.
La invención también proporciona un método para eliminar la contaminación de ácidos nucleicos de una preparación de ADN polimerasa de arranque en caliente que comprende el uso de la ADNasa de la invención. También se proporciona el uso de una ADNasa de la invención en este método.
Por lo tanto la ADNasa de la invención se usa para degradar ADN bicatenario presente en la preparación de ADN polimerasa de arranque en caliente. En particular, el método implica poner en contacto la preparación de ADN polimerasa de arranque en caliente con la ADNasa de la invención, en condiciones que permitan la digestión de cualquier ADN bicatenario presente en la preparación de ADN polimerasa, y después calentar la preparación para inactivar dicha ADNasa.
La presente invención también proporciona un método de amplificación in vitro, la transcripción inversa o amplificación de PCR de arranque en caliente de un ácido nucleico diana, en el que dicha PCR de arranque en caliente es una reacción de arranque en caliente barrera y/o implica a una ADN polimerasa de arranque en caliente, caracterizado por que dicho método incluye una etapa de tratamiento de la mezcla de reacción, de la preparación de reacción, o de los componentes individuales de la misma con la ADNasa de la invención antes del comienzo de la reacción de amplificación o de transcripción inversa existente.
“Transcripción inversa” es el procedimiento por el cual una ADN polimerasa ARN-dependiente cataliza la formación de una molécula de ADN complementaria a un molde de ARN (ADNc). Más específicamente, la polimerasa cataliza la polimerización de deoxirribonucleósidos trifosfato en una secuencia que es complementaria (es decir, siguiendo las reglas de emparejamiento de bases de Watson-Crick) a una secuencia de ARN molde cebada.
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refiere a preparaciones preparadas de forma comercial de ADN polimerasa de arranque en caliente, es decir un reactivo de ADN polimerasa de arranque en caliente que puede suministrar un proveedor comercial de enzimas de laboratorio, aunque esta expresión también abarca versiones de tales preparaciones diluidas, ajustadas y/o modificadas. La preparación de ADN polimerasa de arranque en caliente también puede ser una preparación de una ADN polimerasa de arranque en caliente que se ha obtenido a partir de una fuente bacteriana que expresa la polimerasa natural y/o que comprende un casete de expresión que codifica la polimerasa. La preparación puede purificarse hasta el punto que se compara con la preparación de polimerasa inicial tomada de forma directa de la fuente bacteriana. Normalmente, la preparación también estará tratada para aplicar a la polimerasa entidades bloqueantes de arranque en caliente.
Una “reacción de PCR de arranque en caliente” es una reacción de amplificación de PCR en la que la polimerización detectable a partir de un polinucleótido de ADN cebado solamente se produce a una temperatura que se aproxima a la temperatura catalítica óptima de la polimerasa. Las temperaturas preferentes de polimerización detectable deberían interpretarse de forma consistente con la discusión de ADN polimerasas de arranque en caliente.
Una “mezcla de PCR de arranque en caliente” es una mezcla de reacción de PCR según se define anteriormente, que comprende una polimerasa de arranque en caliente.
Una “preparación de PCR de arranque en caliente barrera” es un recipiente de reacción que comprende dos o más componentes de una mezcla de reacción de PCR en el que al menos un componente está aislado de otro componente (o componentes) detrás de, o en, un material con una temperatura de fusión que corresponde a temperaturas de polimerización de ADN detectable según se define anteriormente. Preferentemente el material es un lípido, por ejemplo una cera.
Por “contaminación” se entiende la presencia en la mezcla de reacción de un ácido nucleico que puede funcionar como un molde para transcripción inversa y/o amplificación que no es una parte de la población de ácido nucleico que es diana de la transcripción inversa/amplificación. Los cebadores que se utilizan en la mezcla de reacción no son contaminantes.
La expresión “eliminar contaminación de ácidos nucleicos” está destinada a cubrir la prevención y reducción de la contaminación de ácidos nucleicos.
La expresión “contaminación por arrastre” se utiliza para describir cualquier ácido nucleico que se introduce en una mezcla de reacción de forma accidental o no intencionada, en particular secuencias diana arrastradas de reacciones previas de amplificación o de transcripción inversa.
La expresión “resultado positivo falso” se refiere a un resultado que parece mostrar que la muestra de ácido nucleico investigada contiene la secuencia diana pero en el que el producto amplificado se obtiene de contaminación por arrastre y/o en el caso de reacciones de amplificación basadas en transcripción inversa, posiblemente de ADN genómico. Claramente, la reducción de los resultados positivos falsos que proporciona la invención, es particularmente ventajosa en el campo forense y en el de diagnóstico. Los métodos de la invención permiten aumentar la especificidad de la amplificación de ácidos nucleicos.
El término “ADNasa” se refiere a una enzima que hidroliza un enlace fosfodiéster en el esqueleto de ADN y no es específica de secuencia de nucleótidos.
Por “inactivada de forma sustancialmente irreversible” se entiende que con calentamiento, la enzima está inactivada al menos el 95 %, preferentemente inactivada el 98 %, más preferentemente la enzima está inactivada el 100 %. El porcentaje de inactivación se puede medir de forma conveniente mediante la incubación de una muestra se ADN (por ejemplo, producto de PCR de 500 pb) durante 3 horas con una ADNasa inactivada o con una ADNasa no inactivada en un tampón adecuado (por ejemplo Tris, HEPES, PBS) a 37 ºC; separando los productos de la reacción en un gel de agarosa con bromuro de etidio mediante electroforesis, y midiendo las intensidades relativas de fluorescencia de las bandas de ADN bajo luz UV (Ejemplo 2). Los expertos podrían idear métodos alternativos para medir las actividades relativas de la ADNasa inactivada y no inactivada. Por ejemplo, podrían utilizarse los cambios relativos en la fluorescencia de muestras de ADN que contienen verde SYBR. Los métodos adicionales son el ensayo de Kunitz (Kunitz, M; 1950, S. Gen Physiol, 33: 363 y el Ejemplo 1) y el ensayo de Kunitz modificado ideado por Yamamoto (Yamamoto, M; 1971, Biochim Biophys Acta, 228: 95 y el Ejemplo 4).
Incluso cuando la temperatura de la mezcla de reacción vuelve a la temperatura ambiente, la ADNasa no recupera su actividad y no hay actividad sustancialmente residual; de forma específica, menos del 5 %, preferentemente menos del 2 %, muy preferentemente no queda actividad detectable de la ADNasa.
Preferentemente, la inactivación sustancialmente irreversible se produce dentro de los 5 minutos de incubación a una temperatura de, o aproximadamente de, 50 ºC, por ejemplo 48 a 52 ºC. Por ejemplo en 1, 2 o 3 minutos de incubación a 50 ºC. La ADNasa de la invención se puede inactivar de forma sustancialmente irreversible a temperaturas más bajas o después de periodos de tiempo más cortos pero, de acuerdo con la invención, calentar
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durante 5 minutos a aproximadamente 50 ºC debe ser suficiente para inactivar la enzima de forma sustancialmente irreversible. Será fácilmente obvio para los expertos que el ajuste de uno de estos dos parámetros se puede compensar mediante el ajuste del otro. Por ejemplo, el aumento de la temperatura de inactivación podría permitir reducir la duración de la incubación. A la inversa, aumentar la duración de la incubación podría permitir utilizar una temperatura de inactivación más baja. Por ejemplo, una ADNasa de acuerdo con la invención podría inactivarse en una incubación de 1 o 2 minutos a una temperatura de 55 ºC, en una incubación de 3 minutos a una temperatura de 52 ºC, en una incubación de 4 minutos a una temperatura de 51 ºC, en una incubación de 10 minutos a una temperatura de 49 ºC, o en una incubación de 15 minutos a una temperatura de 48 ºC. Claro está, como es también fácilmente obvio para un experto y se muestra en los ejemplos, que cuando la ADNasa de la invención se utiliza en los métodos de la invención, si es práctico se pueden usar duraciones de incubación más largas que 5 minutos y se pueden usar temperaturas de inactivación mayores que aproximadamente 50 ºC (por ejemplo la inactivación podría tener lugar a cada una de 50 ºC, 55 ºC, 65 ºC o 94 ºC durante cada uno de 15, 30 o 60 minutos; 60 ºC durante 15 minutos; o 95 ºC durante 10 minutos). Sin embargo, para estar de acuerdo con la invención, una ADNasa debe mostrar inactivación sustancial si se incuba a una temperatura de, o aproximadamente a, 50 ºC durante 5 minutos.
Las temperaturas y tiempos de inactivación para una ADNasa deberían evaluarse mediante la incubación de la ADNasa en una solución que mimetice un tampón típico de PCR o de transcriptasa inversa (por ejemplo Tris/HCl 25 mM, pH 8,5, MgCl2 5 mM). Preferentemente el EDTA debería estar ausente. La ADNasa debería estar presente a aproximadamente entre 0,01 U/µl y 10 U/µl, preferentemente entre 0,05 y 5 U/µl, por ejemplo 0,5 y 1,5 U/µl.
A cualquier temperatura dada la inactivación se puede potenciar en términos de extensión y/o velocidad mediante la presencia de un agente reductor de enlaces disulfuro (es decir, un agente que inhibe y/o rompe enlaces disulfuro entre dos o más restos de cisteína en una proteína) en el tampón de inactivación. Los ejemplos de tales agentes incluyen, pero sin limitación, DTT, 2-mercaptoetanol, 2-mercaptoetilamina-HCl, TCEP·HCl (tris-(2-carboxietil)fosfina clorhidrato), N-etilmaleimida. El DTT es preferente. De forma alternativa el agente reductor de enlaces disulfuro (por ejemplo DTT) se puede utilizar para reducir la temperatura de inactivación que se necesita para una duración particular de la etapa de inactivación. El experto sería capaz de determinar para sus necesidades las concentraciones apropiadas del agente reductor de enlaces disulfuro que mejorarían la inactivación, pero que no serían perjudiciales para las reacciones aguas abajo. Por ejemplo, el DTT se puede incorporar de forma conveniente en la etapa de inactivación a una concentración de entre 0,05 y 50 mM. El DTT se utiliza de forma rutinaria en las reacciones de transcripción inversa a concentraciones de entre 1 y 10 mM y con frecuencia se utiliza en reacciones de PCR.
Preferentemente, la inactivación de la ADNasa en los métodos de la invención tiene lugar en un tampón de Tris/HCl 25 mM, pH 8,5, MgCl2 5 mM y DTT 1 mM.
El ADN bicatenario lineal y el ADN circular superenrollado son sustratos de la enzima de acuerdo con la invención. La enzima tiene poca, despreciable, o esencialmente no detectable actividad para ADN monocatenario tal como los cebadores de amplificación/transcriptasa inversa. En otras palabras, la ADNasa es sustancialmente específica por ADN bicatenario.
Mediante “sustancialmente específica para ADN bicatenario” se entiende que la ADNasa escinde ADN bicatenario pero tiene poca, despreciable o esencialmente no detectable actividad hacia ADN monocatenario a concentraciones de 0,01 a 0,05 U/µl. Preferentemente, a tales concentraciones no habrá actividad detectable hacia ADN monocatenario. El experto sería fácilmente capaz de idear un experimento para hacer una comparación de la actividad relativa de la ADNasa hacia ADN monocatenario y bicatenario. Anisimova et al. (BMC Biochemistry, 2008, 9:14) divulga tal experimento. Brevemente, 2 unidades de Kunitz de una ADNasa bajo prueba se incubaron con ADN de fago M13 (monocatenario) o con ADN de fago lambda (bicatenario) en Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, MgCl2 5 mM (volumen final de reacción 30 μl) durante una hora y los productos se separaron en un gel de agarosa con bromuro de etidio. La actividad contra ADN monocatenario y/o bicatenario era observable por la posición de las bandas con respecto a los controles no tratados. En el Ejemplo 6 se describe otra estrategia con más detalle. En esta estrategia, la especificidad por ADN bicatenario o monocatenario de una ADNasa se puede probar mediante la medición del aumento de la fluorescencia de oligonucleótidos marcados en el extremo 5’ con el fluoróforo FAM (fluoresceína) y en el extremo 3’ con TAMRA. TAMRA absorbe (amortigua) la luz que emite FAM cuando las dos marcas están próximas. La escisión del oligonucleótido por la ADNasa da como resultado la separación de FAM de TAMRA, y un aumento de la fluorescencia de FAM que se puede medir en un fluorímetro con excitación de longitud de onda de 485 nm y emisión de longitud de onda de 520 nm. Se puede preparar un sustrato de ADN bicatenario mediante la mezcla del oligonucleótido marcado con un segundo oligonucleótido que sea complementario al oligonucleótido marcado. Claro está que se pueden utilizar de forma semejante otros pares de fluoróforos adecuados.
En el caso de reacciones de transcripción inversa, estas características permiten la inclusión de la ADNasa dentro de una mezcla de reacción de transcripción inversa que comprende a la muestra de ARN, los cebadores, los nucleótidos, la transcriptasa inversa y los tampones (es decir una mezcla de reacción completa) y la rápida degradación de material de contaminación por arrastre y de ADN genómico, por ejemplo a temperatura ambiente. Estas características también permiten la inclusión de la ADNasa en una mezcla completa de reacción de amplificación basada en transcripción inversa de una etapa.
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Estas características también permiten la inclusión de la ADNasa en una mezcla de reacción de amplificación que comprende cebadores, nucleótidos, ADN polimerasa y tampones, y la degradación rápida de material de contaminación por arrastre, por ejemplo a temperatura ambiente. De forma ventajosa, la ADNasa termoinestable de la invención es completamente funcional en una mezcla de reacción de amplificación completa, y es compatible con los reactantes y las condiciones de amplificación in vitro convencionales. La enzima debería también ser capaz de eliminar cantidades adecuadas de ADN genómico contaminante y/o la contaminación por arrastre de una mezcla de reacción, normalmente de niveles de fg o pg pero preferentemente de hasta 1 ng. Preferentemente, la ADNasa es capaz de degradar toda la contaminación por arrastre dentro de los 5 minutos a temperatura ambiente, más preferentemente dentro de los 3 minutos, muy preferentemente dentro de los 2 minutos.
Elevar la temperatura de la mezcla de reacción a la temperatura de inactivación de la ADNasa de la invención (50 ºC) durante un tiempo corto (5 minutos), inactiva de forma de irreversible la ADNasa de la invención.
En el caso de las reacciones de transcripción inversa, esto puede ser concomitante de forma conveniente con la etapa de transcripción inversa. En el caso de las reacciones de amplificación de ADN (incluyendo PCR de arranque en caliente), después las muestras de ácido nucleico a amplificar y analizar (es decir el ácido nucleico diana) pueden añadirse y comenzar la amplificación. Incluso cuando la temperatura de la mezcla de reacción cae durante el ciclado térmico y después de la amplificación o de la transcripción inversa, las copias de las secuencia diana no se degradarán debido a que la ADNasa se ha inactivado de forma irreversible. Esta es una ventaja particular de la presente invención, que la transcriptasa inversa y/o la ADN polimerasa se pueden incluir en las mezclas de reacción de transcripción inversa y/o de amplificación mientras tienen lugar las etapas de descontaminación y la posterior de inactivación. Esto es resultado de las condiciones suaves que dan como resultado la inactivación de la ADNasa (aproximadamente 50 ºC durante 5 minutos), de modo que se elimina una fuente de contaminación adicional potencial.
Preferentemente, la ADNasa tiene mínima actividad nucleasa hacia la hebra de ADN de un dúplex ADN:ARN. Por “mínima” se entiende que la ADNasa tiene una actividad nucleasa hacia la hebra de ADN de un dúplex ADN:ARN que es de menos del 40 % de su actividad hacia un ADN bicatenario. Preferentemente, la ADNasa tendrá una actividad hacia los dúplex de ADN:ARN que es de menos del 30 % o de menos del 20 % de su actividad hacia ADN bicatenario.
Son estas características particulares de las ADNasas preferentes de la invención (es decir, inactivación sustancialmente irreversible rápida, especificidad por doble hebra y, preferentemente, mínima actividad nucleasa de dúplex ADN:ARN) lo que hace a estas ADNasas excepcionalmente adecuadas para la descontaminación de protocolos de amplificación de transcripción inversa de un paso. Esto se debe a que la mezcla de reacción completa se puede descontaminar sin temor a la degradación no deseada de los productos de amplificación o de transcripción inversa, en un único paso y sin necesidad de añadir materiales adicionales. Esto minimiza el riesgo de contaminación (incluyendo el de ADN genómico), sin sacrificar sensibilidad a través de la digestión no deseada del producto inicial de transcripción inversa y/o del producto de amplificación.
La propia enzima ADNasa utilizada en los métodos anteriores constituye un aspecto adicional de la invención. Por lo tanto, este aspecto de la invención proporciona una ADNasa que se inactiva de forma sustancialmente irreversible mediante el calentamiento a una temperatura de 50 ºC durante 5 minutos, y que es sustancialmente específica para ADN bicatenario. Preferentemente, estas características de inactivación se logran en ausencia de EDTA.
Aunque está claro que cualquier ADNasa termoinestable que tenga las características descritas anteriormente puede ser adecuada para su uso en los métodos de acuerdo con la invención, las ADNasa modificadas obtenidas a partir de la ADNasa de Pandalus borealis, o una ADNasa semejante de otro organismo, preferentemente marino, en la que un resto prolina particular se ha modificado, suprimido o sustituido, forman otro aspecto de la presente invención. El organismo puede ser un procariota o un eucariota. Por “procariota” se entiende cualquier organismo que carece de un núcleo celular, es decir cualquier organismo de los dominios Bacteria y Archaea. Preferentemente el organismo es una bacteria. Más preferentemente el organismo es un eucariota, por ejemplo un organismo clasificado en los reinos taxonómicos de Animalia, Plantae, Fungi o Protista, por ejemplo, un organismo en el fila/división Acanthocephala, Acoelomorpha, Annelida, Arthropoda, Brachiopoda, Bryozoa, Chaetognatha, Chordata, Cnidaria, Ctenophora, Cycliophora, Echinodermata, Echiura, Entoprocta, Gastrotricha, Gnathostomulida, Hemichordata, Kinorhyncha, Loricifera, Micrognathozoa, Mollusca, Nematoda, Nematomorpha, Nemertea, Onychophora, Orthonectida, Phoronida, Placozoa, Platyhelminthes, Porifera, Priapulida, Rhombozoa, Rotifera, Sipuncula, Xenoturbellida, Anthocerotophyta, Bryophyta, March-antiophyta, Lycopodiophyta, Pteridophyta, Pteridospermatophyta, Coniferophyta, Cycadophyta, Ginkgophyta, Gnetophyta, Anthofita (o Magnoliophita), Chytridiomycota, Deuteromycota, Zygomycota, Glomeromycota, Ascomycota o Basidiomycota. Son de destacar los organismos del reino Animalia, por ejemplo, invertebrados y vertebrados. Más preferentemente el organismo se selecciona de aquellos en el filo Arthropoda, por ejemplo, un organismo en los subfilos Crustacea, Hexpoda, Chelicerata o Myriapoda, por ejemplo, un organismo en las clases Crustacea o Branchiopoda, Remipedia, Cephalocarida, Maxillopoda, Ostracoda o Malacostraca, preferentemente Malacostraca y más preferentemente un organismo en el orden Decapoda. El organismo se puede clasificar en la familia Pandalidae, por ejemplo, en los
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de forma genética, por cualquier aminoácido de origen natural, normalmente codificado genéticamente, o por un análogo de aminoácido. Preferentemente, la prolina se reemplaza por alanina, glicina, serina, o cisteína.
Por “modificación” de la prolina se entiende que el resto prolina tiene sus propiedades estereoquímicas usuales alteradas, por ejemplo por el reemplazo de su cadena lateral con un grupo distinto, modificando la composición de la propia cadena lateral o reemplazando el hidrógeno de la cadena lateral opuesta con un grupo lateral distinto.
La invención también proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican las ADNasa de la invención. Se divulgan en SEC ID Nº: 4 y 8 secuencias de nucleótidos que corresponde a la secuencias de aminoácidos de SEC ID Nº: 3 y 7. La degeneración del código genético significa que SEC ID Nº: 4 y 8 son solamente dos de las muchas posibles secuencias de nucleótidos.
La invención también proporciona el uso de las ADNasa particulares descritas anteriormente, como un agente descontaminante en métodos de amplificación de un ácido nucleico. El uso de las ADNasa particulares descritas anteriormente en los métodos de descontaminación descritos en el presente documento, representa una realización particularmente preferente de la invención.
Representa un aspecto adicional de la presente invención un método para el aislamiento y purificación de una ADNasa o un fragmento enzimáticamente activo de la misma, según se describe anteriormente. Por lo tanto, en este aspecto la invención proporciona tal método, comprendiendo dicho método expresar dicha ADNasa o fragmento de la misma en una célula hospedadora adecuada (por ejemplo, Pichia pastoris; E. coli; S. cereviciae, células de insecto infectadas con baculovirus), y separar posteriormente la ADNasa a partir de dichas células hospedadoras y/o del medio en el que se cultivaron dichas células. Se puede lograr la expresión de dicha ADNasa o fragmento de la misma, incorporando en una célula hospedadora adecuada un vector de expresión que codifica dicha ADNasa o fragmento de la misma, por ejemplo, un vector de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica las secuencias de aminoácidos de SEC ID Nº: 3 y 7, por ejemplo la molécula de ácido nucleico que comprende las secuencias de nucleótidos de SEC ID Nº: 4 u 8. La invención abarca a las células hospedadoras que comprenden estos casetes de expresión y moléculas de ácido nucleico.
La enzima ADNasa se puede separar, o aislar, a partir de células hospedadoras/medio de cultivo utilizando cualquiera de las técnicas de purificación de proteínas conocidas en la técnica y descritas ampliamente en la bibliografía, o cualquier combinación de las mismas. Tales técnicas pueden incluir, por ejemplo, precipitación, ultrafiltración, diálisis, diversas técnicas cromatográficas, por ejemplo, filtración en gel, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, electroforesis, centrifugación, etc.
Asimismo, también se puede preparar un extracto de células hospedadoras utilizando técnicas bien conocidas en la técnica, por ejemplo, homogenización, congelación-descongelación, etc. y a partir de este extracto la ADNasa de la invención se puede purificar.
Se ha descubierto que puede utilizarse fácilmente para aislar la enzima un protocolo de purificación basado en una combinación de cromatografía de intercambio iónico y cromatografía de afinidad, por ejemplo en una columna de sefarosa, por ejemplo una columna de sefarosa Red (Pharmacia Biotech, Suecia) o una columna de sefarosa Blue (GE Healthcare).
Más particularmente, el extracto se puede someter a cromatografía de intercambio iónico y la proteína eluirse con un gradiente de NaCl. Las fracciones que contiendo actividad ADNasa se pueden dializar y después aplicar a una columna de afinidad, antes de la elución final con NaCl.
La presente invención también proporciona kits que comprenden al menos una ADNasa de acuerdo con la invención. Los kits también pueden contener algunos o todos los reactivos, tampones, enzimas, etc., necesarios para llevar a cabo reacciones de amplificación y/o de transcripción inversa. Más particularmente, los kits pueden contener nucleótidos trifosfato (incluyendo dNTPaS para SDA), cebadores de oligonucleótidos, transcriptasas inversas, preferentemente las capaces de funcionar a aproximadamente 50 ºC, ADN polimerasas, preferentemente una polimerasa termoestable tal como la polimerasa Taq o la polimerasa Bst (y versiones de arranque en caliente de las mismas) o, en el caso de LAR, una ADN ligasa (preferentemente una ADN ligasa termoestable tal como Ampligase®, o la divulgada en el documento US6280998 que está aislada de Pyrococcus furiosus) o una enzima de restricción (preferentemente una enzima de restricción termoestable tal como BsoB1). Se puede proporcionar la ADNasa en un compartimento junto con una transcriptasa inversa, una ADN polimerasa, una polimerasa de desplazamiento de hebra o LCR ligasa.
La presente invención también proporciona composiciones que comprenden una ADNasa de la invención y uno o más de los reactivos necesarios para llevar a cabo reacciones y métodos de amplificación y/o transcripción inversa de ácidos nucleicos, por ejemplo, los componentes descritos anteriormente. Normalmente, tales composiciones serán acuosas y estarán tamponadas con un tampón convencional, tal como Tris, HEPES, etc.
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Está claro que los métodos de transcripción inversa son ahora convencionales en la técnica, y se pueden efectuar utilizando cualquiera de los reactivos y técnicas conocidos o convencionales.
En un protocolo de transcripción inversa típico, la etapa de descontaminación puede simplemente implicar la incubación de la mezcla de reacción de la transcripción inversa conteniendo la ADNasa durante un período corto de tiempo, por ejemplo, de 1 a 30 minutos a temperatura ambiente, convenientemente de 2 a 15 minutos. El tiempo de esta incubación no es crítico y puede variar dependiendo de la ADNasa y concentración exactas utilizadas, y de los otros componentes del sistema de reacción. La temperatura puede ser cualquier temperatura a la que la enzima está activa, es decir, por debajo de la temperatura de inactivación (por ejemplo, 37 ºC), pero es conveniente la temperatura ambiente.
Tal mezcla de reacción puede, como se menciona anteriormente, contener todos reactantes necesarios para la reacción de transcripción inversa.
Por ejemplo, una mezcla de transcripción inversa representativa típica puede incluir:
Componente Concentración Final dATP 50-200 μM dCTP 50-200 μM dGTP 50-200 μM dTTP 50-200 μM Cebador 0,05-0,2 μM Transcriptasa inversa VMA 10-200 Unidades ADNasa bc de SEC ID Nº: 7 0,1-2 Unidades Tampón de transcripción inversa 1X Agua destilada estéril hasta 50-100 μl finales Molde experimental 50 pg-100 ng Mezcla total 25-50 μl
En el ejemplo representativo anterior, se puede utilizar cualquier combinación de volúmenes de agua destilada estéril y de molde experimental, en tanto el volumen total de la reacción (incluyendo las soluciones de tampón, dNTP, cebadores, enzimas y MgCl2) sea igual a 50-100 μl. Sin embargo, se pueden utilizar volúmenes finales alternativos de acuerdo con la elección, para lograr, por ejemplo, concentraciones de reactantes finales deseadas semejantes, u otras. Se puede utilizar cualquier tampón de transcripción inversa conveniente o disponible de forma comercial. Un tampón de transcripción inversa 5X adecuado puede ser Tris-HCl 250 mM (pH 8,5 a 25 ºC), MgCl2 40 mM, KCl 150 mM, DTT 5 mM. Se puede adquirir un tampón de transcripción inversa de Fermentas.
La cantidad de ADNasa necesaria podría variar dependiendo del nivel de contaminación potencial. Con una etapa corta de incubación (0-15 minutos a temperatura ambiente), 2,0 unidades/50 μl de mezcla de reacción, es en general más que suficiente. Es adecuado 0,1 a 2,0 unidades/50 μl de mezcla de reacción y es preferente una actividad de aproximadamente 0,5 unidades /50 μl de mezcla de reacción por ejemplo, 0,2 a 1,0 unidades/50 μl de mezcla de reacción). A una concentración de 2,0 unidades/50 μl de mezcla de reacción se observa algo de actividad ADNasa sc y, por lo tanto, son preferentes las actividades enumeradas anteriormente. Una unidad de enzima se define como la cantidad que en un ensayo de Kunitz, o el ensayo modificado de Kunitz de Yamamoto (ambos citados anteriormente), aumenta la absorción a 260 nm en 0,001 por minuto. Después de la incubación, la ADNasa se inactiva mediante el calentamiento de la mezcla de reacción. De forma conveniente esto se puede lograr por calentamiento en la etapa de transcripción inversa, por ejemplo alrededor de 50 ºC durante 30 minutos.
De forma conveniente, el método de amplificación que comprende la etapa de descontaminación que utiliza una ADNasa de la invención implicará o estará basado en la PCR. Los métodos de PCR son convencionales en la técnica y se pueden efectuar utilizando cualquiera de los reactivos y técnicas conocidos o convencionales.
En un protocolo de reacción de PCR típico, la etapa de descontaminación simplemente puede implicar la incubación durante un periodo corto de tiempo de la mezcla de reacción de amplificación conteniendo la ADNasa, por ejemplo de 1 a 10 minutos a temperatura ambiente, de forma conveniente de 2 a 5 minutos. El tiempo de esta incubación no es crítico y puede variar dependiendo de la ADNasa y concentración exactas utilizadas, y de los otros componentes del sistema de reacción. La temperatura puede ser cualquier temperatura a la que la enzima está activa, es decir por debajo de la temperatura de inactivación (por ejemplo 37 ºC), pero es conveniente la temperatura ambiente.
Tal mezcla de reacción puede, como se menciona anteriormente, contener todos lo reactantes necesarios para la reacción de amplificación aparte del molde, es decir el ácido nucleico diana a amplificar.
Una mezcla de reacción de amplificación de PCR representativa típica puede incluir, por ejemplo:
Componente Concentración final dATP 50-200 μM
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Componente Concentración final dCTP 50-200 μM dGTP 50-200 μM dTTP 50-200 μM Cebador 1 0,05-0,2 μM Cebador 2 0,05-0,2 μM ADN polimerasa 1-2,5 Unidades ADNasa bc de SEC ID Nº: 7 0,1-2 Unidades MgCl2 1,5-3,0 μM Tampón de PCR 1X Agua destilada estéril Hasta 50-100 μl finales Molde experimental (a añadir después de la 50 pg-100 ng inactivación de la ADNasa) Mezcla total 25-50 μl
En el ejemplo representativo anterior, se puede utilizar cualquier combinación de volúmenes de agua destilada estéril y de molde experimental, en tanto el volumen total de la reacción (incluyendo soluciones de tampón, los dNTP, cebadores, enzimas y MgCl2) sea igual a 25-50 μl. Sin embargo, se pueden utilizar volúmenes finales alternativos de acuerdo con la elección, para lograr, por ejemplo, las concentraciones finales deseadas de los reactantes semejantes, u otras. Se puede utilizar cualquier tampón de PCR conveniente o disponible de forma comercial.
Después de la descontaminación, la ADNasa se inactiva mediante calentamiento de la mezcla de reacción. De forma conveniente, esto se puede lograr mediante calentamiento en el primer ciclo de PCR.
La elección de la temperatura, tiempo a esa temperatura, y la duración del tiempo entre temperaturas para cada etapa en el ciclo, influencian la realización óptima del procedimiento de PCR. Un perfil típico de ciclado para la utilización de la ADNasa para degradar ADN bc contaminante antes de la amplificación por PCR de ácidos nucleicos diana añadidos recientemente es como sigue: (a) 0 a 10 minutos de incubación con ADNasa a temperatura ambiente; (b) 2 minutos de inactivación de la ADNasa a 94 ºC; (c) adición del molde; 1 minuto de fusión del ADN a 94 ºC; (d) 15 segundos de hibridación del cebador a 50-65 ºC; (e) 30 segundos de extensión del cebador a 72 ºC; (f) 10 segundos de fusión del ADN a 94 ºC; y las etapas (d)-(f) se repiten tantas veces como sea necesario para obtener el nivel de amplificación deseado.
Como se menciona previamente, la ADNasa de la invención es especialmente adecuada para una reacción de amplificación de transcripción inversa de una etapa, por ejemplo transcripción inversa PCR. Tales protocolos están bien establecidos en la técnica pero, por amplitud, una mezcla de transcripción inversa PCR representativa típica podría incluir, por ejemplo:
Componente Concentración final dATP 50-200 μM dCTP 50-200 μM dGTP 50-200 μM dTTP 50-200 μM Cebador 1 0,05-0,2 μM Cebador 2 0,05-0,2 μM Transcriptasa inversa VAM 10-200 Unidades ADN polimerasa 1-2,5 Unidades ADNasa bc de SEC ID Nº: 7 0,1-2 Unidades MgCl2 3,0-6,0 mM Tampón de PCR 1X Agua destilada estéril hasta 25-50 μl finales Molde de ARN experimental 50 pg-100 ng Mezcla total 25-50 μl
La discusión anterior en relación a los volúmenes y tampones en las reacciones de transcripción inversa y PCR es aplicable aquí. Después de la descontaminación, la reacción de transcripción inversa se realiza a una temperatura a la que la ADNasa se inactiva (por ejemplo, a 50 ºC durante una hora). Durante esta etapa la ADNasa está inactiva. Esto significa que el producto de ADNc no se degradará según se produce, y tampoco hay degradación de este producto cuando la reacción de PCR comienza. Después de la reacción de transcripción inversa, la reacción de PCR se realiza sin la adicción adicional a las mezclas de reacción mediante la exposición de los recipientes de reacción a un perfil de ciclado tal como al perfil descrito anteriormente.
La invención se describirá ahora por medio de ejemplos no limitantes, con referencia a las siguientes figuras en las que:
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La Figura 1 muestra fotografías de varios geles de agarosa que muestran la actividad de la ADNasa de SEC ID Nº: 7 y de la ADNasa de Pandalus borealis de tipo silvestre (SEC ID Nº: 6) que se han inactivado en presencia o ausencia de DTT a 50, 55, 65 o 94 ºC durante 15, 30 o 60 minutos, contra ADN plasmídico a 37 ºC durante 3 horas. La Figura 2 muestra el curso temporal de la inactivación de la ADNasa de SEC ID Nº: 7 a 55 ºC en presencia de DTT. La Figura 3 muestra el curso temporal de la inactivación de la ADNasa de SEC ID Nº: 7 a 50 ºC en presencia de DTT. La Figura 4 muestra la secuencia de aminoácidos de la forma madura del mutante P214A de la ADNasa de Pandalus borealis de la invención (SEC ID Nº: 7). La Figura 5 muestra la secuencia de nucleótidos codificante del mutante P214A de la forma madura de la ADNasa de Pandalus borealis (SEC ID Nº: 8). La Figura 6 muestra la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos del mutante P237A de la ADNasa de Pandalus borealis de la invención (SEC ID Nº: 3 y 4). Esta secuencia de aminoácidos incluye el péptido señal MIGRTTFIALFVKVLTIWSFTKG (SEC ID Nº: 9). La Figura 7 muestra la secuencia de aminoácidos de la forma madura de la ADNasa de Pandalus borealis (SEC ID Nº: 5). La Figura 8 muestra la secuencia de nucleótidos codificante de la forma madura de la ADNasa de Pandalus borealis (SEC ID Nº: 6). La Figura 9 muestra la secuencia de nucleótidos del ADNc y la secuencia de aminoácidos traducida de la ADNasa de Pandalus borealis (SEC ID Nº: 1 y 2). Esta secuencia de aminoácidos incluye el péptido señal MIGRTTFIALFVKVLTIWSFTKG (SEC ID Nº: 9). La Figura 10 muestra el efecto de la ADNasa de Pandalus borealis de tipo silvestre y del mutante P214A sobre la eficacia de la RT (sigla del inglés reverse transcription)-PCR de una etapa. La Figura 11 muestra el alineamiento de secuencias de aminoácidos de la ADNasa (SEC ID Nº: 15) del cangrejo rojo gigante (Paralithodes camtschaticus) y la ADNasa de Pandalus borealis (SEC ID Nº: 5). 65,7 % de identidad en solapamiento de 379 residuos; puntuación: 1384,0; frecuencia de hueco: 0,0 %. La Figura 12 muestra el efecto de las concentraciones crecientes del mutante P214A en un protocolo de PCR cuantitativa. La Figura 13 muestra una comparación de la termoinestabilidad de la ADNasa I y del mutante P214A, a través de la medición de los efectos inhibitorios de las enzimas tratadas con calor sobre un protocolo de PCR cuantitativa. La Figura 14 muestra el grado de eliminación de ADN adicionado de una mezcla de reacción de PCR cuantitativa con cantidades crecientes del mutante P214A. La Figura 15 muestra el efecto de concentraciones crecientes del mutante P214A sobre una reacción de RT-PCR de una etapa. La Figura 16 muestra el efecto del mutante P214A sobre controles de PCRc sin molde.
y en la que
SEC ID Nº: 1 es la secuencia de aminoácidos de la porción traducida de la secuencia de nucleótidos del ADNc de la ADNasa de Pandalus borealis. SEC ID Nº: 2 es la secuencia de nucleótidos del ADNc de la ADNasa de Pandalus borealis. SEC ID Nº: 3 es la secuencia de aminoácidos del mutante P237A de la ADNasa de Pandalus borealis. SEC ID Nº: 4 es la secuencia de nucleótidos que codifica el mutante P237A de la ADNasa de Pandalus borealis. SEC ID Nº: 5 es la secuencia de aminoácidos de la forma madura de la ADNasa de Pandalus borealis. SEC ID Nº: 6 es la secuencia de nucleótidos que codifica la forma madura de la ADNasa de Pandalus borealis. SEC ID Nº: 7 es la secuencia de aminoácidos del mutante P214A de la forma madura de la ADNasa de Pandalus borealis. SEC ID Nº: 8 es la secuencia de nucleótidos que codifica al mutante P214A de la forma madura de la ADNasa de Pandalus borealis. SEC ID Nº: 9 es la secuencia de aminoácidos del péptido señal de la ADNasa de Pandalus borealis. SEC ID Nº: 10 es un oligonucleótido marcado en el 5’ con FAM y en el 3’ con TAMRA, para la medición de la actividad ADNasa. SEC ID Nº: 11 es la secuencia complementaria de SEC ID Nº: 10. SEC ID Nº: 12 es un cebador directo para la amplificación de una sección del gen ARNr23S de E.coli. SEC ID Nº: 13 es un cebador inverso para la amplificación de una sección del gen ARNr23S de E.coli. SEC ID Nº: 14 es una sonda de oligonucleótido marcada en el 5’ con FAM y en el 3’ con BHQ, complementaria a una sección del gen ARNr23S de E.coli entre regiones complementarias a SEC ID Nº: 13 y SEC ID Nº: 14. SEC ID Nº: 15 es la secuencia de aminoácidos de la ADNasa del cangrejo rojo gigante (Paralithodes camtschaticus).
Texto libre del listado de secuencias
SEC ID Nº: 10
<223> sonda de oligonucleótido marcada en el 5’ con FAM y en el 3’ con TAMRA para la medición de la actividad ADNasa.
SEC ID Nº: 11
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