ES2350525T3 - Nuevo formato de detección para las reacciones en cadena de la polimerasa en tiempo real de inicio en caliente. - Google Patents
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Abstract
Método para amplificar y detectar un ácido nucleico diana, que comprende: -someter dicho ácido nucleico diana a una reacción de amplificación por PCR en tiempo real en presencia de: - una ADN polimerasa termoestable, -una exonucleasa 3'-5' termoestable dependiente de doble cadena que no es una ADN polimerasa que presente actividad correctora de errores 3'-5', -una pareja de cebadores de amplificación, -desoxinucleósidos trifosfato, -una sonda de hibridación que porta un primer marcaje y un segundo marcaje, -siendo capaz dicho primer marcaje de actuar como entidad informadora fluorescente al excitarse con luz de una longitud de onda apropiada, -siendo capaz dicho segundo marcaje de actuar como entidad extintora de la fluorescencia de dicha entidad informadora fluorescente, caracterizado porque un marcaje se encuentra unido al extremo 3' de dicha sonda de hibridación, y caracterizado porque además el otro marcaje se encuentra unido internamente o en el extremo 5' a dicha sonda de hibridación, caracterizado porque además dicha sonda no participa en el procedimiento de amplificación por medio del cebado de una reacción de polimerización de ADN realizando un seguimiento de la fluorescencia de dicha entidad informadora fluorescente por lo menos después de una pluralidad de ciclos de amplificación, - en la que se crea una señal fluorescente por medio de: la eliminación de una entidad fluorescente 3' de dicha sonda de hibridación que realiza dicha exonucleasa termoestable durante cada ciclo de amplificación.
Description
La presente invención se refiere al campo de la PCR en
tiempo real. Más particularmente, la presente invención
proporciona un nuevo método para la PCR en tiempo real, se
realiza el seguimiento de la amplificación caracterizada de
un ADN diana mediante hibridación con una sonda de
hibridación fluorescente apropiadamente marcada en
combinación con una química específica que proporciona un
efecto de PCR de inicio en caliente.
Antecedentes de la técnica anterior
La amplificación del ADN mediante la reacción en cadena
de la polimerasa (PCR) es una técnica fundamental de la
biología molecular. El análisis de los ácidos nucleicos
mediante PCR requiere la preparación de la muestra, la
amplificación y el análisis del producto. Aunque estas
etapas habitualmente se llevan a cabo secuencialmente, la
amplificación y el análisis pueden producirse
simultáneamente. Pueden añadirse pigmentos de ADN o sondas
fluorescentes a la mezcla de PCR antes de la amplificación y
utilizarse para analizar los productos de PCR durante la
misma. El análisis de la muestra se realiza concurrentemente
a la amplificación en el mismo tubo dentro del mismo
instrumento. Este enfoque combinado reduce la manipulación
de la muestra, ahorra tiempo y reduce en gran medida el
riesgo de contaminación del producto para reacciones
posteriores, debido a que no existe necesidad de extraer las
muestras de los recipientes cerrados para el análisis
posterior. El concepto de combinar la amplificación con el
análisis de producto se ha venido a denominar PCR "en tiempo
real" (ver, por ejemplo, la patente US nº 6.174.670).
En la PCR en tiempo real cinética, se realiza el
seguimiento de los productos de PCR en cada ciclo de la
misma. La amplificación habitualmente se mide en
termocicladores que presentan dispositivos adicionales para
medir las señales de fluorescencia durante la reacción de
amplificación.
a) Formato de pigmento ligante de ADN
Debido a que la cantidad de producto de amplificación
de doble cadena habitualmente excede la cantidad de ácido
nucleico originalmente presente en la muestra que debe
analizarse, pueden utilizarse pigmentos específicos de ADN
de doble cadena, que tras la excitación con una longitud de
onda apropiada muestran una fluorescencia incrementada
únicamente en el caso de que se encuentren unidos a ADN de
doble cadena. Preferentemente pueden utilizarse únicamente
aquellos pigmentos que, tal como SybrGreenI, por ejemplo, no
afecten a la eficiencia de la reacción de PCR.
Todos los demás formatos conocidos de la técnica
- requieren
- el diseño de una sonda de hibridación marcada
- fluorescente
- que únicamente emita fluorescencia tras la
- unión a su ácido nucleico diana.
b) Balizas moleculares
Dichas sondas de hibridación también se marcan con un
primer componente y con un extintor, encontrándose los
marcajes situados preferentemente en ambos extremos de la
sonda. Como resultado de la estructura secundaria de la
sonda, ambos componentes se encuentran en vecindad espacial
en solución. Tras la hibridación a los ácidos nucleicos
diana, ambos componentes se separan uno de otro de manera
que, tras la excitación con luz de una longitud de onda
adecuada, puede medirse la emisión de fluorescencia del
primer componente (patente US nº 5.118.801).
c) Sondas de hibridación FRET
La forma de ensayo de sonda de hibridación FRET resulta
especialmente útil para todos los tipos de ensayo de
hibridación homogénea (Matthews J.A. y Kricka L.J.,
Analytical Biochemistry 169:1-25, 169). Se caracteriza por
dos sondas de hibridación de una cadena que se utilizan
simultáneamente y que son complementarios a sitios contiguos
de la misma cadena del ácido nucleico diana amplificado.
Ambas sondas se marcan con diferentes componentes
fluorescentes. Al excitarse con luz de una longitud de onda
adecuada, un primer componente transfiere la energía
absorbida al segundo componente según el principio de
transferencia energética por resonancia de fluorescencia, de
manera que puede medirse una emisión de fluorescencia del
segundo componente al unirse ambas sondas de hibridación a
posiciones contiguas de la molécula diana que debe
detectarse. Alternativamente al seguimiento del incremento
de la fluorescencia del componente aceptor de FRET, también
resulta posible realizar el seguimiento de la reducción de
la fluorescencia del componente donante FRET a modo de
medición cuantitativa de los sucesos de hibridación.
En particular, el formato de sonda de hibridación FRET
puede utilizarse en la PCR en tiempo real con el fin de
detectar el ADN diana amplificado. Entre todos los formatos
de detección conocidos de la técnica de PCR en tiempo real,
se ha demostrado que el formato de sonda de hibridación FRET
es altamente sensible, preciso y fiable (patentes WO nº
97/46707, nº 97/46712 y nº 97/46714). A modo de alternativa
a la utilización de un cebador marcado fluorescentemente,
también resulta posible utilizar un cebador marcado
fluorescentemente y únicamente una sola sonda
oligonucleótida marcada (Bernard P.S. et al., Analytical
Biochemistry 255:101-107, 1998). A este respecto, puede
seleccionarse arbitrariamente si el cebador se marca con el
donador de FRET o con el compuesto aceptor de FRET.
d) Formato de sonda de marcaje único (SLP)
Este formato de detección consiste de un único
oligonucleótido marcado con un único pigmento fluorescente
en el extremo 5' ó 3' (patente WO nº 02/14555). Pueden
utilizarse dos diseños diferentes para el marcaje de oligos:
sondas G-Quenching y sondas nitroindol-desatenuantes. En la
realización de G-Quenching, el pigmento fluorescente se une
a un C en el extremo 5' ó 3' del oligo. La fluorescencia se
reduce significativamente al hibridarse la sonda con la
diana, en el caso de que se encuentren dos G en la cadena
diana delante de Cs y en la posición 1 aparte de la sonda
oligonucleótida complementaria. En la realización de
nitronindol-desatenuantes, el pigmento fluorescente se une a
nitroindol en el extremo 5' ó 3' del oligonucleótido. El
nitroindol en cierta manera reduce la señalización
fluorescente de la sonda libre. Se incrementa la
fluorescencia al hibridarse la sonda al ADN diana debido a
un efecto de desatenuación.
e) Sonda TaqMan
Se marca con dos componentes una sonda de hibridación
de una cadena. Al excitar el primer componente con luz de
una longitud de onda adecuada, se transfiere la energía
absorbida al segundo componente, el denominado extintor,
según el principio de transferencia energética por
resonancia de fluorescencia. Durante la etapa de hibridación
de la reacción de PCR, la sonda de hibridación se une al ADN
diana y es degradado por la actividad 5'-3' exonucleasa de
la polimerasa Taq durante la etapa de alargamiento
posterior. Como resultado, el componente fluorescente
excitado y el extintor se encuentra separados espacialmente
uno de otro y, de esta manera, puede medirse una emisión de
fluorescencia del primer componente. Los ensayos de sonda
TaqMan se dan a conocer en detalle en las patentes US nº
5.210.015, nº 5.538.848 y nº 5.487.972. Las sondas de
hibridación TaqMan y mezclas de reactivos se dan a conocer
en la patente US nº 5.804.375.
f) Formatos de liberación
Además, recientemente se han dado a conocer dos otros
formatos restringidos a la detección específica de alelo que
se basan en el principio de detección específica de una
liberación de un nucleótido 3'-terminal marcado debido a una
situación de correspondencia o no correspondencia con
respecto a su unión al ácido nucleico diana. La patente US
nº 6.391.551 da a conocer un método caracterizado porque el
nucleótido 3'-terminal de una sonda de hibridación resulta
liberado por un enzima despolimerizador en el caso de que se
haya producido una correspondencia perfecta entre la
secuencia diana y la sonda. De manera similar, la patente EP
nº 0 930 370 sugiere la utilización de un cebador marcado
con un informador y con un grupo extintor, caracterizado
porque una actividad de corrección de errores 3'-5' elimina
un grupo en el caso de que se haya producido una
correspondencia no perfecta entre el cebador y la diana de
amplificación.
Enzimología de la PCR
La síntesis de ácidos nucleicos in vitro se lleva a
cabo rutinariamente con ADN polimerasas con o sin
polipéptidos adicionales. Las ADN polimerasas son una
familia de enzimas implicada en la replicación y reparación
del ADN. Se ha llevado a cabo investigación extensiva sobre
el aislamiento de las ADN polimerasas a partir de
microorganismos mesofílicos, tales como E. coli (ver, por
ejemplo, Bessman, ..., et al., J. Biol. Chem. 223:171-177,
1957; y Buttin G., Kornberg A., J. Biol. Chem. 241:54195427, 1966).
También se ha llevado a cabo investigación sobre el
aislamiento y la purificación de ADN polimerasas procedentes
- de
- termófilos, tales como Thermus aquaticus. Chien A. et
- al.,
- J. Bacteriol. 127:1550-1557, 1976, dan a conocer el
- aislamiento
- y purificación de una ADN polimerasa con un
óptimo de temperatura de 80ºC procedente de la cepa YT1 de
Thermus aquaticus. La patente US nº 4.889.818 da a conocer
una ADN polimerasa termoestable purificada de T. aquaticus,
la polimerasa Taq, que presenta un peso molecular de
aproximadamente 86.000 a 90.000 daltons. Además, la
solicitud de patente europea nº 0 258 017 da a conocer una
polimerasa Taq como el enzima preferente para la utilización
en el procedimiento de PCR.
La investigación indica que, aunque la ADN polimerasa
Taq, presenta una función exonucleasa 5'-3' polimerasadependiente, la ADN polimerasa Taq no presenta una función
exonucleasa 3'-5' (Lawyer F.C. et al., J. Biol. Chem.
264:6427-6437, 1989; Bernad A. et al., Cell 59:219-228,
1989). La actividad exonucleasa 3'-5' de las ADN polimerasas
comúnmente se denomina "actividad de corrección de errores".
La actividad exonucleasa 3'-5' elimina bases desapareadas en
el extremo 3' de un dúplex de cebador-molde. La presencia de
actividad exonucleasa 3'-5' puede resultar ventajosa en el
caso de que conduzca a un incremento de la fidelidad de la
replicación de las cadenas de ácidos nucleicos y al
alargamiento de productos terminados prematuramente. Debido
a que la ADN polimerasa Taq no es capaz de eliminar los
extremos de cebador no apareados, presenta una tendencia a
errores de incorporación de bases, provocando que su
utilización en determinadas aplicaciones no resulte
deseable. Por ejemplo, intentar clonar un gen amplificado
resulta problemático debido a que una copia del gen puede
contener un error debido a un suceso de incorporación
incorrecta aleatoria. Dependiendo del ciclo en el que se
produce dicho error (por ejemplo, en uno de los primeros
ciclos de replicación), el ADN amplificado entero podría
contener la base erróneamente incorporada, dando lugar de
esta manera a un producto génico mutado.
Existen varias ADN polimerasas termoestables conocidas
de la técnica que muestran actividad exonucleasa 3'-5',
tales como polimerasas de tipo B procedentes de
arqueobacterias termofílicas que se utilizan para la
amplificación de ADN de alta afinidad. Las polimerasas
termoestables que muestran actividad de exonucleasa 3'-5'
pueden aislarse o clonarse de Pyrococcus (ADN polimerasa de
Pyrococcus furiosus termoestable purificada; Mathur E.,
Strategene, patente WO nº 92/09689, patente US nº 5.545.552;
- Purified
- thermoestable DNA polymerase from Pyrococcus
- species,
- Comb D.G. et al., New England Biolabs, Inc.,
- patente
- EP nº 0 547 359; Organization and nucleotide
- sequence
- of the DNA polymerase gene from the archaeon
Pyrococcus furiosus; Uemori T. et al., Nucleic Acids Res.
21:259-265, 1993, de especies de Pyrodictium (Thermostable
nucleic acid polymerase, Gelfand D.H., F. Hoffmann-La Roche
AG, patente EP nº 0 624 641; Purified thermostable nucleic
acid polymerase and DNA coding sequences from Pyrodictium
species, Gelfand D.H., Hoffmann-La Roche Inc., patente US nº
5.491.086), de Thermococcus (por ejemplo ADN polimerasa
termoestable de Thermococcus spec. TY; Niehaus F. et al.,
patente WO nº 97/35988; Purified Thermococcus barossii DNA
polymerase, Luhm R.A., Pharmacia Biotech., Inc., patente WO
nº 96/22389; DNA polymerase from Thermococcus barossii with
intermediate exonuclease activity and better long term
stability at high temperature, useful for DNA sequencing,
PCR etc., Dhennezel O.B., Pharmacia Biotech Inc., patente WO
nº 96/22389; A purified thermostable DNA polymerase from
Thermococcus litoralis for use in DNA manipulations, Comb
D.G., New England Biolabs, Inc., patente US nº 5.322.7865,
EP nº 0 455 430; Recombinant thermostable DNA polymerase
from Archaebacteria, Comb D.G., New England Biolabs, Inc.,
patente US nº 5.352.778, EP nº 0 547 920 y EP nº 0 701 000;
New isolated thermostable DNA polymerase obtained from
Thermococcus gorgonariius, Angerer B. et al., Boehringer
Mannheim GmbH, patente WO nº 98/14590.
Una posibilidad de preparación de una reacción de PCR
de elevada procesividad y actividad adicional de corrección
de errores son las mezclas de polimerasas Taq y exonucleasas
dependientes del molde bastante termoestables. En este
contexto, el documento EP nº A-1088891 da a conocer un
enzima termoestable obtenible de Archaeoglobus fulgidus, que
cataliza la degradación de extremos no apareados de
cebadores o polinucleótidos en la dirección 3' a 5' en ADN
de doble cadena. Se clonó el gen codificante de la
exonucleasa III termoestable obtenible de Archaeoglobus
fulgidus (Afu) y se expresó en E. coli y se aisló. El enzima
se encuentra activo bajo las condiciones de incubación y de
temperatura utilizadas en las reacciones de PCR. El enzima
proporciona soporte a ADN polimerasas tales como Taq en la
realización de la síntesis de ADN a tasas de error bajas y
síntesis de productos no superiores a 3 kb en ADN genómico
(el rango superior de los productos sintetizados por la
polimerasa Taq) con buenos rendimientos con o sin dUTP
presentes en la mezcla de reacción. Preferentemente se
utilizaron 50 a 500 ng de la exonucleasa III obtenible de
Afu por cada 2,5 U de polimerasa Taq con el fin de obtener
un rendimiento óptimo de la PCR. Más preferentemente es la
utilización de 67 a 380 ng de la exonucleasa III obtenible
de Afu por cada 2,5 U de la polimerasas Taq en la reacción
de PCR.
PCR de inicio en caliente
Otro problema importante de la amplificación de ácidos
nucleicos y más especialmente con la PCR es la generación de
productos de amplificación no específicos. En muchos casos,
lo anterior se debe a un cebador oligonucleótido no
específico y el suceso de extensión de cebador posterior
antes del procedimiento de termociclado real mismo, debido a
que las ADN polimerasas termoestables también se encuentran
moderadamente activas a temperatura ambiente. Por ejemplo,
se observan con frecuencia productos de amplificación
debidos a la dimerización aleatoria de cebadores y posterior
extensión. Con el fin de superar este problema, es bien
conocido de la técnica la realización de una denominada PCR
"de inicio en caliente", en la que un componente esencial
para la reacción de amplificación se separa de la mezcla de
reacción o se mantiene en un estado inactivo hasta que la
temperatura de la mezcla de reacción se ha elevado por
primera vez. Debido a que la polimerasa no puede funcionar
bajo estas condiciones, no se produce alargamiento de
cebador durante el periodo cuando los cebadores pueden
unirse no específicamente. Con el fin de conseguir este
efecto, se han aplicado varios métodos:
a) separación física de la ADN polimerasa.
La separación física puede conseguirse, por ejemplo,
mediante una barrera de cera sólida, que separa el
compartimiento que contiene la ADN polimerasa del
compartimiento que contiene la mayor parte de los demás
reactivos. Durante la primera etapa de calentamiento, la
cera se funde automáticamente y los compartimientos de
fluido se mezclan (Chou Q. et al., Nucleic Acids Res.
20:1717-1723, 1992). Alternativamente, la ADN polimerasa se
inmoviliza por afinidad sobre un soporte sólido previamente
a la reacción de amplificación y únicamente se libera en la
mezcla de reacción mediante una liberación mediada por calor
(Nilsson J. et al., Biotechniques 22:744-751, 1997). Sin
embargo, ambos métodos exigen mucho tiempo y resulta de
realización poco conveniente.
b) Modificación química de ADN polimerasa.
Para este tipo de PCR de inicio en caliente, la ADN
polimerasa se inactiva reversiblemente como resultado de una
modificación química. Más exactamente, se introducen grupos
bloqueadores lábiles al calor en la ADN polimerasa Taq que
inactivan el enzima a temperatura ambiente. Estos grupos
bloqueantes se eliminan a temperatura elevada durante una
etapa previa a la PCR, de manera que se activa el enzima.
Este tipo de modificación lábil al calor, por ejemplo, puede
conseguir mediante acoplamiento de anhídrido citracónico o
anhídrido aconítrico a los residuos de lisina del enzima
(patente US nº 5.677.152). Los enzimas que portan dichas
modificaciones se encuentran disponibles comercialmente,
tales como ADN polimerasa Amplitaq Gold (Moretti T. et al.,
Biotechniques 25:716-722, 1998) o ADN polimerasa FastStart
(Roche Molecular Biochemicals). Sin embargo, la introducción
de grupos bloqueantes es una reacción química que se produce
arbitrariamente en todos los residuos de lisina
estéricamente disponibles del enzima. Por lo tanto, la
reproducibilidad y calidad de las preparaciones de enzima
modificadas químicamente puede variar y resulta difícil de
controlar.
c) Inhibición de la ADN polimerasa con aditivos de ácidos
nucleicos
Se ha demostrado que la extensión de cebadores
hibridados no específicamente resulta inhibida por la
adición de fragmentos de ADN de doble cadena cortos (Kainz
P. et al., Biotechniques 28:278-282, 2000). En este caso, la
extensión de los cebadores resulta inhibida a temperaturas
inferiores al punto de fusión del fragmento de ADN de doble
cadena corto, aunque independiente de la secuencia del ADN
competidor mismo. Sin embargo, no es conocido en que grado
el exceso de ADN competidor influye sobre el rendimiento de
la reacción de amplificación de ácidos nucleicos.
Alternativamente, pueden utilizarse oligonucleótidos
aptámeros con una secuencia específica que resulta en una
estructura secundaria definida. Dichos aptámeros han sido
seleccionados utilizando la tecnología SELEX para una
afinidad muy elevada con la ADN polimerasa (patente US nº
5.693.502) (Lin Y. y Jayasena S.D., J. Mol. Biol. 271:100111, 1997). La presencia de dichos aptámeros dentro de la
mezcla de amplificación antes del procedimiento de
termociclado mismo nuevamente resulta en una unión de alta
afinidad a la ADN polimerasa y en consecuencia una
inhibición lábil al calor de su actividad. Sin embargo,
debido al procedimiento de selección, todos los aptámeros
disponibles hasta el momento únicamente pueden utilizarse en
combinación con una especie particular de ADN polimerasa.
d) Anticuerpos de ADN Taq
Un enfoque alternativo para conseguir la inhibición de
la ADN polimerasa Taq es la adición de anticuerpos
monoclonales cultivados contra el enzima purificado (Kellogg
D.E. et al., Biotechniques 16:1134-1137, 1994; Sharkey D.J.
et al., Biotechnology (NY) 12:506-509, 1994). Al igual que
los oligonucleótidos aptámeros, el anticuerpo se une a la
ADN polimerasa Taq con elevada afinidad a temperatura
ambiente de un modo inhibitorio. El complejo se resuelve en
una etapa de precalentamiento previa al procedimiento de
termociclado mismo. Esto conduce a una prolongación
sustancial de la amplificación globalmente que requiere
mucho tiempo, especialmente en el caso de que se apliquen
protocolos de termociclado rápido (patente WO nº 97/46706).
La patente US nº 5.985.619 da a conocer una realización
específica para llevar a cabo una PCR utilizando un
anticuerpo de inicio en caliente, en la que se añade como
suplemento a la mezcla de amplificación, aparte de
polimerasa Taq, por ejemplo exonucleasa III de E. coli, con
el fin de digerir intermediarios dímeros cebadores no
específicos. Tal como se ha dado a conocer anteriormente, la
exonucleasa III reconoce ADN de doble cadena como sustrato,
tal como, por ejemplo, híbridos de producto de diana/cebador
o de diana/producto de extensión de cebador. La digestión
tiene lugar por medio del corte del enlace fosfodiéster en
el extremo 5' del residuo desoxinucleótido 3'-terminal.
Debido a que este tipo de exonucleasa se encuentra activo a
temperatura ambiente, resultan digeridos todos los cebadores
hibridados no específicamente y los productos de extensión
de cebador. Sin embargo, la digestión de los cebadores no
específicos dependiente de la duración del tiempo de
preincubación puede conducir a una reducción sustancial y no
- controlada
- de la concentración de cebador, que a su vez
- puede afectar a la reacción de amplificación misma.
- e) Uso de exonucleasas
- Otra
- alternativa para incrementar la eficiencia de
amplificación es la utilización de cebadores
oligonucleótidos fosforotioato en combinación con una
exonucleasa III en las mezclas de reacción de PCR (patente
EP nº 0 744 470). En este caso, una exonucleasa 3', que
habitualmente acepta sustratos de ADN de doble cadena, así
como de una cadena, degrada los artefactos dúplex, tales
como dímeros cebadores, así como amplicones contaminantes
arrastrados, dejando los cebadores de amplificación de una
cadena sin degradar. En este contexto, también se ha
sugerido utilizar grupos fosfato unidos al extremo 3' que se
eliminan tras la formación de doble cadena como medio para
impedir el alargamiento de cebador no dependiente de molde
(patente EP nº 0 439 182). De manera similar, se ha sugerido
la utilización de cebadores con extremo 3' modificados
abásicos y la eliminación dependiente de molde por parte de
la endonucleasa IV de E. coli (patente US nº 5.792.607). Sin
embargo, existen varias desventajas importantes de estos
métodos:
en primer lugar, no pueden sintetizarse
oligonucleótidos que contienen residuos fosforotioato de un
modo estereoisoméricamente puro. Además, sus temperaturas de
hibridación son diferentes en comparación con los
oligonucleótidos no modificados de la misma secuencia y se
observan frecuentemente sucesos de hibridación no
específica. En segundo lugar, los cebadores que contienen
residuos fosforotioato incluso a sus extremos 3' todavía
- pueden
- alargarse mediante la ADN polimerasa, que ya se
- encuentra
- presente en la mezcla de reacción. En otras
- palabras,
- el efecto de la exonucleasa se encuentra
compensado por lo menos parcialmente por la presencia de la
polimerasa misma. En tercer lugar, la actividad enzimática
de la endonucleasa IV de E. coli es muy baja en presencia de
iones Mg++ (Siwek B. et al., Nucleic Acids Res. 16:50315038, 1988). Sin embargo, dependiendo del tipo específico de
ensayo, un prerrequisito esencial para una reacción de
amplificación por PCR con éxito es una concentración de Mg++
significativa exacta, que convierte a la aplicación de una
endonucleasa IV en una muestra de PCR en bastante
inefectiva. En cuarto lugar, y más importante, las nucleasas
convencionales, tales como la exonucleasa III de E. coli o
la endonucleasa IV de E. coli son termolábiles y por lo
tanto únicamente son activas previamente al procedimiento de
termociclado mismo. En consecuencia, la unión no específica
a cebadores y la extensión únicamente resultan inhibidas
antes del procedimiento de termociclado y no durante el
mismo.
Una mejora adicional del concepto de exonucleasa para
las aplicaciones de inicio en caliente se da a conocer en el
documento EP nº A-1 277 841, que permite una inhibición del
cebado no específico y de la extensión de cebadores no sólo
antes del procedimiento de amplificación mismo sino también
durante el procedimiento de termociclado. A este respecto,
el documento EP nº A-277 841 da a conocer una composición
para llevar a cabo una reacción de amplificación de ácidos
nucleicos que comprende una ADN polimerasa termoestable, una
exonucleasa 3'-5' termoestable y por lo menos un cebador
para la amplificación de ácidos nucleicos con un residuo 3'terminal modificado que no resulta alargado por dicha ADN
polimerasa termoestable. En este contexto, la exonucleasa
3'-5' termoestable es más activa a temperaturas de entre
37ºC y 72ºC, y menos activa a temperaturas inferiores a
37ºC. La exonucleasa termoestable puede ser un homólogo de
exonucleasa III o una ADN polimerasa mutada con una
actividad polimerasa reducida o nula.
El concepto dado a conocer en el documento EP nº A-1
277 841 se basa principalmente en la posibilidad de evitar
el alargamiento de los cebadores a temperaturas bajas
mediante la introducción de modificaciones químicas en el
extremo 3' de por lo menos un cebador. Con el fin de que el
cebador resulte accesible a temperaturas de alargamiento de
PCR típicas, el concepto incluye la utilización de una
exonucleasa termoestable que es inactiva a temperatura
ambiente o inferior, dejando de esta manera sin afectar al
cebador modificado a estas temperaturas.
Al incrementarse la temperatura, la exonucleasa se
activa y es capaz de eliminar la modificación 3' del
cebador, permitiendo de esta manera que el cebador participe
en la reacción de amplificación misma. De acuerdo con el
concepto, la actividad de exonucleasa es una actividad 3'-5'
exonucleasa que reconoce especialmente dichos híbridos de
molde-cebador como sustratos. Éste es el caso de la
exonucleasa III de E. coli y homólogos de otros organismos,
que reconoce el ADN de doble cadena con un extremo 5'
protuberante como sustrato preferente y resultan
especialmente capaces de digerir el extremo 3' hundido del
sustrato en dirección 3'-5'.
En vista de la técnica anterior comentada
anteriormente, es un objetivo de la invención proporcionar
un método económico alternativo para la PCR en tiempo real
que facilite un protocolo de inicio en caliente y que
simultáneamente permite la detección en tiempo real. En
otras palabras, es un objetivo de la presente invención
desarrollar un método mejorado de PCR en tiempo real que no
- requiera aditivos de inicio en caliente adicionales.
- Breve descripción de la invención
- El
- principio subyacente a la presente invención se
- ilustra esquemáticamente en la fig. 1.
- En
- un primer aspecto, la invención se refiere a un
método para amplificar y detectar un ácido nucleico diana,
que comprende:
-someter dicho ácido nucleico diana a una reacción de
amplificación mediante PCR en tiempo real en presencia de:
-una ADN polimerasa termoestable,
-una exonucleasa 3'-5' termoestable dependiente
de doble cadena que no es una ADN polimerasa que
presente actividad correctora de errores 3'-5',
-una pareja de cebadores de amplificación, tales
como:
-desoxinucleósidos trifosfato,
-una sonda de hibridación que porta un primer
marcaje y un segundo marcaje,
-siendo capaz dicho primer marcaje de actuar como
entidad informadora fluorescente al excitarla con
luz de una longitud de onda apropiada,
-siendo capaz dicho segundo marcaje de actuar
como entidad extintora de la fluorescencia de
dicha entidad informada fluorescente,
caracterizado porque un marcaje se encuentra unido
al extremo 3' de dicha sonda de hibridación, y
caracterizado además porque el otro marcaje se
encuentra unido internamente o en el extremo 5' a dicha
sonda de hibridación,
caracterizado adicionalmente porque dicha sonda no
participa en el procedimiento de amplificación por medio del
cebado de una reacción de polimerización de ADN,
-realizar un seguimiento de la fluorescencia de
dicha entidad informadora fluorescente por lo menos después
de una pluralidad de ciclos de amplificación,
en el que se crea una señal fluorescente por medio de
la eliminación de una entidad fluorescente 3' de dicha sonda
de hibridación que realiza dicha exonucleasa termoestable
durante cada ciclo de amplificación.
En una realización, la entidad informadora se encuentra
en el extremo 3' de dicho oligonucleótido de detección. En
una realización principal alternativa, la entidad extintora
se encuentra en el extremo 3' de dicho oligonucleótido de
detección.
Preferentemente, el marcaje unido al residuo nucleótido
- 3'-terminal
- de dicho oligonucleótido de detección se
- encuentra
- unido a dicho oligonucleótido med iante un grupo
- fosfato.
También preferentemente, el segundo marcaje se une a
una base de un residuo de dicha sonda de hibridación.
Alternativamente, el segundo marcaje puede unirse a un
elemento abásico de dicha sonda de hibridación.
La exonucleasa 3'-5' dependiente de doble cadena se
selecciona preferentemente de entre un grupo de enzimas,
consistiendo dicho grupo de exonucleasa III, endonucleasa
IV, ADN polimerasas que muestran actividad exonucleasa 3'-5'
u otros enzimas con actividad exonucleasa 3'-5' o correctora
de errores procedentes de eucariotas, procariotas,
arqueobacterias, bacteriófagos o virus.
Descripción detallada de la invención
Tal como ya se ha descrito de manera general
anteriormente, la presente invención se refiere a un método
para llevar a cabo PCR en tiempo real. Se refiere a un
método para la detección y análisis homogéneo de secuencias
de ácidos nucleicos por medio de la utilización de
oligonucleótidos marcados la fluorescencia de los cuales
cambia en respuesta a la hibridación de sonda y diana. La
presente invención también se refiere a la degradación de
los extremos 3' de oligonucleótidos hibridados a un molde de
ADN, y a un método para cuantificar secuencias específicas
en la amplificación de ácidos nucleicos en tiempo real.
Predominantemente, la invención se caracteriza porque una
sonda de hibridación porta una entidad extintora de la
fluorescencia y una entidad informadora fluorescente. De
manera similar al formato de detección TaqMan, se crea una
señal fluorescente por medio de la eliminación de una
entidad fluorescente 3' de dicha sonda de hibridación
durante cada ciclo de amplificación.
Más exactamente, la presente invención se refiere a un
método para amplificar y detectar un ácido nucleico diana,
que comprende:
-someter dicho ácido nucleico diana a una reacción de
amplificación mediante PCR en tiempo real en presencia de:
-una ADN polimerasa termoestable,
-una exonucleasa 3'-5' termoestable dependiente
de doble cadena que no es una ADN polimerasa que
presente actividad correctora de errores 3'-5',
-una pareja de de cebadores de amplificación,
-desoxinucleósidos trifosfato,
-una sonda de hibridación que porta un primer
marcaje y un segundo marcaje,
-siendo capaz dicho primer marcaje de actuar como
entidad informadora fluorescente al excitarse con
luz de una longitud de onda apropiada,
-siendo capaz dicho segundo marcaje de actuar
como entidad extintora de la fluorescencia de
dicha entidad informadora fluorescente,
caracterizado porque un marcaje se encuentra unido
al extremo 3' de dicha sonda de hibridación, y
caracterizado adicionalmente porque el otro
marcaje se encuentra unido internamente o en el
extremo 5' a dicha sonda de hibridación,
caracterizado además porque dicha sonda no
participa en el procedimiento de amplificación por
medio del cebado de una reacción de polimerización
del ADN,
-realizar el seguimiento de la fluorescencia de
dicha entidad informadora fluorescente después de
por lo menos una pluralidad de ciclos de
amplificación,
en el que se crea una señal fluorescente por medio de
la eliminación de una entidad fluorescente 3' de dicha sonda
de hibridación que realiza dicha exonucleasa termoestable
durante cada ciclo de amplificación.
Antes del termociclado mismo, únicamente se produce
señalización fluorescente basal o sustancialmente nula
debido a la extinción de la entidad informadora fluorescente
por parte de la entidad extintora de fluorescencia. Tras el
incremento de la temperatura, se activa la exonucleasa
termoestable y se inicia la eliminación del marcaje 3'terminal, con la condición de que la sonda de hibridación se
encuentre unida a una molécula diana. Como consecuencia,
varía la señalización fluorescente durante cada ciclo de
amplificación debido a un incremento de la concentración del
ADN diana amplificado.
La polimerasa termoestable puede ser cualquier tipo de
ADN polimerasa dependiente de ADN o de ARN, preferentemente
la polimerasa Taq de Thermus aquaticus. En una realización
específica, se utiliza una mezcla de polimerasas
termoestables, en la que una polimerasa Taq proporciona una
procesividad elevada y un segundo enzima proporciona una
actividad correctora de errores 3'-5' (por ejemplo ROCHE nº
de cat. 1732641).
En el contexto de la presente invención, el término
"termoestable" se define como un enzima que conserva más de
50%, preferentemente más de 80%, y más preferentemente más
de 90% de su actividad tras 60 minutos de incubación a 70ºC.
En el contexto de la presente invención, la expresión
"exonucleasa 3'-5' termoestable dependiente de doble cadena"
se define como una nucleasa que reconoce el extremo recesivo
3'-terminal de un ADN de doble cadena como sustrato y es
capaz de cortar directamente cadena arriba (5') del grupo
fosfato terminal en el extremo recesivo 3'. También se
indica que, en el contexto de la presente invención, dichas
exonucleasas se discriminan claramente de las ADN
polimerasas que presentan una actividad correctora de
errores 3'-5' adicional.
El método según la invención también resulta aplicable
a cualquier oligonucleótido marcado en su extremo 3'
independiente del enlace entre el compuesto fluorescente y
el oligonucleótido mismo. Sin embargo, resulta altamente
preferente que el marcaje unido al residuo nucleótido 3'terminal de dicha sonda de hibridación se una a dicho
oligonucleótido mediante un grupo fosfato, debido a que
dicho enlace facilita el corte por parte de la exonucleasa
respectiva. En el caso de que se utilicen otros línkers sin
un grupo fosfato, el corte más probablemente se produce en
el enlace fosfato entre el residuo nucleótido terminal y
proxiterminal.
Preferentemente, la exonucleasa 3'-5' termoestable es
más activa a temperaturas de entre 37ºC y 72ºC y menos
activa a temperaturas inferiores a 37ºC. En otras palabras,
la actividad enzimática del enzima a cualquier temperatura
inferior a 37ºC es, en cualquier caso, inferior en
comparación con la actividad enzimática a cualquier
temperatura comprendida entre 37ºC y 72ºC. El óptimo de
temperatura para el enzima en consecuencia puede encontrarse
comprendido entre 50ºC y 85ºC.
La exonucleasa termoestable es preferentemente un
homólogo de la exonucleasa III que puede originarse a partir
cualquier organismo termoestable. En el contexto de la
presente invención, se define un homólogo de la exonucleasa
III como un enzima que reconoce el ADN de doble cadena con
un extremo 5'-protuberante como sustrato y es capaz de
eliminar los residuos nucleótidos del extremo 3' retrasado.
Un homólogo de la exonucleasa III termoestable de
Archaeoglobus fulgidus (ExoIII Afu) ha sido dado a conocer
recientemente (documento EP nº A-1088891), que resulta
- especialmente
- adecuado para los protocolos de inicio en
- caliente
- según la invención. La ventaja de utilizar el
- enzima en comparación con otros enzimas es que:
-el enzima claramente es preferentemente activo en ADN
de doble cadena, y
-es altamente activo a temperaturas de entre 37ºC y
72ºC, pero presenta una actividad baja a temperaturas de
entre 20ºC y 37ºC.
Alternativamente, la exonucleasa 3'-5' termoestable
puede ser una ADN polimerasa mutada con una actividad de
polimerasa nula o sustancialmente reducida aunque con una
actividad de exonucleasa 3' suficientemente alta. Una
actividad de ADN polimerasa reducida en este contexto se
refiere a menos de 50% de dicha actividad de un enzima que
muestra actividad de ADN polimerasa. También
alternativamente, puede utilizarse la endonucleasa IV para
un método según la invención.
Una sonda de hibridación para el seguimiento mismo de
la PCR en tiempo real no participa en el procedimiento de
amplificación por medio del cebado de una reacción de
polimerización de ADN.
Resulta posible prácticamente cualquier tipo de marcaje
y, todavía más importante, se alcanza un grado más alto de
especificidad. La desventaja es que, para un ensayo
respectivo, resultan necesarios por lo menos 2 cebadores de
amplificación y una sonda de hibridación doblemente marcada
adicional. De esta manera, se incrementa la complejidad de
dicho ensayo.
Con el fin de obtener un efecto de inicio en caliente
apropiado, puede modificarse por lo menos uno o ambos
cebadores de amplificación con un grupo fosfato 3'-terminal
u otra modificación que, con el incremento de temperatura,
resulta cortado por la exonucleasa termoestable.
Además, para dicha realización se ha demostrado que
resulta ventajoso que se impida que la ADN polimerasa
termoestable realice una extensión no deseada de la sonda de
hibridación durante la PCR. Lo anterior puede obtenerse de
dos maneras diferentes:
i) en el caso de que el marcaje 3'-terminal se una a la
sonda de hibridación mediante un grupo fosfato, el
nucleótido 3'-terminal puede ser un denominado "finalizador
de polimerasa", es decir, un derivado nucleótido o cualquier
otra estructura que sustituya a un residuo nucleótido, que
no puede ser alargado por una reacción de ADN polimerasa.
Una lista de finalizadores de polimerasa putativos incluye
análogos de bases, enlaces internucleosídicos modificados y
análogos de sacáridos. Dicha modificación todavía permite el
corte del marcaje 3', pero tras el corte, la polimerasa no
puede reconocer el extremo 3' "modificado" que se ha
generado,
ii) en el caso de que el marcaje 3'-terminal se
encuentre unido a la sonda de hibridación mediante un línker
que no contenga un grupo fosfato, el residuo 3'proxiterminal es la posición preferente para un "finalizador
de polimerasa".
Además, los "finalizadores de polimerasa" tales como
los dados a conocer anteriormente también pueden impedir la
degradación completa del oligonucleótido de detección por
parte de la actividad de la exonucleasas 3'-5' termoestable
dependiente de doble cadena.
Tras la utilización de un "finalizador de polimerasa"
interno, puede realizarse la detección específica de alelo
con un residuo 3'-terminal discriminante marcado en el
extremo 3'. En este caso, un oligonucleótido de marcaje dual
según la invención contiene además un residuo nucleótido
derivatizado entre el marcaje interno y el residuo 3'terminal marcado en el extremo 3', siendo incapaz dicho
nucleótido derivatizado de resultar alargado por la ADN
polimerasa termoestable. En el caso de que el residuo
nucleótido discriminante 3'-terminal se aparea con el ADN
diana, se produce la amplificación independiente de alelo y
la generación posterior de una señal específica de alelo
debido a la eliminación del marcaje por parte de la
exonucleasa. En el caso de el residuo nucleótido
discriminante 3'-terminal NO se aparee con el ADN diana, se
produce la amplificación independiente de alelo, aunque la
eliminación exonucleolítica del nucleótido discriminante 3'
que porta el marcaje fluorescente no resulta posible y en
consecuencia, no se genera ninguna señal de detección.
Tal como se ha explicado anteriormente, la sonda de
hibridación según la invención porta un primer marcaje y un
segundo marcaje. El primer marcaje es capaz de actuar como
entidad informadora fluorescente al ser excitada con luz de
una longitud de onda apropiada, y siendo capaz el segundo
marcaje de actuar como entidad extintora de la fluorescencia
- de
- dicha entidad informadora fluorescente. En principio,
- puede
- seleccionarse arbitrariamente si la entidad
- informadora
- fluorescente o la entidad extintora de
fluorescencia se encuentra unida al extremo 3' del
oligonucleótido de detección y cuál de estas entidades se
encuentra unida internamente o en el extremo 5' de dicha
sonda de hibridación. El experto en la materia realizará
esta selección según la disponibilidad de los reactivos de
marcaje fluorescente para cualquiera de las alternativas
indicadas.
La síntesis de oligonucleótidos modificados 3'terminales puede realizarse mediante cualquier método
conocido de la técnica. Pueden introducirse pigmentos
fluorescentes mediante la utilización de un tipo especial de
partículas de vidrio de poro controlado disponibles
comercialmente en forma de matriz iniciadora de la síntesis
de oligonucleótidos. La fluoresceína, por ejemplo, se da a
conocer en el documento EP nº A-1 186 613. En principio, el
segundo marcaje puede introducirse en el extremo 5' de la
sonda de hibridación mediante métodos conocidos de la
técnica. Por ejemplo, pueden acoplarse fluoróforofosforamiditas al oligonucleótido en el extremo de una
síntesis de oligonucleótidos convencional.
Preferentemente, sin embargo, el segundo marcaje se une
internamente al oligonucleótido para proporcionar una
vecindad espacial estrecha entre la entidad informadora
fluorescente y la entidad extintora de fluorescencia con la
condición de que no haya sido eliminado el marcaje 3'terminal.
En una primera realización, dicho segundo marcaje se
une a una base de un residuo de dicho oligonucleótido de
detección. Puede unirse un marcaje interno a la posición 5
de un dU interno (Glenn Research, fluoresceína dT10-1056xx). Alternativamente, puede realizarse el marcaje de bases
según la solicitud europea nº 03007844.8 (presentada el
5.4.03).
En una segunda realización, que es mutuamente exclusiva
respecto a dicha primera realización, dicho segundo marcaje
se une a un elemento abásico apropiado (línker) de dicha
sonda de hibridación. En este caso, el elemento básico se
diseña de manera que las bases de los residuos nucleótidos
vecinos puedan aparearse a dos residuos nucleótidos
complementarios en el ácido nucleico diana, los cuales se
encuentran separados entre sí por 1 residuo nucleótido
adicional. Se dan a conocer ejemplos en la patente WO nº
97/43451.
En una tercera realización que también es mutuamente
exclusiva respecto a dichas primera y segunda realizaciones,
el marcaje se une al esqueleto de la cadena de nucleótidos,
mediante, por ejemplo, un fosfotioato apropiado.
En general, cualquier tipo de sistema de transferencia
energética por resonancia de fluorescencia (FRET) conocido
de la técnica, que consiste de una pareja de donante de FRET
y aceptor de FRET, puede utilizarse para proporcionar un
primer marcaje apropiado y un segundo marcaje apropiado
según la invención. De manera similar, si no idéntica, al
formato de detección TaqMan, en todo caso es el compuesto
donante de FRET que se excita con luz de una longitud de
onda apropiada y se detecta en un canal de detección
apropiado. Para el propósito de la presente invención, el
donante de FRET se denomina "entidad informadora
fluorescente". En consecuencia, el compuesto aceptor de FRET
para el propósito de la presente invención se denomina
"entidad extintora de fluorescencia". En resumen, las
entidades informadoras fluorescentes y entidades extintoras
de fluorescencia que pueden utilizarse para la presente
invención son bien conocidas por el experto en la materia.
Pueden utilizarse todos los pigmentos informadores TaqMan
estándares, tales como FAM (detectado a 530 nm) y HEX o VIC
(detectado a 560 nm). Dos otros ejemplos específicos son la
combinación fluoresceína (informador) y LC-rojo 640 (Roche
Applied Science) (extintor) o fluoresceína (informador) y
dabcilo (Molecular Probes) (extintor). En una realización
específica adicional, pueden utilizarse extintores Black
Hole (Biosearch Technologies) o incluso nitroindol (que es
- conocido
- como compuesto extintor) en combinación con una
- diversidad de diferentes entidades informadoras.
- Descripción de las figuras
- Figura 1
- Dibujo esquemático
- de un método de reacción PCR de
inicio en caliente en tiempo real según la invención,
caracterizado porque el oligonucleótido de detección es
una sonda de hibridación.
Figura 2
Seguimiento en tiempo real de una reducción de la señal
FRET de LC-Rojo 640 tal como se da a conocer en el
Ejemplo 1. El cebador porta un marcaje interno R640 y
un marcaje fluoresceína 3'-terminal. Se eliminó el
marcaje terminal utilizando la exonucleasa III tras la
hibridación del cebador.
Figura 3
Seguimiento en tiempo real de un incremento de la
fluorescencia de la fluoresceína tal como se ha dado en
conocer en el Ejemplo 1. El cebador porta un marcaje
R640 interno y un marcaje fluoresceína 3'-terminal. El
marcaje terminal fue liberado mediante exonucleasa III
- tras
- la hibridación del cebador, conduciendo a un
- cambio de la señal fluorescente.
- Figura 4
- Tinción
- en gel de los productos de amplificac ión
- obtenidos en el Ejemplo 1.
- 1.
- Reacción de PCR en ausencia de exonucleasa III.
- 2.
- en presencia de 3 ng
- 3.
- en presencia de 20 ng
- 4.
- en presencia de 12,5 ng
- 5.
- en presencia de 5 ng de exonucleasa III
- 6.
- Marcador V de peso molecular de Roche Applied Science, nº de cat. 821705.
Reacción de PCR en tiempo real tal como se da a conocer
en el Ejemplo 2. "Cebador 300.1 + 500rev + Sonda
HPQ15": detección de la formación de producto con una
sonda que porta una fluoresceína interna y una molécula
extintora en el extremo 3'.
"Cebador 300.1 + Sonda HPQ15": detección de la
formación de producto con ayuda de un cebador que porta
una fluoresceína interna y una molécula extintora en el
extremo 3'.
El experimento siguiente no es un ejemplo de la
invención.
Para este experimento de PCR en tiempo real, utilizando
el procedimiento FRET, se diseñó un cebador marcado
doblemente que portaba un marcaje interno LC-Rojo 640 (Roche
Applied Science, nº de cat. 2 015 161) y un marcaje
fluoresceína 3'-terminal (Roche Applied Science nº de cat. 3
138 178). Se eliminó el marcaje terminal mediante
exonucleasa III tras la hibridación del cebador, resultando
en una reducción de la señalización de LC-Rojo640 y
simultáneamente un incremento de la fluorescencia de la
fluoresceína.
Los cebadores eran los siguientes:
Sec Id. nº 1:
"βActinaHP25": CCTGGGTCATCTTCT**(Rojo
640)CGCGG*U*TpFluos-3'
T**(Rojo 640)=T-LCRojo 640 (se introdujo T
fosforamidato amino-modificado durante la síntesis de
oligonucleótidos. Posteriormente, se hizo reaccionar el
grupo amino reactivo con NHS éster de LC-Rojo 640)
U*=2'-O-metil-U
G*=2'-O-metil-G
p=fosfato
Fluos=Fluoresceína
La síntesis y el marcaje de los oligonucleótidos se
llevó a cabo según protocolos estándares conocidos de la
técnica.
Se prepararon reacciones de PCR con 2 µl de sondas de
hibridación de mezcla de reacción LightCycler FastStart
(Roche Applied Science nº de cat. 3003248), 30 ng de ADN genómico humano (Roche Applied Science nº de cat. 1691112), MgCl2 3 mM, 500 nM de secuencias de cebador nº βActina5.2fd, 400 nM de cebador sec. nº βActinaHP25 y 2,5 unidades de 5 polimerasa Taq sin exonucleasa III de A. fulgidus y con la adición de cantidades decrecientes de exonucleasa III de A. fulgidus, 33 ng, 20 ng, 12,5 ng y 5 ng por reacción. El volumen de reacción final de 20 µl se ajustó con agua destilada. Las reacciones de PCR se llevaron a cabo en un
10 LightCycler (Roche Applied Science nº de cat. 2011468) programado siguiendo las instrucciones del manual para el usuario del fabricante. Las condiciones de PCR eran las siguientes:
- 1 ciclo
- 60 s
- 95ºC
- 45 ciclos
- 0 s
- 95ºC
- 10 s
- 60ºC
- 15 s
- 72ºC
15 Los resultados se muestran en las figuras 2, 3 y 4. Tal como puede observarse en la fig. 2, la señal de LC-Rojo 640 monitorizada en el canal F2 se redujo al incrementarse el número de ciclos. El efecto era dependiente de la dosis con respecto a la cantidad de exonucleasa III de A. fulgidus en
20 la mezcla de reacción. En ausencia de exonucleasa III no se observó ninguna reducción de la fluorescencia de LC-rojo
640.
Se realizó un seguimiento de la emisión de
fluorescencia de la fluoresceína en el canal F1. Tal como
25 puede observarse en la fig. 3, la señal se incrementó con un número creciente de ciclos. El efecto era dependiente de la
dosis con respecto a la cantidad de exonucleasa III de A.
- fulgidus
- en la mezcla de reacción. En ausencia de
- exonucleasa
- III no se observó ningún incremento de la
- señalización de fluoresceína.
Tras completarse el análisis de LightCycler, los
productos de PCR se analizaron en un gel de Agarosa MS ROCHE
al 3% teñido con bromuro de etidio. El resultado se muestra
en la fig. 4. Únicamente pudo detectarse la presencia de
exonucleasa III de A. fulgidus, el producto de PCR esperado
de 214 pb (carriles 2 a 5). Ejemplo
En otro experimento de PCR en tiempo real, se realizó
un seguimiento de la reacción con una sonda oligonucleótida
que portaba una fluoresceína interna y dabcilo como
compuesto extintor 3'-terminal. Tras la hibridación del
oligonucleótido, se eliminó el extintor terminal con
exonucleasa III, resultando en una desatenuación de la señal
de la fluoresceína. Los grupos informadores se encontraban
situados en un oligonucleótido utilizado como sonda
(reacción 1, "Cebador 300.1 + 500rev + SondaHPQ15") o,
alternativamente, como cebador (reacción 2, "Cebador 300.1 +
SondaHPQ15").
Las secuencias de cebador y sonda eran las siguientes:
SEC ID nº 3
"Cebador βAct300.1" CACCCCGTGCTGCTGACCGAp
p=fosfato
SEC ID nº 4
"β-Act 500 rev" AGGGAGGCGGCCACCAGAAGp
p=fosfato
SEC ID nº 5
"βActinaHPQ15" CCTGGGTCATCTTCT* *(Fluos)CGCGGTTpZ p=fosfato Z=dabcilo
5 T**(Fluos)=T-fluoresceína, incorporada durante la síntesis de oligonucleótidos en forma de Tfluoresceína-fosforamidita.
Se prepararon reacciones de PCR con 2 µl de sondas de hibridación de mezcla de reacción LightCycler FastStart 10 (Roche Applied Science nº de cat. 3003248), 30 ng de ADN genómico humano (Roche Applied Science nº de cat. 1691112), MgCl2 3 mM, 2,5 unidades de polimerasa Taq, 33 ng de exonucleasa III de A. fulgidus. La reacción nº 1 contenía 500 nM de cebador Seq 300.1, 500 nM de cebador 500 rev y 500 15 nM de sonda Sec. nº HPQ15. La reacción nº 2 contenía 500 nM de cebador 300.1 y 500 nM de βActina HPQ15. El volumen de reacción final de 20 µl se ajustó con agua destilada. Las reacciones de PCR se llevaron a cabo en un LightCycler (Roche Applied Science nº de cat. 2011468) programado
20 siguiendo las instrucciones del manual para el usuario del fabricante. Las condiciones de PCR eran las siguientes:
- 1 ciclo
- 60 s
- 95ºC
- 45 ciclos
- 0 s
- 95ºC
- 10 s
- 65ºC
- 10 s
- 72ºC
Se realizó el seguimiento de las reacciones de PCR en tiempo real en el canal F1 y se observó un incremento de la 25 señal con la formación creciente de producto de PCR. Tal como se muestra en la figura 5, tanto la utilización de una
sonda doblemente marcada según la invención (reacción 1,
"Cebador 300.1 + 500rev + SondaHPQ15"), así como la
utilización de un cebador doblemente marcado según la
invención (reacción 2, "Cebador 300.1 + SondaHPQ15) resultó
en una señalización de amplificación con éxito.
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- <110>
- Roche Diagnostics GmbH
- F.
- Hoffmann-La Roche AG
<120> Nuevo formato de detección para la reacción en cadena
de la polimerasa en tiempo real de inicio en caliente
<130> 21869 EP
<160> 5
<170> PatentIn versión 3.2
<210> 1
<211> 20
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10
Claims (6)
- Reivindicaciones1. Método para amplificar y detectar un ácido nucleicodiana, que comprende: -someter dicho ácido nucleico diana a una reacción de amplificación por PCR en tiempo real en presencia de:-una ADN polimerasa termoestable, -una exonucleasa 3'-5' termoestable dependiente de doble cadena que no es una ADN polimerasa que presente actividad correctora de errores 3'-5', -una pareja de cebadores de amplificación, -desoxinucleósidos trifosfato, -una sonda de hibridación que porta un primer marcaje y un segundo marcaje, -siendo capaz dicho primer marcaje de actuar como entidad informadora fluorescente al excitarse con luz de una longitud de onda apropiada, -siendo capaz dicho segundo marcaje de actuar como entidad extintora de la fluorescencia de dicha entidad informadora fluorescente, caracterizado porque un marcaje se encuentra unido al extremo 3' de dicha sonda de hibridación, y caracterizado porque además el otro marcaje se encuentra unido internamenteo en el extremo 5' a dicha sonda de hibridación,caracterizado porque además dicha sonda noparticipa en el procedimiento deamplificación por medio del cebado de unareacción de polimerización de ADNrealizando un seguimiento de la fluorescenciade dicha entidad informadora fluorescente porlo menos después de una pluralidad de ciclosde amplificación,-en la que se crea una señal fluorescentepor medio de:la eliminación de una entidad fluorescente 3' de dicha sonda de hibridación que realiza dicha exonucleasa termoestable durante cada ciclo de amplificación.
-
- 2.
- Método según la reivindicación 1, en el que dicha entidad informadora se encuentra en el extremo 3' de dicha sonda de hibridación.
-
- 3.
- Método según las reivindicaciones 1 a 2, en el que dicho marcaje unido al residuo nucleótido 3'-terminal de dicha sonda de hibridación se encuentra unido a dicho oligonucleótido mediante un grupo fosfato.
-
- 4.
- Método según las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicha exonucleasa 3'-5' dependiente de doble cadena se selecciona de entre un grupo que consiste de exonucleasa III y exonucleasa IV.
-
- 5.
- Método según las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho segundo marcaje se encuentra unido a una base de un residuo de dicha sonda de hibridación.
-
- 6.
- Método según las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho segundo marcaje se une a un elemento abásico de dicha sonda de hibridación.
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