JP2003070497A - 核酸欠失シーケンスの検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 核酸における欠失部分の存在を決定するため
の方法を提供する。 【解決手段】 本発明の方法において、関係している核
酸を含有していると思われるサンプルを短鎖ＰＣＲにお
いて適当な試薬を含む試薬および欠失シーケンスに隣接
するプライマーに接触させる。これらの物質に接触した
核酸を増幅して確認する。上記プライマーに対してハイ
ブリッド形成する各シーケンスの間に比較的に長いシー
ケンスを有する野生型の核酸は増幅されない。一方、変
異体の核酸は増幅される。従って、増幅体の検出により
欠失部分を有する核酸シーケンスの存在を知らせるシグ
ナルが得られる。このサンプルを上記欠失シーケンスに
対して特異的な切断試薬に接触させることにより、野生
型ＤＮＡが切断されるが、当該欠失シーケンスを含まな
い変異体の核酸は切断されない。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は関係しているサンプ
ル中の突然変異体（Mutant）の存在の有無を決定する方
法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ミトコンドリアは動物細胞内に分布して
いる細胞質の小器官であり、その機能は細胞の生物化学
的なプロセスを行なうために必要な高エネルギーのＡＴ
Ｐ分子を発生することである。このミトコンドリアは染
色体ＤＮＡから分離して異なっている固有のＤＮＡを含
む。このミトコンドリアのＤＮＡ（ｍｔ−ＤＮＡ）は電
子伝達鎖の多数の重要なタンパク質のサブユニットおよ
びこれらのタンパク質の表現に必要な構造のリボソーム
ＲＮＡ（ｒＲＮＡ）およびトランスファーＲＮＡ（ｔＲ
ＮＡ）に対応して限定的にコード化する。染色体ＤＮＡ
とは異なり、各細胞は１００，０００個以上のｍｔ−Ｄ
ＮＡの複製体または模写体を含有できる。また、細胞は
野生型および変異体のｍｔ−ＤＮＡの混合物（異種原形
質（heteroplasmy））を収容できる。ミトコンドリアの
遺伝子は動的であり、そのｍｔ−ＤＮＡ遺伝子型は異種
原形質の細胞母集団内において増加したＤＮＡ変異体の
担持状態に移行する方向に漂流できる。このような条件
下において代謝の表現型は経時的に劣化し、変異体の担
持状態が影響を受けている組織内の一定の臨界的な閾値
を超えると病気を明示して、生体エネルギー的な不全を
引き起こし、結果として細胞の死を生じる。

【０００３】ミトコンドリアの障害は心臓および脳等の
器官において特に問題であり、これら２種類の器官はエ
ネルギーのための最も高い代謝および最も豊富なミトコ
ンドリア（ｍｔ）を必要としている。ＡＴＰは酸素
（「酸化的リン酸化」）を必要とするために、急激な低
酸素症はこれらの組織に特に損傷を与える。さらに、低
酸素症の期間に続いて酸素を再び供給すると、酸素誘導
型の遊離ラジカルが放出されて、これらのラジカルがＤ
ＮＡを損傷する可能性がある（灌流／再灌流の損傷）。
このようなラジカルはミトコンドリア・ゲノムに近接し
て存在しているミトコンドリア・シトクロムにより豊富
に生成される。さらに、ミトコンドリアは原始的なバク
テリアから誘導されるために、これらは哺乳類動物の細
胞核において見られる比較的に進歩した修復機構を欠い
ている。上記の両方の理由により、ミトコンドリアのＤ
ＮＡはその核のゲノムよりも高い突然変異速度を示す。

【０００４】酸化的リン酸化（ＯＸＰＨＯＳ）に付随す
る酵素の活性は人類および霊長類の筋肉、肝臓、および
脳において年齢と共に低下する傾向を示していた。この
現象は心臓および骨格筋線維の局所性シトクロム・オキ
シダーゼ（ＣＯＸ）欠損における年齢に関連した増加に
平行して生じ、このＣＯＸ陰性領域は個々のｍｔ−ＤＮ
Ａ再配列のクローン性増殖体を含む。さらに、上記の現
象は種々の欠失および塩基置換を含む種々の体細胞のｍ
ｔ−ＤＮＡ変異の蓄積にも相関付けられる。また、種々
の組織において蓄積するｍｔ−ＤＮＡの損傷の程度は年
齢に関連した機能不全を最も生じやすい組織に相関付け
られる。従って、脳幹神経節に最高レベルのｍｔ−ＤＮ
Ａの損傷が蓄積し、その後に種々の皮質領域に蓄積され
る。しかしながら、小脳は一生を通じてｍｔ−ＤＮＡの
損傷が比較的に無い状態で維持される。このことは体細
胞のｍｔ−ＤＮＡ変異の蓄積が体細胞組織の年齢に関連
した衰退化において重要なファクターになり得ることを
示している。

【０００５】体細胞の突然変異体が蓄積すると、組み合
わされた欠損症がその組織のエネルギー不全を生じるの
に十分になるまで、これらの変異体が遺伝したＯＸＰＨ
ＯＳ欠損部分を悪化する可能性がある。体細胞ｍｔ−Ｄ
ＮＡの突然変異の頻度の増加に伴う３種類の晩年開始性
の進行性の病気は（ｉ）疲労性を伴う潜行性の近位筋
（肢帯）の弱体化を含む晩年（６９才以上）のミトコン
ドリア・ミオパシー、（ｉｉ）筋肉の弱体化を生じる晩
年開始性の慢性の炎症性筋疾患を含む封入体筋炎、およ
び（ｉｉｉ）炎症性の硬化に伴うリウマチ性多筋通、お
よび肩甲帯および下肢帯の痛みである。また、ＯＸＰＨ
ＯＳ欠損症はハンティングトン病（ＨＤ）およびアルツ
ハイマー病（ＡＤ）においても報告されている。体組織
ｍｔ−ＤＮＡの突然変異は太陽露光した皮膚、特定種の
心筋症、アルコール依存者の肝臓、閉経期後の女性の卵
巣、および移動性の低下した静止において増加すると報
告されている。

【０００６】上記ｍｔ−ＤＮＡに対する多くの突然変異
が周知であり、特徴付けられている。最近において、特
定の虚血性心臓病、心筋症、およびミオクローヌス性て
んかんを含む場合において大規模な（キロベース（塩基
の１０００個単位）の長さの（kb long））ｍｔ−ＤＮ
Ａゲノムの欠失が発見されている。いわゆる「長鎖（lo
ng）」ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）はこのような突
然変異を明らかにするための選択方法であった。この技
法において、損傷または悪影響を受けている組織の完全
なミトコンドリア・ゲノムが増幅される。その後、この
完全な長さのｍｔ−ＤＮＡはシーケンス化されて手をつ
けていないヒトｍｔ−ゲノムにおける既知のシーケンス
に対比されることにより欠失している各ヌクレオチド・
シーケンスが同定される。

【０００７】研究手段として有用であるが、上記長鎖Ｐ
ＣＲは上述した内容において効率的な臨床方法ではな
い。さらに、臨床的に有用な方法は核の偽遺伝子に帰す
ることのできる増幅またはシグナルを最少にする必要が
ある。これらの偽遺伝子は核のＤＮＡ内に既に組み込ま
れているｍｔ−ＤＮＡシーケンスに類似している核酸シ
ーケンスである。加えて、長鎖ＰＣＲは手間がかかり、
高度に特殊化された実験の熟練を必要とする。また、注
意深く実施しないと、この長鎖ＰＣＲは不正確な否定的
な結果を生じやすい。

【０００８】さらに、ＤＮＡ分子における特定の状況を
特徴付ける別の方法が知られている。例えば、Wiglerに
発行されている米国特許第５，４３６，１４２号は類似
の起源とは異なるＤＮＡ分子を識別するためのプローブ
を製造するための方法を提案している。この方法におい
て、２種類の異なっているが関連している供給源からの
各ＤＮＡ分子が各制限酵素により切断または開裂され、
これらの制限フラグメントが増幅される。その後、両方
の増幅体（amplicons）の組が混合され、融合およびア
ニールされて、さらに増幅される。この方法は特定のシ
ーケンス（目的領域（target））を欠失しているＤＮＡ
を起源としている過剰の増幅体により行なわれる。この
方法の生成物は上記目的領域を含む濃厚にしたＤＮＡ分
子である。その後、これらの分子は上記目的領域に対し
て相補的な多形性のシーケンスに対応するプローブを調
製するために使用できる。

【０００９】Taylorに発行されている米国特許第５，９
１９，６２３号は一方が関係しているシーケンスを含む
と思われる異なるＤＮＡの各制限フラグメントによるヘ
テロ二本鎖ＤＮＡの計画的な構成を提案している。その
後、この不適正がその不適正部位に結合する不適正修復
タンパク質により同定できる。同様に、Kemberに発行さ
れている米国特許第６，１１０，６８４号は各不適正部
位を検出するためのレゾルベース（resolvase）を採用
している。また、Davisに発行されている米国特許第
５，３９１，４８０号も不適正部位の形成により関係し
ているシーケンスの存在を確認している。この場合に、
不適正部位が検出されると、エキソヌクレアーゼがその
不適正部位におけるラベル（標識）を切断するために用
いられる。また、Cottonに発行されている米国特許第
５，９５８，６９２号はヘテロ二本鎖の不適正部位の検
出に関するさらに別の特許である。この方法は十字形Ｄ
ＮＡ分子を切断するレゾルベース・システムを採用して
いる。この特許における実験結果はこの方法が欠失シー
ケンス状の突然変異である４種類の変異体から３種類の
変異体を検出できないということを示している。増幅は
シーケンスの不足に対して相関していない。Landegren
に発行されている米国特許第５，８７６，９４１号は多
くの点で上記Cotton特許に類似している。

【００１０】Browに発行されている米国特許第６，００
１，５６７号は目的のＤＮＡシーケンスを同定するため
に修飾したＤＮＡポリメラーゼの使用を提案している。
このポリメラーゼはその５’エキソヌクレアーゼ活性を
維持するが合成能力が全く無くなるように修飾される。
各核酸セグメントはこれらが目的のシーケンスに隣接す
るシーケンスを含むように手が加えられる。このような
セグメントの一例は修飾したポリメラーゼが付着するＤ
ＮＡ分子の残部における特定の部分が目的のシーケンス
に結合している時に当該修飾したポリメラーゼにより攻
撃を受けて切断されやすい５’アーム部分を含む。この
５’アーム部分の切断は上記目的のシーケンスの存在を
示すシグナル・プロセスを開始する。この場合に、目的
のシーケンスの位置決めを行なうものは上記の切断され
やすい核酸である。つまり、上記の修飾したＤＮＡポリ
メラーゼは目的のシーケンスの位置決めにおいて直接的
な役割を有していない。

【００１１】Sorgeに発行されている米国特許第６，０
１７，７０１号は特定の別々のシーケンスを有している
核酸を選択的に増幅するための方法を提案している。こ
の方法において、各核酸は増幅におけるプライマーとし
ても作用するアダプターにより修飾される。濃厚にされ
るべき上記の各シーケンスを有していない核酸に結合す
る各アダプターは制限酵素による攻撃を受けやすいシー
ケンスも有している。従って、関係している各シーケン
スが不足している各核酸は増幅できないが、これらのシ
ーケンスを有している各核酸は増幅される。この特許は
特定のシーケンスが不足している変異体である核酸の増
幅を提案していない。さらに、任意のシーケンスの存在
の有無に基づく核酸の識別は反応開始が行なわれるまで
行なうことができない。

【００１２】Toddに対するＰＣＴ国際公開第ＷＯ９６３
２５００号は個体における発生学的な多形性を検出する
方法を提案している。この方法は制限酵素により切断し
た部位を野生型の増幅体に誘導するように選択したプラ
イマーによるサンプルのＰＣＲ増幅により行なわれ、こ
の野生型のＤＮＡは増幅されない。この制限エンドヌク
レアーゼ媒介型ＰＣＲ（Restriction Endonuclease Med
iated PCR）は大過剰の野生型ＤＮＡにおいて存在して
いる変異体ＤＮＡの選択的な濃厚化を可能にする。

【００１３】

【発明が解決しようとする課題】既に報告されている技
法の多くは点状または短鎖の突然変異の検出に主に適用
されている。欠失部分の検出はこれらの部分が変異体の
分子において欠失しているシーケンスであるという点で
特に困難である。本質的に、一定のシーケンスを含む大
過剰の野生型ＤＮＡの存在下において当該シーケンスを
欠失しているＤＮＡの小フラクションを検出する試みが
行なわれている。しかしながら、低量の欠失部分が臨床
的に関連している可能性のある場合に診断が必要であ
る。従って、上記のような突然変異を確認するための市
場において利用可能な診断手段は高感度で、特定的で、
丈夫で定量的である必要がある。また、上記欠失部位の
臨床的関連性を確立するために別の方法によりシーケン
ス化が採用されているが、このシーケンス化自体が市販
の診断手段において過度に複雑である。

【００１４】

【課題を解決するための手段】本発明は核酸における突
然変異の存在を決定するための方法である。特に、これ
らの突然変異は欠失である。この方法において、当面の
核酸を有するサンプルが短鎖ＰＣＲ条件下において変異
体ＰＣＲプライマーに接触する。その後、この物質に接
触した核酸が増幅されて同定される。これらの変異体Ｐ
ＣＲプライマー（野生型ＤＮＡ等）に対してハイブリッ
ド形成する各シーケンスの間の長いシーケンスを有して
いる核酸は増幅されない。従って、各増幅体の存在はそ
の野生型の核酸から欠失した各シーケンスを有している
核酸シーケンスの存在を示している。

【００１５】本発明の別の態様において、当面の核酸を
有するサンプルが切断試薬に接触する。その後、この物
質に接触した核酸が増幅されて同定される。この物質の
攻撃を受けるシーケンスを含まない核酸は切断されず
に、適正な増幅条件下において増幅される。また、上記
物質の攻撃を受けるシーケンスを含む野生型の核酸は切
断されて、切断位置に隣接する変異体プライマーにより
増幅されない。

【００１６】上記の切断試薬は、例えば、欠失シーケン
スに対して特異的な制限酵素、ＤＮＡザイム（DNAzym
e）、リボザイム（Ribozyme）またはその他の必要な特
異性を有する物質を含む。

【００１７】本発明の実施形態の一例において、本発明
の方法により処理される核酸はミトコンドリア・ＤＮＡ
（ｍｔ−ＤＮＡ）である。

【００１８】本発明の別の実施形態において、上記方法
はサンプルの多数の部分を調製する工程を含む。この１
個の部分は欠失部分を有する核酸の存在を検出するため
に増幅され、別の部分は野生型の核酸の存在を検出する
ために増幅される。この方法により得られる各増幅体は
陽性の対照として有用である。本発明のさらに別の実施
形態において、上記方法は変異体核酸の量を非変異体核
酸の量に対して比較することにより定量化される。

【００１９】本発明の別の実施形態において、上記方法
を行なうためのプライマーおよびプローブとして有用な
分子が提供される。

【００２０】本発明のさらに別の実施形態において、増
幅試薬を含有しているキットが提供される。また、切断
試薬を含有しているキットも提供される。

【００２１】本明細書において説明する本発明は市販の
臨床的診断手段の適用において有用である。

【００２２】

【発明の実施の形態】定義 「野生型（ｗｔ）核酸シーケンス（wildtype（wt）nucl
eic acid sequence）」は遺伝子型および表現型に関し
て生物体における標準と考えられる核酸シーケンスであ
る。このシーケンスは野生において見られるような生物
体における任意の遺伝子またはコード化セグメントにお
いて最も一般的なシーケンスである。本明細書の内容に
おいて、この用語は各塩基の長いシーケンスにおける欠
失部分により突然変異していない核酸のセグメントを言
う。

【００２３】「変異体核酸シーケンス（mutant nucleic
acid sequence）」は上記野生型シーケンスから外れて
いる核酸シーケンスである。従って、欠失シーケンスは
これらが野生型シーケンスから外れているのでこの観点
に従って変異体である。

【００２４】「核酸欠失シーケンス（Nucleic acid del
etion sequence）」は生物体における野生型の核酸シー
ケンスにおいて存在しているヌクレオチドのシーケンス
またはセグメントであり、これらの任意の個々のまたは
一群に対応して関係している核酸セグメントにおける不
足が突然変異を構成する。すなわち、このシーケンスの
不足により、その核酸セグメントが変異体の核酸シーケ
ンスになる。一般に、このような突然変異は疾病または
疾病素因等の臨床的に有意義な方法で個体内において明
示できる。

【００２５】「切断試薬（cleavage reagents）」は核
酸に接触した場合にこれらを特定の１個以上の部位にお
いて切断する物質である。制限酵素は最も好ましい切断
試薬であるが、ＤＮＡザイムおよび核酸を特定の部位に
おいて分解または攻撃するその他の試薬も（これらの試
薬が変異体ＤＮＡを分解しないこと、あるいは、変異体
ＤＮＡを増幅不能にしないという条件下において）使用
できる。本発明のキットおよび方法において、上記切断
試薬は既知の核酸欠失シーケンスを含む核酸を剪断、分
解および／または攻撃する。例えば、一定の５キロベー
スの欠失シーケンスを欠いている変異体のｍｔ−ＤＮＡ
を検出するためのアッセイは、変異体プライマーを増幅
において使用する場合に野生型シーケンスの増幅を防ぐ
ために、上記欠失シーケンス内において、または当該欠
失シーケンスを有している結果として、１個以上の位置
において野生型ｍｔ−ＤＮＡを切断する切断試薬を含む
ことになる。

【００２６】切断試薬の使用に関連して使用されている
用語としての「切断する（cleave）」および「切断（cl
eavage）」は、欠失シーケンスの検出用に使用されるプ
ライマーにおける場合のように、正方向および逆方向の
開始部位が切断位置に隣接している場合に、核酸を増幅
不能するプロセスを言う。

【００２７】「短鎖ＰＣＲ（short PCR）」または「ｓ
ＰＣＲ」は増幅されるシーケンスが約１キロベース以
下、好ましくは５００個以下の塩基、最も好ましくは３
００個以下の塩基（の長さ）であるポリメラーゼ連鎖反
応（ＰＣＲ）による増幅を意味する。この短鎖ＰＣＲは
以下に詳述する特定条件下におけるＰＣＲの実施により
確実に行なうことができる。

【００２８】「長鎖ＰＣＲ（long PCR）」は増幅される
シーケンスが約５キロベース以上であるポリメラーゼ連
鎖反応（ＰＣＲ）による増幅を意味する。この長鎖ＰＣ
Ｒは以下に詳述する特定条件下におけるＰＣＲの実施を
含む。

【００２９】また、本明細書において使用されている用
語としての「プライマー（primer）」はＰＣＲ技法に関
連している通常の意味を有している。

【００３０】「変異体ＰＣＲプライマー（mutant PCR P
rimers）」は野生型のＤＮＡに対して１キロベース以上
異なっている相補的な核酸シーケンスにおけるプライマ
ー部位に対してハイブリッド形成するために作成したプ
ライマーを意味する。

【００３１】「野生型ＰＣＲプライマー」は野生型のＤ
ＮＡに対して１キロベース以下だけ異なっている相補的
な核酸シーケンスにおけるプライマー部位に対してハイ
ブリッド形成するために作成したプライマーを意味す
る。

【００３２】アッセイ目的物 本発明のアッセイの目的物は４キロベース以上の欠失部
分を含む突然変異を有すると思われる核酸である。好ま
しくは、この目的物は約４キロベース乃至約１０キロベ
ースの欠失部分を含むと思われる核酸である。最も好ま
しくは約５キロベース乃至約７キロベースの欠失部分を
含むと思われる核酸である。

【００３３】本発明に従って定量（アッセイ）される核
酸は任意の起源のものとすることができるが、ｍｔ−Ｄ
ＮＡが本発明の方法に対して特に敏感に反応して、その
高い変異率、既知の顕著な欠失の数および種類、および
ｍｔ−ＤＮＡの定量化の臨床的な重要性を示す。さら
に、このｍｔ−ＤＮＡゲノムの長さおよび変異体ｍｔ−
ＤＮＡにおける欠失部分の分布性は当該ｍｔ−ＤＮＡを
本発明のアッセイにおける優れた分析物にしている。好
ましい各実施形態におけるこのｍｔ−ＤＮＡは全血およ
び各組織（胎盤サンプル等）を含むヒトｍｔ−ＤＮＡの
任意の供給源から入手できる。

【００３４】以下の欠失部分を含むと思われるｍｔ−Ｄ
ＮＡが好ましい分析物である。（www.gen.emory.edu/mi
tomap：ｍｔ−ＤＮＡに関するエモリー大学（Emory Uni
versity）のウェブサイトを参照されたい。） 欠失部位の接合位置 欠失部位の大きさ 欠失した遺伝子 （ｎｔ：ｎｔ） （ｂｐ） 470:5152 -4681 MTTFH- MTND2 502:5443 -4939 MTTFH- MTND2 547:4443 -3895 MTHSP1- MTTM 1836:5447 -3610 MTRNR2- MTND2 3173:14161 -10987 MTRNR2- MTND6 4398:14822 -10422 MTTQ- MTCYB 5786:13923 -8136 MTTC- MTND5 5793:12767 -6973 MTTC- MTND5 5835:12661 -6825 MTND5- MTTY 6023:14424 -8400 MTCO1- MTND6 6074:9179 -3104 MTCO1- MTATP6 6075:13799 -7723 MTCO1- MTND5 6226:13456 -7279 MTCO1- MTND5 6238:14103 -7864 MTCO1- MTND5 6325:13989 -7663 MTCO1- MTND5 6329:13994 -7664 MTCO1- MTND5 6330:13994 -7663 MTCO1- MTND5 6380:14096 -7715 MTCO1- MTND5 6465:14135 -7669 MTCO1- MTND5 7193:14596 -7402 MTCO1- MTND6 7438:13476 -6037 MTCO1- MTND5 7449:15926 -8476 MTTS1- MTTT 7491:11004 -3512 MTTS1- MTND4 7493:12762 -5268 MTTS1- MTND5 7501:14428 -6926 MTND6- MTTS1 7635:15440 -7804 MTCO2- MTCYB 7669:15437 -7767 MTCO2- MTCYB 7697:12364 -4666 MTCO2- MTCYB 7777:13794 -6016 MTCO2- MTND5 7808:14799 -6990 MTCO2- MTCYB 7815:15381 -7565 MTCO2- MTCYB 7829:14135 -6305 MTCO2- MTND5 7841:13905 -6063 MTCO2- MTND5 7841:13905 -6063 MTCO2- MTND5 7845:9748 -1902 MTCO2- MTCO3 7974:15496 -7521 MTCO2- MTCYB 8032:16075 -8042 MTCO2- MTATT 8210:15339 -7128 MTCO2- MTCYB 8213:13991 -5777 MTCO2- MTND5 8278:13770 -5491 MTTK- MTND5 8304:15055 -6750 MTTK- MTCYB 8412:15664 -7251 MTATP8- MTTT 8426:12894 -4467 MTND5- MTATP8 8468:13446 -4977 MTND5- MTATP8 8469:13447 -4977 MTND5- MTATP8 8482:13460 -4977 MTATP8- MTND5 8517:15421 -6903 MTATP8- MTCYB 8563:13758 -5196 MTATP6- MTND5 8563:14596 -6032 MTATP6- MTND6 8570:13236 -4665 MTATP8- MTCYB 8573:15727 -7153 MTATP8- MTCYB 8580:15731 -7150 MTATP6- MTCYB 8582:15957 -7374 MTATP6- MTTP 8623:15662 -7038 MTATP6- MTCYB 8624:13886 -5261 MTATP6- MTND5 8631:13513 -4881 MTATP6- MTND5 8637:16084 -7446 MTATP6- MTTP 8648:16085 -7436 MTATP6- MTTP 8707:13723 -5015 MTATP6- MTND5 8823:15855 -7031 MTATP6- MTCYB 8828:14896 -6067 MTATP6- MTCYB 8992:16072 -7079 MTATP6- MTTP 9144:13816 -4671 MTATP6- MTND5 9180:14281 -5100 MTATP6- MTND6 9191:12909 -3717 MTATP6- MTND5 9238:15576 -6377 MTCO3- MTCYB 9320:14273 -4952 MTCO3- MTND6 9357:13865 -4507 MTCO3- MTND5 9515:13055 -3539 MTCO3- MTND5 9574:12972 -3397 MTCO3- MTND5 9995:15897 -5901 MTTG- MTTT 10050:15076 -5025 MTTG- MTCYB 10058:14593 -4534 MTND6- MTND3 10154:15945 -5790 MTND3- MTTT 10169:14435 -4265 MTND3- MTND6 10190:13753 -3562 MTND3- MTND5 10367:12829 -2461 MTND3- MTND5 10370:15570 -5199 MTND3- MTCYB 10587:15913 -5325 MTND4L- MTTT 10598:13206 -2607 MTND4L- MTND5 10665:14856 -4190 MTND4L- MTCYB 10676:14868 -4191 MTND4L- MTCYB 10744:14124 -3379 MTND4L- MTND5 10941:15362 -4420 MTND4- MTCYB 10952:15837 -4884 MTND4- MTCYB 10961:15846 -4884 MTND4- MTCYB 11232:13980 -2747 MTND4- MTND5 11368:15786 -4417 MTND4- MTCYB 12102:14412 -2309 MTND4- MTND6 12103:14414 -2310 MTND4- MTND6 12113:14422 -2308 MTND4- MTND6 12203:15355 -3151 MTTH- MTCYB

【００３５】（注：上記において使用した用語はＭＩＴ
ＯＭＡＰ（以下を参照されたい）において使用されてい
る用語と同じである。）

【００３６】 ＭＩＴＯＭＡＰ：ミトコンドリアＤＮＡの各機能位置 マップ 座 マップ 位置（ｎｐ） 簡略的表記 説明 MTOHR 110-441 OH Ｈ−ストランド開始点 MTCSB1 213-235 CSB1 保存シーケンス・ブロックＩ MTTFX 233-260 ｍｔＴＦ１結合部位 MTTFY 276-303 ｍｔＴＦ１結合部位 MTCSB2 299-315 CSB2 保存シーケンス・ブロックＩＩ MTHPR 317-321 複製プライマー MTCSB3 346-363 CSB3 保存シーケンス・ブロックＩＩＩ MTMT4H 371-379 ｍｔ４Ｈ−ストランド調節要素 MTMT3H 384-391 ｍｔ３Ｈ−ストランド調節要素 MTLSP 392-445 PL Ｌ−ストランド・プロモーター MTTFL 418-445 ｍｔＴＦ１結合部位 MTTFH 523-550 ｍｔＴＦ１結合部位 MTHSP1 545-567 PH1 メジャーＨ−ストランド・プロモーター MTTF 577-647 F ｔＲＮＡフェニルアラニン MTHSP2 645-645 PH2 マイナーＨ−ストランド・プロモーター MTRNR1 648-1601 12S １２ＳｒＲＮＡ MTTV 1602-1670 V ｔＲＮＡバリン MTRNR2 1671-3229 16S １６ＳｒＲＮＡ MTRNR3 3206-3229 ５Ｓ−類似シーケンス MTTER 3229-3256 転写終結部分 MTTL1 3230-3304 L(UUA/G) ｔＲＮＡロイシン１ MTNC1 3305-3306 ＭＴＴＬ１とＭＴＮＤ１との間の 非コード化ヌクレオチド MTND1 3307-4262 ND1 ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ１ MTTI 4263-4331 I ｔＲＮＡイソロイシン MTTQ 4329-4400 Q ｔＲＮＡグルタミン MTNC2 4401-4401 ＭＴＴＱとＭＴＴＭとの間の 非コード化ヌクレオチド MTTM 4402-4469 M ｔＲＮＡメチオニン MTND2 4470-5511 ND2 ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ２ MTTW 5512-5576 W ｔＲＮＡトリプトファン MTNC3 5577-5586 ＭＴＴＷとＭＴＴＡとの間の 非コード化ヌクレオチド MTTA 5587-5655 A ｔＲＮＡアラニン MTNC4 5656-5656 ＭＴＴＡとＭＴＴＮとの間の 非コード化ヌクレオチド MTTN 5657-5729 N ｔＲＮＡアスパラギン MTOLR 5721-5798 OL Ｌ−ストランド開始点 MTTC 5761-5826 C ｔＲＮＡシステイン MTTY 5826-5891 Y ｔＲＮＡチロシン MTNC5 5892-5903 ＭＴＴＹとＭＴＣＯ１との間の 非コード化ヌクレオチド MTCO1 5904-7445 COI シトクロムｃオキシダーゼＩ MTTS1 7445-7516 S(UCN) ｔＲＮＡセリン１ MTNC6 7517-7517 ＭＴＴＳ１とＭＴＴＤとの間の 非コード化ヌクレオチド MTTD 7518-7585 D ｔＲＮＡアスパラギン酸 MTCO2 7586-8269 COII シトクロムｃオキシダーゼＩＩ MTNC7 8270-8294 ＭＴＣＯ２とＭＴＴＫとの間の 非コード化ヌクレオチド MTTK 8295-8364 K ｔＲＮＡリジン MTNC8 8365-8365 ＭＴＴＫとＭＴＡＴＰ８との間の 非コード化ヌクレオチド MTATP8 8366-8572 ＡＴＰアーゼ８ ＡＴＰシンターゼ８ MTATP6 8527-9207 ＡＴＰアーゼ６ ＡＴＰシンターゼ６ MTCO3 9207-9990 COIII シロクロムｃオキシダーゼＩＩＩ MTTG 9991-10058 G ｔＲＮＡグリシン MTND3 10059-10404 ND3 ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ３ MTTR 10405-10469 R ｔＲＮＡアルギニン MTND4L 10470-10766 ND4L ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ４Ｌ MTND4 10760-12137 ND4 ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ４ MTTH 12138-12206 H ｔＲＮＡヒスチジン MTTS2 12207-12265 S(AGY) ｔＲＮＡセリン２ MTTL2 12266-12336 L(CUN) ｔＲＮＡロイシン２ MTND5 12337-14148 ND5 ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ５ MTND6 14149-14673 ND6 ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ６ MTTE 14674-14742 E ｔＲＮＡグルタミン酸 MTNC9 14743-14746 ＭＴＴＥとＭＴＣＹＢとの間の 非コード化ヌクレオチド MTCYB 14747-15887 Cytb シトクロムｂ MTTT 15888-15953 T ｔＲＮＡトレオニン MTATT 15925-499 膜結合部位 MTNC10 15954-15954 ＭＴＴＴとＭＴＴＰとの間の 非コード化ヌクレオチド MTTP 15955-16023 P ｔＲＮＡプロリン MTDLOOP 16028-577 Ｄループ 置換ループ （以下の（注）を参照されたい。） MT7SDNA 16106-191 7S ７ＳＤＮＡ MTTAS 16157-16172 TAS 終結シーケンス MTMT5 16194-16208 mt5 調節要素 MTMT3L 16499-16506 mt3 Ｌ−ストランド調節要素

【００３７】上記のデータベースにおける「Ｄループ
（D-Loop）」はプロリンとフェニルアラニンとの間（ヌ
クレオチド対：１６０２４−５７６）の非コード化領域
を言う。

【００３８】各座名は任意のヌクレオチド番号により表
現されている公認の表示様式である。また、各マップ位
置は上記のＤＮＡシーケンスから決定した各ヌクレオチ
ド対（ｎｐ）の番号に対応している。さらに、各マップ
のシンボルは当該マップにおける各座の位置を示すため
に用いられている。

【００３９】（注：各座をさらに定義する：ＴＡＳ＝シ
ーケンスに付随する終結部分、ＣＳＢ＝保存シーケンス
・ブロック、ｍｔＴＦ１＝ミトコンドリア転写因子、Ｙ
＝いずれかのピリミジン、Ｎ＝任意の塩基。） 各Ｈ−ストランド複製開始位置は各ヌクレオチド対番号
１１０，１４７，１６９，１９１，２１９，３１０，４
４１において確認された。各Ｌ−ストランド・プロモー
ター位置は各ヌクレオチド対番号４０７，３９２乃至４
３５において確認された。また、各Ｈ−ストランド・プ
ロモーター位置は各ヌクレオチド対番号５５９１，５６
１において確認された。さらに、各Ｌ−ストランド複製
開始位置は各ヌクレオチド対番号５７２１乃至５７８
１，５７６１，５７９９において確認された。

【００４０】サンプルの調製 種々の供給源（好ましくは、ヒトｍｔ−ＤＮＡ）から核
酸を得るための周知の方法が本発明の方法において使用
するための核酸を入手および単離するために使用でき
る。例えば、血液サンプルからのＤＮＡは細胞の溶解お
よびその後のアルカリ処理により得ることができる。ま
た、全体の核酸は約１０分間にわたり沸騰している水槽
中における細胞のインキュベーションにより水中に再懸
濁した白血球の溶解により得られる。冷却後、約２分間
にわたり約１４，０００Ｇにおける遠心分離により、細
胞の破片を除去した。このＤＮＡを含む透明な上澄み液
は、例えば、−８０℃において凍結状態で保管できる。

【００４１】目的物がｍｔ−ＤＮＡである場合には、Ｄ
ＮＡを単離する従来的なプロテイナーゼＫ／フェノール
−クロロホルム法は好ましくなく、別のＤＮＡ単離の従
来的な方法もまた好ましくない。これらの方法よりも、
上記のような沸騰法（boiling method）が好ましい。こ
の方法はHerrnstadtに発行されている米国特許第６，０
２７，８８３号においてさらに詳しく説明されており、
本明細書に参考文献として含まれる。核ＤＮＡによるサ
ンプルの汚染はＰＣＲ増幅の前にＣｓＣｌ勾配において
単離したｍｔ−ＤＮＡを精製することにより排除でき
る。この処理はＤＮＡが偽遺伝子（ｍｔ−ＤＮＡの各シ
ーケンスと同一に見えるまたは極めて類似している核Ｄ
ＮＡ内に含まれる核酸セグメント）を含むと考えられる
場合に好ましい。また、この処理はＤＮＡが不注意に増
幅されること、あるいは、ＤＮＡが目的物のｍｔ−ＤＮ
Ａに関連している反応に対して干渉する様式で作用を受
けないことを確実にする。さらに、ＰＣＲのためのｍｔ
−ＤＮＡサンプルにおける核ＤＮＡ汚染を減少するため
のあらゆる処理が、選択したプライマーがその核シーケ
ンスに対して潜在的に有効である場合に、損なわれる可
能性があることにも注意を要する。従って、この点につ
いても賢明な用法が重要であり、このような方法につい
て以下に詳述する。

【００４２】ｍｔ−ＤＮＡを抽出して精製するための市
販のキットもまた本発明の実施において良好に作用する
ために入手可能であり且つ使用可能できる。例えば、ア
ルカリ溶解のミニプレップ（miniprep）処理はｍｔ−Ｄ
ＮＡの精製における比較的に単純な技法である。この技
法は「WIZARD MINIPREPS DNA PURIFICATION SYSTEM」
（Promega社から市販されている）の適用において使用
される。さらに、多数の他のｍｔ−ＤＮＡ抽出キットが
ドイツ国のQiagen Corporation（血液サンプルに対して
好ましい）および日本国のWaco Corporation（組織に対
して好ましい）のような会社から容易に入手可能であ
る。

【００４３】増幅および試薬 本発明の方法は全てＰＣＲを採用している。本発明の好
ましい方法は短鎖ＰＣＲプロトコル（「short PCR」）
を採用している。いわゆる「長鎖ＰＣＲ（LongPCR）」
は使用していない。このことにより、本明細書において
記載する大きさおよび種類の野生型シーケンスは増幅さ
れず、これにより、不実に報告されないことが確実にな
る。

【００４４】ハイブリッド形成条件はプライマーを単一
の核酸における目的のストランドに対して結合可能にす
る必要がある。当業界において知られているように、延
長生成物がその鋳型（補体）から分離される時に、１個
のプライマーから合成される延長生成物が別のプライマ
ーにおける延長のための鋳型として作用して定められた
長さの複製鎖を生成するように、各プライマーは二重シ
ーケンスに沿うそれぞれの相対的な位置になるように選
択される。

【００４５】このことを考慮に入れて、各試薬を上記方
法において採用し、本発明の各キットは以下の部品を含
む。 １．切断試薬 好ましい切断試薬は制限酵素である。最も好ましい試薬
は制限エンドヌクレアーゼである。上述したように、欠
失シーケンス内における各核酸を剪断または切断できる
別の試薬も使用できる。 ２．増幅試薬 ａ．ＰＣＲ試薬 一般的な短鎖ＰＣＲ試薬を使用する。これらはＭｇ²⁺含
有溶液（好ましくはＭｇＣｌ₂ ）、ｄＮＴＰ（各種）、
最少の３’プルーフリーディング能力を有する１種類の
ポリメラーゼ、および米国特許第６，１５０，０９７号
（本明細書に参考文献として含まれる）において記載さ
れている分子ビーコン等のシグナル試薬を含む。好まし
くは、上記のポリメラーゼはTaqポリメラーゼ等の熱安
定ポリメラーゼである。しかしながら、増幅技法が等温
式である場合は、上記ポリメラーゼは熱安定性である必
要がない。短鎖ＰＣＲにより増幅される各シーケンスお
よびトリス−ヒドロキシエチルアミノメタン（「ＴＲＩ
Ｓ」）およびＫＣＬ等の緩衝液に対して特異的なプライ
マーも採用する。保管および適用における量および諸条
件は全て短鎖ＰＣＲ増幅における標準である。

【００４６】特に、典型的な長鎖ＰＣＲ試薬は本発明の
方法において使用しない。すなわち、プルーフリーディ
ング・ポリメラーゼは使用せず、使用したポリメラーゼ
は長鎖ＰＣＲにおいて使用されるポリメラーゼよりもは
るかに進行性が低い。一般的に、このポリメラーゼは約
［１単位（１ｕ）］の活性で存在しているが、長鎖ＰＣ
Ｒにおける活性は［２単位乃至５単位］である。また、
長鎖ＰＣＲにおいて使用される各ポリメラーゼを安定化
するために主に用いられているＤＭＳＯおよびグリセロ
ール等の別の試薬も本発明において実施される短鎖ＰＣ
Ｒ法において望ましくない。さらに、ＴＲＩＳ緩衝液が
本明細書における本発明の方法により実施される短鎖Ｐ
ＣＲにおいて好ましいが、長鎖ＰＣＲ技法の場合にはＴ
ＲＩＣＩＮＥ緩衝液が用いられる。

【００４７】上述したように、各プライマーを適正に選
択することが重要である。このことは目的である欠失シ
ーケンスにより決まる実際的な問題である。切断試薬に
より攻撃を受けた野生型ＤＮＡ（異性体プライマーが隣
接した場合に当該ＤＮＡを増殖不能にする）を有するこ
とが望ましい。従って、サンプルの核酸の上流部分に対
してハイブリッド形成する各プライマー・シーケンスが
その下流部分に対してハイブリッド形成する各プライマ
ー・シーケンスから十分に離れているように選択され
て、そのアッセイにおける目的でない未切断状態の核酸
は増幅しない。このことは欠失シーケンスの大きさおよ
び性質により決まる。一般に、欠失シーケンスが長いほ
ど、この問題に関する重要性が低くなる。当該技術分野
における通常の熟練者であれば、この重要性について各
プライマーを操作する方法が認識でき、日常的な実験の
みによりこれらを容易に作成できる。本発明の好ましい
プライマーを以下のシーケンス・リストにおいて記載す
る。

【００４８】ｂ．目的物（および、随意的に、各対照）
が増幅したことを示すために上記のシグナル試薬を使用
した。分子ビーコン、「TAQMAN」プローブ（PE Biosyst
ems社から市販されている）、ペプチド核酸（「ＰＮ
Ａ」）、およびＤＮＡザイム・プローブを含む多くのシ
グナル試薬が利用可能である。あるいは、このプローブ
を、例えば、ビオチン等の結合相手の対における一方の
要素に対して連結させ、その標識をペルオキシダーゼ、
アルカリ・ホスファターゼまたはグルコース・オキシダ
ーゼ等のアビジンまたはストレパビジン連結酵素とする
ことができる。同一のアッセイにおいて使用する異なる
プローブの標識は同一でもよく、異なっていてもよい。
バックグラウンドを超える検出可能な蛍光シグナルの最
初の検出工程に基づく定量化を可能にするためのリアル
タイム処理（「リアルタイム（real-time）モニター処
理」を分子ビーコンまたはTaqManプローブまたは特定の
等価な同質のプローブにより行なうことが好ましい。ま
た、酵素ラベル化（標識化）した各プローブをＰＣＲに
従って異質的に用いる。

【００４９】本発明において分子ビーコンを各プローブ
として使用する場合に、米国特許第６，１５０，０９７
号において記載されている典型的なプローブ長、ステム
長、蛍光体、および消光剤（例えば、ＤＡＢＣＹＬ等）
に対する各基準が適用できる。このＤＡＢＣＹＬは好ま
しい消光剤であり、ＦＡＭ（６−カルボキシフルオレセ
イン）は単一色分子ビーコン・システムにおける好まし
い蛍光体である。

【００５０】当該技術分野における熟練者が理解できる
ように、別の検出方法も利用可能である。これらの方法
は、例えば、増幅体または核酸フラグメントの大きさま
たは分子量により決まる検出技法を含む。ゲル電気泳動
法および毛管電気泳動法がこのような技法の例である。

【００５１】３．増幅条件 典型的な短鎖ＰＣＲの増幅条件を採用する。これらは長
鎖ＰＣＲ以外のＰＣＲを行なう場合に当該技術分野にお
ける熟練者が適用する標準的な諸条件である。なお、ア
ニール−延長の各時間は長鎖ＰＣＲの諸条件に対して大
幅に減少されている。一般的に、これらは１分よりも短
く、好ましくは約３０秒である。このことにより、本発
明の工業的用途において必要とされる試験時間が短縮で
きる。

【００５２】本発明の各キットはパッケージ化した増幅
試薬およびシグナル試薬を含む。好ましくは、これらは
切断試薬も含んでいる。

【００５３】本発明の方法 本発明の方法の実施は、好ましくはｍｔ−ＤＮＡであ
る、関係しているサンプルからの核酸の単離を必要とす
る。このＤＮＡ分子における各ストランドは上流領域、
下流領域、および当該上流領域と下流領域との間におけ
るシーケンス（このシーケンスは変異体ＤＮＡにおいて
欠失している）を有するものとして特徴付けることがで
きる。野生型ＤＮＡにおいて、この欠失シーケンスが切
断試薬の存在下において切断できる。変異体ＤＮＡは上
流領域および下流領域を有しているが、上述したよう
に、野生型ＤＮＡにおいて見られる欠失シーケンスを欠
損している。従って、野生型ＤＮＡにおいてのみ見られ
る欠失シーケンス等に対して使用される切断試薬の存在
は変異体ＤＮＡにおいて全く切断作用を示さない。

【００５４】本発明の実施形態の一例において（好まし
くは、目的物が５キロベースの欠失部分を有する変異体
ＤＮＡである場合に）、単離した核酸サンプルは第１の
当量部分および第２の当量部分に分けられる。この第１
の当量部分は切断試薬に対して接触されることにより、
混合物が形成される。この混合物は切断部分に隣接する
変異体プライマーを用いた場合に増幅不能である切断さ
れた野生型ＤＮＡを含有している。しかしながら、欠失
部分を有する変異体ＤＮＡが存在している場合には、切
断されない変異体ＤＮＡが増幅できる。この混合物は変
異体ＤＮＡおよび野生型ＤＮＡの両方に対して共通であ
る上流領域の部分に対して特異的である正（方向）プラ
イマーに対して接触される。さらに、変異体ＤＮＡのみ
を増幅するための諸条件下において、変異体ＤＮＡの下
流領域に対して相補的な逆（方向）プライマー、および
４種類の異なるヌクレオシド・トリホスフェートのそれ
ぞれ、およびＤＮＡポリメラーゼをこの混合物に加え
る。

【００５５】また、上記第２の当量部分を両方のＤＮＡ
分子における上流領域の部分に対して特異的な正プライ
マーおよび野生型ＤＮＡ分子における欠失シーケンスの
部分に対して特異的な逆プライマーに対して接触させ
る。さらに、この当量部分は４種類の異なるヌクレオシ
ド・トリホスフェートおよびＤＮＡポリメラーゼに対し
ても接触される。この処理はＤＮＡを増幅するような諸
条件下において行なわれる。切断試薬を全く加えておら
ず、開始部位を分離しているシーケンスが短いために、
各プライマーに対してハイブリッド形成できる野生型Ｄ
ＮＡは欠失シーケンスの存在にかかわらず増幅する。し
かしながら、変異体ＤＮＡ分子は上記逆プライマーに対
して相補的な逆方向の開始部位を欠損しており、この部
位は上記欠失シーケンス内に存在している。従って、変
異体ＤＮＡは増幅されない状態で保たれる。それゆえ、
野生型ＤＮＡのみが増幅される。従って、上記第２の当
量部分は野生型ＤＮＡに対応する陽性対照として作用で
きる。

【００５６】上記の各等量部分は増幅された種類を検出
するための適当なシグナル試薬の存在下に増幅される。
上記対照における野生型ＤＮＡおよび上記第１の当量部
分における変異体ＤＮＡの両方の存在を示すために２種
類以上のシグナル試薬が使用できる。このことは、例え
ば、上記欠失シーケンスまたは、例えば、当該欠失シー
ケンスが存在している場合に一体にスプライス（接合）
している変異体ＤＮＡの各セグメントの境界領域におけ
るシーケンスのいずれかに対して相補的な各ビーコンに
結合している異なる蛍光体を有する各分子ビーコンによ
り容易に行なえる。

【００５７】本発明の別の実施形態において、（ａ）上
流領域、下流領域、および当該上流領域と下流領域との
間における欠失シーケンスを含むセンス野生型ＤＮＡス
トランドを含み、その欠失シーケンスが一定の切断部位
に対して上流領域および下流領域を含む、（ｂ）上記セ
ンスＤＮＡストランドに対して相補的であり、当該セン
スＤＮＡ分子における下流領域に対して相補的な上流領
域、当該センスＤＮＡ分子における上流領域に対して相
補的な下流領域、および当該センスＤＮＡ分子における
欠失シーケンスに対して相補的な欠失シーケンスを含む
アンチセンス野生型ＤＮＡを含み、当該アンチセンスＤ
ＮＡ分子における欠失シーケンスが上記センスＤＮＡ分
子の欠失シーケンスにおける下流領域に対して相補的な
上流領域、および上記センスＤＮＡ分子の欠失シーケン
スにおける上流領域に対して相補的な下流領域を含む、
（ｃ）上記センスＤＮＡストランドにおける上流領域お
よび当該センスＤＮＡストランドにおける下流領域を含
むセンス変異体ＤＮＡストランドを含み、上記欠失シー
ケンスが存在していない（すなわち、当該変異体ＤＮＡ
は欠失突然変異部分を有している）、および（ｄ）上記
センス変異体ＤＮＡストランドに対して相補的であり、
当該センス変異体ＤＮＡストランドにおける下流領域に
対して相補的な上流領域、および当該センス変異体ＤＮ
Ａストランドにおける上流領域に対して相補的な下流領
域を含むアンチセンス変異体ＤＮＡストランドを含む、
と思われるサンプルが調製される。

【００５８】上記サンプルは２個の当量部分に分割され
る。一方の当量部分は欠失シーケンスの各切断部位に対
して特異的な切断手段に対して接触されることにより、
切断状態および未切断状態の各ＤＮＡ分子の混合物が形
成される。切断された各ＤＮＡ分子は変異体プライマー
を使用した時に当然に増幅しない。この切断状態および
未切断状態のＤＮＡの混合物は野生型ＤＮＡおよび変異
体ＤＮＡの各分子の両方における上流領域の部分に対し
て特異的な正プライマー、および変異体ＤＮＡ分子の下
流領域に対して特異的な逆プライマーに対して接触され
る。さらに、この混合物に、変異体ＤＮＡのみを増幅す
るための短鎖ＰＣＲ条件下において、４種類の異なるヌ
クレオシド・トリホスフェート、およびＤＮＡポリメラ
ーゼを加える。全部ではなくとも、ほとんどの野生型Ｄ
ＮＡ分子は切断試薬により既に切断されているために、
変異体シーケンスに対応するプライマーを使用した場合
に増幅不能になっている（一部の野生型ＤＮＡが切断を
回避している場合には、これらもまた本発明の方法によ
る短鎖ＰＣＲ技法により各開始部位の間の距離だけ橋渡
しすることが不能であるために増幅不能になる）。さら
に、各変異体ＤＮＡ分子において増幅される部分内のシ
ーケンスに対して特異的なプローブが加えられる。この
プローブはラベル化されているか、ラベル化することが
可能である。

【００５９】また、別の当量部分（切断試薬が存在して
いない）を野生型ＤＮＡ分子および変異体ＤＮＡ分子に
おける両方の上流領域の部分に対して特異的な正プライ
マー、および野生型ＤＮＡにおける欠失シーケンス内の
一定の部位に対応する逆プライマー、４種類の異なるヌ
クレオシド・トリホスフェートおよびＤＮＡポリメラー
ゼに対して野生型ＤＮＡを増幅する条件下において接触
させる。さらに、センスまたはアンチセンスの各野生型
ＤＮＡ分子における欠失シーケンス内の一定のシーケン
スに対して特異的なプローブを加える。このプローブは
ラベル化されているか、または、好ましくは上記第１の
当量部分の場合におけるプローブの様式と異なる様式
で、ラベル化することが可能である。

【００６０】その後、各種ＤＮＡの存在または量につい
ての測定値として処理工程の進行に伴って各プローブに
おける標識を検出する。

【００６１】上記検出シーケンスは本発明の方法におい
て採用する短鎖ＰＣＲ条件下において各末端部分に対し
て特異的なプライマーにより容易に増幅できない程度に
十分に長い（好ましくは、１キロベース以上である）こ
とが必要である。変異体シーケンスに対応する逆プライ
マーは、一部の野生型の物質が制限後に残存している場
合でも当該野生型シーケンスが増幅しない程度に、正プ
ライマーから十分に離れて使用されるように選択され
る。

【００６２】各図面は本発明の実施をさらに説明してい
る。図１（上部）において、増幅体は野生型ＤＮＡ分子
の上流部分において存在している開始部位に結合する正
プライマーにより生成される。また、この野生型の逆開
始部位はその欠失部位内に存在している。野生型プロー
ブはこの欠失シーケンス内における一定の部位を目標に
している。また、この図面における下部の図は変異体Ｄ
ＮＡに対応する当量部分を示している。増幅体はＤＮＡ
分子における上流部分内に存在している正プライマーに
より生成される。この変異体の開始部位はその下流部分
に存在しているが、変異体プローブはその上流部分内の
一定領域を目標にしている。図１は５キロベースの各欠
失シーケンスの検出において特に好ましい方法を示して
いる図である。

【００６３】図２（上部）において、増幅体は野生型Ｄ
ＮＡ分子における欠失シーケンス内に存在している開始
部位に結合する正プライマーにより生成される。また、
この野生型の逆（方向）開始部位はそのＤＮＡ分子にお
ける下流部分内に存在している。野生型プローブは欠失
シーケンス内に存在している一定の部位を目標にしてい
る。この図面における下部の図は変異体ＤＮＡに対応す
る当量部分を示している。増幅体はＤＮＡ分子における
上流部分内に存在している正プライマーにより生成され
る。この変異体の逆（方向）開始部位はその下流部分に
存在しており、変異体プローブは当該下流部分内の一定
領域を目標にしている。図２は７キロベースの各欠失シ
ーケンスの検出において特に好ましい方法を示している
図である。これら両方の図面において、ａおよびｂはス
プライス位置を示している。これらは欠失が、存在して
いる場合に、開始および終結する位置である。従って、
例えば、５キロベースの欠失部分を含むｍｔＤＮＡは、
野生型ＤＮＡの場合において欠損することのない、５キ
ロベースの欠損部分を有する可能性がある。

【００６４】増幅可能なＤＮＡの存在についての検出手
段および増幅可能であることを確認するための対照とし
て、保存されているＤＮＡシーケンスに対して適当なプ
ライマーおよびプローブを野生型および変異体の各当量
部分のいずれかまたは両方に対して加えることができ
る。従って、増幅は野生型シーケンス（野生型の当量部
分の場合）、または変異体シーケンス（変異体の当量部
分の場合）のいずれかにおいて保存されている領域の同
時増幅（co-amplification）を含む可能性がある。

【００６５】本発明の最も好ましい各実施形態におい
て、副生成物の生成および増幅を生じる可能性のある誤
開始を最少にするために反応の諸条件がさらに調整され
る。これらの条件は実施例７および実施例８において例
示的に説明されている。実施例８において説明されてい
る各方法の一例において、その熱的プロファイルを変更
して初期的に極めて厳しい条件を含むようにできる。こ
れらの条件に続いて比較的に厳しさを抑えた工程が行な
われ、この工程中において各ビーコンがリアルタイムで
モニターされる。実際に、実施例８において、上記熱的
プロファイルを極めて厳しい条件下（すなわち、アニー
ル−延長温度を７２℃に選択した）で行なわれる１０回
の初期的なＰＣＲの工程を含むように変更した。これら
の初期的な厳しい条件のＰＣＲ工程に続いて、２０回の
ＰＣＲ工程を比較的に厳しさを抑えた条件下において行
なった（５１℃のアニール工程を採用し、この工程中に
その処理の進行に沿ってプローブからの蛍光をリアルタ
イムでモニターした）。また、第２の手法において、各
欠失シーケンスにおける反対側の端部の近くに存在して
いる増幅体に目標を定めている第２のビーコンが導入で
きる。このことにより、所望の生成物であってその一部
のフラグメントのみではない物質の存在が確認できる。
このような方法が実施例７において説明されており、こ
の実施例においては、各分子ビーコンが５キロベースの
欠失シーケンスにおける下流領域および７キロベースの
欠失シーケンスにおける上流領域にそれぞれ目標を定め
ている。

【００６６】実施例 各実施例を通して（特別に示さない限り）以下の各条件
および各試薬を用いた。ＰＣＲマスターミックス ［Ｍｇ＋＋］：（ＭｇＣｌ₂ として）、３ｍＭ（４．５
ｍＭである実施例１を除く）、Perkin-Elmer社から入手 ［ｄＮＴＰ］：それぞれ０．２ｍＭ、Boehringer-Mannh
eimから入手 ［Taq pol］：１単位／約５０μｌの反応ウェル ［ビーコン］：０．２μＭ（０．０８３μＭである実施
例２および実施例３を除く） ［各プライマー］：０．１５μＭ ［緩衝液］：１０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ８．３、５０ｍ
ＭＫＣｌ、内部ＲＯＸ標準色素無し、（Perkin-Elmer社
から市販品として入手）

【００６７】各制限酵素ScaIおよびPleIをNew England
BioLabs社から購入した。各試料を分光光度計により測
定した場合に１単位の酵素／１μｇのＤＮＡを用いて販
売点により供給された制限特異性の各緩衝液中において
先ず消化した（PleIを除く、この場合には、１５単位／
１μｇのＤＮＡを用いた）。各反応混合物を１時間にわ
たり３７℃でインキュベーションした後に、２０分間に
わたり８０℃で熱的に不活性化した。全ての場合におい
て、各ＰＣＲのウェル（井戸）当たりに２μｌの消化体
を用いた。

【００６８】DdeIをGibco社から購入した。２μｌの酵
素を用いて３０μｌの脱イオン水により希釈した４μｌ
の１０倍緩衝液中に希釈した０．２４単位／１μｇの濃
度における４μｌのｍｔ−ＤＮＡを制限した。インキュ
ベーションは３．５時間にわたり３７℃であった。

【００６９】各プライマーおよびプローブを本発明者に
より特定した各シーケンス仕様に従ってResearch Genet
icsおよびTriLinkにより合成した。

【００７０】ＰＣＲの熱的プロファイル ８９度／１５秒 ５５度／１５秒 ５８度／１０秒 ６２度／１５秒

【００７１】実験器具 Perkin-Elmer ABI 7700シーケンス・ディテクター

【００７２】各ｍｔ−ＤＮＡ抽出キットをQiagen Corpo
rationから購入し、ワシントンＤ．Ｃ．のNational Ins
titute of Standards and Technology社から購入したｍ
ｔ−ＤＮＡの各標準物（後述）を除いて、各志願者の全
血から入手したｍｔ−ＤＮＡを抽出した。

【００７３】実施例１：対照シーケンスの増幅および検
出 ｍｔ−ＤＮＡの存在についての試験に対する基準および
５キロベースおよび７キロベースの各シーケンスを測定
する場合の標準として対照シーケンスを調製した。

【００７４】上記オリゴヌクレオチドの目的物は以下の
シーケンス（塩基２７１乃至塩基３７７）を有してい
た。 5’- cacagacatc ataacaaaaa atttccacca aaccccccct
cccccgcttc tggccacagcacttaaacac atctctgcca aacccca
aaa acaaagaacc ctaacac-3’：シーケンス認識番号１
（Seq. ID. No.1）

【００７５】この実施例において使用した正プライマー
は２４個のヌクレオチド（２４ｎｔ）の塩基長であり、
以下のシーケンス（塩基２７１乃至塩基２９４）を有し
ていた。 5’-cac aga cat cat aac aaa aaa ttt-3’：シーケン
ス認識番号２（Seq. ID.No.2）

【００７６】この実施例において使用した逆プライマー
は２５個のヌクレオチド（２５ｎｔ）の塩基長（塩基３
５３乃至塩基３７７）であり、以下のシーケンスを有し
ていた。 5’-gtg tta ggg ttc ttt gtt ttt gggg-3’：シーケン
ス認識番号３（Seq. ID.No.3）

【００７７】以下に記載するシーケンスを有するプロー
ブは分子ビーコンであり、６個のヌクレオチド（６ｎ
ｔ）の長さのステム・シーケンス（下線部）を有してい
た。このプローブは塩基３２１乃至塩基３４１を探査す
る。 5’FAM -gcg agc tct ggc cac agc act taa acc c gct
cgc dabcyl-3’：シーケンス認識番号４（Seq. ID. No.
4）

【００７８】上記目的のために使用した制限酵素はBamH
Iであり、この酵素は以下のシーケンスを認識する。 この酵素は対照領域外においてｍｔＤＮＡを切断した多
くの制限酵素の内の一つである。

【００７９】上記対照シーケンスを上記各物質の存在下
に増幅し、当該対照シーケンスの濃度の対数対バックグ
ラウンドに対して蛍光が最初に検出可能になったＰＣＲ
の工程数（「Ｃ_t 」）のプロットを作成した。この処理
はｍｔ−ＤＮＡの３×１０⁰個のコピー数乃至３×１０
⁸ 個のコピー数の範囲内の異なるコピー・レベルの一連
の希釈において行なった。さらに、同様のプロットを制
限されない各シーケンスによる増幅生成物を用いて作成
した。この結果、制限状態において、約７０個のコピー
数にわたる退行線が得られたが、非制限状態の場合は、
３０個にわたる線形の退行線しか得られなかった。この
実施例はｍｔＤＮＡの増幅および検出において説明した
ような各プライマーおよびプローブを使用する能力を示
している。このことはｍｔＤＮＡが円形で、その両端部
において共有結合的に結合していて十分にハイブリッド
形成しているにもかかわらず示された。また、この実施
例は各切断試薬の使用により改善された増幅が達成でき
ることも示している。

【００８０】実施例２：野生型ＤＮＡの増幅および検出 この実施例において使用した野生型のオリゴヌクレオチ
ドの目的物は以下のシーケンス（塩基８３４４乃至塩基
８６７０）を有していた。 agaaccaaca cctctttaca gtgaaatgcc ccaactaaat actacc
gtat ggcccaccat aattaccccc atactcctta cactattcct
catcacccaa ctaaaaatat taaacacaaa ctaccacctacctccct
cac caaagcccat aaaaataaaa aattataaca aaccctgaga ac
caaaatga acgaaaatct gttcgcttca ttcattgccc ccacaatc
ct aggcctaccc gccgcagtac tgatcattctatttccccct cta
ttgatcc ccacctccaa atatctcatc aacaaccgac taatcacca
c ccaacaatga：シーケンス認識番号５（Seq. ID. No.
5）

【００８１】この実施例において使用した正プライマー
は２７個のヌクレオチド（２７ｎｔ）の塩基長（塩基８
３４４乃至塩基８３６９）であり、以下のシーケンスを
有していた。 5’-acc aac acc tct tta cag tga aat gcc-3’：シー
ケンス認識番号６（Seq.ID. No.6）

【００８２】この実施例において使用した逆プライマー
は２１個のヌクレオチド（２１ｎｔ）の塩基長（塩基８
６５０乃至塩基８６７０）であり、以下のシーケンスを
有していた。 5’-tca ttg ttg ggt ggt gat tag-3’：シーケンス認
識番号７（Seq. ID. No.7）

【００８３】野生型のプローブは以下に記載するシーケ
ンスを有していた。このプローブは分子ビーコン（塩基
８４９０乃至塩基８５１０）であり、６個のヌクレオチ
ド（６ｎｔ）の長さのステム・シーケンス（下線部）を
有していた。 5’FAM -ccg tcg cct ccc tca cca aag ccc ata aa cg
a cgg dabcyl-3’：シーケンス認識番号８（Seq. ID. N
o.8）

【００８４】上記欠失シーケンスを切断するために使用
した制限酵素はScaIであり、この酵素は以下のシーケン
スを認識する。 この酵素ScaIは対照領域を切断せず、この対照領域は必
要であれば別のシーケンスにより同時増幅できる。

【００８５】上記各物質を用いてＰＣＲ反応を行なっ
た。一組のサンプルは各切断試薬に接触させず、別の組
は接触させた。目的物ＤＮＡの存在下および非存在下に
おける５キロベースの野生型シーケンスにおける蛍光対
工程数のプロットにより、ScaIによる非制限状態のサン
プルは工程数１６において蛍光における増加を示し始め
た。このことは上記サンプルが相当量の５キロベースの
野生型ｍｔ−ＤＮＡを含有していることを示している。
また、ScaIにより制限されたサンプルを用いた同様のプ
ロットは蛍光対工程数において約６工程ほどの右側への
ずれを示し、このことは野生型分子の数が約２⁶ ＝６４
倍の係数だけ制限により減少したことを示している。

【００８６】実施例３：５キロベースの欠失部分を含む
ＤＮＡの増幅および検出マスター・ミックス ： ［緩衝液］：１０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ８．３、５０ｍ
ＭＫＣｌ、Perkin-Elmer社から入手 ［ＭｇＣｌ₂ ］：５ｍＭ、Sigma社から入手 ［ｄＮＴＰ、各種］：０．２ｍＭ、Kodak社から入手 ［Taq pol］：１単位／反応ウェル（５０μｌ） ［5Mb3-TET（ビーコン）］：０．１ｍＭ（使用する場
合） ［プライマー、各種］：０．１７μＭ

【００８７】切断試薬：制限酵素Hind IIIをNew Englan
d BioLabs社から購入した。１単位／μｇの代わりに約
５単位の酵素を１μｇのＤＮＡに対して用いたことを除
いて、提唱されている標準的な反応条件を採用した。

【００８８】この実施例において、以下のＰＣＲプロフ
ァイル、すなわち、４０工程にわたり、９２度／１５
秒、７１度／４５秒、を１回目の増幅において採用し
た。

【００８９】上記のマスター・ミックスを、ビーコンの
非存在下において、以下の各プライマーと共にＰＣＲに
おいて用いた。 5’ accaaca cctctttaca gtgaaatgcc 3’：シーケンス
認識番号６（Seq. ID. No.6） 5’ tgtatg atatgtttgc ggtttcgatg at 3’：シーケン
ス認識番号９（Seq. ID.No.9） １００ｎｇのHind III消化したＤＮＡも含まれていた。

【００９０】上記ＰＣＲからの各生成物をアガロース・
ゲル電気泳動法により検査した。いずれのレーンにおい
ても生成物のゲル帯域は全く観察されなかった。

【００９１】上記実験の次の段階において、１μｌの目
的物ＤＮＡを上記のＰＣＲ反応における各ウェルから取
り出した。このＤＮＡを新しいマスター・ミックスおよ
び以下の各プライマーを入れた新しいウェルの中に入れ
た。 5’ gcc ccaactaaat actaccg 3’：シーケンス認識番号
１０（Seq. ID. No.10） 5’ gatgtggtctt tggagtagaaacctg 3’：シーケンス認
識番号１１（Seq. ID. No.11）

【００９２】以下のＰＣＲプロファイル、すなわち、４
０工程にわたり、９２度／１５秒、６９度／４５秒、を
２回目の増幅において採用した。

【００９３】上記２回目のＰＣＲにより得られた各サン
プルについてアガロース・ゲル電気泳動を行なった。検
査した全てのサンプルにおいて５キロベース（約１７４
の塩基対（ｂｐ））の欠失領域に匹敵する大きさのゲル
帯域が見られた。プライマー−二量体の帯域は全く観察
されなかった。

【００９４】この実験の最後の段階において、１μｌの
目的物ＤＮＡを７１℃のアニール−延長温度において行
なったＰＣＲ（１回目のＰＣＲ）の増幅物から取り出し
た。このサンプルを新しいマスター・ミックスを入れた
反応チューブに加えて、以下の各プライマーを、 5’ gcc ccaactaaat actaccg 3’：シーケンス認識番号
１０（Seq. ID. No.10） 5’ gatgtggtctt tggagtagaaacctg 3’：シーケンス認
識番号１１（Seq. ID. No.11） 以下のビーコン、すなわち、5’ TET-ccgctcgaaa ggtat
tcctg ctaatgctag gctgccaatc gagcgg-Dabcyl 3’：シ
ーケンス認識番号１２（Seq. ID. No.12）と共に使用し
た。

【００９５】その後、上記反応チューブを以下の各ＰＣ
Ｒ条件にかけた。１０工程にわたり、９２度／１５秒、
および７１度／３０秒の後に、３０工程にわたり、９２
度／１５秒、５７度／１０秒、および６９度／１５秒

【００９６】その後、ABI PRISM 7700分析装置において
リアルタイムで５７℃においてプローブからの蛍光シグ
ナルをモニターした。

【００９７】さらに、目的物ＤＮＡの存在下および非存
在下において５キロベースの変異体シーケンスについて
蛍光対工程数をプロットした。この結果、ＰＣＲ工程数
約１０の後に閾値を超えた蛍光における増加により、こ
の５キロベースの検出において陽性のビーコン・シグナ
ルが示された。また、この蛍光シグナルは上述した対応
するゲル帯域の観察結果と一致している。

【００９８】その後、上記の再増幅処理したＰＣＲの各
生成物をアガロース・ゲル電気泳動により可視化した。
この結果、約１７４個の塩基対（ｂｐ）に相当する分子
量（ＭＷ）の主要な帯域により分かるように、各サンプ
ル中において５キロベースの変異体ＤＮＡの存在が示さ
れた。

【００９９】実施例４：野生型ＤＮＡの増幅および検出 野生型のオリゴヌクレオチド目的物は以下のシーケンス
（塩基１６０３３乃至塩基１６２１３）を有していた。 ggggaagc agatttgggt accacccaag tattgactca cccatcaa
ca accgctatgt atttcgtaca ttactgccag ccaccatgaa tat
tgtacgg taccataaat acttgaccac ctgtagtaca taaaaaccc
a atccacatca aaaccccctc cccatgctta caagcaagta ca
g：シーケンス認識番号１３（Seq. ID. No.13）

【０１００】この実施例において使用した正（方向の）
野生型プライマーは２２個のヌクレオチド（２２ｎｔ）
の塩基長（塩基１６０３３乃至塩基１６０５４）であ
り、以下のシーケンスを有していた。5’-ggg gaa gca
gat ttg ggt acc a -3’：シーケンス認識番号１４（Se
q. ID.No.14）

【０１０１】また、逆（方向の）プライマーは２０個の
ヌクレオチド（２０ｎｔ）の塩基長（塩基１６１９４乃
至塩基１６２１３）であり、以下のシーケンスを有して
いた。 5’-ctg tac ttg ctt gta agc at -3’：シーケンス認
識番号１５（Seq. ID. No.15）

【０１０２】また、以下に記載するシーケンス（塩基１
６０６５乃至１６０８８）の野生型プローブは分子ビー
コンであり、６個のヌクレオチド（６ｎｔ）長のステム
・シーケンス（下線部）を有していた。 5’FAM -gcg tcg gac tca ccc atc aac aac cgc tat cg
a cgc-dabcyl 3’：シーケンス認識番号１６（Seq. ID.
No.16）

【０１０３】上記７キロベースの欠失シーケンスを切断
するために使用した制限酵素はPleIであり、この制限酵
素は以下のシーケンスを認識する。 この結果、PleIは保存領域を切断せず、この領域は同時
増幅可能である。

【０１０４】上記各物質によるＰＣＲ反応を行なった。
一組のサンプルを各切断試薬に接触させず、別の組のサ
ンプルを接触させた。目的物ＤＮＡの存在下および非存
在下における７キロベースの野生型シーケンスについて
の蛍光対工程数のプロットを作成した。上記のPleIによ
る非制限状態のサンプルは工程数１７において蛍光にお
ける増加を示し始めた。このことはこの試料中における
相当量の７キロベースの野生型ｍｔ−ＤＮＡの存在を示
している。また、制限状態のサンプルについての蛍光対
工程数のプロットは約５工程ほどの右側へのずれを示
し、このことは野生型分子の数が約２⁵ ＝３２倍の係数
だけ制限により減少したことを示している。

【０１０５】実施例５：７キロベースの欠失部分（予言
的）を有するＤＮＡの増幅および検出 サンプルの一方の当量部分が７キロベースの欠失部分を
有しているｍｔＤＮＡを含有していることを除いて実施
例４を繰り返した。

【０１０６】上記変異体（７キロベースの欠失部分）目
的物のシーケンスは以下のようである。 5’-gccgcagtac tgatcattct atttccccct ctattgatcc cc
acctccaa atatctcatc aacaaccg gctatgt atttcgtaca tt
actgccag ccaccatgaa tattgtacgg taccataaat acttgacc
ac ctgtagtaca taaaaaccca atccacatca aaaccccctc ccc
atgctta caagcaagta cag -3’：シーケンス認識番号１
７（Seq. ID. No.17）

【０１０７】上記変異体のプローブは以下のシーケンス
を有する分子ビーコン（塩基１６１０３乃至塩基１６１
２７）である。 5’-gcg tcg ctg cca gcc acc atg aat att gta cga c
gc dabcyl-3’：シーケンス認識番号１８（Seq. ID. N
o.18）

【０１０８】この実施例において使用した正方向の変異
体プライマーは３３個のヌクレオチド（３３ｎｔ）の塩
基長（塩基８５８１乃至塩基８６１３）であり、以下の
シーケンスを有している。 5’-gcc gca gta ctg atc att cta ttt ccc cct cta -
3’：シーケンス認識番号１９（Seq. ID. No.19） 上記変異体ＤＮＡは増殖し、上記プローブの探査により
検出した。

【０１０９】実施例６：ＮＩＳＴヒトｍｔ−ＤＮＡの各
標準値についての較正線による比較 ＮＩＳＴから入手し、上記第１の実施例において述べた
ｍｔ−ＤＮＡの基準の各標準値を別々に行なった二重の
較正実験における標準値として用いた。5’FAM-gcg agc
tct ggc cac agc act taa acc c gct cgc dabcyl-
3’：シーケンス認識番号４（Seq. ID. No.4）および付
随の各プライマーを用いて対照領域を増幅して検出し
た。実施例１において説明したＰＣＲを行い、上記Ｃｔ
の値を決定して目的物のコピー数の対数に対してプロッ
トした。得られた線形の各退行パラメータは以下の表に
示すような値である。この較正曲線の切片は以下に示す
ような目的物の１回のコピーを検出するために必要な工
程数である。この較正曲線の式は以下のようである。 Ｃｔ＝切片＋勾配・ｌｏｇ［コピー数］ 上記コピー数＝１の時に、上記ｌｏｇ［１］＝０である
ので、１回に対応するＣｔの値は上記切片により与えら
れるために、この切片は１回のコピーの感度に必要とさ
れるＰＣＲの工程数を示している。

【０１１０】上記実施例はその進行における再現性（そ
れぞれ２個の切片は１工程未満で異なっており、各勾配
は５％のみしか異なっていない）を示しており、このア
ッセイが４６回または４７回のＰＣＲ工程のレベルにお
ける１回のコピー感度を有していることも示している。
従って、このアッセイは再現性があり、感度も高い。さ
らに、信頼性のある較正曲線を確立することにより、野
生型ＤＮＡに対する、あるいは、対照シーケンスに対す
る変異体ＤＮＡの定量化が可能になる。このことは老化
以外の原因に関連している病気の状態または状況に対比
した場合の老化に関連している病気の状態または状況の
間における識別において特に重要になる可能性がある。

【０１１１】実施例７：５キロベースおよび７キロベー
スの変異体の増殖体に対応する２種類の付加的なプロー
ブの試験 ２種類のビーコンは５キロベースおよび７キロベースの
欠失部分により生成された２種類の変異体の増殖体のそ
れぞれに対して目標を定めていた。これらのプローブを
以下に記載されている各条件に従ってＰＣＲにおいて試
験した。２種類の新しいプライマーを合成して、上記各
プローブに対して相補的な結合部位を含む野生型ｍｔ−
ＤＮＡゲノムの部分を増幅するために用いた。

【０１１２】上記の各プライマーおよびプローブの各シ
ーケンスは以下のようである。５キロベースの欠失部分
に対応するプローブは：5’ TET-ccg ctc ga aag gtat
tc ctg cta atg cta ggc tgc caa tc gag cgg-Dabcyl：
シーケンス認識番号１２（Seq. ID. No.12）であった。
７キロベースの欠失部分に対応するプローブは：5’ TE
T-ccgctcg gccgcagtac tgatcattct atttccccct cta cga
gcgg-Dabcyl 3’：シーケンス認識番号２０（Seq. ID.
No.20）のプローブであった。（下線部はヘアピン・プ
ローブにおけるステム領域を示している。）

【０１１３】上記５キロベースの欠失部分に対応するプ
ローブと共に用いた逆プライマーは以下のシーケンスを
有していた。 tgt atg ata tgt ttg cgg ttt cga tga t：シーケンス
認識番号９（Seq. ID. No.9） また、正プライマーは以下のシーケンスを有していた。 tac tca aaa cca tac ctc tca ctt caa cct.：シーケン
ス認識番号２１（Seq. ID. No.21） このプライマーは上記プローブが結合可能な部位におけ
る増幅を達成するために合成した。

【０１１４】上記７キロベースの欠失部分に対応するプ
ローブと共に用いた正プライマーは以下のシーケンスを
有していた。 gaa cga aaa tct gtt cgc ttc att cat tgc.：シーケン
ス認識番号２２（Seq. ID. No.22） また、逆プライマーは以下のシーケンスを有していた。 ctg tac ttg ctt gta agc at.：シーケンス認識番号１
５（Seq. ID. No.15） このプライマーは上記プローブが結合可能な部位におけ
る増幅を達成するために合成した。

【０１１５】さらに、上記ABI 7700シーケンス・ディテ
クターにおいて採用した熱的プロファイルは以下のよう
である。 ５秒間にわたり５０℃ １分間にわたり９５℃ １０工程の二温度式ＰＣＲ、すなわち、 １５秒間にわたり９２℃（変性） ３０秒間にわたり７２℃（アニール−延長）、 次に、３０工程の三温度式ＰＣＲ、すなわち、 １５秒間にわたり９２℃（変性） １０秒間にわたり５１℃（アニール工程であり、この工
程中に各ビーコンが読み取られる） １５秒間にわたり７２℃（延長工程）

【０１１６】上記ＰＣＲのマスター・ミックスは １０ｍＭのＴＲＩＳ、ｐＨ ５ｍＭのＭｇＣｌ₂ 、 ５０ｍＭのＫＣｌ ０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ 約２単位のTaqＤＮＡポリメラーゼ

【０１１７】２９蛍光単位の蛍光の閾値を採用して、５
キロベースの欠失部分に対応するビーコンにより７回程
度のＰＣＲ工程においてリアルタイムで目的物を先ず検
出した。その後、３９蛍光単位の閾値を採用して、７キ
ロベースの欠失部分に対応するビーコンにより１６回程
度のＰＣＲ工程において目的物を先ず検出した。

【０１１８】上記各ＰＣＲ反応の生成物を標準的なアガ
ロース・ゲル上において電気泳動して、臭化エチジウム
により染色した。適正な大きさ（それぞれ、５キロベー
スに対応する１２６個程度の塩基対および７キロベース
に対応する２３６個程度の塩基対）の各増幅体に相当す
る帯域を観察した。７キロベースの欠失部位に対応する
ブランクの反応に相当する鋳型無しの対照のレーンは帯
域が全く無かったが、５キロベースの欠失部分に対応す
るブランクに相当するレーンにおいて少量のプライマー
−二量体と思われる副生成物が観察された。

【０１１９】実施例８：厳しい条件の初期的なＰＣＲ工
程 上記の各実施例におけるように、２種類の異なる熱的プ
ロファイルを採用したことを除いて、ｍｔＤＮＡを５キ
ロベースおよび７キロベースの欠失シーケンスの両方に
対応する変異体プライマーの各組の存在下においてＰＣ
Ｒリアルタイム・モニター処理にかけた。

【０１２０】第１の熱的プロファイルは以下のようであ
る。５秒間にわたり５０℃、および５秒間にわたり９５
℃、次に、４０工程の：１５秒間にわたり８９℃、１５
秒間にわたり５５℃、１０秒間にわたり５８℃、および
１５秒間にわたり６２℃。

【０１２１】プライマー／ビーコンの各組は以下のよう
である。 ５キロベースの変異体： ビーコン：5' FAM gcgtcg cat cac cca act aaa aat at
t aaa cac cgacgc -Dabcyl 3'，シーケンス認識番号２
３（Seq. ID. No.23） 正プライマー：5’ accaaca cctctttaca gtgaaatgcc
3’，シーケンス認識番号６（Seq. ID. No.6） 逆プライマー：5’ ctg cta atg cta ggc tgc caa t
3’，シーケンス認識番号２４（Seq. ID. No.24） ７キロベースの変異体： 正プライマー：5’ gccgcagtac tgatcattct atttccccct
cta 3’，シーケンス認識番号１９（Seq. ID. No.19）

【０１２２】上記ＰＣＲに続いて、増幅した各生成物を
標準の条件下においてアガロース・ゲル上で電気泳動し
て、臭化エチジウムにより染色することにより各反応生
成物の大きさの分布を調べた。このゲルは非特異的な開
始を示す多数の帯域を示した。

【０１２３】次に、高い［厳しい条件の］アニール温度
による１０工程を伴って第２のＰＣＲの熱的プロファイ
ルを開始した後に、３０工程の比較的に厳しさを抑えた
条件（すなわち、さらに低いアニール温度）においてリ
アルタイム・モニター処理を行なった。この場合の各プ
ライマー／ビーコンは以下のようである。５キロベースの変異体 ： ビーコン：5’ FAM-cgccgcct catcacccaa ctaaaaatat t
aaacacaaa ctaccacc ggcggcg-Dabcyl 3’，シーケンス
認識番号２５（Seq. ID. No.25） 正プライマー：5’ gcc ccaactaaat actaccg 3’，シー
ケンス認識番号１０（Seq. ID. No.10） 逆プライマー：5’ gatgtggtctt tggagtagaaacctg
3’，シーケンス認識番号１１（Seq. ID. No.11）７キロベースの変異体 ： 正プライマー：5’ gccgcagtac tgatcattct atttccccct
cta 3’，シーケンス認識番号１９（Seq. ID. No.19） ビーコン：5’ FAM-cctgcgg ctgccag ccaccatgaa tatt
gtacgg ta ccgcagg-Dabcyl 3’，シーケンス認識番号２
６（Seq. ID. No.26）

【０１２４】熱的プロファイルは以下のようである。５
秒間にわたり５０℃、６０秒間にわたり９５℃、１０工
程の：１５秒間にわたり９５℃、３０秒間にわたり７１
℃、次に、３０工程の：１５秒間にわたり９２℃、１０
秒間にわたり５１℃（アニール工程であり、この工程中
に蛍光が読み取られる） １５秒間にわたり７１℃。

【０１２５】再び、増幅した生成物をゲル上で電気泳動
して、臭化エチジウムにより染色し、得られた各帯域を
既知の分子量の各マーカーの帯域に対して比較した。前
の熱的な工程条件下において得られた結果に対して、リ
アルタイム・モニター処理中にバックグラウンドを超え
る蛍光は全く観察されなかった。さらに、このゲルの各
結果物は各帯域が完全に存在していないことを示した。
それゆえ、この試料中に変異体ＤＮＡは全く検出されな
かった。

【０１２６】実施例９：Hind III制限（予言的）の使用 上記の各実施例において説明したように、Ple1およびSc
a1は野生型ＤＮＡを制限するために使用できるが、７キ
ロベースおよび５キロベースの野生型ｍｔ−ＤＮＡの両
方をそれぞれの欠失シーケンス内において切断できる１
種類のみの制限酵素を使用できれば都合が良い。そこ
で、この目的のために以下のシーケンスを切断するHind
IIIを使用する。 AAGCTT TTCGAA この酵素は対照領域を切断しないので、当該対照領域に
対して各欠失部分を定量化することが望まれる場合に、
Hind IIIは特に好ましい。この酵素は、製造者（New En
gland Nuclear社）により説明されているように、約１
単位／１μｇのＤＮＡのレベルでＤＮＡと共に３７℃に
おいて１時間にわたりインキュベーションする。

【０１２７】本発明の実施態様は以下の通りである。 （１）前記核酸がミトコンドリアの核酸である請求項１
に記載の方法。 （２）前記核酸がｍｔ−ＤＮＡである実施態様（１）に
記載の方法。 （３）さらに、前記サンプルを切断試薬に接触させる工
程を含む請求項１に記載の方法。 （４）さらに、前記各当量部分をプローブに接触させる
工程、および当該プローブの有無を検出する工程を含む
請求項２に記載の方法。 （５）前記検出がゲル電気泳動法または毛管電気泳動法
により行なわれる請求項２に記載の方法。

【０１２８】（６）前記プローブがTaqManプローブ、分
子ビーコン、ＰＮＡプローブ、ＤＮＡザイム、およびこ
れらの組合せから成る群の一部を含む実施態様（４）に
記載の方法。 （７）さらに、前記各当量部分をプローブに接触させる
工程、および当該プローブの有無を検出する工程を含む
請求項３に記載の方法。 （８）前記検出がゲル電気泳動法または毛管電気泳動法
により行なわれる請求項３に記載の方法。 （９）前記プローブがTaqManプローブ、分子ビーコン、
ＰＮＡプローブ、ＤＮＡザイム、およびこれらの組合せ
から成る群の一部を含む実施態様（７）に記載の方法。 （１０）さらに、前記工程（ａ）または工程（ｂ）にお
ける当量部分を切断試薬に接触させる工程を含む請求項
４に記載の方法。

【０１２９】（１１）さらに、前記工程（ｄ）における
増幅体の存在を確認する工程を含み、前記工程（ｂ）に
おける増幅体の存在の定量結果が前記サンプル内に存在
している野生型核酸の量に対して相関している請求項４
に記載の方法。 （１２）前記定量が一定の標準値に対する比較により行
なわれる請求項４に記載の方法。 （１３）前記定量がリアルタイムのモニター処理により
行なわれる請求項４に記載の方法。 （１４）さらに、短鎖ＰＣＲの試薬を含む請求項６に記
載のキット。 （１５）さらに、シーケンス認識番号２（Seq. ID
2）、シーケンス認識番号３（Seq. ID 3）、シーケンス
認識番号４（Seq. ID 4）、シーケンス認識番号６（Se
q. ID 6）、シーケンス認識番号７（Seq. ID 7）、シー
ケンス認識番号８（Seq. ID 8）、シーケンス認識番号
９（Seq. ID 9）、シーケンス認識番号１０（Seq. ID 1
0）、シーケンス認識番号１１（Seq. ID 11）、シーケ
ンス認識番号１２（Seq. ID 12）、シーケンス認識番号
１４（Seq. ID 14）、シーケンス認識番号１５（Seq. I
D 15）、シーケンス認識番号１６（Seq. ID 16）、シー
ケンス認識番号１８（Seq. ID 18）、シーケンス認識番
号１９（Seq. ID 19）、シーケンス認識番号２０（Seq.
ID 20）、シーケンス認識番号２１（Seq. ID 21）、シ
ーケンス認識番号２２（Seq. ID 22）、シーケンス認識
番号２３（Seq. ID 23）、シーケンス認識番号２４（Se
q. ID 24）、シーケンス認識番号２５（Seq. ID 25）、
シーケンス認識番号２６（Seq. ID 26）から成る群から
選択される組成物を含む請求項６に記載のキット。

【０１３０】

【発明の効果】従って、本発明によれば、核酸における
欠失部分の存在を検出するための優れた方法、組成物お
よびキットが提供できる。

【０１３１】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Ortho-Clinical Diagnostics, Inc. <120> Detecting Nucleic Acid Detection Sequences <130> CDS-232 <140> US 09/877,748 <141> 2001-06-11 <160> 26 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 107 <212> DNA <213> Synthetic construct <400> 1 cacagacatc ataacaaaaa atttccacca aaccccccct cccccgcttc tggccacagc 60 acttaaacac atctctgcca aaccccaaaa acaaagaacc ctaacac 107 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Synthetic construct <400> 2 cacagacatc ataacaaaaa attt 24 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Synthetic construct <400> 3 gtgttagggt tctttgtttt tgggg 25 <210> 4 <211> 34 <212> DNA <213> Synthetic construct <400> 4 gcgagctctg gccacagcac ttaaacccgc tcgc 34 <210> 5 <211> 330 <212> DNA <213> Human <400> 5 agaaccaaca cctctttaca gtgaaatgcc ccaactaaat actaccgtat ggcccaccat 60 aattaccccc atactcctta cactattcct catcacccaa ctaaaaatat taaacacaaa 120 ctaccaccta cctccctcac caaagcccat aaaaataaaa aattataaca aaccctgaga 180 accaaaatga acgaaaatct gttcgcttca ttcattgccc ccacaatcct aggcctaccc 240 gccgcagtac tgatcattct atttccccct ctattgatcc ccacctccaa atatctcatc 300 aacaaccgac taatcaccac ccaacaatga 330 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Synthetic construct <400> 6 accaacacct ctttacagtg aaatgcc 27 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Synthetic construct <400> 7 tcattgttgg gtggtgatta g 21 <210> 8 <211> 35 <212> DNA <213> Synthetic construct <400> 8 ccgtcgcctc cctcaccaaa gcccataaac gacgg 35 <210> 9 <211> 28 <212> DNA <213> Synthetic construct <400> 9 tgtatgatat gtttgcggtt tcgatgat 28 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Synthetic construct <400> 10 gccccaacta aatactaccg 20 <210> 11 <211> 26 <212> DNA <213> Synthetic construct <400> 11 gatgtggtct ttggagtaga aacctg 26 <210> 12 <211> 46 <212> DNA <213> Synthetic construct <400> 12 ccgctcgaaa ggtattcctg ctaatgctag gctgccaatc gagcgg 46 <210> 13 <211> 181 <212> DNA <213> Human <400> 13 ggggaagcag atttgggtac cacccaagta ttgactcacc catcaacaac cgctatgtat 60 ttcgtacatt actgccagcc accatgaata ttgtacggta ccataaatac ttgaccacct 120 gtagtacata aaaacccaat ccacatcaaa accccctccc catgcttaca agcaagtaca 180 g 181 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Synthetic construct <400> 14 ggggaagcag atttgggtac ca 22 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Synthetic construct <400> 15 ctgtacttgc ttgtaagcat 20 <210> 16 <211> 36 <212> DNA <213> Synthetic construct <400> 16 gcgtcggact cacccatcaa caaccgctat cgacgc 36 <210> 17 <211> 198 <212> DNA <213> Human <400> 17 gccgcagtac tgatcattct atttccccct ctattgatcc ccacctccaa atatctcatc 60 aacaaccggc tatgtatttc gtacattact gccagccacc atgaatattg tacggtacca 120 taaatacttg accacctgta gtacataaaa acccaatcca catcaaaacc ccctccccat 180 gcttacaagc aagtacag 198 <210> 18 <211> 36 <212> DNA <213> Synthetic construct <400> 18 gcgtcgctgc cagccaccat gaatattgta cgacgc 36 <210> 19 <211> 33 <212> DNA <213> Synthetic construct <400> 19 gccgcagtac tgatcattct atttccccct cta 33 <210> 20 <211> 47 <212> DNA <213> Synthetic construct <400> 20 ccgctcggcc gcagtactga tcattctatt tccccctcta cgagcgg 47 <210> 21 <211> 30 <212> DNA <213> Synthetic construct <400> 21 tactcaaaac catacctctc acttcaacct 30 <210> 22 <211> 30 <212> DNA <213> Synthetic construct <400> 22 gaacgaaaat ctgttcgctt cattcattgc 30 <210> 23 <211> 39 <212> DNA <213> Synthetic construct <400> 23 gcgtcgcatc acccaactaa aaatattaaa caccgacgc 39 <210> 24 <211> 22 <212> DNA <213> Synthetic construct <400> 24 ctgctaatgc taggctgcca at 22 <210> 25 <211> 53 <212> DNA <213> Synthetic construct <400> 25 cgccgcctca tcacccaact aaaaatatta aacacaaact accaccggcg gcg 53 <210> 26 <211> 43 <212> DNA <213> Synthetic construct <400> 26 cctgcggctg ccagccacca tgaatattgt acggtaccgc agg 43

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明を実施する一つの方法の概略図である。

【図２】図１において示されている方法と異なる本発明
を実施する方法の概略図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (71)出願人 501131014 100 Ｉｎｄｉｇｏ Ｃｒｅｅｋ Ｄｒｉ ｖｅ， Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ， ＮＹ 14626−5101， Ｕ．Ｓ．Ａ. (72)発明者 ジョン・ダブリュ・サザーランド アメリカ合衆国、14620 ニューヨーク州、 ロチェスター、カルバー・ロード 57 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 CA01 HA14 4B063 QA01 QQ42 QR08 QR32 QR42 QR62 QS25 QS34 QX02

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 変異体核酸を検出する方法において、 （ａ）核酸を含有するサンプルを変異体ＰＣＲプライマ
   ーに接触させる工程、 （ｂ）短鎖ＰＣＲの条件下で前記工程（ａ）の生成物を
   増幅する工程、および （ｃ）前記工程（ｂ）の増幅体の存在を確認する工程を
   含み、当該増幅体の存在が核酸の欠失シーケンスの存在
   を示す方法。
2. 【請求項２】 欠失部分を有する核酸を検出する方法に
   おいて、 （ａ）核酸を含有するサンプルを入手する工程、 （ｂ）前記サンプルを第１の当量部分および第２の当量
   部分に分割する工程を含み、それぞれの当量部分が変異
   体ＤＮＡおよび野生型ＤＮＡの混合物を含有していると
   思われ、さらに、 （ｃ）前記第１の当量部分を切断試薬に接触させること
   により、混合物を形成する工程、 （ｄ）前記工程（ｃ）の混合物を前記欠失シーケンスの
   上流領域における開始部位に対して相補的な正プライマ
   ーに接触させる工程、 （ｅ）前記工程（ｄ）の混合物に、前記変異体ＤＮＡの
   下流領域に対して相補的な逆プライマーおよび４種類の
   異なるヌクレオシド・トリホスフェートのそれぞれ、な
   らびに、ＤＮＡポリメラーゼを、前記変異体ＤＮＡのみ
   が増幅される条件下において、加える工程、 （ｆ）前記第２の当量部分を前記欠失シーケンスの上流
   領域における開始部位に対して相補的な正プライマーお
   よび当該欠失シーケンス内の開始部位に対して相補的な
   逆プライマーに接触させる工程、 （ｇ）前記工程（ｆ）の混合物に、４種類の異なるヌク
   レオシド・トリホスフェートおよびＤＮＡポリメラーゼ
   を、ＤＮＡが増幅される条件下において、加える工程、
   および （ｈ）前記増幅したＤＮＡの存在を検出する工程を含む
   方法。
3. 【請求項３】 欠失部分を有する核酸を検出する方法に
   おいて、 （ａ）核酸を含有するサンプルを入手する工程、 （ｂ）前記サンプルを第１の当量部分および第２の当量
   部分に分割する工程を含み、それぞれの当量部分が変異
   体ＤＮＡおよび野生型ＤＮＡの混合物を含有していると
   思われ、さらに、 （ｃ）前記第１の当量部分を切断試薬に接触させること
   により、混合物を形成する工程、 （ｄ）前記工程（ｃ）の混合物を前記欠失シーケンスの
   下流領域における逆プライマーに接触させる工程、 （ｅ）前記工程（ｄ）の混合物に、前記欠失シーケンス
   の上流側の領域に対して相補的な正プライマーおよび４
   種類の異なるヌクレオシド・トリホスフェートのそれぞ
   れ、ならびに、ＤＮＡポリメラーゼを、前記変異体ＤＮ
   Ａのみが増幅される条件下において、加える工程、 （ｆ）前記第２の当量部分を前記欠失シーケンス内の開
   始部位に対して相補的な正プライマーおよび当該欠失シ
   ーケンスの下流領域における逆プライマーに接触させる
   工程、 （ｇ）前記工程（ｆ）の混合物に、４種類の異なるヌク
   レオシド・トリホスフェートおよびＤＮＡポリメラーゼ
   を、ＤＮＡが増幅される条件下において、加える工程、
   および （ｈ）前記増幅したＤＮＡの存在を検出する工程を含む
   方法。
4. 【請求項４】 欠失シーケンスを有する核酸を定量する
   方法において、 （ａ）核酸を含有しているサンプルの一定の当量部分を
   短鎖ＰＣＲの条件下において変異体ＰＣＲプライマーに
   接触させる工程、 （ｂ）前記工程（ａ）の生成物を増幅する工程、 （ｃ）前記核酸を含有している核酸サンプルの別の当量
   部分を野生型ＰＣＲプライマーに接触させる工程、 （ｄ）前記工程（ｃ）の生成物を増幅する工程、 （ｅ）前記工程（ｂ）の増幅体の存在を確認する工程、
   および （ｆ）前記工程（ｂ）の増幅体の存在を定量する工程を
   含む方法。
5. 【請求項５】 シーケンス認識番号２（Seq. ID 2）、
   シーケンス認識番号３（Seq. ID 3）、シーケンス認識
   番号４（Seq. ID 4）、シーケンス認識番号６（Seq. ID
   6）、シーケンス認識番号７（Seq. ID 7）、シーケン
   ス認識番号８（Seq. ID 8）、シーケンス認識番号９（S
   eq. ID 9）、シーケンス認識番号１０（Seq. ID 10）、
   シーケンス認識番号１１（Seq. ID 11）、シーケンス認
   識番号１２（Seq. ID 12）、シーケンス認識番号１４
   （Seq. ID 14）、シーケンス認識番号１５（Seq. ID 1
   5）、シーケンス認識番号１６（Seq. ID 16）、シーケ
   ンス認識番号１８（Seq. ID 18）、シーケンス認識番号
   １９（Seq. ID 19）、シーケンス認識番号２０（Seq. I
   D 20）、シーケンス認識番号２１（Seq. ID 21）、シー
   ケンス認識番号２２（Seq. ID 22）、シーケンス認識番
   号２３（Seq. ID 23）、シーケンス認識番号２４（Seq.
   ID 24）、シーケンス認識番号２５（Seq. ID 25）、シ
   ーケンス認識番号２６（Seq. ID 26）から成る群から選
   択される物質の組成物。
6. 【請求項６】 変異体ＰＣＲプライマーを含む核酸欠失
   シーケンスの発生を検出または定量するためのキット。