JP4339062B2

JP4339062B2 - ミスマッチ領域検出方法

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Publication number: JP4339062B2
Application number: JP2003339713A
Authority: JP
Inventors: 徹土谷
Original assignee: Fujifilm Corp
Current assignee: Fujifilm Corp
Priority date: 2003-09-30
Filing date: 2003-09-30
Publication date: 2009-10-07
Anticipated expiration: 2023-09-30
Also published as: JP2005102579A; US7250257B2; US20050130200A1

Description

本発明は、ＤＮＡ等のポリヌクレオチド中に含まれる特定の配列の検出、解析等に使用される生化学解析マイクロアレイにおいて、ミスマッチ結合をした領域を特定する方法に関するものである。

ＤＮＡマイクロアレイは、遺伝子発現モニタリング、遺伝子の塩基配列決定、遺伝子多型ＳＮＰの解析、癌における遺伝子増幅や欠失、癌等の疾患の分類、薬物応答性の予測、疾患遺伝子の探索など生命科学の広い範囲での応用が期待されている。

ＤＮＡマイクロアレイの原理はハイブリダイゼーションに基づく核酸の検出に基づいており、ガラス、シリコンあるいはメンブレンフィルタなどの表面上の多数の領域に、異なったプローブＤＮＡを高密度に整列化（アレイ化）して固定し、この上で、ターゲットＤＮＡ（標識物質で標識されたＤＮＡ）とハイブリダイズさせて各々の領域（スポット）からのシグナルを検出するものである。例えば、標識物質が放射性標識物質である場合には、多数の領域に選択的に含まれている放射性標識物質によって蓄積性蛍光体シートの蓄積性蛍光体層を露光し、露光された蓄積性蛍光体層を励起光によって走査して、蓄積性蛍光体層に含まれている蓄積性蛍光体を励起し、蓄積性蛍光体から放出された光を光電的に検出することにより、標識物質が蛍光物質である場合には、多数の領域を励起光によって走査して多数の領域に選択的に含まれている蛍光物質を励起し、蛍光物質から放出された蛍光を光電的に検出することにより、標識物質が化学発光標識物質である場合には、多数の領域に選択的に含まれている化学発光標識物質を化学発光基質と接触させ、化学発光標識物質から放出される化学発光を光電的に検出することにより解析が行われている（例えば特許文献１参照）。

ＤＮＡマイクロアレイはアレイ化するＤＮＡの種類やその作製法により、大きく２つの種類に分かれる。一つは、半導体の露光技術であるフォトリソグラフィーを利用してシリコン基板にマスクと呼ばれる遮光板をかぶせて露光させる作業を繰り返し、基板上にＤＮＡを１分子ずつ積み上げていく方法で作製されるオリゴヌクレオチドアレイ（以下、単にオリゴヌクレオチドアレイという）、もう一つはあらかじめＰＣＲ増幅したｃＤＮＡをスライドガラス上に細いピンやインクジェット方式などで滴下して作製されるｃＤＮＡマイクロアレイである。

ところで、領域に固定されているプローブＤＮＡには、それぞれ最適なハイブリダイズのための条件（温度、塩濃度など）があるが、高密度に形成された領域に固定されているプローブＤＮＡのそれぞれにおいて最適な条件で反応を行うことは困難であるため、一般的にはすべての領域において同一の条件で反応が行われている。このため、アレイ上のプローブＤＮＡと完全には相補的ではないが似たような配列をもったターゲットＤＮＡが、アレイ上のプローブＤＮＡと誤ってハイブリダイズする、いわゆるミスマッチ結合を起こす場合がある。このミスマッチ結合しているターゲットＤＮＡは、検出の際に生じるノイズの一因となり検出精度を低下させるものとなる。

特に、ｃＤＮＡマイクロアレイは、細胞から単離したｃＤＮＡをそのままＰＣＲ増幅してスライドガラス上に固定したものであって、オリゴヌクレオチドアレイのように、あらかじめプローブＤＮＡをミスマッチを起こさないように設計して作製しているものではないため、アレイ上のプローブＤＮＡがミスマッチを起こす可能性が高い。このため、ｃＤＮＡマイクロアレイにおいても、検出したい遺伝子に特異的な配列を選び出し、その配列に従って合成したオリゴＤＮＡをプローブに用いるなど、アレイに載せるプローブを調製することによってミスマッチの軽減が図られている。

しかし、オリゴヌクレオチドアレイにしても合成オリゴアレイにしても、ミスマッチ結合を全く起こさないように設計することは困難であり、特にｃＤＮＡのような長い遺伝子について解析する場合に、ミスマッチ結合を起こさないように設計することは殆ど不可能である。

このようなミスマッチ結合に関する問題を、アレイ上のプローブＤＮＡにターゲットＤＮＡをハイブリダイズさせる際の、温度あるいはｐＨを細かに調製するなどして解決しようとする試みがなされている。たとえば、特許文献２にはオリゴヌクレオチドプローブとポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションにおいて、個々のプローブ固定面で、ハイブリダイゼーションに最適な温度で生化学反応をさせることが可能な生化学反応検出チップが提案されている。これはオリゴヌクレオチドプローブの相補鎖結合の融解温度（Ｔｍ値）に着目し、このＴｍ値よりも低温の条件ではミスマッチ結合によるバックグラウンドのノイズが増加し、Ｔｍ値よりも高温の条件ではポリヌクレオチドがプローブと結合しにくいことから、ミスマッチを起こさずにポリヌクレオチドとハイブリダイゼーションするための温度を、それぞれのプローブについて最適に調整するというものである。

また、特許文献３には基板表面の各領域にオリゴヌクレオチドプローブを固定し、これにポリヌクレオチドをハイブリダイゼーションさせた後、基板の特定の領域のみを選択的に加熱して、プローブに相補的に結合しているポリヌクレオチドのみをプローブから分離させることにより所望のポリヌクレオチドを選択的に分離、回収する方法が記載されている。
特開２００２−３５５０３６号公報特開２００１−２３５４７４号公報特開２０００−２７９１６９号公報

しかし、特許文献２に記載されている方法では、生化学反応検出チップに複数のアイランドを設け、そのアイランド毎に温度調整を細かくモニターすることが必要であり、特許文献３に記載されている技術を利用する場合にも、基板の特定の領域のみを選択的に加熱する必要がある。さらにアイランドや領域に含まれるプローブのＴｍ値をほぼ同じ値で揃えておかなければならないという、操作において極めて煩雑であり、かつ特殊な装置を必要とするものである。また、煩雑さの点からすれば、反応させる溶液の塩濃度を上げたり下げたりして微調整を行わなければミスマッチ結合を抑制することができない、ｐＨ調製をしながらハイブリダイゼーション行う場合も同様である。

このように、ハイブリダイゼーションのミスマッチ結合を抑制することは煩雑な調製が伴う上、時間もかかり、ミスマッチ結合を抑制する条件によっては完全に相補的結合をしている、いわゆるパーフェクトマッチ結合を弱めてしまうという新たな問題が生じる。

一方、ミスマッチ結合しているターゲットＤＮＡが存在している領域を特定することができれば、データ解析する際にその領域を排除するなどして、検出精度を向上させることが可能になると考えられる。

本発明はこのような事情に鑑みなされたものであり、ハイブリダイゼーション後にミスマッチ結合をしている領域をデータ解析する際に排除等することが可能なミスマッチ領域検出方法を提供することを目的とするものである。

本発明のミスマッチ領域検出方法は、担体上の複数の領域に固定されたオリゴヌクレオチドプローブに標識物質で標識されたポリヌクレオチドをハイブリダイズさせた後、前記オリゴヌクレオチドプローブと二本鎖を形成していない１本鎖部分の標識ポリヌクレオチドを、該標識ポリヌクレオチドの末端から１本鎖ポリヌクレオチドを分解する第１の制限酵素を作用させて、前記オリゴヌクレオチドプローブと前記標識ポリヌクレオチドとで形成された二本鎖から切り離し、その後、標識ポリヌクレオチドの標識物質からの信号を前記領域毎に検出して第１検出データを得、該第１検出データを得た後、前記オリゴヌクレオチドプローブと前記標識ポリヌクレオチドがミスマッチしている部分を切断する第２の制限酵素を作用させて前記オリゴヌクレオチドプローブと前記標識ポリヌクレオチドがミスマッチしている部分を切り離し、その後、標識ポリヌクレオチドの標識物質からの信号を前記領域毎に検出して第２検出データを得、前記第１検出データと前記第２検出データとを比較してミスマッチポリヌクレオチドが結合していた領域を特定することを特徴とするものである。

オリゴヌクレオチドプローブは担体上の全ての領域において、ほぼ同じ長さのヌクレオチドから形成される。

前記第１の制限酵素はエキソヌクレアーゼVIIであることが好ましい。また、前記第２の制限酵素はＳ１ヌクレアーゼおよび／またはMung Bean ヌクレアーゼであることが好ましい。

本発明のミスマッチ領域検出方法は、担体上の複数の領域に固定されたオリゴヌクレオチドプローブに標識物質で標識されたポリヌクレオチドをハイブリダイズさせた後、オリゴヌクレオチドプローブと二本鎖を形成していない１本鎖部分の標識ポリヌクレオチドを、この標識ポリヌクレオチドの末端から１本鎖ポリヌクレオチドを分解する第１の制限酵素を作用させて、オリゴヌクレオチドプローブと標識ポリヌクレオチドとで形成された二本鎖から切り離し、その後、標識ポリヌクレオチドの標識物質からの信号を領域毎に検出して第１検出データを得、第１検出データを得た後、オリゴヌクレオチドプローブと標識ポリヌクレオチドがミスマッチしている部分を切断する第２の制限酵素を作用させてオリゴヌクレオチドプローブと標識ポリヌクレオチドがミスマッチしている部分を切り離し、その後、標識ポリヌクレオチドの標識物質からの信号を領域毎に検出して第２検出データを得、得られた第１検出データと第２検出データとを比較するので、ミスマッチポリヌクレオチドが結合していた領域を特定、検出することができ、その領域を解析から排除等することが可能となる。従って、ミスマッチ結合によるバックグラウンドのノイズの軽減を図ることが可能となり、検出精度を向上させることができる。

また、ミスマッチポリヌクレオチドが結合していた領域を特定することができれば、その領域に固定されているオリゴヌクレオチドプローブについては、ターゲットとして用いたポリヌクレオチド中にわずかに塩基配列が異なる多型、例えば遺伝子であれば一塩基多型（ＳＮＰ）等が含まれている可能性があるため、この特定された領域のオリゴヌクレオチドプローブについてさらに解析を進めることによってＳＮＰ等を見つけることが可能となる。さらに担体に固定するオリゴヌクレオチドプローブの選択によっては、特定の遺伝子欠失の発見も可能となる。

以下、図面を参照して本発明の実施の形態について、担体上の複数の領域にオリゴＤＮＡプローブが固定されている、ＤＮＡアレイを用いる場合を例にとって説明する。図１は本発明のミスマッチ領域検出方法の流れを示す概略図である。

まず、メンブレンフィルタ１の表面にカルボキシル基（ＣＯＯＨ）あるいはアルデヒド基（ＣＯＨ）が露出するように処理を行う。一方、ＤＮＡプローブ２となる合成オリゴＤＮＡの５′末端にアミノ基（ＮＨ₂）を導入し、このアミノ基が末端に導入されたＤＮＡプローブを表面処理がなされたメンブレンフィルタ１にスポットする。メンブレンフィルタの表面のカルボキシル基あるいはアルデヒド基とＤＮＡプローブの末端のアミノ基間に共有結合が形成されることによって、図１(a)に示すようにＤＮＡプローブ２がメンブレンフィルタ１に固定される。

図１(a)のＤＮＡプローブ２のメンブレンフィルタ１に垂直に立っている部分はＤＮＡの配列を示し、この垂直部分から枝状に出ている部分が相補的に塩基対を形成する部分である。各領域にはそれぞれ異なる配列のＤＮＡプローブがスポットされるが、ＤＮＡプローブは担体上の全ての領域において、ほぼ同じ長さのＤＮＡに調製される。なお、図１では、説明を簡単にするため、１つの領域（スポット）に１つのＤＮＡプローブが固定されているが、領域に固定されるＤＮＡプローブはこのように、１つであっても複数であってもよい。また、ＤＮＡプローブは、合成したオリゴＤＮＡであってもよいし、細胞から単離したｃＤＮＡであっても差し支えない。

次にターゲットとなる標識ＤＮＡを準備する。標識ＤＮＡのＤＮＡは細胞や組織から抽出精製されたTotal ＲＮＡやPoly-A⁺ＲＮＡ等を逆転写酵素を用いて逆転写しｃＤＮＡを調整するが、この逆転写酵素による逆転写反応時に標識物質を取り込ませることで標識ＤＮＡを調整することができる。なお、逆転写時にビオチンやＤＮＰ（Dinitrophenyl）を取り込ませて、抗体反応、酵素反応を仲介することでシグナルを増幅するように調製してもよい。

標識物質は、ｃＤＮＡに取り込まれる規則性があらかじめわかっているものであればよく、標識物質としては、Ｃｙ３、Ｃｙ５、フルオレセインイソチオシアネートなどの蛍光色素、^３２Ｐ、^３３Ｐなどの放射性同位体、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、ビオチン、ジゴキシゲニンなどの化学発光用の標識物質を好ましく用いることができる。

続いてメンブレンフィルタ１に固定されたＤＮＡプローブ２と、標識ＤＮＡ３とでハイブリダイゼーション反応を行う。ハイブリダイゼーション反応は、ＤＮＡプローブ２が固定されたメンブレンフィルタ１と、標識ＤＮＡが添加された反応液をハイブリダイゼーションバッグ内に入れハイブリダイゼーションバッグに振動を加えて、標識ＤＮＡを対流あるいは拡散により移動させて結合させることによって、あるいは反応液を領域を横切るように強制的に流動させることが可能なポンプやシリンジなどを有するリアクタを用いて結合させることによって行うことができる。

なお、ハイブリダイゼーション後、ＤＮＡプローブ２とハイブリダイゼーションをしなかった標識ＤＮＡを除去するために、ハイブリダイゼーションバッグ内あるいはリアクタ内洗浄液を入れて洗浄することが好ましい。

反応後は、図１(b)に示すように標識物質４で標識されたさまざまな長さの標識ＤＮＡ３が、ＤＮＡプローブ２に相補的に水素結合により塩基対を形成している状態となる（なお、図１(b)の右端のプローブＤＮＡと標識ＤＮＡは完全には相補的結合をしていない部分を有している状態を示している）。標識ＤＮＡの長さがこのようにさまざまな長さのままで標識物質４を検出すると、後述する第１検出データと第２検出データとを比較してもシグナル強度の差がミスマッチ結合をしている領域を特定する指標とはならない。すなわち、第１検出データと第２検出データとのシグナル強度の差をミスマッチ結合をしている領域を特定する指標とするためには、プローブＤＮＡに結合している標識ＤＮＡの長さを揃える必要がある。

そこで、ＤＮＡプローブ２と二本鎖を形成していない１本鎖の標識ＤＮＡ部分をエキソヌクレアーゼVIIを用いて切り離す。エキソヌクレアーゼVIIは１本鎖のＤＮＡに末端から特異的に作用して１本鎖ポリヌクレオチドを分解することができる制限酵素である。この酵素を好ましくは５〜２０℃で作用させることによって、図１(c)に示すように、二本鎖を形成していない１本鎖の標識ＤＮＡ部分は切り離されて、ＤＮＡプローブ２と標識ＤＮＡ３が二本鎖を形成している部分が残った状態となる。

図１(c)に示す状態となったところで、標識ＤＮＡの１回目の検出を行う。検出は標識ＤＮＡを標識する標識物質によって異なり、標識物質が蛍光色素である場合には、各領域を励起光によって走査して各領域に選択的に含まれている蛍光物質を励起し、蛍光物質から放出された蛍光をＣＣＤカメラやレーザー＋ＰＭＴ等によって光電的に検出する。また、標識物質が放射性同位体である場合には、各領域に選択的に含まれている放射性標識物質によって蓄積性蛍光体シートの蓄積性蛍光体層を露光し、露光された蓄積性蛍光体層を励起光によって走査して、蓄積性蛍光体層に含まれている蓄積性蛍光体を励起し、蓄積性蛍光体から放出された光を光電的に検出する。さらに、標識物質が酵素のような化学発光標識物質である場合には、各領域に選択的に含まれている化学発光標識物質を化学発光基質と接触させ、化学発光標識物質から放出される化学発光を光電的に検出する。このようにして各領域からそれぞれ得られた検出データを第１検出データとする。

次に、図１(d)の一番右端に示す標識ＤＮＡのように、ＤＮＡプローブと完全に塩基対を形成してないにもかかわらずＤＮＡプローブと結合しているものをＳ１ヌクレアーゼを用いて分解する。Ｓ１ヌクレアーゼは糸状菌（Aspergillus oryzae）から精製されるヌクレアーゼの一つであり、単鎖のＲＮＡまたはＤＮＡを５′−モノヌクレオチドに分解する制限酵素である。この酵素を作用すると、塩基対を形成していない１本鎖の部分を分解することができる。この酵素を好ましくは５〜１５℃で作用させることによって、図１(d)の一番右端に示すミスマッチ結合をしているものは、図１(e)に示すように、塩基対を形成していない１本鎖の部分が分解された状態となる。

図１(e)に示す状態となったところで、第１検出データを得た方法と同様の方法で標識ＤＮＡの検出を行う。ここで各領域からそれぞれ得られた検出データを第２検出データとする。

ミスマッチ結合をしている標識ＤＮＡが結合していた領域では、Ｓ１ヌクレアーゼが作用して塩基対を形成していない１本鎖の部分が分解されているため、この領域から得られる第２検出データは、第１検出データに比べて標識物質からのシグナル強度は大きく低下する。これによって、ミスマッチ結合をしていた標識ＤＮＡが存在していた領域を特定、検出することができる。

以上のように、ＤＮＡプローブに標識ＤＮＡをハイブリダイズさせた後、ＤＮＡプローブと二本鎖を形成していない１本鎖部分の標識ＤＮＡをエキソヌクレアーゼVIIを作用させて二本鎖から切り離し、その後、標識ＤＮＡの標識物質からの信号を領域毎に検出して第１検出データを得、第１検出データを得た後、ＤＮＡプローブと標識ＤＮＡがミスマッチしている部分を切断するＳ１ヌクレアーゼを作用させてＤＮＡプローブと標識ＤＮＡがミスマッチしている部分を切り離し、その後、標識ＤＮＡの標識物質からの信号を領域毎に検出して第２検出データを得、得られた第１検出データと第２検出データとを比較すればミスマッチＤＮＡが結合していた領域を特定、検出することができるので、例えばデータ解析の際にこのミスマッチをしている領域から得られるデータを除外して解析を行うことが可能となり、ミスマッチ結合によるバックグラウンドのノイズの軽減を図ることが可能となり、検出精度を向上させることができる。

また、第１検出データから第２検出データで大きく低下したものは、Ｓ１ヌクレアーゼが作用した塩基対を形成していない１本鎖の部分が存在していた領域であることがわかるので、この特定された領域のＤＮＡプローブについてさらに解析を進めることによってＳＮＰ等を見つけやすくなり、さらに固定するＤＮＡプローブの選択によっては、特定の遺伝子欠失の発見も可能となる。

なお、ここではオリゴヌクレオチドプローブとしてＤＮＡプローブを標識ポリヌクレオチドとして標識ＤＮＡを用いた場合を例にとって説明したが、これに限定されるものではなく、例えばＲＮＡや核酸の前駆体や補酵素などにも用いることができる。

本発明のミスマッチ領域検出方法の流れを示す概略図

符号の説明

１メンブレンフィルタ
２ＤＮＡプローブ
３標識ＤＮＡ
４標識物質

Claims

担体上の複数の領域に固定されたオリゴヌクレオチドプローブに標識物質で標識されたポリヌクレオチドをハイブリダイズさせた後、前記オリゴヌクレオチドプローブと二本鎖を形成していない１本鎖部分の標識ポリヌクレオチドを、１本鎖のＤＮＡに末端から特異的に作用して１本鎖ポリヌクレオチドを分解することができる第１の制限酵素を作用させて、前記オリゴヌクレオチドプローブと前記標識ポリヌクレオチドとで形成された二本鎖から切り離し、その後、標識ポリヌクレオチドの標識物質からの信号を前記領域毎に検出して第１検出データを得、該第１検出データを得た後、単鎖のＲＮＡまたはＤＮＡを５′−モノヌクレオチドに分解することができる第２の制限酵素を作用させて前記オリゴヌクレオチドプローブと前記標識ポリヌクレオチドがミスマッチしている部分を切り離し、その後、標識ポリヌクレオチドの標識物質からの信号を前記領域毎に検出して第２検出データを得、前記第１検出データと前記第２検出データとを比較してミスマッチポリヌクレオチドが結合していた領域を特定することを特徴とするミスマッチ領域検出方法。
前記第１の制限酵素がエキソヌクレアーゼVIIであることを特徴とする請求項１記載のミスマッチ領域検出方法。
前記第２の制限酵素がＳ１ヌクレアーゼおよび／またはMung Bean ヌクレアーゼであることを特徴とする請求項１または２記載のミスマッチ領域検出方法。