WO2018025938A1 - ハイブリダイゼーション用バッファー組成物及びハイブリダイゼーション方法 - Google Patents

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WO2018025938A1
WO2018025938A1 PCT/JP2017/028141 JP2017028141W WO2018025938A1 WO 2018025938 A1 WO2018025938 A1 WO 2018025938A1 JP 2017028141 W JP2017028141 W JP 2017028141W WO 2018025938 A1 WO2018025938 A1 WO 2018025938A1
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nucleic acid
target nucleic
target
hybridization
base
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PCT/JP2017/028141
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稔也 津田
亀井　修一
大場　光芳
山野　博文
亮一 恒富
彰一 硲
浩昭 永野
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東洋鋼鈑株式会社
国立大学法人山口大学
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6832—Enhancement of hybridisation reaction
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology

Definitions

  • the present invention relates to a hybridization buffer composition containing a blocking nucleic acid having a base sequence complementary to at least a region containing a non-detection target base in a non-target nucleic acid containing a non-detection target base, and hybridization using the same Regarding the method.
  • nucleic acid probe In order to accurately detect a nucleic acid molecule to be measured by hybridization with a nucleic acid probe, it is important that the nucleic acid probe accurately recognizes the nucleic acid molecule. Therefore, conventionally, when performing hybridization, a method of appropriately adjusting the salt concentration or reaction temperature of the reaction solution, or a blocking agent that suppresses non-specific hybridization between the nucleic acid probe and a nucleic acid molecule other than the measurement target is used. The method is used.
  • a blocking agent for example, a nucleic acid component that does not have a complementary base sequence to a nucleic acid molecule or nucleic acid probe to be measured such as salmon sperm DNA or yeast tRNA, SDS (sodium dodecyl sulfate), N lauroyl sarcosine (N -LS) and other surfactants, and proteins such as bovine serum albumin (BSA) and casein are known.
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • N -LS N lauroyl sarcosine
  • BSA bovine serum albumin
  • Patent Document 1 uses a blocker probe that hybridizes specifically to a specific sequence in a nucleic acid molecule to be measured and specifically hybridizes to a capture sequence probe containing a nucleic acid sequence captured on a solid phase. A method is disclosed. In the method described in Patent Document 1, after the capture sequence probe is hybridized to the nucleic acid molecule to be measured, a blocker probe is added to the reaction solution, so that the non-hybridized capture sequence probe is attached to the nucleic acid molecule to be measured. Hybridization to existing cross-reactive nucleic acid sequences can be prevented, and thus detection specificity can be improved.
  • Patent Document 2 discloses that an oligonucleotide containing a modified nucleotide such as a locked nucleic acid (LNA) is used as a blocking agent when a nucleic acid molecule to be measured is detected using a microarray.
  • LNA locked nucleic acid
  • Patent Document 3 a 5 ′ terminal block nucleic acid that hybridizes to the 5 ′ end side of the detection target base in the nucleic acid molecule to be measured, and a 3 ′ hybrid that hybridizes to the 3 ′ end side of the detection target base.
  • a method for detecting a nucleic acid molecule to be measured with a nucleic acid probe using a terminal block nucleic acid is disclosed.
  • the base sequence specificity in the hybridization between the probe nucleic acid and the target nucleic acid is high, and it is necessary to detect the difference of only one base in the base sequence with high accuracy, or the specific base It is said that the efficiency and specificity of detection and separation of nucleic acids having sequences can be improved.
  • Patent Document 4 when a sample includes a target nucleic acid containing a detection target base and a non-target nucleic acid containing a non-detection target base corresponding to the detection target base, the sample is complementary to the non-target nucleic acid. It discloses that by using a blocking nucleic acid containing a base sequence, the detection efficiency of the target nucleic acid based on the specific hybridization between the target nucleic acid and the probe nucleic acid can be greatly improved. In particular, in Patent Document 4, it is preferable that the blocking nucleic acid has a length of 60% or more with respect to the base length of the nucleic acid probe.
  • the present invention achieves further excellent detection efficiency of the target nucleic acid when the blocking nucleic acid is used to prevent non-specific hybridization between the non-target nucleic acid and the nucleic acid probe. It is aimed.
  • the present inventors have succeeded in finding the concentration of a blocking nucleic acid capable of effectively suppressing nonspecific hybridization between a nucleic acid probe and a non-target nucleic acid.
  • the invention has been completed.
  • the present invention includes the following.
  • a buffer composition used for hybridization between a target nucleic acid containing a base to be detected and a nucleic acid probe containing a base sequence complementary to a region containing at least the base to be detected in the target nucleic acid Complementary to a nucleic acid concentration of a nucleic acid mixture comprising a target nucleic acid and a non-target nucleic acid containing a non-detection target base corresponding to the detection target base, to a region containing at least the non-detection target base in the non-target nucleic acid
  • a hybridization buffer composition comprising a blocking nucleic acid containing a base sequence at a concentration of 1 or more.
  • (3) A hybridization method of a target nucleic acid containing a detection target base and a nucleic acid probe containing a base sequence complementary to at least a region containing the detection base in the target nucleic acid, the target nucleic acid and the detection A blocking nucleic acid comprising a solution containing a nucleic acid mixture comprising a non-target nucleic acid containing a non-detection target base corresponding to the target base, and a base sequence complementary to a region containing at least the non-detection base in the non-target nucleic acid
  • a hybridization method comprising mixing a hybridization buffer composition contained as a concentration of 1 or more times the nucleic acid concentration of a nucleic acid mixture, and then performing hybridization between the nucleic acid probe and the target nucleic acid.
  • the hybridization buffer composition comprises a blocking nucleic acid at a concentration of 1 to 5 times the nucleic acid concentration of the nucleic acid mixture.
  • the solution containing the nucleic acid mixture contains a target nucleic acid at a concentration of 0.66 nM or more.
  • the solution containing the nucleic acid mixture contains the target nucleic acid at 0.5 to 10% when the total of the target nucleic acid and the non-target nucleic acid is 100%.
  • the solution containing the nucleic acid mixture contains the target nucleic acid at 0.5 to 10% when the total of the target nucleic acid and the non-target nucleic acid is 100%, and the target nucleic acid has a concentration of 0.66 nM or more.
  • the hybridization method according to (3) (8) A mixed solution obtained by mixing the hybridization buffer composition and a solution containing the nucleic acid mixture is brought into contact with a microarray in which the nucleic acid probe is immobilized on a substrate (3). The hybridization method described.
  • the solution containing the nucleic acid mixture is a reaction solution after a nucleic acid amplification reaction for amplifying the target nucleic acid, and the reaction solution and the hybridization buffer composition are mixed ( 3)
  • the hybridization method according to the above includes the contents described in the specification and / or drawings of Japanese Patent Application No. 2016-153058, which is the basis of the priority of the present application.
  • the hybridization buffer composition and the hybridization method of the present invention nonspecific hybridization between a nucleic acid molecule other than the target nucleic acid containing the base to be detected and the probe nucleic acid can be suppressed. Therefore, by applying the hybridization buffer composition and the hybridization method according to the present invention, the detection efficiency of the target nucleic acid based on the specific hybridization of the target nucleic acid and the probe nucleic acid can be greatly improved.
  • Example 1 the fluorescence when hybridizing only the wild type oligo DNA from the fluorescence intensity ratio of the mutant type probe when the nucleic acid mixture of the mutant type oligo DNA and the wild type oligo DNA was hybridized to the DNA chip. It is a characteristic view which shows the difference of fluorescence intensity ratio which deducted intensity ratio.
  • Example 1 the fluorescence when hybridizing only the wild type oligo DNA from the fluorescence intensity ratio of the mutant type probe when the nucleic acid mixture of the mutant type oligo DNA and the wild type oligo DNA was hybridized to the DNA chip. It is a characteristic view which shows the difference of fluorescence intensity ratio which deducted intensity ratio.
  • Example 2 the fluorescence when hybridizing only the wild type oligo DNA from the fluorescence intensity ratio of the mutant type probe when the nucleic acid mixture of the mutant type oligo DNA and the wild type oligo DNA was hybridized to the DNA chip. It is a characteristic view which shows the difference of fluorescence intensity ratio which deducted intensity ratio.
  • Example 2 the fluorescence when hybridizing only the wild type oligo DNA from the fluorescence intensity ratio of the mutant type probe when the nucleic acid mixture of the mutant type oligo DNA and the wild type oligo DNA was hybridized to the DNA chip. It is a characteristic view which shows the difference of fluorescence intensity ratio which deducted intensity ratio.
  • Example 3 the fluorescence when hybridizing only the wild type oligo DNA from the fluorescence intensity ratio of the mutant type probe when the nucleic acid mixture of the mutant type oligo DNA and the wild type oligo DNA was hybridized to the DNA chip. It is a characteristic view which shows the difference of fluorescence intensity ratio which deducted intensity ratio.
  • Example 3 the fluorescence when hybridizing only the wild type oligo DNA from the fluorescence intensity ratio of the mutant type probe when the nucleic acid mixture of the mutant type oligo DNA and the wild type oligo DNA was hybridized to the DNA chip. It is a characteristic view which shows the difference of fluorescence intensity ratio which deducted intensity ratio.
  • Example 3 the fluorescence when hybridizing only the wild type oligo DNA from the fluorescence intensity ratio of the mutant type probe when the nucleic acid mixture of the mutant type oligo DNA and the wild type oligo DNA was hybridized to the DNA chip. It is a characteristic view which shows the difference of fluorescence intensity ratio which deducted intensity ratio.
  • the hybridization buffer composition according to the present invention is used for hybridization between a target nucleic acid containing a base to be detected and a nucleic acid probe containing a base sequence complementary to a region containing at least the base to be detected in the target nucleic acid. Buffer composition.
  • the hybridization buffer composition according to the present invention includes a blocking nucleic acid having a function of suppressing nonspecific hybridization to a nucleic acid probe.
  • the target nucleic acid means a nucleic acid molecule containing a detection target base, that is, a nucleic acid fragment.
  • the target nucleic acid may be a nucleic acid molecule composed of DNA, a nucleic acid molecule composed of RNA, or a nucleic acid molecule (DNA-RNA complex) containing DNA and RNA.
  • the nucleic acid is meant to include adenine, cytosine, guanine, thymine and uracil, and artificial nucleic acids such as peptide nucleic acid (PNA) and locked nucleic acid (LNA).
  • PNA peptide nucleic acid
  • LNA locked nucleic acid
  • the detection target base means, for example, one or a plurality of nucleic acid residues at a predetermined position of the chromosome, and is not particularly limited, but means a kind of a specific base in a base sequence such as a single nucleotide polymorphism (SNP). is doing.
  • SNP single nucleotide polymorphism
  • a predetermined single nucleotide polymorphism can take A (adenine) or C (cytosine)
  • any one of the bases, that is, A (adenine) in the single nucleotide polymorphism can be set as a detection target base.
  • the detection target base may be either a major allele or a minor allele in a gene polymorphism, or may not be a risk allele.
  • the target nucleic acid containing the detection target base can be adjusted by amplifying a predetermined region containing the detection target base by a nucleic acid amplification method.
  • the target nucleic acid may be cDNA obtained by reverse transcription reaction from a transcript obtained from collection of an individual organism, tissue or cell.
  • the base length of the target nucleic acid is not particularly limited, but may be, for example, 60 to 1000 bases, preferably 60 to 500 bases, and more preferably 60 to 200 bases.
  • a nucleic acid molecule (nucleic acid fragment) containing a non-detection target base corresponding to the detection target base is referred to as a non-target nucleic acid.
  • a base other than the detection target base is set as a non-detection target base.
  • the single nucleotide polymorphism at a predetermined position can be A (adenine) or C (cytosine)
  • a (adenine) in the single nucleotide polymorphism is the detection target base
  • the single nucleotide polymorphism C (cytosine) in is a non-detection target base.
  • the non-target nucleic acid containing the non-detection target base is simultaneously acquired when obtaining the target nucleic acid containing the detection target base as described above when the non-detection target base is present on the chromosome.
  • a target nucleic acid is obtained by a nucleic acid amplification reaction such as a polymerase chain reaction, if one allele is a non-detection target base, the non-target nucleic acid is amplified together with the target nucleic acid.
  • a mixture composed of a target nucleic acid and a non-target nucleic acid is referred to as a nucleic acid mixture.
  • a target nucleic acid containing a detection target base is obtained by a nucleic acid amplification reaction such as a polymerase chain reaction
  • the amplified target nucleic acid and the non-target nucleic acid are collectively referred to as a nucleic acid mixture.
  • a nucleic acid probe having a base sequence complementary to at least the region containing the detection target base in the target nucleic acid is used.
  • the nucleic acid probe is not particularly limited, but can be, for example, 10 to 30 bases long, and preferably 15 to 25 bases long.
  • the base complementary to the detection target base is a position that becomes the center of the character string when the base constituting the nucleic acid probe is viewed as the character string.
  • the center of the character string means that the nucleic acid probe consisting of an even number of bases includes a case where the nucleic acid probe is shifted by one in the 5 ′ end or 3 ′ end direction.
  • the blocking nucleic acid has a base sequence complementary to a region containing a non-detection target base in the non-target nucleic acid. Therefore, the blocking nucleic acid can hybridize with the non-target nucleic acid under conditions that allow the target nucleic acid and the nucleic acid probe to hybridize.
  • the concentration of the blocking nucleic acid is 1 or more times higher than the nucleic acid concentration of the nucleic acid mixture described above.
  • the concentration becomes one or more times the concentration of the nucleic acid mixture consisting of the amplified target nucleic acid and non-target nucleic acid. Adjust the amount of blocking nucleic acid in this way.
  • the concentration of the blocking nucleic acid within the above range, non-specific hybridization between the non-target nucleic acid and the nucleic acid probe can be more effectively suppressed, and specific hybridization between the target nucleic acid and the nucleic acid probe is prevented. It can be detected with high sensitivity.
  • the upper limit of the concentration range of the blocking nucleic acid is not particularly limited, but is preferably, for example, 5 times or less the concentration of the nucleic acid mixture. That is, in the hybridization buffer composition according to the present invention, the concentration range of the blocking nucleic acid is preferably 1 to 5 times the nucleic acid concentration of the nucleic acid mixture.
  • the nucleic acid concentration of the nucleic acid mixture can be measured according to a conventional method. For example, after purifying the reaction solution after the nucleic acid amplification reaction, the absorbance at a wavelength of 260 nm is measured using a spectrophotometer, and the measured value is converted into the nucleic acid concentration. Thereby, the nucleic acid concentration of the nucleic acid mixture obtained by the nucleic acid amplification reaction can be measured. Further, the nucleic acid concentration of the nucleic acid mixture can be measured by intercalating the amplification product with a fluorescent dye such as SYBR Gold, Pico Green, etc., and measuring the absorbance near 600 nm.
  • a fluorescent dye such as SYBR Gold, Pico Green, etc.
  • the nucleic acid concentration of the nucleic acid mixture can be measured by detecting the electrophoresis band of the amplification product by electrophoresis and comparing it with the electrophoresis band relating to nucleic acids of known concentration.
  • the blocking nucleic acid is not particularly limited, but the difference between the Tm value when the target nucleic acid and the blocking nucleic acid are hybridized and the Tm value when the non-target nucleic acid and the blocking nucleic acid are hybridized ( [Delta] Tm) is preferably designed to be 3 [deg.] C. or higher, preferably 5.5 [deg.] C. or higher.
  • Tm value regarding a nucleic acid fragment can be calculated by the calculation method by the nearest base pair model, for example.
  • the blocking nucleic acid preferentially hybridizes with the non-target nucleic acid, and non-specific hybridization between the non-target nucleic acid and the nucleic acid probe is further improved. It can be effectively suppressed, and specific hybridization between the target nucleic acid and the nucleic acid probe can be detected with high sensitivity.
  • the blocking nucleic acid is not particularly limited as described in International Publication No. 2015/045741, but it is preferably 60% or more of the base length of the nucleic acid probe.
  • the blocking nucleic acid is preferably shorter than the base length of the nucleic acid probe. For example, if the length of the nucleic acid probe is 25 bases, the blocking nucleic acid preferably has a base length of 15 to 24 bases.
  • the base complementary to the non-detection target base is preferably located at the center of the character string when the base constituting the blocking nucleic acid is viewed as the character string.
  • the center of the character string means that the blocking nucleic acid consisting of an even number of bases is shifted by one in the 5′-end or 3′-end direction.
  • the blocking nucleic acid may contain a mismatched base (non-complementary base) at a position corresponding to a base other than the non-detection target base contained in the non-target nucleic acid.
  • the number of mismatched bases can be 1 to 3, and preferably 1 to 2.
  • the number of mismatched bases can be 1 to 3, and preferably 1 to 2.
  • the hybridization buffer composition according to the present invention contains a blocking nucleic acid in a predetermined concentration range, nonspecific hybridization between a non-target nucleic acid and a nucleic acid probe can be suppressed, Inhibition of specific hybridization between the target nucleic acid and the nucleic acid probe can be prevented. Therefore, by using the hybridization buffer composition according to the present invention, for example, even when the target nucleic acid has a low concentration, the target nucleic acid can be detected with high accuracy using a nucleic acid probe. it can.
  • the target nucleic acid can be obtained using a nucleic acid probe. Can be detected with high accuracy.
  • the hybridization buffer composition according to the present invention is preferably used for a nucleic acid mixture containing a target nucleic acid at a concentration of 0.66 nM or more.
  • concentration of the target nucleic acid is within the above range, non-specific hybridization between the non-target nucleic acid and the nucleic acid probe can be more effectively suppressed, and the specific hybridization between the target nucleic acid and the nucleic acid probe is highly sensitive. Can be detected.
  • the hybridization buffer composition according to the present invention is preferably used for a nucleic acid mixture containing 50% of target nucleic acid (50% of non-target nucleic acid), and 10% of target nucleic acid (non-target nucleic acid). More preferably, it is used for a nucleic acid mixture containing 90% of the target nucleic acid, and a nucleic acid mixture containing 0.5% of the target nucleic acid (99.5% of the non-target nucleic acid). More preferably, it is used.
  • the ratio of the target nucleic acid in the nucleic acid mixture is within the above range, non-specific hybridization between the non-target nucleic acid and the nucleic acid probe can be more effectively suppressed, and the specific hybridization between the target nucleic acid and the nucleic acid probe can be suppressed. Soybean can be detected with high sensitivity.
  • the hybridization buffer composition according to the present invention is a nucleic acid mixture containing a target nucleic acid at a concentration of 3.3 nM or higher, preferably 0.66 nM or higher, and a target nucleic acid of 10 % Or less (90% or more of non-target nucleic acid) is preferably used for a mixture of nucleic acids, and 0.5% or more (non-target nucleic acid is less than 99.5%) of target nucleic acid More preferably, it is used for a mixed nucleic acid mixture.
  • the concentration and ratio of the target nucleic acid in the nucleic acid mixture are within the above range, non-specific hybridization between the non-target nucleic acid and the nucleic acid probe can be more effectively suppressed, and the specificity between the target nucleic acid and the nucleic acid probe can be reduced. Can be detected with high sensitivity.
  • the upper limit of the ratio of the target nucleic acid contained in the nucleic acid mixture is not particularly limited, but is preferably 50% or less, for example, when the total of the target nucleic acid and the non-target nucleic acid is 100%, preferably 10% or less. It is more preferable that When the ratio of the target nucleic acid in the nucleic acid mixture exceeds the above range, there is a possibility that the target nucleic acid cannot be detected even when the blocking nucleic acid is added, or the target nucleic acid can be detected without adding the blocking nucleic acid.
  • the hybridization buffer composition according to the present invention can be used in any system as long as it includes hybridization that means complementary binding between nucleic acid molecules. That is, the hybridization buffer composition according to the present invention can be used for Southern hybridization, Northern hybridization, and in situ hybridization.
  • the hybridization buffer composition according to the present invention includes a nucleic acid probe immobilized on a carrier (including a substrate, hollow fibers, and fine particles), and detects the target nucleic acid using the immobilized nucleic acid probe (including qualitative and quantitative). ) Is preferably used in the system. More specifically, the hybridization buffer composition according to the present invention is most preferably used when a target nucleic acid is detected using a DNA microarray (DNA chip) in which a nucleic acid probe is immobilized on a substrate.
  • DNA chip DNA microarray
  • hybridization buffer composition according to the present invention is used to detect a target nucleic acid using a DNA microarray (DNA chip) will be described.
  • the embodiments of the hybridization buffer composition according to the present invention are not limited to the following examples.
  • the 12th codon (codon 12) in K-ras is set as the target nucleic acid to be measured including the wild-type GGTGGC sequence.
  • the 117th codon (codon 117) is a target nucleic acid to be measured containing a wild-type AAA sequence. Therefore, a nucleic acid containing a sequence in which codon 12 and / or codon 117 is mutated is a non-target nucleic acid.
  • codon 12 see p. G12S (c.34G> A), p. G12C (c. 34G> T), p.
  • G12R (c.34G> C), p. G12D (c.35G> A), p. G12V (c.35G> T) and p.
  • the G12A (c.35G> C) mutation is known.
  • codon 117 see p. K117N (c.351A> C) and p.
  • the K117N (c.351A> T) mutation is known.
  • blocking nucleic acids may be prepared for all non-target nucleic acids, or blocking nucleic acids may be prepared for some non-target nucleic acids.
  • the nucleic acid probe and the blocking nucleic acid are more preferably single-stranded DNA.
  • the nucleic acid probe and the blocking nucleic acid can be obtained, for example, by chemically synthesizing with a nucleic acid synthesizer.
  • a nucleic acid synthesizer an apparatus called a DNA synthesizer, a fully automatic nucleic acid synthesizer, an automatic nucleic acid synthesizer or the like can be used.
  • the nucleic acid probe is preferably used in the form of a microarray by modifying a linker at its 5 ′ end and immobilizing it on a carrier.
  • the linker may or may not be composed of a specific single base, but it is preferably composed of a base sequence that does not participate in hybridization between the target nucleic acid and the nucleic acid probe.
  • the material for the carrier those known in the art can be used and are not particularly limited.
  • noble metals such as platinum, platinum black, gold, palladium, rhodium, silver, mercury, tungsten and their compounds, and conductor materials such as graphite and carbon typified by carbon fiber
  • the carrier preferably has a carbon layer such as diamond-like carbon (DLC) on the surface and chemical modification groups such as amino group, carboxyl group, epoxy group, formyl group, hydroxyl group and active ester group.
  • DLC diamond-like carbon
  • a carrier is used.
  • Carriers having a carbon layer and a chemical modification group on the surface include those having a carbon layer and a chemical modification group on the surface of the substrate, and those having a chemical modification group on the surface of the substrate made of the carbon layer.
  • the material for the substrate those known in the art can be used, and there is no particular limitation, and the same materials as those mentioned above as the carrier material can be used.
  • the target nucleic acid in the subject can be detected using the thus prepared DNA microarray.
  • the subject is usually a human and can include patients suffering from colorectal cancer, including colon cancer and rectal cancer, head and neck cancer, or non-small cell lung cancer.
  • a healthy person who does not suffer from these cancers may be the subject.
  • the subject can be a patient suffering from EGFR-positive advanced / recurrent colorectal cancer.
  • the sample derived from the subject is not particularly limited. For example, blood-related samples (blood, serum, plasma, etc.), lymph fluid, feces, cancer cells, tissue or organ crushed materials and extracts can be mentioned.
  • DNA is extracted from a sample collected from the subject.
  • the extraction means is not particularly limited.
  • a DNA extraction method using phenol / chloroform, ethanol, sodium hydroxide, CTAB or the like can be used.
  • an amplification reaction is performed using the obtained DNA as a template to amplify a nucleic acid encoding the K-RAS gene, preferably DNA.
  • amplification reaction polymerase chain reaction (PCR), LAMP (Loop-MediatedMediIsothermal Amplification), ICAN (Isothermal and Chimerichiprimer-initiated Amplification of Nucleic acids) method or the like can be applied.
  • PCR polymerase chain reaction
  • LAMP Loop-MediatedMediIsothermal Amplification
  • ICAN Isothermal and Chimerichiprimer-initiated Amplification of Nucleic acids
  • the method for labeling the amplified nucleic acid is not particularly limited.
  • a method in which a primer used in the amplification reaction is labeled in advance may be used, or a labeled nucleotide is used as a substrate in the amplification reaction. You may use the method to do.
  • the labeling substance is not particularly limited, and radioisotopes, fluorescent dyes, or organic compounds such as digoxigenin (DIG) and biotin can be used.
  • this reaction system consists of buffers necessary for nucleic acid amplification and labeling, heat-resistant DNA polymerase, primers specific to the K-RAS gene, labeled nucleotide triphosphates (specifically, nucleotide triphosphates added with a fluorescent label or the like). Acid), nucleotide triphosphate, magnesium chloride and the like.
  • the primer used in the amplification reaction is not particularly limited as long as it can specifically amplify the region containing codon 12 and / or codon 117 of K-ras, and can be appropriately designed by those skilled in the art.
  • codon 12 For codon 12, Primer 1: 5′-gtgtgacatgttctaatatagtcac-3 ′ (SEQ ID NO: 17) and Primer 2: 5′-gaatggtcctgcaccagtaa-3 ′ (SEQ ID NO: 18)
  • a set of primers consisting of
  • the amplified nucleic acid obtained as described above includes target nucleic acids and non-target nucleic acids.
  • the amount of nucleic acid hybridized to the nucleic acid probe can be measured, for example, by detecting a label, by performing a hybridization reaction between the nucleic acid probe and the target nucleic acid.
  • the signal intensity from the label can be quantified by detecting the fluorescent signal using a fluorescent scanner and analyzing the detected signal with image analysis software.
  • the amplified nucleic acid hybridized with the nucleic acid probe can also be quantified, for example, by preparing a calibration curve using a sample containing a known amount of DNA.
  • hybridization reaction using the hybridization buffer composition is preferably carried out under stringent conditions.
  • Stringent conditions refer to conditions in which specific hybrids are formed and non-specific hybrids are not formed.For example, after hybridization at 50 ° C. for 16 hours, 2 ⁇ SSC / 0.2% SDS, 25 This refers to the conditions for washing at 5 ° C for 10 minutes and 2 x SSC at 25 ° C.
  • the hybridization buffer composition according to the present invention may contain a salt necessary for the hybridization reaction, such as SSC, or a known blocking agent, such as SDS.
  • the reaction solution containing the target nucleic acid and the non-target nucleic acid after the amplification reaction and the hybridization buffer composition according to the present invention are mixed in advance, and the non-target nucleic acid and the blocking nucleic acid are specifically hybridized. Then, the reaction solution may be brought into contact with the DNA microarray to allow the hybridization reaction between the target nucleic acid and the nucleic acid probe to proceed.
  • the reaction solution containing the target nucleic acid and the non-target nucleic acid after the amplification reaction and the hybridization buffer composition according to the present invention are mixed on a DNA microarray so that the non-target nucleic acid and the blocking nucleic acid are specific. Hybridization and specific hybridization between the target nucleic acid and the nucleic acid probe may proceed simultaneously.
  • the wild-type base sequence (AAA) of codon 117 in K-ras was set as the non-detection target base, and the mutant base sequences (AAC, AAT) were set as the detection bases.
  • AAA wild-type base sequence
  • AAC mutant base sequences
  • Wild type oligo DNA 1 and mutant type oligo DNAs 1 and 2 are labeled with Cyanine5 (Cy5) at the 5 ′ end, respectively.
  • the wild type oligo DNA and the mutant type oligo DNA were mixed so that the mutation type oligo DNA was 3.3 nM and the mutation rate was 0.5%, 10% or 50% to obtain a nucleic acid mixture.
  • a non-detection target base that is, a blocking nucleic acid 1 (sequence: GCAAATCACAtttATTTCCTA: SEQ ID NO: 4) complementary to the wild type base sequence (AAA) was designed.
  • the nucleic acid mixture obtained as described above was mixed with a hybridization buffer composition containing a blocking nucleic acid to prepare a hybridization reaction solution (containing 1 ⁇ SSC / 0.1% SDS).
  • the hybridization reaction solution was dropped onto the DNA chip, covered with a hybrid cover, and reacted at 45 ° C. for 1 hour in a hybridization chamber.
  • a DNA chip Gene Silicon (R) (manufactured by Toyo Kohan Co., Ltd.) was used.
  • the DNA chip includes a nucleic acid probe 1: GCAAATCACAtttATTTCCTA (SEQ ID NO: 5) for detecting wild-type oligo DNA, a nucleic acid probe 2: CAAATCACAgttATTTCCT (SEQ ID NO: 6) for detecting wild-type oligo DNA, and a mutant oligo.
  • a nucleic acid probe 3 for detecting DNA 2 is provided: GCAAATCACAattATTTCCTA (SEQ ID NO: 7).
  • Table 1 summarizes the base sequences of wild-type oligo DNA 1, mutant oligo DNAs 1 and 2, blocking nucleic acid 1 and nucleic acid probes 1 to 3.
  • Tables 2-1 to 2-3 collectively show the composition ratio, blocking nucleic acid concentration, blocking nucleic acid equivalent, etc. of the mutant oligo DNA and wild type oligo DNA contained in the nucleic acid mixture in each test section.
  • the DNA chip was washed by shaking 30 times with 1 ⁇ SSC / 0.1% SDS and 30 times with 1 ⁇ SSC. Thereafter, a cover film was put on, and the fluorescence intensity was measured by Bioshot. At this time, the exposure time of the CCD camera was changed to 2 seconds, 5 seconds, 10 seconds, and 20 seconds under the condition that the mixed nucleic acid was less than 660 nM. Under the condition that the mixed nucleic acid was 660 nM, the fluorescence intensity was obtained by changing the exposure time of the CCD camera to 1, 3, 5, and 7 seconds.
  • mutation determination [1], [2] and [3] using a DNA chip is performed as follows, and the determination results are shown in Table 3-1.
  • the results are shown in Table 3-2.
  • the notation “AB-1-1” in the column of test conditions in FIG. 1, Table 3-1 and Table 3-2 is the test condition “A-1-1” shown in Table 2-1. This is based on the results of the tests conducted in the above and the results of the tests conducted under the test condition “B-1-1” shown in Table 2-3.
  • the fluorescence intensity of the nucleic acid probe 2 or 3 is the fluorescence of the nucleic acid probe 1. Higher than the intensity (fluorescence intensity ratio> 1) and when only the wild type oligo DNA is hybridized to the nucleic acid probes 1 to 3, the fluorescence intensity of the nucleic acid probe 2 or 3 is higher than the fluorescence intensity of the nucleic acid probe 1. When it was low (fluorescence intensity ratio ⁇ 1), the mutation determination result was “ ⁇ ”.
  • the mutation determination is easy.
  • the mutation determination [2] only the wild type oligo DNA is detected from the fluorescence intensity ratio when the nucleic acid mixture of the mutant type oligo DNA and the wild type oligo DNA is hybridized to the nucleic acid probes 1 to 3.
  • the mutation determination result is “ ⁇ ”. That is, in the positive determination in the mutation determination [2], the mutation ratio of the mutant oligo DNA contained in the nucleic acid mixture of the mutant oligo DNA and the wild type oligo DNA is low, and the fluorescence intensity of the nucleic acid probe 2 or 3 is the nucleic acid probe 1. This means that even if the fluorescence intensity is lower than the fluorescence intensity, a positive determination by a DNA chip can be made by comparing with the fluorescence intensity when the mutant oligo DNA is not present.
  • the blocking nucleic acid is 0 to 1 times when the mutation rate is 50%, 0 to 3 times when the mutation rate is 10%, and the mutation rate is 0.5%. Then, positive determination was made at 1 to 3 times, and it was found that positive determination was possible even under the condition where the mutation rate was 0.5%.
  • the double difference of the intensity ratio is calculated by subtracting the difference of the fluorescence intensity ratio in the condition where the blocking nucleic acid is not added from the difference in the fluorescence intensity ratio in the condition where the blocking nucleic acid is added.
  • the mutation determination result was “ ⁇ ”. That is, in the positive determination in the mutation determination [3], the condition with the addition of the blocking nucleic acid has higher determination sensitivity than the condition without the addition of the blocking nucleic acid, and it means that adding the blocking nucleic acid is more effective for the mutation determination. To do.
  • Example 2 In this example, as in Example 1, the wild type base sequence (AAA) of codon 117 in K-ras is set as the non-detection target base, and the mutant base sequence (AAC, AAT) is set as the detection target base. The experiment was conducted in the same manner as in Example 1 except that the sample having a mutant base sequence of 0.66 nM was used.
  • Tables 4-1 to 4-3 collectively show the composition ratio, blocking nucleic acid concentration, blocking nucleic acid equivalent, etc. of the mutant oligo DNA and wild type oligo DNA contained in the nucleic acid mixture in each test section.
  • Example 2 the difference in fluorescence intensity ratio was calculated for each exposure time in the same manner as in Example 1, and the largest values are shown in Table 5-1 and Table 5-2 and FIG.
  • mutation determination using a DNA chip is performed, and mutation determination [1], [2] and [3] are performed in the same manner as in Example 1.
  • the determination result are shown in Table 5-1 and Table 5-2.
  • the notation “CD-1-1” in the column of test conditions in FIG. 2 refers to the test condition “C-1-1” shown in Table 4-1. This is based on the results of the tests conducted in the above and the results of the tests conducted under the test condition “D-1-1” shown in Table 4-3.
  • mutation determination [2] mutation can be determined with 0 to 5 times blocking nucleic acid if the mutation ratio is 50%, and mutation can be determined only when the mutation ratio is 10% and 0.5%. It became clear that.
  • mutation determination [3] mutation can be determined with a blocking nucleic acid of 0.5 to 5 times if the mutation ratio is 50%, and mutation can be determined only when the mutation ratio is 10% and 0.5%. It became clear that there was.
  • Example 3 the wild-type base sequence (GGT) of codon 12 in K-ras was set as the non-detection target base, and the mutant base sequences (GAT, GTT, GCT) were set as the detection bases.
  • an oligo DNA wild type oligo DNA 2 consisting of 26 bases centering on the wild type base sequence (GGT) of codon 12 is used, and as a mutant type specimen, the mutant base sequence of codon 12 ( Oligo DNA consisting of 24 bases (GAT, GTT, GCT) (mutant oligo DNA 3-5) was used.
  • Wild-type oligo DNA 2 and mutant-type oligo DNAs 3 to 5 are labeled with Cyanine5 (Cy5) at the 5 ′ end, respectively.
  • Cyanine5 Cyanine5
  • the wild type oligo DNA and the mutant type oligo DNA were mixed so that the mutation type oligo DNA was 0.66 nM and the mutation rate was 0.5%, 1% or 5% to obtain a nucleic acid mixture.
  • a non-detection target base that is, a blocking nucleic acid 2 (sequence: GAGCTggtGGCGTA: SEQ ID NO: 12) complementary to the wild-type base sequence (GGT) was designed.
  • the nucleic acid mixture obtained as described above was mixed with a hybridization buffer composition containing a blocking nucleic acid to prepare a hybridization reaction solution (containing 1 ⁇ SSC / 0.1% SDS).
  • the hybridization reaction solution was dropped onto the DNA chip, covered with a hybrid cover, and reacted at 45 ° C. for 1 hour in a hybridization chamber.
  • a DNA chip Gene Silicon (R) (manufactured by Toyo Kohan Co., Ltd.) was used.
  • the DNA chip includes a nucleic acid probe 4 for detecting wild-type oligo DNA 2: GAGCTggtGGCGTA (SEQ ID NO: 13), a nucleic acid probe 5 for detecting mutant oligo DNA 3: GAGCTgatGGCGTAG (SEQ ID NO: 14), and a mutant oligo.
  • a nucleic acid probe 6 for detecting DNA4 AGCTgttGGCGTAG (SEQ ID NO: 15) and a nucleic acid probe 7 for detecting mutant oligo DNA 5: GCTgctGGCGTAG (SEQ ID NO: 16) are provided.
  • Table 6 summarizes the base sequences of wild type oligo DNA 2, mutant type oligo DNAs 3 to 5, blocking nucleic acid 2 and nucleic acid probes 4 to 7.
  • Tables 7-1 to 7-4 collectively show the composition ratio, the blocking nucleic acid concentration, the blocking nucleic acid equivalent, etc. of the mutant oligo DNA and the wild type oligo DNA contained in the nucleic acid mixture in each test section.
  • Example 3 the difference in fluorescence intensity ratio was calculated for each exposure time, and the largest values are shown in Table 8-1, Table 8-2, Table 8-3, and FIG.
  • mutation determination using a DNA chip is performed, and mutation determination [1], [2] and [3] are performed in the same manner as in Example 1.
  • the determination result are shown in Tables 8-1 to 8-3.
  • the notation “EF-1-1” in the column of test conditions in FIG. 3 and Tables 8-1 to 8-3 refers to the test conditions “E-1-1” shown in Table 7-1.
  • Table 9 shows the GC ratio of the nucleic acid probe used in this example, the Tm (w) between the [wild type oligo DNA-blocking nucleic acid] calculated using the closest base method and the [mutated oligo DNA-blocking].
  • the difference ( ⁇ Tm) between Tm (w) and Tm (m) was calculated from Tm (m) between the nucleic acids].
  • the GC rate of the nucleic acid probe of codon 12 in K-ras is 57% or more, and Tm (w) between [wild type oligo DNA-blocking nucleic acid] and [mutant oligo DNA-blocking nucleic acid] ],
  • the difference ( ⁇ Tm) between Tm (w) and Tm (m) was 8 ° C. or higher, whereas the GC rate of the nucleic acid probe at codon 117 in K-ras was 32%. It can be seen that the ⁇ Tm was 6.6 ° C. or lower. From this, it can be said that the nucleic acid probe at codon 12 is designed under conditions that are more advantageous for mutation determination.
  • the blocking nucleic acid in this example is particularly effective when applied in a combination of a target and a probe, which have a GC rate of 32% or less and a ⁇ Tm of 6.6 ° C. or less, preferably 5.5 to 6.6 ° C., which is disadvantageous for mutation determination.
  • a blocking nucleic acid is added at a concentration of 1 to 3 times to a nucleic acid mixture containing a mutation type oligo DNA 0.66 to 3.3 nM and a mutation rate of 0.5 to 10%, the mutation can be determined and 1 time. Is more preferable. All publications, patents and patent applications cited herein are incorporated herein by reference in their entirety.

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Abstract

ターゲット核酸と核酸プローブとの非特異的なハイブリダイズを防止するためにブロッキング用核酸を使用する場合において、ターゲット核酸の更に優れた検出効率を達成する。ターゲット核酸と核酸プローブとのハイブリダイゼーションに使用するバッファー組成物であって、上記ターゲット核酸と非ターゲット核酸とからなる核酸混合物の核酸濃度に対して、非ターゲット核酸における少なくとも非検出対象塩基を含む領域に対して相補的な塩基配列を含むブロッキング用核酸を１倍以上の量として含有する。

Description

ハイブリダイゼーション用バッファー組成物及びハイブリダイゼーション方法
　本発明は、非検出対象塩基を含む非ターゲット核酸における少なくとも非検出対象塩基を含む領域に対して相補的な塩基配列を有するブロッキング用核酸を含むハイブリダイゼーション用バッファー組成物及びこれを用いたハイブリダイゼーション方法に関する。
　測定対象の核酸分子を核酸プローブとのハイブリダイゼーションにより正確に検出するには、核酸プローブが核酸分子を正確に認識することが重要である。よって従来、ハイブリダイゼーションを行う際は、反応液の塩濃度や反応温度を適宜調節する方法や、核酸プローブと測定対象以外の核酸分子との非特異的なハイブリダイズを抑制するブロッキング剤を使用する方法が用いられている。ブロッキング剤としては、例えば、サケ精子ＤＮＡや酵母ｔＲＮＡなどの測定対象の核酸分子や核酸プローブに対して、相補的な塩基配列を有しない核酸成分、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、Ｎラウロイルサルコシン（Ｎ－ＬＳ）などの界面活性剤、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼインなどのタンパク質が知られている。
　しかし、測定対象でない核酸分子が多くある場合、核酸成分からなるブロッキング剤ではブロッキング効果が不十分であり、また界面活性剤やタンパク質では塩基配列を正確に認識できないためブロッキング効果は弱いといった問題があった。
　また、特許文献１には、測定対象の核酸分子における固有の配列にハイブリダイズし、且つ固相上へ捕捉される核酸配列を含む捕捉配列プローブに対して特異的にハイブリダイズするブロッカープローブを使用する方法が開示されている。特許文献１に記載の方法では、捕捉配列プローブが測定対象の核酸分子にハイブリダイズした後、ブロッカープローブを反応液に添加することで、ハイブリダイズしていない捕捉配列プローブが測定対象の核酸分子に存在する交差反応性核酸配列にハイブリダイズすることを防ぎ、そのために検出の特異性を向上させることができる。
　さらに、特許文献２には、測定対象の核酸分子をマイクロアレイを用いて検出する際にブロッキング剤として、ロックド核酸（ＬＮＡ）といった改変ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを使用することが開示されている。
　さらにまた、特許文献３には、測定対象の核酸分子における検出対象塩基よりも５’末端側にハイブリダイズする５’末端側ブロック核酸、検出対象塩基よりも３’末端側にハイブリダイズする３’末端側ブロック核酸を用いて、測定対象の核酸分子を核酸プローブで検出する方法が開示されている。特許文献３によれば、プローブ核酸と標的核酸とのハイブリダイゼーションにおける塩基配列特異性が高く、塩基配列中の一塩基のみの相違を高精度に検出する必要のあるＳＮＰのタイピングや、特定の塩基配列を有する核酸の検出や分離の効率及び特異性を向上できるとされている。
　さらにまた、特許文献４には、検出対象塩基を含むターゲット核酸と、上記検出対象塩基に対応する非検出対象塩基を含む非ターゲット核酸とを試料が含む場合、非ターゲット核酸に対して相補的な塩基配列を含むブロッキング用核酸を使用することで、ターゲット核酸とプローブ核酸との特異的ハイブリダイズに基づくターゲット核酸の検出効率を大幅に向上できることを開示している。特に、特許文献４では、ブロッキング用核酸を核酸プローブの塩基長に対して６０％以上の長さとすることが好ましいとしている。
特表２００４－５１１２２０号公報 特表２００５－５０２３４６号公報 特開２０１０－２００７０１号公報 国際公開２０１５／０４５７４１号公報
　本発明は、上述のように、非ターゲット核酸と核酸プローブとの非特異的なハイブリダイズを防止するためにブロッキング用核酸を使用する場合において、ターゲット核酸の更に優れた検出効率を達成することを目的としている。
　本発明者らは、上述した目的を達成するために鋭意検討した結果、核酸プローブと非ターゲット核酸との非特異的ハイブリダイズを効果的抑制できるブロッキング用核酸の濃度を見いだすことに成功し、本発明を完成するに至った。本発明は以下を包含する。
　（１）検出対象塩基を含むターゲット核酸と、当該ターゲット核酸における少なくとも検出対象塩基を含む領域に対して相補的な塩基配列を含む核酸プローブとのハイブリダイゼーションに使用するバッファー組成物であって、上記ターゲット核酸と、上記検出対象塩基に対応する非検出対象塩基を含む非ターゲット核酸とからなる核酸混合物の核酸濃度に対して、非ターゲット核酸における少なくとも非検出対象塩基を含む領域に対して相補的な塩基配列を含むブロッキング用核酸を１倍以上の濃度として含有する、ハイブリダイゼーション用バッファー組成物。
　（２）上記ブロッキング用核酸は、上記核酸混合物の核酸濃度に対して１～５倍の濃度であることを特徴とする（１）記載のハイブリダイゼーション用バッファー組成物。
　（３）検出対象塩基を含むターゲット核酸と、当該ターゲット核酸における少なくとも検出対象塩基を含む領域に対して相補的な塩基配列を含む核酸プローブとのハイブリダイゼーション方法であって、上記ターゲット核酸と上記検出対象塩基に対応する非検出対象塩基を含む非ターゲット核酸とからなる核酸混合物を含む溶液と、非ターゲット核酸における少なくとも非検出対象塩基を含む領域に対して相補的な塩基配列を含むブロッキング用核酸を核酸混合物の核酸濃度に対して１倍以上の濃度として含有するハイブリダイゼーション用バッファー組成物とを混合し、その後、上記核酸プローブと上記ターゲット核酸とのハイブリダイズを行う、ハイブリダイゼーション方法。
　（４）上記ハイブリダイゼーション用バッファー組成物は、上記核酸混合物の核酸濃度に対して１～５倍の濃度のブロッキング用核酸を含むことを特徴とする（３）記載のハイブリダイゼーション方法。
　（５）上記核酸混合物を含む溶液は、ターゲット核酸を０．６６ｎＭ以上の濃度で含有することを特徴とする（３）記載のハイブリダイゼーション方法。
　（６）上記核酸混合物を含む溶液は、ターゲット核酸及び非ターゲット核酸の合計を１００％としたときにターゲット核酸を０．５～１０％で含有することを特徴とする（３）記載のハイブリダイゼーション方法。
　（７）上記核酸混合物を含む溶液は、ターゲット核酸及び非ターゲット核酸の合計を１００％としたときにターゲット核酸を０．５～１０％で含有し、且つ、ターゲット核酸を０．６６ｎＭ以上の濃度で含有することを特徴とする（３）記載のハイブリダイゼーション方法。
　（８）上記核酸プローブが基板上に固定されてなるマイクロアレイに、上記ハイブリダイゼーション用バッファー組成物と、上記核酸混合物を含有する溶液とを混合した混合液を接触させることを特徴とする（３）記載のハイブリダイゼーション方法。
　（９）上記核酸混合物を含有する溶液は、上記ターゲット核酸を増幅する核酸増幅反応の後の反応液であり、当該反応液と上記ハイブリダイゼーション用バッファー組成物とを混合することを特徴とする（３）記載のハイブリダイゼーション方法。
　本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2016-153058号の明細書及び/又は図面に記載される内容を包含する。
　本発明に係るハイブリダイゼーション用バッファー組成物及びハイブリダイゼーション方法によれば、検出対象塩基を含むターゲット核酸以外の核酸分子とプローブ核酸との非特異的ハイブリダイズを抑制することができる。したがって、本発明に係るハイブリダイゼーション用バッファー組成物及びハイブリダイゼーション方法を適用することにより、ターゲット核酸とプローブ核酸との特異的ハイブリダイズに基づく、ターゲット核酸の検出効率を大幅に向上させることができる。
実施例１に関して、変異型オリゴDNAと野生型オリゴDNAとの核酸混合物をＤＮＡチップにハイブリダイズさせたときの変異型プローブの蛍光強度比から、野生型オリゴDNAのみをハイブリダイズさせたときの蛍光強度比を差し引いた、蛍光強度比の差分を示す特性図である。 実施例１に関して、変異型オリゴDNAと野生型オリゴDNAとの核酸混合物をＤＮＡチップにハイブリダイズさせたときの変異型プローブの蛍光強度比から、野生型オリゴDNAのみをハイブリダイズさせたときの蛍光強度比を差し引いた、蛍光強度比の差分を示す特性図である。 実施例２に関して、変異型オリゴDNAと野生型オリゴDNAとの核酸混合物をＤＮＡチップにハイブリダイズさせたときの変異型プローブの蛍光強度比から、野生型オリゴDNAのみをハイブリダイズさせたときの蛍光強度比を差し引いた、蛍光強度比の差分を示す特性図である。 実施例２に関して、変異型オリゴDNAと野生型オリゴDNAとの核酸混合物をＤＮＡチップにハイブリダイズさせたときの変異型プローブの蛍光強度比から、野生型オリゴDNAのみをハイブリダイズさせたときの蛍光強度比を差し引いた、蛍光強度比の差分を示す特性図である。 実施例３に関して、変異型オリゴDNAと野生型オリゴDNAとの核酸混合物をＤＮＡチップにハイブリダイズさせたときの変異型プローブの蛍光強度比から、野生型オリゴDNAのみをハイブリダイズさせたときの蛍光強度比を差し引いた、蛍光強度比の差分を示す特性図である。 実施例３に関して、変異型オリゴDNAと野生型オリゴDNAとの核酸混合物をＤＮＡチップにハイブリダイズさせたときの変異型プローブの蛍光強度比から、野生型オリゴDNAのみをハイブリダイズさせたときの蛍光強度比を差し引いた、蛍光強度比の差分を示す特性図である。 実施例３に関して、変異型オリゴDNAと野生型オリゴDNAとの核酸混合物をＤＮＡチップにハイブリダイズさせたときの変異型プローブの蛍光強度比から、野生型オリゴDNAのみをハイブリダイズさせたときの蛍光強度比を差し引いた、蛍光強度比の差分を示す特性図である。
　本発明に係るハイブリダイゼーション用バッファー組成物は、検出対象塩基を含むターゲット核酸と、当該ターゲット核酸における少なくとも検出対象塩基を含む領域に対して相補的な塩基配列を含む核酸プローブとのハイブリダイゼーションに使用するバッファー組成物である。特に、本発明に係るハイブリダイゼーション用バッファー組成物には、核酸プローブに対する非特異的ハイブリダイズを抑制する機能を有するブロッキング用核酸が含まれている。
　ここで、ターゲット核酸とは、検出対象塩基を含む核酸分子、すなわち核酸断片を意味する。ターゲット核酸は、ＤＮＡからなる核酸分子でも良いし、ＲＮＡからなる核酸分子でも良いし、ＤＮＡとＲＮＡとを含む核酸分子（ＤＮＡ－ＲＮＡ複合体）でもよい。また、核酸としては、アデニン、シトシン、グアニン、チミン及びウラシル、並びに、ペプチド核酸（ＰＮＡ）及びロックド核酸（ＬＮＡ）等の人工核酸を含む意味である。
　検出対象塩基とは、例えば染色体の所定の位置における１又は複数の核酸残基を意味しており、特に限定されないが、一塩基多型（ＳＮＰ）等の塩基配列における特定の塩基の種類を意味している。例えば、所定の一塩基多型がＡ（アデニン）又はＣ（シトシン）を取りうるとして、いずれか一方の塩基、すなわち当該一塩基多型におけるＡ（アデニン）を検出対象塩基とすることができる。ここで、検出対象塩基としては、遺伝子多型におけるメジャーアレル及びマイナーアレルのいずれでも良いし、リスクアレルであってもなくても良い。
　検出対象塩基を含むターゲット核酸は、検出対象塩基を含む所定の領域を核酸増幅法により増幅することで調整することができる。また、ターゲット核酸としては、生物個体、組織及び細胞採取から採取した転写産物から逆転写反応により得られるｃＤＮＡとしても良い。ターゲット核酸の塩基長としては、特に限定されないが、例えば６０～１０００塩基とすることができ、６０～５００塩基とすることが好ましく、６０～２００塩基とすることがより好ましい。
　なお、検出対象塩基を含むターゲット核酸に対して、当該検出対象塩基に対応する非検出対象塩基を含む核酸分子（核酸断片）を非ターゲット核酸と称する。例えば、染色体における所定の位置で取りうる複数の塩基のうち、１つの塩基を検出対象塩基とした場合、検出対象塩基以外の塩基を非検出対象塩基とする。より具体的に、所定の位置における一塩基多型がＡ（アデニン）又はＣ（シトシン）を取りうる場合、当該一塩基多型におけるＡ（アデニン）を検出対象塩基とすると、当該一塩基多型におけるＣ（シトシン）が非検出対象塩基ということになる。
　非検出対象塩基を含む非ターゲット核酸は、染色体上に非検出対象塩基が存在する場合、上述のように検出対象塩基を含むターゲット核酸を取得する際に同時に取得される。例えば、ターゲット核酸をポリメラーゼ連鎖反応等の核酸増幅反応により取得する場合、一方のアレルが非検出対象塩基であれば、ターゲット核酸とともに非ターゲット核酸が増幅されることとなる。
　本明細書において、ターゲット核酸と非ターゲット核酸とからなる混合物を核酸混合物と称する。例えば、上述のように、検出対象塩基を含むターゲット核酸をポリメラーゼ連鎖反応等の核酸増幅反応により取得する場合、増幅されたターゲット核酸と非ターゲット核酸とを併せて核酸混合物と称する。
　検出対象塩基を含むターゲット核酸を検出するには、ターゲット核酸において、少なくとも検出対象塩基を含む領域に対して相補的な塩基配列を有する核酸プローブを使用する。核酸プローブは、特に限定されないが、例えば１０～３０塩基長とすることができ、１５～２５塩基長とすることが好ましい。また、検出対象塩基に相補的な塩基は、核酸プローブを構成する塩基を文字列として見たときに、当該文字列の中心となる位置とすることが好ましい。なお、文字列の中心とは、偶数個の塩基からなる核酸プローブについては５’末端又は３’末端方向に１つずれている場合を含む意味である。
　本発明に係るハイブリダイゼーション用バッファー組成物において、ブロッキング用核酸は、非ターゲット核酸における非検出対象塩基を含む領域に対して相補的な塩基配列を有する。よって、ブロッキング用核酸は、ターゲット核酸と核酸プローブとがハイブリダイズできる条件下において、非ターゲット核酸とハイブリダイズすることができる。
　特に、本発明に係るハイブリダイゼーション用バッファー組成物において、ブロッキング用核酸の濃度は、上述した核酸混合物の核酸濃度に対して１倍以上の濃度としている。例えば、検出対象塩基を含むターゲット核酸をポリメラーゼ連鎖反応等の核酸増幅反応により取得する場合、増幅されたターゲット核酸と非ターゲット核酸とからなる核酸混合物の濃度に対して、１倍以上の濃度となるようにブロッキング用核酸の量を調整する。
　ブロッキング用核酸の濃度を上記範囲とすることで、非ターゲット核酸と核酸プローブとの非特異的なハイブリダイズをより効果的に抑制することができ、ターゲット核酸と核酸プローブとの特異的ハイブリダイズを高感度に検出することができる。
　一方、本発明に係るハイブリダイゼーション用バッファー組成物において、ブロッキング用核酸の濃度範囲の上限は、特に限定されないが、例えば、核酸混合物の濃度に対して５倍以下とすることが好ましい。すなわち、本発明に係るハイブリダイゼーション用バッファー組成物において、ブロッキング用核酸の濃度範囲は、核酸混合物の核酸濃度に対して１～５倍の範囲とすることが好ましい。
　なお、核酸混合物の核酸濃度については、定法に従って測定することができる。例えば、核酸増幅反応後の反応液を精製した後、分光光度計を用いて波長２６０ｎｍの吸光度を測定し、測定値を核酸濃度に換算する。これにより核酸増幅反応により得られた核酸混合物の核酸濃度を測定することができる。また、SYBR Gold , Pico Green等の蛍光色素で増幅産物をインターカレーションし、６００ｎｍ付近の吸光を測定することで核酸混合物の核酸濃度を測定することができる。あるいは、電気泳動によって増幅産物の電気泳動バンドを検出し、既知濃度の核酸に関する電気泳動バンドと比較することで、核酸混合物の核酸濃度を測定することができる。
　また、ブロッキング用核酸としては、特に限定されないが、ターゲット核酸とブロッキング用核酸とがハイブリダイズしたときのＴｍ値と、非ターゲット核酸とブロッキング用核酸とがハイブリダイズしたときのＴｍ値との差（ΔＴｍ）が３℃以上となるように、好ましくは５．５℃以上となるように設計することが好ましい。なお、核酸断片に関するＴｍ値は例えば最近接塩基対モデルによる計算法により算出することができる。以上のように、ブロッキング用核酸の塩基配列を設計することで、ブロッキング用核酸が非ターゲット核酸と優先的にハイブリダイズすることとなり、非ターゲット核酸と核酸プローブとの非特異的なハイブリダイズをより効果的に抑制することができ、ターゲット核酸と核酸プローブとの特異的ハイブリダイズを高感度に検出することができる。
　さらに、ブロッキング用核酸としては、国際公開２０１５／０４５７４１号公報に記載されるように、特に限定されないが、核酸プローブの塩基長に対して６０％以上の長さであることが好ましい。また、ブロッキング用核酸は、核酸プローブの塩基長よりも短い長さであることが好ましい。例えば核酸プローブの長さが２５塩基長とすると、ブロッキング用核酸の塩基長は１５～２４塩基長であることが好ましい。
　また、ブロッキング用核酸において、非検出対象塩基に相補的な塩基は、ブロッキング用核酸を構成する塩基を文字列として見たときに、当該文字列の中心となる位置とすることが好ましい。なお、文字列の中心とは、偶数個の塩基からなるブロッキング用核酸については５’末端又は３’末端方向に１つずれている場合を含む意味である。
　さらに、ブロッキング用核酸は、非ターゲット核酸に含まれる非検出対象塩基以外の塩基に対応する位置にミスマッチな塩基（相補的でない塩基）を含んでいても良い。ブロッキング用核酸が１５塩基長である場合、ミスマッチな塩基は１～３個とすることができ、１～２個であることが好ましい。また、ブロッキング用核酸が２４塩基長である場合、ミスマッチな塩基は１～３個とすることができ、１～２個であることが好ましい。
　以上のように、本発明に係るハイブリダイゼーション用バッファー組成物は、所定の濃度範囲のブロッキング用核酸を含むため、非ターゲット核酸と核酸プローブとの非特異的なハイブリダイズを抑制することができ、ターゲット核酸と核酸プローブとの特異的なハイブリダイズが阻害されることを防止できる。このため、本発明に係るハイブリダイゼーション用バッファー組成物を使用することによって、例えばターゲット核酸が低濃度であるような場合であっても、核酸プローブを用いてターゲット核酸を高精度に検出することができる。また、本発明に係るハイブリダイゼーション用バッファー組成物を使用することによって、例えば、ターゲット核酸に対して一塩基のみが相違する非ターゲット核酸が存在する場合であっても、核酸プローブを用いてターゲット核酸を高精度に検出することができる。
　特に、本発明に係るハイブリダイゼーション用バッファー組成物は、ターゲット核酸が０．６６ｎＭ以上の濃度で含まれている核酸混合物に利用することが好ましい。ターゲット核酸の濃度が上記範囲にある場合、非ターゲット核酸と核酸プローブとの非特異的なハイブリダイズをより効果的に抑制することができ、ターゲット核酸と核酸プローブとの特異的ハイブリダイズを高感度に検出することができる。
　また、本発明に係るハイブリダイゼーション用バッファー組成物は、ターゲット核酸が５０％（非ターゲット核酸が５０％）の割合で含まれている核酸混合物に利用することが好ましく、ターゲット核酸が１０％（非ターゲット核酸が９０％）の割合で含まれている核酸混合物に利用することがより好ましく、ターゲット核酸が０．５％（非ターゲット核酸が９９．５％）の割合で含まれている核酸混合物に利用することが更に好ましい。核酸混合物中のターゲット核酸の割合が上記範囲にある場合、非ターゲット核酸と核酸プローブとの非特異的なハイブリダイズをより効果的に抑制することができ、ターゲット核酸と核酸プローブとの特異的ハイブリダイズを高感度に検出することができる。
　さらにまた、本発明に係るハイブリダイゼーション用バッファー組成物は、ターゲット核酸が３．３ｎＭ以上の濃度、好ましくは０．６６ｎＭ以上の濃度で含まれている核酸混合物であって、且つ、ターゲット核酸が１０％以下（非ターゲット核酸が９０％以上）の割合で含まれている核酸混合物に利用することが好ましく、ターゲット核酸が０．５％以上（非ターゲット核酸が９９．５％未満）の割合で含まれている核酸混合物に利用することがより好ましい。核酸混合物中のターゲット核酸の濃度及び割合が上記範囲にある場合、非ターゲット核酸と核酸プローブとの非特異的なハイブリダイズをより効果的に抑制することができ、ターゲット核酸と核酸プローブとの特異的ハイブリダイズを高感度に検出することができる。
　ここで、核酸混合物において、ターゲット核酸の含まれる割合の上限は、特に限定されないが、例えばターゲット核酸及び非ターゲット核酸の合計を１００％としたときに５０％以下であることが好ましく、１０％以下であることがより好ましい。核酸混合物においてターゲット核酸の割合が上記範囲を超える場合には、ブロッキング核酸を加えてもターゲット核酸を検出できない、或いはブロッキング核酸を加えなくてもターゲット核酸を検出できるといった不都合が生じる虞がある。
　本発明に係るハイブリダイゼーション用バッファー組成物は、核酸分子同士の相補的な結合を意味するハイブリダイゼーションを含むならば、如何なる系にも使用することができる。すなわち、本発明に係るハイブリダイゼーション用バッファー組成物は、サザンハイブリダイゼーション、ノーザンハイブリダイゼーション、in situ ハイブリダイゼーションに使用することができる。特に、本発明に係るハイブリダイゼーション用バッファー組成物は、担体（基板、中空繊維、微粒子を含む）に核酸プローブを固定し、固定化した核酸プローブを用いてターゲット核酸を検出（定性、定量を含む）する系に使用することが好ましい。より具体的に、本発明に係るハイブリダイゼーション用バッファー組成物は、核酸プローブを基板に固定したＤＮＡマイクロアレイ（ＤＮＡチップ）を用いてターゲット核酸を検出する際に使用することが最も好ましい。
　以下、本発明に係るハイブリダイゼーション用バッファー組成物を、ＤＮＡマイクロアレイ（ＤＮＡチップ）を用いてターゲット核酸を検出する際に使用する系を例示的に説明する。なお、本発明に係るハイブリダイゼーション用バッファー組成物の実施形態は、以下の例に限定されるものではない。
　K-ras（v-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog（カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ））における12番目のコドン（コドン１２）に関して、野生型のGGTGGC配列を含む測定対象のターゲット核酸とする例、及び117番目のコドン（コドン１１７）に関して、野生型のAAA配列を含む測定対象のターゲット核酸とする例である。よって、コドン１２及び／又はコドン１１７が変異型である配列を含む核酸が非ターゲット核酸である。なお、コドン１２についてはｐ．Ｇ１２Ｓ（ｃ．３４Ｇ＞Ａ）、ｐ．Ｇ１２Ｃ（ｃ．３４Ｇ＞Ｔ）、ｐ．Ｇ１２Ｒ（ｃ．３４Ｇ＞Ｃ）、ｐ．Ｇ１２Ｄ（ｃ．３５Ｇ＞Ａ）、ｐ．Ｇ１２Ｖ（ｃ．３５Ｇ＞Ｔ）及びｐ．Ｇ１２Ａ（ｃ．３５Ｇ＞Ｃ）変異が知られている。また、コドン１１７についてはｐ．Ｋ１１７Ｎ（ｃ．３５１Ａ＞Ｃ）及びｐ．Ｋ１１７Ｎ（ｃ．３５１Ａ＞Ｔ）変異が知られている。
　複数の非ターゲット核酸が存在する場合、全ての非ターゲット核酸についてブロッキング用核酸を準備しても良いし、一部の非ターゲット核酸についてブロッキング用核酸を準備しても良い。
　なお、核酸プローブ及びブロッキング用核酸は、より好ましくは一本鎖DNAである。核酸プローブ及びブロッキング用核酸は、例えば、核酸合成装置によって化学的に合成することで取得することができる。核酸合成装置としては、DNAシンセサイザー、全自動核酸合成装置、核酸自動合成装置等と呼ばれる装置を使用することができる。
　本例において、核酸プローブは、その5'末端にリンカーを修飾して担体上に固定化することにより、マイクロアレイの形態で用いるのが好ましい。リンカーは特定の単一塩基で構成されていてもよく、そうでなくてもよいが、ターゲット核酸と核酸プローブとのハイブリダイゼーションに関与しない塩基配列で構成することが好ましい。
　担体の材料としては、当技術分野で公知のものを使用でき、特に制限されない。例えば、白金、白金黒、金、パラジウム、ロジウム、銀、水銀、タングステンおよびそれらの化合物などの貴金属、およびグラファイト、カ－ボンファイバ－に代表される炭素などの導電体材料；単結晶シリコン、アモルファスシリコン、炭化ケイ素、酸化ケイ素、窒化ケイ素などに代表されるシリコン材料、SOI（シリコン・オン・インシュレータ）などに代表されるこれらシリコン材料の複合素材；ガラス、石英ガラス、アルミナ、サファイア、セラミクス、フォルステライト、感光性ガラスなどの無機材料；ポリエチレン、エチレン、ポリプロビレン、環状ポリオレフィン、ポリイソブチレン、ポリエチレンテレフタレート、不飽和ポリエステル、含フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、アセタール樹脂、ポリカーボネート、ポリアミド、フェノール樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、スチレン・アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリル・ブタジエンスチレン共重合体、ポリフェニレンオキサイドおよびポリスルホンなどの有機材料等が挙げられる。担体の形状も特に制限されないが、好ましくは平板状である。
　なお担体として、好ましくは表面にダイヤモンドライクカーボン（DLC：Diamond Like Carbon）等のカーボン層と、アミノ基、カルボキシル基、エポキシ基、ホルミル基、ヒドロキシル基及び活性エステル基等の化学修飾基とを有する担体を用いる。表面にカーボン層と化学修飾基とを有する担体には、基板の表面にカーボン層と化学修飾基とを有するもの、およびカーボン層からなる基板の表面に化学修飾基を有するものが包含される。基板の材料としては、当技術分野で公知のものを使用でき、特に制限されず、上述の担体材料として挙げたものと同様のものを使用できる。
　このように作製したＤＮＡマイクロアレイを用いて被検者における、ターゲット核酸を検出することができる。これには、被検者由来の試料からDNAを抽出する工程と、抽出したDNAを鋳型とし、K-rasにおけるコドン１２及び/又はコドン１１７を含む領域を増幅する工程と、ＤＮＡマイクロアレイを用いて増幅された核酸を検出する工程とを含む。
　被検者は通常ヒトであり、結腸癌及び直腸癌を含む大腸癌、頭頸部癌又は非小細胞肺癌に罹患した患者を挙げることができる。これらの癌に罹患していない健常者を被検者としてもよい。さらに被検者としては、EGFR陽性の進行・再発の結腸・直腸癌に罹患した患者とすることもできる。被検者由来の試料は特に制限されない。例えば、血液関連試料（血液、血清、血漿など）、リンパ液、糞便、がん細胞、組織または臓器の破砕物および抽出物などが挙げられる。
　まず、被検者から採取した試料からDNAを抽出する。抽出手段としては、特に限定されない。例えばフェノール／クロロホルム、エタノール、水酸化ナトリウム、CTABなどを用いたDNA抽出法を用いることができる。
　次に、得られたDNAを鋳型として用いて増幅反応を行い、K-RAS遺伝子をコードする核酸、好ましくはDNAを増幅させる。増幅反応としては、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、LAMP（Loop-Mediated Isothermal Amplification）、ICAN（Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids）法等を適用することができる。増幅反応においては、増幅後の領域を識別できるように標識を付加することが望ましい。このとき、増幅された核酸を標識する方法としては、特に限定されないが、例えば増幅反応に使用するプライマーをあらかじめ標識しておく方法を使用してもよいし、増幅反応に標識ヌクレオチドを基質として使用する方法を使用してもよい。標識物質としては、特に限定されないが、放射性同位元素や蛍光色素、あるいはジゴキシゲニン（DIG）やビオチンなどの有機化合物などを使用することができる。
　またこの反応系は、核酸増幅・標識に必要な緩衝剤、耐熱性DNAポリメラーゼ、K-RAS遺伝子に特異的なプライマー、標識ヌクレオチド三リン酸（具体的には蛍光標識等を付加したヌクレオチド三リン酸）、ヌクレオチド三リン酸および塩化マグネシウム等を含む反応系である。
　増幅反応に用いるプライマーは、K-ras のコドン１２及び/又はコドン１１７を含む領域を特異的に増幅できるものであれば特に制限されず、当業者であれば適宜設計できる。例えば、コドン１２に対しては、
プライマー１：5'- gtgtgacatgttctaatatagtcac -3'（配列番号１７）及び
プライマー２：5'- gaatggtcctgcaccagtaa -3'（配列番号１８）
また、コドン１１７に対しては、
プライマー３：5’- ctctgaagatgtacctatggtc -3’（配列番号１９）及び
プライマー４：5’- gtctactgttctagaaggcaaat -3’（配列番号２０）
からなるプライマーのセットが挙げられる。
　上記のようにして得られた増幅核酸には、ターゲット核酸及び非ターゲット核酸が含まれる。核酸プローブとターゲット核酸のハイブリダイゼーション反応を行い、核酸プローブにハイブリダイズした核酸の量を、例えば標識を検出することにより測定できる。標識からのシグナルは、例えば、蛍光標識を用いた場合は、蛍光スキャナを用いて蛍光シグナル検出し、これを画像解析ソフトによって解析することによりシグナル強度を数値化することができる。また、核酸プローブにハイブリダイズした増幅核酸は、例えば、既知量のDNAを含む試料を用いて検量線を作成することにより、定量することもできる。
　このとき、上述した本発明に係るハイブリダイゼーション用バッファー組成物を使用することで、非ターゲット核酸と核酸プローブとの非特異的なハイブリダイズを抑制することができる。ハイブリダイゼーション用バッファー組成物を用いたハイブリダイゼーション反応は、好ましくはストリンジェントな条件下で実施する。ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、例えば、50℃で16時間ハイブリダイズ反応させた後、2×SSC/0.2% SDS、25℃、10分および2×SSC、25℃、5分の条件で洗浄する条件をさす。すなわち、本発明に係るハイブリダイゼーション用バッファー組成物には、ハイブリダイゼーション反応に必要な塩、例えばSSCや、公知のブロッキング剤、例えばSDSが含まれていても良い。
　また、増幅反応後のターゲット核酸及び非ターゲット核酸を含む反応液と本発明に係るハイブリダイゼーション用バッファー組成物とを予め混合して、非ターゲット核酸とブロッキング用核酸との特異的なハイブリダイズを行った後、反応液をＤＮＡマイクロアレイに接触させてターゲット核酸と核酸プローブとのハイブリダイゼーション反応を進行させても良い。或いは、増幅反応後のターゲット核酸及び非ターゲット核酸を含む反応液と本発明に係るハイブリダイゼーション用バッファー組成物とをＤＮＡマイクロアレイ上にて混合して、非ターゲット核酸とブロッキング用核酸との特異的なハイブリダイズ並びにターゲット核酸と核酸プローブとの特異的なハイブリダイズを同時に進行させても良い。
　以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが本発明の技術的範囲は、以下の実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕
　本実施例では、K-rasにおけるコドン１１７の野生型の塩基配列（AAA）を非検出対象塩基とし、変異型の塩基配列（AAC, AAT）を検出対象塩基とした。野生型の検体として、コドン１１７の野生型の塩基配列（AAA）を中心に３６塩基からなるオリゴDNA（野生型オリゴDNA１）を使用し、変異型の検体としてコドン１１７の変異型の塩基配列（AAC, AAT）を中心に３６塩基からなるオリゴDNA（変異型オリゴDNA１及び２）を使用した。野生型オリゴDNA１及び変異型オリゴDNA１並びに２は、それぞれ5’末端にCyanine5(Cy5)を標識している。変異型オリゴDNAを3.3nMとして変異割合が0.5%、10%又は50%になるように野生型オリゴDNA及び変異型オリゴDNAを混合し、核酸混合物とした。
　本実施例では、非検出対象塩基、すなわち野生型の塩基配列（AAA）と相補的なブロッキング用核酸１（配列：GCAAATCACAtttATTTCCTA：配列番号４）を設計した。上述のように得られた核酸混合物に、ブロッキング用核酸を含むハイブリダイゼーション用バッファー組成物を混合し、ハイブリダイゼーション反応液（1xSSC/0.1%SDSを含む）を調製した。
　ハイブリダイゼーション反応液をDNAチップに滴下し、ハイブリカバーを被せ、ハイブリチャンバーにて45℃、1時間反応させた。なお、DNAチップとしては、ジーンシリコン（R）（東洋鋼鈑社製）を使用した。なお、当該DNAチップは、野生型オリゴDNAを検出するための核酸プローブ１：GCAAATCACAtttATTTCCTA（配列番号５）、変異型オリゴDNA１を検出するための核酸プローブ２：CAAATCACAgttATTTCCT（配列番号６）及び変異型オリゴDNA２を検出するための核酸プローブ３：GCAAATCACAattATTTCCTA（配列番号７）を備えている。
　表１に野生型オリゴDNA１、変異型オリゴDNA１及び２、ブロッキング用核酸１及び核酸プローブ１～３の塩基配列をまとめて記載した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表２－１～表２－３には、各試験区における核酸混合物に含まれる変異型オリゴDNAと野生型オリゴDNAの組成比、ブロッキング核酸濃度及びブロッキング核酸当量等をまとめて記載した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　反応終了後、1xSSC/0.1%SDSで30回振とう、1xSSCで30回振とうしてDNAチップを洗浄した。その後カバーフィルムを被せ、バイオショットにて蛍光強度を測定した。この時、混合核酸物が660nM未満の条件ではCCDカメラの露光時間を2秒、5秒、10秒、20秒と可変した。また混合核酸物が660nMの条件ではCCDカメラの露光時間を1秒、3秒、5秒、7秒と可変して蛍光強度を得た。
　核酸プローブ２（変異型オリゴDNA１検出用）の蛍光強度を核酸プローブ１（野生型オリゴDNA検出用）の蛍光強度で除して蛍光強度比、核酸プローブ３（変異型オリゴDNA２検出用）の蛍光強度を核酸プローブ１の蛍光強度で除して蛍光強度比をそれぞれ算出した。なお、検出された蛍光強度が2000以下のときは、強度不足として、50000以上の時は強度検出飽和域の近傍として、強度比を0（エラー）とした。表２－１～２－３に各露光時間の中で最も大きい蛍光強度比を示した。
　変異型オリゴDNAと野生型オリゴDNAとの核酸混合物を核酸プローブ１～３にハイブリダイズさせたとき（表２－１及び表２－２）の蛍光強度比から、野生型オリゴDNAのみを核酸プローブ１～３にハイブリダイズさせたとき（表２－３）の蛍光強度比を差し引くことで、蛍光強度比の差分を露光時間毎に求めた。蛍光強度比の差分は露光時間毎に求め、最も大きい値を表３－１及び表３－２と図１に示した。
　また、得られた蛍光強度及び図１に示した測定結果を用いて、以下のようにDNAチップによる変異判定[1]、[2]及び[3]を行い、その判定結果を表３－１及び表３－２に示した。なお、例えば、図１、表３－１及び表３－２の試験条件の欄における“AB-1-1”との表記は、表２－１に示した試験条件“A-1-1”で実施した試験結果と、表２－３に示した試験条件“B-1-1”で実施した試験結果とに基づくものである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　まず、変異判定[1]としては、変異型オリゴDNAと野生型オリゴDNAとの核酸混合物を核酸プローブ１～３にハイブリダイズさせたとき、核酸プローブ２又は３の蛍光強度が核酸プローブ１の蛍光強度よりも高く（蛍光強度比＞１）、且つ、野生型オリゴDNAのみを核酸プローブ１～３にハイブリダイズさせたとき、核酸型プローブ２又は３の蛍光強度が核酸プローブ１の蛍光強度よりも低い（蛍光強度比＜１）ときに変異判定結果を”○“とした。すなわち、変異判定[1]における陽性判定では、変異型オリゴDNAが存在するときは核酸プローブ２又は３の蛍光強度の方が高く、存在しないときは核酸プローブ１の蛍光強度の方が高いため、変異判定が容易な条件であることを意味する。
　表３－１及び表３－２に示す結果より、変異判定[1]では変異割合50%であれば、ブロッキング核酸0～1倍、変異割合10%ではブロッキング核酸3倍のみで陽性判定となった。
　次に、変異判定[2]としては、変異型オリゴDNAと野生型オリゴDNAとの核酸混合物を核酸プローブ１～３にハイブリダイズさせたときの蛍光強度比から、野生型オリゴDNAのみを核酸プローブ１～３にハイブリダイズさせたときの蛍光強度比を差し引いた、蛍光強度比の差分について、いずれかの露光時間における強度比の差分＞0.1となれば変異判定結果を”○“とした。すなわち、変異判定[2]における陽性判定では、変異型オリゴDNAと野生型オリゴDNAとの核酸混合物に含まれる変異型オリゴDNAの変異割合が低く、核酸プローブ２又は３の蛍光強度が核酸プローブ１の蛍光強度よりも低い場合であっても、変異型オリゴDNAが存在しないときの蛍光強度と比較することによって、DNAチップによる陽性判定が可能であるということを意味する。
　表３－１及び表３－２に示す結果より、変異判定[2]では変異割合50%であればブロッキング核酸0～1倍、変異割合10%であれば0～3倍、変異割合0.5%であれば1～3倍において陽性判定となり、変異割合が0.5%の条件でも陽性判定可能であることがわかった。
　次に、変異判定[3]としては、ブロッキング核酸を加えた条件における蛍光強度比の差分からブロッキング核酸を加えない条件における蛍光強度比の差分を差し引いた強度比の二重差分を算出し、この強度比の二重差分＞0.1となれば変異判定結果を”○“とした。すなわち、変異判定[3]における陽性判定では、ブロッキング核酸を加えた条件の方が、ブロッキング核酸を加えない条件よりも判定感度が高く、ブロッキング核酸を加えることが変異判定に有効であることを意味する。
　表３－１及び表３－２に示す結果より、変異割合が50%ではほとんど判定不可となり、ブロッキング核酸の効果は得られないことがわかる。一方で変異割合10%及び0.5%であれば1～3倍で陽性判定となったことから、変異型オリゴDNAを3.3nMを含む混合核酸中で変異割合が0.5～10%の時、ブロッキング核酸を1～3倍加えることが変異判定に好ましい添加量であることが判明した。
〔実施例２〕
　本実施例では実施例１と同様に、K-rasにおけるコドン１１７の野生型の塩基配列（AAA）を非検出対象塩基とし、変異型の塩基配列（AAC, AAT）を検出対象塩基とし、これらの塩基配列が変異型の検体を0.66nMとした以外は実施例１と同様に実験を行った。
　表４－１～表４－３には、各試験区における核酸混合物に含まれる変異型オリゴDNAと野生型オリゴDNAの組成比、ブロッキング核酸濃度及びブロッキング核酸当量等をまとめて記載した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　本実施例２において、実施例１と同様にして蛍光強度比の差分を露光時間ごとに算出し、最も大きい値を表５－１及び表５－２と図２に示した。
　得られた蛍光強度、並びに図２の測定結果を用いて、DNAチップによる変異判定を行い、実施例１と同様にして変異判定[1]、[2]及び[3]を行い、その判定結果を表５－１及び表５－２に示した。なお、例えば、図２、表５－１及び表５－２の試験条件の欄における“CD-1-1”との表記は、表４－１に示した試験条件“C-1-1”で実施した試験結果と、表４－３に示した試験条件“D-1-1”で実施した試験結果とに基づくものである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　表５－１及び表５－２に示すように、本実施例２では、変異判定[1]に関して陽性判定に該当する条件は存在しなかった。しかしながら、変異判定[2]に関しては、変異割合50%であればブロッキング核酸0～5倍で変異判定可能であり、変異割合が10%及び0.5%であれば1倍の場合にのみ変異判定可能であることが明らかとなった。さらに、変異判定[3]に関しては、変異割合50%であればブロッキング核酸0.5～5倍で変異判定可能であり、変異割合10%及び0.5%であれば1倍の場合にのみ変異判定可能であることが明らかとなった。
　以上の結果から、変異型オリゴDNAの濃度が0.66nMである核酸混合物において変異割合が0.5～10%の場合、ブロッキング核酸を1倍で加えることで良好に変異判定が可能であることが判明した。
〔実施例３〕
　本実施例では、K-rasにおけるコドン１２の野生型の塩基配列（GGT）を非検出対象塩基とし、変異型の塩基配列（GAT, GTT, GCT）を検出対象塩基とした。野生型の検体として、コドン１２の野生型の塩基配列（GGT）を中心に２６塩基からなるオリゴDNA（野生型オリゴDNA２）を使用し、変異型の検体としてコドン１２の変異型の塩基配列（GAT, GTT, GCT）を中心に２４塩基からなるオリゴDNA（変異型オリゴDNA３～５）を使用した。野生型オリゴDNA２及び変異型オリゴDNA３～５は、それぞれ5’末端にCyanine5(Cy5)を標識している。変異型オリゴDNAを0.66nMとして変異割合が0.5%, 1%又は5%になるように野生型オリゴDNA及び変異型オリゴDNAを混合し、核酸混合物とした。
　本実施例では、非検出対象塩基、すなわち野生型の塩基配列（GGT）と相補的なブロッキング用核酸２（配列：GAGCTggtGGCGTA：配列番号１２）を設計した。上述のように得られた核酸混合物に、ブロッキング用核酸を含むハイブリダイゼーション用バッファー組成物を混合し、ハイブリダイゼーション反応液（1xSSC/0.1%SDSを含む）を調製した。
　ハイブリダイゼーション反応液をDNAチップに滴下し、ハイブリカバーを被せ、ハイブリチャンバーにて45℃、1時間反応させた。なお、DNAチップとしては、ジーンシリコン（R）（東洋鋼鈑社製）を使用した。なお、当該DNAチップは、野生型オリゴDNA２を検出するための核酸プローブ４：GAGCTggtGGCGTA（配列番号１３）、変異型オリゴDNA３を検出するための核酸プローブ５：GAGCTgatGGCGTAG（配列番号１４）、変異型オリゴDNA４を検出するための核酸プローブ６：AGCTgttGGCGTAG（配列番号１５）及び変異型オリゴDNA５を検出するための核酸プローブ７：GCTgctGGCGTAG（配列番号１６）を備えている。
　表６に野生型オリゴDNA２、変異型オリゴDNA３～５、ブロッキング用核酸２及び核酸プローブ４～７の塩基配列をまとめて記載した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
　表７－１～表７－４には、各試験区における核酸混合物に含まれる変異型オリゴDNAと野生型オリゴDNAの組成比、ブロッキング核酸濃度及びブロッキング核酸当量等をまとめて記載した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
　本実施例３において、蛍光強度比の差分を露光時間ごとに算出し、最も大きい値を表８－１、表８－２及び表８－３と図３に示した。
　得られた蛍光強度、並びに図３の測定結果を用いて、DNAチップによる変異判定を行い、実施例１と同様にして変異判定[1]、[2]及び[3]を行い、その判定結果を表８－１～表８－３に示した。なお、例えば、図３、表８－１～表８－３の試験条件の欄における“EF-1-1”との表記は、表７－１に示した試験条件“E-1-1”で実施した試験結果と、表７－４に示した試験条件“F-1-1”で実施した試験結果とに基づくものである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
　表８－１～表８－３に示すように、本実施例３では、変異判定[1]に関して、変異割合が0.5～5%の全ての場合において、ほぼ全ての条件で陽性判定であった。また、変異判定[2]に関しても、変異割合が0.5～5%の全ての場合において、ほぼ全ての条件で陽性判定であった。さらに、変異判定[3]に関して、変異割合が1～5%の場合においてほぼ全ての条件で陽性判定であり、変異割合が0.5%の場合においてはブロッキング核酸の混合割合が3倍以上で変異判定可能であった。
　表９には、本実施例で用いた核酸プローブのGC比率と、最近接塩基法を用いて計算した［野生型オリゴDNA－ブロッキング核酸］間のTm(w)と［変異型オリゴDNA－ブロッキング核酸］間のTm(m)から、Tm(w)とTm(m)の差分(ΔTm)を算出して示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
　表９から判るように、K-rasにおけるコドン１２の核酸プローブのGC率は57%以上であり、［野生型オリゴDNA－ブロッキング核酸］間のTm(w)と［変異型オリゴDNA－ブロッキング核酸］間のTm(m)から、Tm(w)とTm(m)の差分(ΔTm)は8℃以上であったのに対して、K-rasにおけるコドン１１７の核酸プローブのGC率は32%以下であり、そのΔTmは6.6℃以下であったことがわかる。このことから、コドン１２の核酸プローブの方が変異判定に有利な条件で設計されていると言える。したがって、本実施例におけるブロッキング核酸は、GC率が32%以下でΔTmが6.6℃以下、好ましくは5.5～6.6℃となる、変異判定には不利なターゲットとプローブの組み合わせにおいて適用する場合に特に有効であり、変異型オリゴDNA0.66～3.3nMを含む変異割合0.5～10%の核酸混合物に対して、ブロッキング核酸が1～3倍の濃度で加えた時、変異判定が可能であり、1倍の時がより好ましい。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

Claims (9)

  1. 　検出対象塩基を含むターゲット核酸と、当該ターゲット核酸における少なくとも検出対象塩基を含む領域に対して相補的な塩基配列を含む核酸プローブとのハイブリダイゼーションに使用するバッファー組成物であって、
    　上記ターゲット核酸と、上記検出対象塩基に対応する非検出対象塩基を含む非ターゲット核酸とからなる核酸混合物の核酸濃度に対して、非ターゲット核酸における少なくとも非検出対象塩基を含む領域に対して相補的な塩基配列を含むブロッキング用核酸を１倍以上の濃度として含有する、ハイブリダイゼーション用バッファー組成物。
  2. 　上記ブロッキング用核酸は、上記核酸混合物の核酸濃度に対して１～５倍の濃度であることを特徴とする請求項１記載のハイブリダイゼーション用バッファー組成物。
  3. 　検出対象塩基を含むターゲット核酸と、当該ターゲット核酸における少なくとも検出対象塩基を含む領域に対して相補的な塩基配列を含む核酸プローブとのハイブリダイゼーション方法であって、
    　上記ターゲット核酸と上記検出対象塩基に対応する非検出対象塩基を含む非ターゲット核酸とからなる核酸混合物を含む溶液と、非ターゲット核酸における少なくとも非検出対象塩基を含む領域に対して相補的な塩基配列を含むブロッキング用核酸を核酸混合物の核酸濃度に対して１倍以上の濃度として含有するハイブリダイゼーション用バッファー組成物とを混合し、その後、上記核酸プローブと上記ターゲット核酸とのハイブリダイズを行う、ハイブリダイゼーション方法。
  4. 　上記ハイブリダイゼーション用バッファー組成物は、上記核酸混合物の核酸濃度に対して１～５倍の濃度のブロッキング用核酸を含むことを特徴とする請求項３記載のハイブリダイゼーション方法。
  5. 　上記核酸混合物を含む溶液は、ターゲット核酸を０．６６ｎＭ以上の濃度で含有することを特徴とする請求項３記載のハイブリダイゼーション方法。
  6. 　上記核酸混合物を含む溶液は、ターゲット核酸及び非ターゲット核酸の合計を１００％としたときにターゲット核酸を０．５～１０％で含有することを特徴とする請求項３記載のハイブリダイゼーション方法。
  7. 　上記核酸混合物を含む溶液は、ターゲット核酸及び非ターゲット核酸の合計を１００％としたときにターゲット核酸を０．５～１０％で含有し、且つ、ターゲット核酸を０．６６ｎＭ以上の濃度で含有することを特徴とする請求項３記載のハイブリダイゼーション方法。
  8. 　上記核酸プローブが基板上に固定されてなるマイクロアレイに、上記ハイブリダイゼーション用バッファー組成物と、上記核酸混合物を含有する溶液とを混合した混合液を接触させることを特徴とする請求項３記載のハイブリダイゼーション方法。
  9. 　上記核酸混合物を含有する溶液は、上記ターゲット核酸を増幅する核酸増幅反応の後の反応液であり、当該反応液と上記ハイブリダイゼーション用バッファー組成物とを混合することを特徴とする請求項３記載のハイブリダイゼーション方法。
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