BR102014029398A2 - composição para reação de transcrição reversa hot-start, métodos de preparação, e kit para reação de transcrição reversa hot-start - Google Patents

Abstract

composição para reação de transcrição reversa hot-start, métodos de preparação, e kit para reação de transcrição reversa hot-start a presente invenção refere-se a uma composição para reação de transcrição reversa hot-start e uma composição para a pcr de transcrição reversa, mais particularmente a uma composição de reação obtida através da adição de pirofosfato e pirofosfatase á uma solução aquosa contendo solução tampão de reação, mgcl2, quatro tipos de dntps, e polimerase de transcrição reversa em um œnico tubo de reação, e uma composição para reação de transcrição reversa hot-start obtida por congelamento ou secagem da composição de reação e tendo uma maior estabilidade e estabilidade de armazenamento a longo prazo. além disso refere-se a uma composição que compreende dna polimerase na composição para reação de transcrição reversa hot-start, e, portanto, permite uma reação de transcrição reversa hot-start e reação pcr a serem executadas sequencialmente, e a um método para amplificar ácido nucleico da mesma. em comparação com as composições convencionais para a reação de transcrição reversa, a composição da invenção pode evitar as reações de transcrição reversa não específicas durante a mistura em temperatura ambiente e pode realizar seletivamente a transcrição reversa do rna alvo em temperatura de reação, tornando poss’vel amplificar o produto de transcrição reversa por pcr com alta sensibilidade.

Description

COMPOSIÇÃO PARA REAÇÃO DE TRANSCRIÇÃO REVERSA HOT-START, MÉTODOS DE PREPARAÇÃO, E KIT PARA REAÇÃO DE TRANSCRIÇÃO REVERSA HOT-START

Campo de Aplicação [001] A presente invenção refere-se à uma composição para reação de transcrição reversa hot-start ou reação em cadeia da polimerase de transcrição reversa hot-start.

Estado da Técnica [002] Reações de transcrição reversa são classificadas em reações que empregam iniciadores aleatórios e reações que empregam iniciadores específicos para alvos. Nas reações de transcrição reversa para a detecção de um alvo especifico, como kits de diagnóstico para a detecção de virus RNA ou semelhantes, iniciadores específicos de alvos são geralmente usados porque apresentam maior sensibilidade. Em tais reações de transcrição reversa, especificidade e sensibilidade são determinadas pela alta seletividade de iniciadores que se ligam especificamente à uma sequência de RNA alvo. No entanto, devido ao fato de que todos os componentes requeridos para uma reação de transcrição reversa são misturas em temperatura ambiente, uma reação de transcrição reversa não específica é causada por uma iniciação não específica sob esta condição. Mesmo em temperatura ambiente, iniciação não específica ocorre devido à alta atividade de transcriptase reversa para produzir um número de cDNAs não específicos, e, assim, é um fator principal que aumenta as reações de amplificação não específicas. Devido às reações de transcrição reversa não específicas, iniciadores requeridos para reações de PCR subsequentes e concentrações limitadas de outros componentes essenciais são consumidos, e por esta razão, as reações de transcrição reversa não específicas atuam como inibidores competitivos. Reações de cadeia reversa não específicas são problemáticas quando detectam uma concentração baixa de RNA, e particularmente, interferem com a detecção de um RNA alvo que está presente em uma quantidade pequena em uma solução que contém grandes quantidades de RNAs extraídos de células ou fluidos corporais e tendo uma complexidade de sequência de nucleotídeos. Assim, as reações de transcrição reversa não específicas tornam difícil a detecção de um vírus ou gene presente em uma baixa concentração. Ainda, em reações de transcrição reversa multiplex que são realizadas usando vários iniciadores ao mesmo tempo, as reações de transcrição reversa não específicas reduzem a especificidade, tornam difícil as múltiplas detecções. Esta amplificação não específica é mais enormemente influenciada pelas quantidades relativas do ácido nucleico alvo e outros ácidos nucleicos derivados de uma amostra biológica do que a quantidade absoluta do ácido nucleico alvo. Isto é porque hibridização não específica de iniciadores aumenta as reações não específicas, quando muitos RNAs além de um alvo desejado estão presentes em uma mistura de reação.

[003] A fim de reduzir tais reações não específicas indesejáveis e de amplificação, várias tentativas têm sido feitas. Especificamente, houve uma tentativa de aumentar o limite de detecção de um alvo especifico por iniciadores que hibridizam mais fortemente ao alvo. Por exemplo, foi relatado um método, em que o terminal 5' dos iniciadores são substituídos com LNA, de modo que este pode hibridizar mais fortemente ao alvo, reduzindo assim a amplificação não específica (Malgoyre A. et al., Biochem Biophys Res Commun. Mar 2, 2007; 354(1) :246-52) . Como outro método para a resolução de problemas utilizando uma estrutura de iniciador específico, um método de prevenção da formação de dímero de iniciador também foi desenvolvido. Quando uma reação de transcrição reversa é realizada particularmente em temperaturas baixas, a polimerização pode prosseguir por hibridização parcial entre os iniciadores para formar um dímero, um fator importante que reduz rapidamente a sensibilidade na reação de transcrição reversa. A fim de resolver este problema, foi proposto utilizar iniciadores formados por sequências de nucleotídeos complementares que se estendem de modo que cinco nucleotídeos da sequência 5' de nucleotídeos dos iniciadores pode formar uma estrutura em hairpin em baixa temperatura (Ji Young Hong et al. , J Virol . 2011; 8: 330. Publicado on-line 2011; Patente coreana No. 10-0987352) . No entanto, este método de iniciador bloqueado tem desvantagens em que, devido ao fato de que os iniciadores possuem alta temperatura hibridização devido à da sequência de nucleotídeos adicionada ao terminal 5', a hibridização não específica dos iniciadores aos alvos não específicos tendo sequências de nucleotídeos semelhantes à mesma em uma subsequente reação de PCR pode ser induzida, e a eficiência de hibridização na etapa de hibridização é reduzida, devido à estrutura hairpin dos iniciadores.

[004] Para resolver tais problemas, foi desenvolvido um método que utiliza iniciadores bloqueados que são parcialmente complementares aos iniciadores e que são bloqueados no terminal 3' . Tais iniciadores bloqueadas tem vantagens na medida em que, porque são bloqueados no terminal 3', eles não atuam como iniciadores em uma reação de polimerização de ácido nucleico, e porque eles curtos no comprimento, hibridizam com os iniciadores só em temperatura ambiente para evitar a formação de dimero de iniciador, e porque são destacados imediatamente a partir dos iniciadores e não são operados quando a temperatura aumenta, em uma reação subsequente, PCR de transcrição inversa imediata pode ser realizado (Pedido de Patente coreana No.10-2011-0017226).

[005] Além disso, foi desenvolvido um método para realização de uma reação de transcrição reversa em alta temperatura para hibridização mais especifica a um RNA alvo. Foi relatado que, quando um cDNA é sintetizado em alta temperatura, como 70°C utilizando iniciadores que hibridizam em alta temperatura e uma polimerase de transcrição reversa que opera mesmo em alta temperatura, pode ser mais especificamente amplificado (Fuchs B, et al., Mol Biotechnol de 1999 Oct; 12 (3) : 237-40) .

[006] No PCR de transcrição reversa multiplex, a especificidade é mais importante. Isto porque vários iniciadores são usados na reação, uma reação não especifica pode ocorrer em uma reação de PCR subsequente devido à uma reação não especifica na etapa de reação de transcrição reversa. Para evitar esta reação não especifica em PCR de transcrição reversa multiplex, uma reação de transcrição reversa é realizada em primeiro lugar, e, em seguida, uma reação de PCR é realizada, de modo que uma reação mais especifica pode ser alcançada. No entanto, neste caso, o processo de abertura de um tubo de reação e a adição de uma solução de reação para o tubo de reação aberta é problemático, e a possibilidade de contaminação do processo de abertura e de funcionamento do tubo de reação é mais elevada. Por esta razão, é geralmente preferencial realizar sequencialmente uma Reação de transcrição reversa e PCR em um único tubo. Assim, um método para separar fisicamente as reações da outra durante a realização de PCR de transcrição reversa em um único tubo sem abrir o tubo foi desenvolvido, em que a mistura de reação de transcrição reversa está presente na parte inferior do tubo durante a reação, e a mistura de reação PCR é suspensa a partir da tampa. Neste método, a reação de transcrição reversa é realizada no tubo, enquanto a mistura de reação de PCR é suspensa a partir da tampa e não é reagida, e após a conclusão da reação de transcrição reversa, e o tubo de reação é rodado em uma centrifuga de modo a que a solução de PCR suspensa a partir da tampa do tubo de reação é misturada com a reação de transcrição reversa do produto, após o qual a reação de PCR é realizada (Rodney Mark Ratcliff, et al, 2002 november; 40 (11): 40914099. doi: 10.1128 / JCM.40.11.4091-4099.2002).

[007] Como resultado dos esforços para resolver os problemas acima descritos que ocorrem em reações de transcrição reversa convencionais, uma "reação de transcrição reversa de hot-start" foi desenvolvido. A reação de transcrição reversa hot-start é um método para a detecção de uma quantidade muito pequena de um RNA alvo, no qual uma reação de transcrição reversa pode ser iniciada a uma temperatura elevada em que a iniciação podería ocorrer apenas para um RNA tendo uma sequência de nucleotídeos que é exatamente complementar ais iniciadores, impedindo assim a iniciação não específica de ocorrer em temperatura ambiente e prevenir a oligomerização de iniciador não específico, aumentando assim a especificidade da reação de transcrição reversa. Para implementar este método, um método que utiliza uma polimerase resistente ao calor e um aptâmero foi desenvolvido e está sendo utilizado. Um kit máster de ciclador de RNA à luz (Roche) é um método que emprega Tth DNA polimerase e um aptâmero. Tth DNA polimerase combina uma função de polimerização de DNA usando RNA como molde e uma função de polimerização de DNA, utilizando DNA como um molde. 0 aptâmero aqui utilizado está ligado ao sítio reativo de Tth DNA polimerase, e, assim, é inativo em temperatura ambiente. Quando a temperatura da solução de reação é aumentada para altas temperaturas, a estrutura tridimensional do aptâmero é modificada de modo a que esteja separada da Tth DNA polimerase, de modo a ser ativa, e a reação de transcrição reversa de um RNA alvo especificamente sensibilizado pode ser realizada, e depois PCR pode ser realizado. Além disso, o kit GeneAmp AccuRT Hot Start RNA PCR (Applied Biosystems) utiliza uma polimerase resistente ao calor proveniente da espécie Thermus Z05 e pode realizar uma reação de transcrição reversa e PCR usando uma única enzima, como a Tth DNA polimerase. Além disso, a reação é realizada utilizando um aptâmero especifico aos mesmos. Tais produtos podem reduzir a amplificação não específica em PCR de transcrição reversa por inibição da atividade enzimática em temperatura ambiente utilizando o aptâmero para reduzir as reações de transcrição reversa não especificas. No entanto, quando a temperatura do aptâmero é aumentada a temperaturas elevadas, a estrutura tridimensional do mesmo é modificada, mas quando a temperatura é reduzida, o aptâmero é restaurado à sua estrutura original para inibir as DNA polimerases. Em outras palavras, o aptâmero tem o problema de inibir reversivelmente DNA polimerases. Para o kit GeneAmp RNA AccuRT Hot Start PCR, é descrito que o aptâmero ainda está ligado à DNA polimerase, mesmo a 55°C e é completamente destacado quando a temperatura se torna 65°C. Assim, em reações em que a temperatura de anelamento de iniciadores que são geralmente utilizados é de 55°C ou abaixo, existe um problema em que a atividade de DNA polimerase é inibida para reduzir a eficiência da PCR. Por esta razão, uma DNA polimerase resistente ao calor, como Tth DNA polimerase, que tem a função de transcrição reversa, é utilizada. Esta DNA polimerase resistente ao calor tem um problema na medida em que, uma vez que tem a função de transcrição reversa, durante um processo de PCR subsequente em que a atividade enzimática é mantida, provoca uma reação de transcrição reversa não especifica continua, resultando na amplificação não especifica.

[008] Um método de reação de PCR hot-start empregando anticorpos só é aplicável a Taq DNA polimerase (Enneth, G. et al, 1994, Biotechnology, 12; . 506-509) . A fim de realizar reações de transcrição reversa de hot-start, utilizando outros tipos de polimerases de transcrição reversa, uma transcriptase reversa resistente ao calor que é resistente a alta temperatura deve ser utilizada, e para a PCR de transcrição reversa, um anticorpo especifico para a transcriptase reversa que é separado em baixa temperatura e um anticorpo especifico para a DNA polimerase, que é separado em alta temperatura. Por esta razão, os anticorpos específicos para as respectivas polimerases resistentes ao calor deve ser desenvolvido, e assim, não existe um limite técnico para tais reações de transcrição reversa hot-start.

[009] Os presentes inventores desenvolveram um método de PCR hot-start que utiliza pirofosfato (PPi) e pirofosfatase resistente ao calor (PPase) (Patente Coreana No. 10-0292883). Este método baseia-se no princípio de que o PPi que se liga fortemente aos íons essenciais de magnésio para a polimerização de DNA é adicionado para inibir uma reação de polimerase em temperatura ambiente e, em seguida PPase é reagida em alta temperatura para remover o PPi. A transcriptase reversa não pode ser utilizada em um método hot-start que utiliza um anticorpo, por causa da sua baixa temperatura de ativação. Um método convencional de PCR hot-start que utiliza um anticorpo é um método em que a atividade da enzima é inibida por ligação enzima-anticorpo em baixa temperatura, e o anticorpo perde a sua ligação com a enzima devido a uma diminuição da sua estabilidade quando se atinge temperatura elevada, pela qual ocorre uma reação de PCR. Transcriptase reversa não tem estabilidade térmica em alta temperatura, ao contrário da DNA polimerase. Quando o anticorpo atingir temperatura elevada para perder sua ligação com a transcriptase reversa, a atividade da transcriptase reversa é inibida. Em uma tentativa para resolver este problema, um método de reação de transcrição reversa hot-start que utiliza o PPi e PPase tem vantagens na medida em que pode ser geralmente aplicado independentemente do tipo de DNA polimerase e na reatividade pode ser mantida continuamente, removendo continuamente o PPi gerado a partir de dNTP durante a PCR. No entanto, se um solução de mistura máster de PCR hot-start é feita utilizando este método, PPase lentamente irá dissolver o PPi de ions Mg2 + , de modo que a atividade de DNA polimerase aparecerá, e, finalmente, um efeito desejado de reação de PCR hot-start será perdido. Além disso, se uma solução de mistura máster de transcrição reversa contendo PPase é feita, esta tem um problema na medida em que a atividade de PPase em temperatura ambiente ou 4°C é mantida apenas durante um curto periodo de tempo, porque PPase é muito instável. Assim, uma mistura em uma forma seca tendo uma maior estabilidade foi desenvolvida (Patente Coreana No. 10-1098764) . Por conseguinte, a fim de resolver os problemas acima descritos de reações de transcrição reversa de hot-start, tecnologia para transcrição reversa e PCR de transcrição reversa de hot-start mais altamente sensível é requerida.

Objetivos da Invenção [010] É um objetivo da presente invenção fornecer uma composição para reação de transcrição reversa hot-start ou a PCR de transcrição reversa hot-start, o qual compreende pirofosfato (PPi) e pirofosfatase (PPase).

[011] Para atingir o objetivo acima, a presente invenção fornece uma composição para reação de transcrição reversa hot-start, a qual compreende um íon Mg2+, quatro tipos de dNTPs, polimerase de transcrição reversa, pirofosfato (PPi), e pirofosfatase (PPase).

[012] A presente invenção também fornece uma composição para PCR de transcrição reversa hot-start, que compreende um ion Mg2+, quatro tipos de dNTPs, polimerase de transcrição reversa, pirofosfato (PPi), e pirofosfatase (PPase), e compreende ainda DNA polimerase.

[013] A presente invenção também fornece um método de preparação de uma composição para uma reação de transcrição inversa hot-start, o método compreendendo a introdução da composição acima descrita para a reação de transcrição inversa hot-start em um único tubo de reação.

[014] A presente invenção também fornece um kit para a reação de transcrição inversa hot-start, a qual compreende a composição acima descrita para a reação de transcrição inversa hot-start.

[015] A presente invenção também fornece um método para a amplificação de ácido nucleico, o método compreendendo as etapas de: misturar a composição acima descrita para PCR de transcrição reversa hot-start com uma amostra contendo molde de RNA para se obter uma mistura de reação; realizar uma reação de modo a amplificar a mistura de reação para assim se obter um produto de amplificação; e analisar o produto de amplificação.

Breve Descrição das Figuras [016] A Fig. 1 mostra o efeito do pirofosfato (PPi) na inibição de reações de transcrição reversa: [017] Faixas 1, 2, 3 e 4: os resultados da realização de reações de transcrição reversa de 100 ng, 10 ng, 1 ng e 100 pg de RNA, respectivamente;

[018] A: resultados de controles positivos obtidos através da realização de uma reação de transcrição reversa na ausência de PPi, seguido de reação de PCR;

[019] B, C, D, E e F: os resultados da realização de reações de transcrição reversa na presença de variadas concentrações de PPi, seguido por reações de PCR; e [020] Pista M: escada de DNA de 100 pb (Bioneer, Coréia) para o dimensionamento de produtos de PCR.

[021] A Fig. 2 mostra que reações de transcrição reversa são ativadas novamente adicionando pirofosfatase (PPase) que hidrolisa PPi em dois fosfatos: [022] Faixas 1, 2, 3 e 4: os resultados da realização de reações de transcrição reversa de 100 ng, 10 ng, 1 ng e 100 pg de RNA, respectivamente;

[023] A: resultados de controle positivos obtidos através da realização de uma reação de transcrição reversa na ausência de PPi, seguido de reação de PCR;

[024] B, C, D, E e F: os resultados obtidos pela adição de variadas concentrações de PPi;

[025] B — 1, C-l, D-l, E —1 e F-l : os resultados da realização de reações de transcrição reversa na presença de PPase, seguido por reações de PCR;

[026] Pista M: escada de 1 kb de DNA.

[027] A Fig. 3 mostra os efeitos da adição de PPi e PPase em PCR de transcrição reversa em tempo real: [028] Faixas 1, 2, 3 e 4: os resultados de PCR de transcrição reversa em tempo real utilizando 100 ng, 10 ng, 1 ng e 100 pg de RNA total humano.

[029] A Fig. 4 mostra os resultados da detecção de RNA do virus da hepatite C por uma reação de transcrição reversa hot-start.

[030] A Fig. 5a mostra os efeitos do PPi e PPase sobre a inibição de reações não especificas em PCR de transcrição reversa em tempo real: [031] A: os resultados obtidos utilizando uma solução de reação não tendo função de transcrição reversa hot-start;

[032] B: os resultados obtidos a partir da adição de 1 ug de RNA total de células humanas para a solução de reação "A";

[033] C: os resultados obtidos através de uma solução de reação de transcrição reversa hot-start compreendendo PPi e PPase; e [034] D: os resultados obtidos a partir da adição de 1 jug de RNA total de células humanas para a solução de reação de "C".

[035] A Fig. 5b mostra os resultados de eletroforese em produtos de PCR de transcrição inversa em tempo real sobre gel de agarose a 2%: [036] Faixas 1, 2, 3, 4, 5 e 6: os produtos obtidos a partir de moldes de RNAs de virus da hepatite C com números de cópia de 106, 105, ΙΟ4, ΙΟ3, 102 e 10;

[037] A: os resultados obtidos utilizando a solução de reação não tendo função de transcrição reversa hot-start;

[038] B: os resultados obtidos a partir da adição de 1 ug de RNA total de células humanas para a solução de reação "A";

[039] C: os resultados obtidos através de uma solução de reação de transcrição reversa hot-start compreendendo PPi e PPase; e [040] D: os resultados obtidos a partir da adição de 1 qg de RNA total de células humanas para a solução de reação de "C".

[041] A Fig. 6a mostra uma comparação da inibição de reações não especificas em PCR de transcrição inversa em tempo real entre o uso de solução de reação de transcrição reversa hot-start e Taq anticorpo: [042] A: os resultados obtidos utilizando a solução de reação não tendo função de transcrição reversa hot-start, que compreende Taq anticorpo, juntamente com uma solução de reação PCR hot-start;

[043] B: os resultados obtidos a partir da adição de 1 çg de RNA total de células humanas para a solução de reação "A";

[044] C: os resultados obtidos utilizando a solução de reação de transcrição reversa hot-start, que compreende PPi e PPase, juntamente com uma solução de reação PCR hot-start; e [045] D: os resultados obtidos a partir da adição de 1 jug de RNA total de células humanas para a solução de reação de "C";

[046] A Fig. 6b mostra os resultados de eletroforese de produtos de PCR de transcrição inversa em tempo real sobre gel de agarose a 2%: [047] Faixas 1, 2, 3, 4, 5 e 6: os produtos obtidos a partir de moldes de RNAs de virus da hepatite C com números de cópia de 106, 105, ΙΟ4, ΙΟ3, 102 e 10;

[048] A: os resultados obtidos utilizando a solução de reação não tendo função de transcrição reversa hot-start, que compreende Taq anticorpo, juntamente com uma solução de reação PCR hot-start;

[049] B: os resultados obtidos a partir da adição de 1 ug de RNA total de células humanas para a solução de reação "A";

[050] C: os resultados obtidos utilizando a solução de reação de transcrição reversa hot-start, que compreende PPi e PPase, juntamente com uma solução de reação PCR hot-start;

[051] D: os resultados obtidos a partir da adição de 1 jug de RNA total de células humanas para a solução de reação de "C";

[052] As Figs. 7a e 7c são os gráficos de PCR de transcrição reversa em tempo real, que ilustram que uma transcrição reversa em estado de solução/composição PCR e uma transcrição reversa no estado seco/composição de PCR apresentam igual desempenho em PCR de transcrição reversa em tempo real (FIG. 7a: estado sólido; FIG 7c: estado seco).

[053] As Figs. 7b e 7d são os gráficos padrões de PCR de transcrição reversa em tempo real, as quais ilustram que uma transcrição reversa em estado de solução/composição de PCR e uma transcrição reversa em estado seco/composição de PCR apresentam igual desempenho PCR de transcrição reversa em tempo real (FIG. 7b: estado sólido; FIG 7d: estado seco).

[054] A Fig. 8a é um diagrama gráfico mostrando os resultados da realização de PCR de transcrição reversa em tempo real, utilizando uma mistura em estado liquido como um controle a fim de testar a estabilidade de uma transcrição reversa seca/composição de PCR como uma função do período de armazenamento .

[055] A Fig. 8b é um diagrama gráfico mostrando os resultados da realização de PCR de transcrição reversa em tempo real utilizando a uma mistura seca em intervalos de um dia para um período de armazenamento de um total de 5 dias após o armazenamento a 50°C, a fim de testar a estabilidade de armazenamento da mistura seca: [056] 1 dia 5 dias: o número de dias durante os quais a mistura seca foi armazenada a 50°C.

[057] A Fig. 9a mostra os resultados da realização de PCR de transcrição reversa em tempo real utilizando um iniciador com 6 nucleotídeos descombinados na extremidade 5', e a FIG. 9b mostra os resultados da realização de PCR de transcrição inversa em tempo real utilizando um iniciador com 6 nucleotídeos descombinados no meio. Além disso, Figs. 9a e 9b mostram graficamente os resultados da realização de transcrição reversa em tempo real para confirmar a inibição da ligação não específica de um iniciador a um molde em uma mistura de reação de PCR de transcrição reversa hot-start.

[058] As Figs. 10a e 10b são gráficos mostrando os resultados da realização de PCR transcrição reversa em tempo real, a fim de analisar o polimorfismo de nucleotídeo único de RNA por PCR de transcrição reversa hot-start: [059] "A" indica o resultado obtido utilizando um iniciador tendo uma sequência de nucleotídeos que é exatamente combinada, e "B" indica o resultado obtido utilizando um iniciador que tem um único nucleotídeo descombinado.

[060] A Fig. 11 mostra graficamente os resultados da realização de transcrição reversa em tempo real, a fim de analisar se uma reação de transcrição reversa hot-start inibe reações não especificas decorrentes de auto-iniciação de RNA-RNA: [061] "A" na Fig. 11 mostra os resultados da realização de uma PCR em tempo real utilizando RNA isolado, sem uma reação de transcrição reversa; e "B" mostra os resultados da realização de uma reação de transcrição reversa utilizando um iniciador, seguido de PCR em tempo real. "B-A" indica o resultado obtido pela realização da reação de transcrição reversa utilizando uma solução de reação de transcrição reversa hot-start, e "B-B" mostra o resultado obtido pela realização da reação de transcrição reversa utilizando uma solução de reação não tendo inversa função de transcrição hot-start. "C" mostra os resultados da realização de uma reação transcrição reversa utilizando RNA isolado em uma solução de reação não tendo função de transcrição reversa hot-start, seguida de PCR em tempo real. "D" mostra os resultados da realização de uma reação de transcrição reversa utilizando RNA isolado em uma solução de reação de transcrição reversa hot-start, seguido de PCR em tempo real.

[062] A Fig. 12 é um diagrama gráfico, mostrando os resultados da realização de PCR de transcrição reversa em tempo real, a fim de examinar se a auto-iniciação de RNA-RNA em uma reação de transcrição reversa é inibida por terminação de RNA. "A" e "B" indicam o resultado obtido utilizando o RNA não terminado, e "C" e "D" indicam os resultados obtidos usando RNA terminado. Para "A" e "C", uma reação de transcrição reversa simples foi realizada, e para "B" e "D", um reação de transcrição reversa hot-start foi realizada.

[063] A Fig. 13a mostra os resultados para detectar o marcador de câncer da queratina-8 usando RNA extraído a partir de células Hela. Para a análise quantitativa, o RNA foi extraído serialmente 10 vezes diluído e foi submetido a PCR de transcrição reversa em tempo real, a fim de traçar uma curva padrão.

[064] As Figs . 13b, 13c, 13d e 13e são gráficos que mostram os resultados da realização de PCR de transcrição reversa em tempo real, a fim de examinar se terminação de RNA e PCR de transcrição reversa hot-start aumentam o limite de detecção do marcador de câncer.

Melhor Forma para Realização da Invenção [065] Em um aspecto, a presente invenção é dirigida a uma composição para reação de transcrição reversa hot-start, a qual compreende um íon Mg2+, quatro tipos de dNTPs, polimerase de transcrição reversa, pirofosfato (PPi), e pirofosfatase (PPase).

[066] A polimerase de transcrição reversa que é usada na presente invenção pode ser qualquer uma polimerase de transcrição reversa conhecida. Especificamente, podem ser geralmente utilizadas as AMV ou MMLV comercialmente disponíveis.

[067] Como pirofosfatase (PPase), PPase convencional disponível comercialmente pode ser utilizada na presente invenção sem limitação. Especificamente, PPase que é utilizada na presente invenção pode ser preferencialmente pirofosfatase inorgânica Tte (SibEnzyme Ltd.) derivada de uma E. coli clonada com um gene da fosfatase inorgânica derivada de Thermus thermophilus B35, ou pirofosfatase inorgânica Pto (Bioneer corporação, Coréia) derivada de uma E. coli clonada com um gene derivado de pirofosfatase inorgânica de Picrophilus torridus. 1 unidade de pirofosfatase inorgânica Pto é definida como a quantidade de enzima necessária para produzir 40 nmol de fosfato a partir de pirofosfato durante 1 minuto. A reação é realizada utilizando Tris-HCl (pH 7,5) , 5 mM MgCl2, e 2,0 mM PPi com um volume de reação total de 0,5 ml a 70°C durante 10 minutos.

[068] PPi que está contida na composição pode ser adicionada a uma concentração de 0,1-5,0 mM, preferencialmente 0,2-3,0 mM, com base na solução de reação final. Se a concentração de PPi é maior do que 5,0 mM, a concentração de PPase para ser utilizada precisa aumentar proporcionalmente, e neste caso, a quantidade do produto de reação de transcrição reversa pode diminuir. Se a concentração de PPi é inferior a 0,1 mM, a capacidade de capturar íon Mg2+ na composição da reação de transcrição reversa será reduzida e, assim, o efeito de inibir a produção de produtos não específicos causada por iniciação de: não específica (iniciação incorreta) não pode ser obtida. Quando a concentração de PPi é de 0,1-5 mM, 0, 005-0,25 U de PPase é de preferência contida na mistura de reação de transcrição reversa. PPase é usada 0,005-0,25 U por 0,1 mM PPi. Se PPase é utilizado em uma concentração superior a 0,25 U por 0,1 mM PPi, o resultado pode ser confirmado com uma concentração mais elevada quando um modelo de alto número de cópias é utilizado, quando comparado com um modelo de baixo número de cópias é usado, e a reatividade de transcrição reversa pode ser reduzida, resultando em uma diminuição significativa na quantidade do produto de reação. Se a concentração de PPase é inferior a 0,005 U por 0,1 mM PPi, a reação de transcrição reversa pode ser inibida.

[069] A solução tampão de reação que é utilizada na presente invenção é de preferência um tampão (pH 9,0) contendo 10 mM Tris HC1 e 40 mM KC1, e os quatro tipos de dNTPs indicam dATP, dTTP, dGTP e dCTP. Se necessário, a composição pode ainda compreender substâncias requeridas para a reação de transcrição reversa, incluindo iniciadores, molde de ácido nucleico e semelhantes. Os iniciadores podem ser preferencialmente iniciadores aleatórias, ou iniciadores específicos para o molde de ácido nucleico, e o molde de ácido nucleico é preferencialmente um RNA em necessidade de uma reação de transcrição reversa. Além disso, a composição pode compreender um corante fluorescente que pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em SYBR Verde, EtBr e HRdye.

[070] A composição para a reação de transcrição reversa de acordo com a presente invenção pode ainda compreender os iniciadores de transcrição inversa. Os iniciadores de transcrição reversa que são utilizados na presente invenção podem ser quaisquer iniciadores que podem anelar o molde de RNA para realizar a transcrição reversa do RNA. Especificamente, os iniciadores de transcrição inversa podem ser iniciadores poli A, ou iniciadores específicos para o molde de RNA.

[071] Enquanto isso, a composição da reação de transcrição reversa de acordo com a presente invenção pode compreender um corante e/ou um pollol, o que não é reativo com o ácido nucleico, para os fins de conveniência dos experimentos, a prevenção da contaminação por produtos de PCR, a estabilização da DNA polimerase e dNTPs e o melhoramento da reatividade.

[072] 0 "corante não reativo" deve ser selecionado de entre substâncias que não influenciam reações de transcrição reversa, e é utilizado para analisar ou para identificar as reações de PCR utilizando os produtos da reação reversa. Exemplos de substâncias que satisfazem essas condições incluem corante solúvel em água, como a rodamina, tamra, lax, azul de bromofenol, xileno cianol, bromocresol vermelho, e cresol vermelho. Entre eles, o xileno cianol é preferencialmente utilizado. 0 corante não reativo pode estar contido em uma quantidade de 0,0001-0,01% em peso, preferencialmente 0,001-0,005% em peso, e mais preferencialmente 0,001-0,003% em peso, com base no peso total da composição. Se o teor de corante não reativo na composição é inferior a 0,0001% em peso, será difícil observar visualmente a migração de uma amostra durante a eletroforese em gel de agarose para análise após a reação de transcrição reversa, dado que a concentração do corante é baixa. Se o teor de corante não reativo na composição é superior a 0,01% em peso, uma alta concentração do corante solúvel em água pode atuar como um inibidor da reação durante a reação de transcrição reversa. Além disso, este corante pode interferir com a migração da amostra durante a eletroforese em gel de agarose.

[073] Além disso, o poliol pode ser usado como um estabilizador adicional para estabilizar ainda mais a composição da presente invenção, e pode ser um ou mais compostos selecionados a partir do grupo que consiste em glicose, glicerol, manitol, galacitol, glucitol, e sorbitol. 0 teor do poliol na composição pode ser 10-500 mM, e preferencialmente de 50-300 mM. Se o teor de poliol é superior a 500 mM, será difícil de dissolver com uma solução aquosa, devido à solubilidade do próprio polímero solúvel em água, será difícil de misturar suficientemente, devido à sua elevada viscosidade, irá aumentar o volume da composição a um volume maior do que o necessário, e não será facilmente dissolvida em uma solução esterilizada e de água destilada e gene antes da reação de transcrição reversa. Além disso, uma alta concentração do polímero solúvel em água pode atuar como um inibidor da reação durante a reação de transcrição reversa. Por outro lado, se o conteúdo do poliol na composição é inferior a 10 mM, a enzima alvo e superfície moléculas de água não podem ser suficientemente revestidos de modo que não podem ser protegidos, e assim o efeito de estabilizar de forma eficiente a enzima não pode ser obtido. Além disso, a solução pode espalhar por toda a parte inferior do tubo devido à sua muito baixa viscosidade e não pode ser seca em uma forma ideal, e a enzima não pode ser suficientemente protegida. Na presente invenção, em adição ao poliol, gelatina, albumina de soro bovino, Thesit ou PEG-8000 podem ser utilizados como um estabilizador.

[074] A composição da presente invenção é, preferencialmente liofilizada ou seca, a fim de aumentar a estabilidade, a conveniência de armazenamento e a estabilidade de armazenamento a longo prazo dos mesmos. A secagem pode ser realizada por um método de secagem conhecido, como secagem em temperatura ambiente, secagem em temperatura elevada, por exemplo, 40 a 60°C, liofilização, ou secagem em pressão reduzida. Além disso, qualquer método de secagem pode ser utilizado, contanto que o componente da composição não seja perdido. 0 método de secagem como descrito acima pode ser aplicado, dependendo do tipo e da quantidade de enzima utilizada. Na presente invenção, pode ser preferencialmente utilizado o método de secagem por congelamento ou o método de pressão reduzida que emprega a centrifugação a vácuo.

[075] A composição para o PCR de transcrição reversa hot-start pode ser preparada de uma forma estável por introdução da mistura de reação em um único tubo de reação, e, em seguida, imediatamente, congelamento ou secagem da mistura de reação.

[076] Se necessário, a mistura de reação pode ainda compreender um iniciador, uma sonda, o molde de ácido nucleico, um corante fluorescente, um corante não reativo e/ou um poliol.

[077] À medida que a DNA polimerase, DNA polimerase de qualquer conhecida pode ser utilizada na presente invenção sem limitação especial. Entre estas polimerases, uma polimerase tendo atividade 5' -> 3' exonuclease, uma polimerase tendo atividade 3'-> 5' exonuclease, e uma polimerase não tendo atividade 5' -> 3' exonuclease e atividade 3'-> 5' exonuclease pode ser utilizada isoladamente ou em combinação. Exemplos de polimerase tendo atividade 5' -> 3' exonuclease incluem Taq DNA polimerase, exemplos de polimerase tendo atividade 3'-> 5' exonuclease incluem Pfu DNA polimerase ou TLA DNA polimerase (Bioneer), e exemplos da polimerase não tendo atividade 5' -> 3' exonuclease e atividade 3'-> 5' exonuclease incluem Top DNA polimerase (Bioneer). A DNA polimerase pode estar contida na composição para PCR de transcrição reversa em uma concentração de 0,1-10 U (unidade), preferencialmente 0,5-2 U, e mais preferencialmente de 1 U. As Taq, Pfu, Top TLA e DNA polimerases têm as características mostradas na Tabela 1 abaixo. TABELA 1 [078] Além disso, a composição para a PCR de transcrição reversa pode ser usada em, além de PCR de transcrição reversa, qualquer reação de amplificação de ácidos nucleicos, como PCR de transcrição reversa multiplex em tempo real, PCR de transcrição reversa, PCR quantitativa em tempo real ou PCRs de transcrição reversa múltiplas em tempo real.

[079] Na presente invenção, a composição para a PCR de transcrição reversa pode ainda compreender uma substância que demonstra um efeito de PCR hot-start através da ligação a DNA polimerase ou regulando a ação da DNA polimerase. Esta substância pode ser selecionada a partir do grupo que consiste em um anticorpo, um aptâmero e um affibody, que se ligam à DNA polimerase.

[080] Na presente invenção, a DNA polimerase pode estar em uma forma modificada e pode ter um efeito de PCR hot-start, e os exemplos desta enzima incluem, entre outras, Tth polimerase.

[081] PPase é preferencialmente uma enzima estável ao calor que é termicamente estável, mesmo em uma temperatura de 70°C ou acima. Ela é estável termicamente durante os processos de transcrição reversa e PCR. Particularmente, PPase mostra a atividade enzimática em uma temperatura semelhante à temperatura a que a transcriptase reversa e DNA polimerase reagem. Por esta razão, a reação de transcrição reversa e PCR são impedidas de ocorrerem durante o processo de mistura e a PPase é reagida para decompor o PPi a uma temperatura igual ou superior à temperatura na qual os iniciadores especificamente hibridizam, em que a transcriptase reversa pode ser ativada enquanto a reação de transcrição reversa pode ser iniciada em temperatura de hibridização dos iniciadores, para eliminar a síntese de cDNA não específico. Além disso, quando a DNA polimerase hibridiza, a amplificação não específica de ácido nucleico pode ser evitada. Como resultado, a seletividade pode ser grandemente aumentada em comparação com a transcrição reversa/PCR convencionais, e uma quantidade muito pequena do ácido nucleico alvo pode ser detectada com sucesso. Assim, a composição da invenção para a reação de transcrição reversa ou PCR de transcrição reversa hot-start compreendendo PPi e PPase é uma composição estável, que pode resolver os problemas de reação de transcrição reversa não especifica que ocorrem na reação de transcrição reversa convencional, e a amplificação por PCR não específica resultante, e que podem amplificar especificamente um produto alvo desejado sem inconveniência para fornecer um resultado de amplificação preciso.

[082] Especificamente, a composição para a reação de transcrição reversa hot-start de acordo com a presente invenção tem as seguintes vantagens em relação às várias composições de reações de transcrição reversa que foram relatadas no estado da técnica e têm sido utilizados comercialmente: [083] 1) Mesmo quando um RNA alvo está contido em uma quantidade muito pequena no RNA total de uma solução de reação, a composição para PCR transcrição reversa hot-start, de acordo com a presente invenção pode realizar seletivamente a transcrição reversa do RNA alvo para realizar amplificação por PCR de um modo especifico para o RNA alvo. Assim, a composição da presente invenção torna possível detectar uma quantidade muito pequena de vírus de RNA ou análise de um gene de RNA ligado ao câncer.

[084] 2) A composição da presente invenção pode impedir a produção de produtos de amplificação causados por iniciação não específica, e, assim, pode detectar simultaneamente vários alvos em PCRs de transcrição reversa multiplex em que as reações de PCR de transcrição reversa para vários objetivos são realizadas em simultâneo.

[085] 3) Devido ao fato de que todos os componentes da mistura de reação para PCR de transcrição reversa, que são utilizados na presente invenção, são preparados como uma única mistura, um processo de mistura em separado não é necessário durante a PCR de transcrição reversa, e, assim, a ocorrência de erro causado pela mistura durante a reação pode ser evitada. Além disso, a ocorrência de produtos de PCR não específicos pode ser impedida, o experimento pode ser realizado convenientemente, contaminação por produtos de PCR de transcrição reversa podem ser prevenidos, e a estabilidade e reatividade da polimerase de transcrição reversa, DNA polimerase e dNTP pode ser aumentada.

[086] 4) Quando o ácido nucleico é utilizado em uma mistura com um estabilizador, a estabilidade é aumentada, é fácil de usar e fácil de armazenar.

[087] Em uma modalidade preferencial da presente invenção, a fim de resolver os problemas de reações de transcrição reversa não específicas que ocorrem na técnica anterior e realizar a reação de transcrição reversa hot-start de um modo específico para o alvo, apenas um RNA desejado em cDNA é sintetizado e PPi e PPase foram usadas na reação de transcrição reversa para realizar uma reação de PCR de um modo específico para o cDNA sintetizado para amplificar, assim, um RNA desejado com alta sensibilidade. Especificamente, 0,5 mM a 2,0 mM (preferencialmente 2,0 mM) de PPi e 0,005 U para 0,25 U, preferencialmente de 0,1 U de PPase foram adicionados a uma mistura de reação de transcrição reversa contendo polimerase de transcrição reversa, e em seguida, uma reação de transcrição reversa foi realizada utilizando a mistura de reação a 42°C durante 60 minutos. Como resultado, foi demonstrado que, quando nenhum de PPase foi adicionado, reações de transcrição reversa foram inibidas por PPi (ver Fig. 1), mas PPi e PPase foram adicionados, as reações de transcrição reversa e de PCR foram ativadas para aumentar a quantidade de produto de reação (ver Figs. 2 e 3) . Além disso, foi demonstrado que, quando o gene do virus da hepatite C foi amplificado utilizando o PPi e PPase, um molde de RNA possuindo um número de cópias de 1010 a 10 podería ser detectado (ver Fig. 4) , e quando o RNA total extraído de células humanas, além do molde de RNA do vírus da hepatite C, foi adicionado, as reações não específicas causadas pelo RNA humano foram inibidas, e RNAs além do RNA alvo não resultaram em uma diminuição da eficácia da reação e as alterações na sensibilidade e capacidade de detecção. No entanto, na ausência de PPi e PPase, reações não específicas foram causadas pelo RNA humano adicionado (ver Figs. 5a e 5b) . Além disso, foi demonstrado que, no método de PCR de transcrição reversa hot-start, as reações não específicas foram significativamente reduzidas em comparação com aqueles métodos convencionais de PCR hot-start empregando Taq anticorpo, e, assim, um RNA alvo, mesmo com um número de cópias de 10 foi detectado seletivamente com alta sensibilidade (ver Figs. 6a e 6b) . Além disso, a composição para PCR de transcrição reversa hot-start, de acordo com a presente invenção foi seca para aumentar a estabilidade e estabilidade de armazenamento da mesma, e foi verificado que a composição seca pode mostrar de forma estável resultados de reatividade e amplificação semelhantes aos da composição que não foi seca (ver Figs. 7 e 8) .

[088] Assim, a composição para reação de transcrição reversa hot-start e a composição para a PCR de transcrição reversa pode ser usada para realizar reação de transcrição reversa e PCR de alta sensibilidade, e, consequentemente, podem ser vantajosamente utilizadas em tecnologias de amplificação de RNA para análise de vários virus e exame da expressão do gene do câncer.

[089] Na presente invenção, a fim de evitar que o próprio molde de ácido nucleico não seja especificamente auto-iniciado e amplificado em reações de amplificação de ácidos nucleicos, como uma reação de PCR em tempo real ou reação de PCR quantitativa para a detecção do ácido nucleico alvo, um método pode adicionalmente ser utilizado, no qual uma substância para terminar a reação de polimerização e uma polimerase de ácido nucleico são adicionadas ao molde de ácido nucleico para realizar uma reação de terminação, de modo que o molde de ácido nucleico não pode atuar como um iniciador, e, portanto, apenas o ácido nucleico alvo pode ser amplificado e detectado com alta sensibilidade.

[090] Assim, a composição da presente invenção pode ser caracterizada pelo fato de compreender ainda um molde de ácido nucleico que tem um terminador de polimerização de ácido nucleico ligado à extremidade 3' para evitar a polimerização não especifica de ácido nucleico. 0 terminador de polimerização de ácido nucleico pode ser um composto do tipo de ácido nucleico que é ativado sob a forma de trifosfato capaz de atuar sobre a ácido nucleico polimerase e outros que têm um grupo hidroxil na extremidade 3'.

[091] Na presente invenção, o molde de ácido nucleico que tem o terminador de polimerização de ácido nucleico ligado ao mesmo, para evitar a polimerização não especifica de ácido nucleico é preparado pelo seguinte método de preparação de ácidos nucleicos que compreende as etapas de: 1) terminar a extremidade 3' do molde de ácido nucleico com uma mistura de reação contendo ácido nucleico polimerase, tampão de reação enzimática e um terminador de polimerização de ácido nucleico; e 2) inativar ou remover terminador da polimerização do ácido nucleico a partir da mistura de reação.

[092] Mais especificamente, o método de preparação do ácido nucleico podem compreender as etapas de: 1) separar e purificar ácidos nucleicos a partir de uma amostra biológica contendo o ácido nucleico; 2) terminar a extremidade 3' do molde de ácido nucleico separado e purificado da etapa 1) com uma mistura de reação contendo ácido nucleico polimerase, tampão de reação enzimática e um terminador de polimerização de ácido nucleico; e 3) remover ou inativar terminador da polimerização do ácido nucleico a partir da mistura de reação contendo o ácido nucleico terminados na extremidade 3'.

[093] 0 método de preparação de ácido nucleico descrito na presente invenção pode ser realizado utilizando um dispositivo de extração de ácido nucleico convencional conhecido, por exemplo, um dispositivo descrito na Patente Coreana No. 10-0148239, US 5702590, US 5647994, EP 0691541, ÜS 5336760, US 5897783, US6187270, ou patente de invenção coreana NO. 10-2008- 0032904. Além disso, o DNA ExiPrepTM-16 totalmente automatizada/RNA/Sistema de Purificação de Proteínas (Bioneer, Coréia do Sul) podem ser preferencialmente utilizados como um dispositivo de extração automática de ácidos nucleicos na presente invenção.

[094] Na presente invenção, a amostra pode ser uma amostra que contenha ácido nucleico (polinucleotídeo) e que é derivado a partir de qualquer planta, animal, bactéria ou vírus.

[095] Na presente invenção, o ácido nucleico é RNA ou DNA, e o ácido nucleico polimerase compreende qualquer ácido nucleico polimerase que permite que um terminador seja ligado à extremidade 3' de DNA ou de RNA, de modo a terminar a polimerização.

[096] Mais especificamente, o ácido nucleico polimerase que é utilizado na presente invenção é preferencialmente uma polimerase não tendo atividade 3' -* 5' exonuclease de modo a não hidrolisar o terminador. Mais preferencialmente, é um polímero que perde a sua atividade enzimática em uma temperatura de 90 °C ou superior. 0 ácido nucleico polimerase pode compreender pelo menos um selecionado de entre RNA polimerase dependente de RNA, DNA polimerase dependente de RNA, DNA polimerase e RNA polimerase.

[097] Como aqui utilizado, o termo "terminador de polimerização de ácido nucleico" refere-se a uma substância que termina a polimerização de todos os fragmentos do molde de ácido nucleico de modo que o ácido nucleico não se estenda. Refere-se também a uma substância que é ligada à extremidade do fragmento de molde de ácido nucleico de modo que o alongamento da cadeia do ácido nucleico não pode continuar a ocorrer.

[098] Como aqui utilizado, o termo "terminação" significa que o "termlnador de polimerização de ácido nucleico" está ligado de forma covalente à extremidade 3' do ácido nucleico para terminar a polimerização do ácido nucleico, e a substância que é usada para a terminação é definida como um terminador.

[099] Mais especificamente, o termo "terminação", como aqui mencionado, significa que uma substância não tendo nenhum grupo hidroxil na extremidade 3' ou tendo um grupo químico que termina em uma reação de polimerização causada pela polimerase é ligado de forma covalente à extremidade 3' do ácido nucleico para terminar a polimerização do ácido nucleico, e a substância que é usada para a terminação é definida como um terminador.

[0100] Na presente invenção, o terminador de ácido nucleico é um composto do tipo de ácido nucleico ativado sob a forma de trifosfato capaz de atuar sobre ácido nucleico polimerase e pode ser selecionado de entre vários nucleotídeos trifosfatos que não possuem o grupo 3' hidroxil ao qual o ácido nucleico está ligado ou que são substituídos por outros grupos. Pode ser um terminador de ácido nucleico tendo uma boa reatividade com ácido nucleico polimerase.

[0101] 0 composto tipo ácido nucleico que pode ser utilizado na presente invenção pode compreender pelo menos um selecionado de entre 2'3' -didesoxinuclosídeo 5'-trifosfato, 3 ' -desoxiadenosina 5'-trifosfato, 3' -azido-3'-desoxitimidina 5'-trifosfato, Ι-β-d-Arabinofuranosilnucleosídeo 5'-trifosfato, aciclo-guanosina trifosfato, 3'-amino-2'-desoxinuclosídeo 5'-trifosfato, e 3'— fluoro-3'-desoxinuclosídeo-5'-trifosfato.

[0102] Mais especificamente, DNA polimerase derivada de E. coli ou bactérias de resistência ao calor pode ser 2'3'-dideoxinucleotídeo trifosfato (ddNTP) que tem sido frequentemente utilizada no método de sequenciação de didesoxi desenvolvido por Sanger.

[0103] Na presente invenção, o dideoxinucleotídeo trifosfato (ddNTP) pode compreender, pelo menos, um selecionado de entre didesoxiguanosina trifosfato (ddGTP), didesoxiadenosina trifosfato (ddATP), didesoxitimidina trifosfato (ddITP), e didesoxicitidina trifosfato (ddCTP).

[0104] 0 deoxinucleotídeo trifosfato (dNTP) pode compreender, pelo menos, um selecionado de entre guanosina, adenosina, timidina, uridina e citidina.

[0105] Por exemplo, vários terminadores de polimerização de ácido nucleico podem ser usados para realizar uma reação de terminação utilizando DNA polimerase. Quando a DNA polimerase derivada de mamíferos é utilizada, é possível a utilização de 5'-trifosfato Ι-β-d-arabínofuranosilcitosina ou 5'-trifosfato 9-β-ά-arabinofuranosiladenina, que tem reatividade elevada com esta enzima (Inibição de DNA polimerase de mamífero pela 5'-trifosfato de Ι-β-d-arabinofuranosilcítosina e o 5'-trifosfato de 9-p-d-arabinofuranosiladenina, J.J. Furth, e Seymour S. Cohen, Câncer Res 28, October 1968; 2061).

[0106] Além disso, aciclonucleosídeo trifosfato que tem sido frequentemente utilizado como um agente antiviral para a inibição de DNA polimerases virais também pode ser usado como o terminador de polimerização de ácido nucleico (Inhibition of herpes simplex virus-induced DNA polimerase activity and viral DNA replication by 9-(2-hydroxyethoxymethyl)guanine and its triphosphate. P A Furman, Μ H St Clair, J A Fyfe, J L Rideout, P M Keller e G B Elion, J. Virol . October 1979 vol . 32 no. 172-77) .

[0107] Além disso, a polimerase de poli A que é uma RNA polimerase é uma enzima que é utilizada para ligar adenosina na extremidade 3' do RNA e é adequada para a terminação da polimerização de ácido nucleico, como descrito na presente invenção. Quando esta enzima é usada, 3'-desoxiadenosina trifosfato (3'-dATP; cordicepina) conhecido como um inibidor da polimerase de poli A pode ser utilizado.

[0108] Na presente invenção, a etapa 2) é um processo de inativar ou remover terminador de polimerização de ácido nucleico não reagido após a etapa 1), em que a inativação do terminador de polimerização de ácido nucleico pode ser realizada utilizando qualquer enzima capaz de hidrolisar a ligação trifosfato de várias terminadores de polimerização de ácido nucleico que são usados na polimerização.

[0109] Mais especificamente, o terminador de ácido nucleico é preferencialmente facilmente inativado por calor, porque perde a sua função enzimática, depois que inativa os terminadores de polimerização de ácido nucleico, por hidrólise. Isto é assim porque não degrada o trifosfato de nucleotideo em uma subsequente reação de transcrição reversa ou reação de PCR.

[0110] Por exemplo, a fosfatase pode ser BAP (fosfatase alcalina bacteriana) ou CIP (fosfatase intestinal de bezerro), que tem a propriedade de degradar trifosfato. Preferencialmente, CIP, que é facilmente inativada por calor é utilizada.

[0111] Além disso, uma fosfatase alcalina (Autotaxina) (Clair T, Lee HY, Liotta LA, Stracke ML (1997) . "Autotaxin is an exoenzyme possessing 5'-nucleotíde phosphodiesterase/ATP pyrophosphatase and ATPase activítíes". J. Biol. Chem. 272 (2) : 996-1001 doi: 10.1074/jbc.272.2.996 PMID 8995394.) pode ser usada, e que hidrolisa ATP e pirofosfato e é derivada de vários organismos, incluindo E. coli, intestino delgado de bovino, e camarões. Além disso, sintase adenosina de Staphylococcus aureus (Adsa) que degrada não especificamente nucleotideo trifosfato pode ser utilizada.

[0112] No método de preparação de ácido nucleico de acordo com a presente invenção, subsequentemente ao processo de separação/purificação de ácido nucleico, ácido nucleico polimerase e um terminador de polimerização de ácido nucleico podem ser adicionados ao ácido nucleico extraído para terminar a polimerização do ácido nucleico para evitar, deste modo a iniciação não específica dos moldes de ácido nucleico. Depois da reação, é necessária uma etapa de remoção de terminadores de polimerização de ácidos nucleicos que não reagiram, porque os terminadores de polimerização de ácido nucleico que não reagiram atuam como um inibidor de uma reação em cadeia da polimerase subsequente ou outras reações de PCR.

[0113] A remoção do terminador de polimerização de ácido nucleico pode ser realizada por meio de filtração em gel, ou um agente caotrópico e uma esfera de silica, mas não está limitado a estes.

[0114] 0 método de preparação de ácido nucleico de acordo com a presente invenção pode ser realizado utilizando um analisador de ácidos nucleicos conhecidos que compreende um sistema de extração de ácido nucleico automático conhecido e um sistema de amplificação do gene. Preferencialmente, Exiprep 16 DX (Bioneer, Coréia) , como descrito acima pode ser utilizado, mas não está limitado a estes.

[0115] Mais especificamente, subsequentemente ao processo de separação/purificação de ácido nucleico, ácido nucleico polimerase e um terminador de ácido nucleico podem ser adicionados ao ácido nucleico extraído para terminar a reação de polimerização do ácido nucleico e inativar a função de iniciação de todos os ácidos nucleicos. O terminador remanescente após a cessação atua como um inibidor de uma subsequente reação de transcrição reversa ou de reação de PCR, e por esta razão, dois métodos podem ser utilizados para remover o terminador restante: um método de realizar outra vez a purificação de RNA utilizando o sistema Exiprep 16 DX (Bioneer); e um método de degradação do terminador de polimerização de ácido nucleico, de modo a não reagir.

[0116] O método de realizar a purificação de RNA utilizando o sistema Exiprep 16 DX é um método no qual o RNA é ligado às partículas magnéticas de sílica, na presença de um agente caotrópico e lavado e eluído. Este método tem problemas na medida em que é demorado, devido às várias etapas a serem realizadas, e em que o RNA purificado é perdido. Por outro lado, o método de inativação do terminador de polimerização de ácido nucleico ativado (nucleotídeo trifosfato), degradando-o em di ou mono trifosfatos tem muitas vantagens na medida em que é rápido e simples e não reduz o rendimento.

[0117] Mais especificamente, no método de inativação do terminador de polimerização de ácido nucleico usando a enzima, os poços de Exiprep 16 DX, que contêm partículas magnéticas e que são usados na etapa de eluição, são poços de temperatura controlável. Assim, após eluição com tampão de eluição, o terminador de polimerização de ácido nucleico pode ser facilmente removido pela adição de hidrolase trifosfato, como fosfatase alcalina, autotoxina ou sintase adenosina de Staphylococcus aureus (Adsa) aos poços e reagir a enzima a 37°C.

[0118] Em outro aspecto, a presente invenção também se refere a um método para a preparação de uma composição para reação de transcrição reversa hot-start ou PCR de transcrição reversa hot-start.

[0119] Especificamente, o método de preparação compreende a introdução de uma mistura de reação, a qual compreende uma solução tampão de reação, MgCl2, quatro tipos de dNTPs, polimerase de transcrição reversa, PPi e PPase, em um único tubo de reação. Particularmente, na preparação da composição para PCR de transcrição reversa hot-start, a mistura de reação compreende ainda DNA polimerase.

[0120] A DNA polimerase pode ser uma ou mais selecionadas do grupo que consiste em uma polimerase tendo atividade 5' -> 3' exonuclease, uma polimerase tendo atividade 3' -> 5' exonuclease, e uma polimerase não tendo atividade 5' -> 3' exonuclease e atividade 3' -> 5' exonuclease.

[0121] Preferencialmente, o método de preparação acima compreende ainda uma etapa de congelamento ou secagem da mistura de reação para formar uma composição seca tendo uma maior estabilidade e estabilidade de armazenamento a longo prazo, mas não está limitado a estes.

[0122] 0 pirofosfato (PPi) está preferencialmente contido em uma concentração de 0,1-5 mM, e preferencialmente de 0,5-2,0 mM, e a pirofosfatase é preferencialmente contida em uma quantidade de 0,005-0,25 U por 0,1 mM PPi, mas não está limitado a estes.

[0123] Além disso, a mistura de reação pode compreender, pelo menos, uma selecionada a partir do grupo que consiste em um ou mais iniciadores ou sondas, um corante fluorescente que se liga ao DNA, o molde de ácido nucleico, um corante não reativo com o ácido nucleico, um poliol, gelatina, albumina de soro bovina, Thesit, e PEG-8000. Aqui, o corante fluorescente pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em SYBR Verde, EtBr e HRdye, e o corante pode ser um ou mais selecionados do grupo que consiste em rodamina, tamra, lax, azul de bromofenol, xileno cianol, vermelho de bromocresol, e vermelho de cresol.

[0124] Ainda em outro aspecto, a presente invenção é dirigida a um kit para a reação de transcrição reversa hot-start, a qual compreende a composição acima descrita para a reação de transcrição reversa hot-start.

[0125] A presente invenção é também dirigida a um kit para PCR de transcrição reversa hot-start, a qual compreende a composição acima descrita para PCR de transcrição reversa hot-start.

[0126] 0 kit pode ser preparado de acordo com um método convencional para a preparação de um kit para a reação de transcrição reversa ou um kit para a PCR de transcrição reversa.

[0127] A presente invenção é também dirigida a um método de transcrição reversa do molde de RNA, o método compreendendo as etapas de: misturar a composição para iniciar a reação de transcrição reversa hot-start com uma amostra contendo o molde de RNA, para formar uma mistura de reação; e realizar uma reação de modo a que a mistura de reação possa ser transcrita de modo reverso.

[0128] A presente invenção também fornece um método de amplificação de ácido nucleico, o método compreendendo as etapas de: misturar a composição PCR de transcrição reversa hot-start com uma amostra contendo molde de RNA para se obter uma mistura de reação; realizar uma reação de modo a amplificar a mistura de reação para assim se obter um produto de amplificação; e analisar o produto de amplificação.

[0129] Aqui, a reação de PCR de transcrição reversa pode ser qualquer uma ou mais dos PCRs de transcrição reversa multiplex, PCR de transcrição reversa em tempo real, PCR transcrição reversa quantitativa em tempo real.

[0130] Em uma modalidade preferencial da presente invenção, o molde de ácido nucleico é preferencialmente um RNA que pode ser amplificado através de transcrição reversa e PCR.

[0131] A composição da invenção para a reação de transcrição reversa hot-start e a composição da invenção para a PCR de transcrição reversa compreendem, além de uma mistura de reação de transcrição reversa compreendendo solução de tampão de reação, MgCl2, quatro tipos de dNTPs e polimerase de transcrição reversa, PPi e PPase, o que pode impedir uma reação de transcrição reversa de ocorrer em um processo de mistura em temperatura ambiente. Além disso, PPi pode ser degradado para ativar a polimerase de transcrição reversa por reação de PPase a uma temperatura igual ou superior à temperatura em que os iniciadores hibridizam especificamente, e, assim, uma reação de transcrição reversa pode ser iniciada em temperatura de hibridização de modo uma sintese de cDNA não especifica pode ser eliminada. Assim, a seletividade pode ser grandemente aumentada em comparação com as reações de transcrição reversa convencionais, e mesmo uma quantidade muito pequena do RNA alvo pode ser detectada com sucesso. Além disso, quando a composição é congelada, ou seca em uma mistura com um estabilizador, esta pode ser usada de uma maneira estável e conveniente em comparação com composições convencionais, e, assim, é útil como uma composição mais estável para reação de transcrição reversa hot-start.

[0132] Em uma modalidade da presente invenção, uma transcrição reversa hot-start foi realizada na presença de PPi e PPase utilizando um iniciador reverso correspondendo exatamente ao molde de RNA e um iniciador tendo uma sequência de nucleotideos descombinada com o molde de RNA. Como resultado, o produto de amplificação foi detectado no iniciador reverso correspondendo exatamente ao molde de RNA, mas não foi detectado no iniciador inverso tendo a sequência de nucleotideos descombinada do molde de RNA. Pelo contrário, verificou-se que, quando uma reação de transcrição reversa hot-start foi realizada na ausência de PPi e PPase, o produto de amplificação foi detectado mesmo no iniciador reverso tendo a sequência de nucleotideos descombinada.

[0133] Em outra modalidade da presente invenção, o único polimorfismo de nucleotideos do RNA alvo foi analisado utilizando uma reação de PCR de transcrição reversa hot-start. Como resultado, verificou-se que, quando a reação de transcrição reversa hot-start foi realizada na presença de PPi e PPase, os resultados obtidos utilizando o iniciador correspondendo exatamente ao molde de RNA diferiram na eficiência de PCR a partir dos resultados obtidos utilizando o iniciador reverso tendo um único nucleotideo descombinado. No entanto, a reação de transcrição reversa hot-start não tendo PPi e PPase foi detectada no mesmo ciclo, sem diferença entre o iniciador reverso combinado e o iniciador reverso descombinado. Isto sugere que o inicio a reação de transcrição reversa hot-start de acordo com a presente invenção faz com que seja possivel a análise de polimorfismo de nucleotideos utilizando um método de PCR em tempo real, mas em uma solução de reação não tendo a função de transcrição reversa hot-start, é dificil para analisar único polimorfismo de nucleotideos.

[0134] Em outra modalidade da presente invenção, o efeito de reação de PCR de transcrição reversa hot-start com a presente invenção sobre a inibição de reações não especificas resultantes da auto-iniciação de ácidos nucleicos de cadeia simples contidos nos ácidos nucleicos extraídos foi examinado. Como resultado, foi verificado que a reação de transcrição reversa hot-star inibiu reações não específicas resultantes de auto-iniciação, em comparação com uma solução de reação não tendo função hot-start (isto é, não tendo qualquer PPi e PPase).

[0135] Em outra modalidade da presente invenção, o efeito de terminação de RNA na inibição em reações de PCR de transcrição reversa não específica resultantes a partir de RNA auto-iniciação foi examinada. Foi mostrado que, quando um RNA extraído terminado com poli (A) polimerase e 3'-desoxiadenosina 5'-trifosfato (3'-dATP) na extremidade 3' foi utilizado como um molde, o sDNA foi sintetizado a partir de RNA não terminado mesmo quando qualquer iniciador não foi adicionado. Em outras palavras, o cDNA foi sintetizado pela auto-iniciação e amplificado no PCR. Além disso, a amplificação por PCR resultante da sintese de cDNA não especifico pode não ser perfeitamente evitada, mesmo por reação de PCR de transcrição reversa hot-start, e a reação de PCR de transcrição reversa por RNA de auto-iniciação pode ser parcialmente inibida, e, assim, o valor de Ct foi reduzido por cerca de 5 indicando que a reação não especifica podería ser inibida em cerca de 1/30.

[0136] No entanto, foi mostrado que, em uma amostra que compreende o RNA terminado na extremidade 3', cDNA não foi amplificado até 45 ciclos em todas as reações de PCR de transcrição reversa, indicando que nenhum cDNA foi sintetizado. Tais resultados sugerem que muitas reações de PCR de transcrição reversa não específicas ocorrem durante a mistura da reação de PCR de transcrição reversa misturada, e por esta razão, muitos cDNAs não específicos são preparados. Além disso, a partir dos resultados anteriores, pode ser visto que reações indesejadas não podem ser inibidas pelo PCR de transcrição reversa hot-start isolado. Como resultado, pode ser observado que tais reações de PCR de transcrição reversa não específicas resultantes a partir de RNA de auto-iniciação podem ser inibidas perfeitamente pela terminação do RNA utilizando a reação de terminação da presente invenção.

[0137] Em outra modalidade da presente invenção, verificou-se que, quando o PCR hot-start da presente invenção é usado, o limite de detecção de um marcador de câncer é aumentado.

[0138] A informação da sequência de nucleotideos de Homo sapiens queratina 8 (KRT8) como um marcador de câncer foi obtida a partir do National Center for Biotechnology Information (NCBI, EUA) , e o RNA foi extraído a partir de células Hela C humanas e submetido a terminação de RNA. Como resultado, no caso de amostras submetidas à terminação de RNA, o marcador de câncer foi detectado em uma reação de amostra de transcrição reversa hot-start contendo 10 ou mais células Hela adicionadas a 1 ml de soro humano. No caso de reações não tendo função de reação de transcrição reversa hot-start, o marcador de câncer foi detectado na amostra contendo 100 ou mais células Hela. No caso de amostras que compõem o RNA não terminado, o marcador de câncer foi detectado em amostras de reação de transcrição reversa hot-start contendo 100 ou mais células Hela. No caso de soluções de reação não tendo a função de transcrição reversa hot-start, o marcador câncer foi detectado nas amostras que continham 1000 ou mais células Hela.

[0139] Assim, pode ser observado que o limite de detecção foi aumentado mesmo pela reação de transcrição reversa hot-star isolada, mas um melhor efeito pode ser obtido quando a reação de transcrição reversa hot-start foi realizada em conjunto com a terminação de RNA.

[0140] Embora a presente invenção tenha sido descrita em detalhes com referência às características específicas, será evidente para os especialistas na técnica que esta descrição é apenas para uma modalidade preferencial e não limita o escopo da presente invenção. Assim, o escopo substancial da presente invenção será definido pelas reivindicações anexas e seus equivalentes.

Exemplos [0141] Daqui em diante, a presente invenção será descrita em maior detalhe com referência aos exemplos. Deve ser compreendido, contudo, que estes exemplos são apenas para fins ilustrativos e não se destinam a limitar o escopo da presente invenção.

[0142] Exemplo 1: Análise do efeito de PPi na inibição de reações de transcrição reversa [0143] A fim de examinar as condições em que uma reação de transcrição reversa é inibida pelo PPi, uma reação de transcrição reversa foi realizada utilizando ion de magnésio 1,5 mM e concentrações variáveis de PPi, e o produto de reação foi submetido a PCR. Especificamente, 0,5-2 mM de PPi foi adicionado ao AccuPower RT Premix (Bioneer, Coréia), e foram realizadas uma reação de transcrição reversa e reação de PCR. A reação de transcrição reversa foi realizada utilizando 100 ng, 10 ng, 1 ng ou 100 pg de RNA extraído a partir de células Hela humanas foi adicionado, na presença de PPi adicionado a uma concentração de 0, 0,5, 1, 1,5, 2 ou 2,5 mM. A Reação de transcrição reversa foi realizada uma vez a 42°C (a temperatura ideal de AccuPower RT Premix (Bioneer, Coréia)) durante 60 minutos, e foi realizada uma vez em 95°C durante 5 minutos para inativar a transcriptase reversa. 5 u£ de 20 u£ de produto de reação de transcrição reversa foi adicionado a AccuPower PCR Preraix (Pioneer, Coréia) e submetido a uma reação de PCR utilizando o iniciador direto 5'-GGAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3' (SEQ ID NO: 1) e iniciador reverso GAPDH 5'-GCCAAATTCGTTGTCATACC-3' (SEQ ID NO: 2), que tem como alvo as sequências de nucleotideos dos iniciadores GAPDH humanos. A reação de PCR foi realizada nas seguintes condições: pré-desnaturação a 95°C durante 5 min e, em seguida, com 30 ciclos de 95°C durante 20 seg, 55°C por 40 seg, e 72°C por 60 seg como um ciclo, são seguidas por extensão final a 72°C durante 5 min. 0 produto da reação de PCR foi submetido a eletroforese em gel de agarose, juntamente com um marcador de peso molecular de DNA, e, em seguida, corado com brometo de etidio e a banda de DNA amplificada pela reação de PCR foi fotografada com uma câmara Polaroid. Como um controle positivo, RT PreMix (Pioneer, Coréia) não contendo o PPi foi utilizado, e o produto foi submetido a uma reação de PCR.

[0144] Como resultado, pode ser observado que, no grupo experimental contendo o PPi, o Reação de transcrição reversa foi inibida a partir de uma concentração de PPi de 0,5 mM e foi inibida de forma mais clara quando o PPi 2 mM foi adicionado (FIG. 1) .

[0145] Exemplo 2 : Análise da transcrição reversa por PPase que hidrolisa o PPi em dois fosfatos [0146] Os resultados do Exemplo 1 indicaram que as reações de transcrição reversa foram inibidas por adição de PPi. Para a reação de transcrição reversa como descrito acima, PPase que degrada o PPi em dois fosfatos foi adicionado a fim de examinar a ativação da reação de transcrição reversa. Especificamente, sob a condição em que o PPi foi adicionado da mesma maneira como descrito no Exemplo 1, 0,1 U de PPase foi adicionado, e uma reação enzimática PPi e uma reação de transcrição reversa foram realizadas em simultâneo a 42°C durante 60 minutos. Em seguida, o produto da reação foi deixado em repouso a 95°C durante 5 minutos de modo a inativar a transcriptase reversa, e foi então submetido a PCR.

[0147] Como resultado, verificou-se que, quando PPase foi adicionado, a PCR foi ativada para maximizar a quantidade do produto de PCR (Fig. 2).

[0148] Exemplo 3: Exame de PCR de transcrição reversa em tempo real na presença de PPi e PPase [0149] A fim de analisar em reação de PCR de transcrição reversa em tempo real por uma composição contendo o PPi e PPase, 2 mM PPi e 0,1 U PPase foram adicionados à solução 2X PCR PreMix (contendo 10 mM Tris-HCl pH 9,0, KC1 50 mM, 1,5 mM MgCl2, quatro tipos de dNTPs (250 uM cada), 1U de taq DNA polimerase, 200 U de transcriptase reversa, 1 mM DTT, 0,01% Tween 20, e estabilizador), e a reação foi realizada utilizando 25 μ£ da solução de PCR PreMix. O iniciador direto 5'-CGTGGAAGGACTCATGACCACA-3' (SEQ ID NO: 3), o iniciador reverso GCCTTGGCAGCGCCAGTAGA-3 ' (SEQ ID NO: 4) e a sonda 5'-CTGTGGATGGCCCCTCCGGGAAA-3 ' (SEQ ID NO: 5), que têm como alvo o gene GAPDH humano, foram sintetizados e cada um foi adicionado a uma concentração de 10 nM. Como molde de RNA, o RNA total extraído de células Hela foi usada em uma quantidade de 100 ng, 10 ng, 1 ng ou 100 pg. Em seguida, foi adicionada água destilada à mistura até um volume final de 50 μ£. PCR de transcrição reversa em tempo real foi realizada utilizando Exicycler 96 Real-Ilme Quantitative Thermal Block (Bioneer, Coréia) , sob as seguintes condições: a transcrição reversa a 50°C durante 15 minutos e, em seguida, pré-desnaturação a 95°C durante 5 min, e em seguida 45 ciclos, cada ciclo consistindo de desnaturação a 95°C durante 5 segundos, anelamento a 60°C durante 5 seg, extensão a 72°C durante 6 seg, e varredura para a detecção de fluorescência.

[0150] Como resultado, demonstrou-se que o PPi e PPase não influenciaram o PCR de transcrição reversa em tempo real, e um gráfico padrão tendo uma inclinação de -3,1 e um valor linear de R2 de 0,9994 foi representada (Fig. 3).

[0151] Exemplo 4: Detecção do vírus da hepatite C RNA por reação de transcrição reversa hot-start [0152] Para a realização PCR de transcrição reversa em tempo real, o molde de RNA foi preparado. Especificamente, um gene do vírus da hepatite C foi sintetizado por um método de síntese de genes (ver Biochem. Biophys, Res . Commun 1998, 248, 200-203), e uma porção do mesmo foi clonado em um vetor pGEM-T-Easy (Cat. A1360, Promega, EUA) . Especificamente, 5 U.Q de tampão de ligação rápida 2X (Promega, EUA), 1 uQ de vetor T-easy (Promega, EUA), 1 U8 de T4 DNA ligase (Promega, EUA) , e 3 fjQ (8 ng) do gene sintetizado foram colocados e misturados no mesmo tubo, e depois incubados em repouso a 37°C durante 1 hora. Em seguida, 5 u8 da solução de reação incubada foi adicionada a 50 de células de E. coli competentes, mantidas em gelo durante 40 minutos, incubadas a 429C durante 40 segundos, e, em seguida, mantidas em gelo durante 2 minutos. A solução da reação foi semeada em uma placa de LB contendo ampicilina, isopropil 1-tio β-D-galactosídeo (IPTG) e X-gal, e foi, em seguida, incubada a 37°C durante 16 horas. Após a incubação, as colônias brancas foram tomadas, incubadas em meio LB liquido durante 16 horas e, em seguida, centrifugadas. 0 sobrenadante foi removido, e o DNA de plasmídeo foi extraído a partir do pellet utilizando um kit AccuPrep Plasmid Prep (Bioneer, Coréia). Quando o DNA de plasmídeo tinha uma pureza de 1,8-2,0 como medido por um espectrofotômetro de UV (Shimadzu, Japão) , o DNA de plasmídeo foi transcrito em RNA usando um kit de transcrição in vitro MAXIscript (Ambion, EUA). Após a transcrição, quando o RNA tinha um pureza de 1,8-2,0 como medido por um espectrof otômetro de UV, este foi utilizado como molde de RNA em um subsequente PCR de transcrição reversa em tempo real. 0 número de cópias do RNA foi calculado usando a seguinte equação 1: Equação 1 6,02 x 1023 x concentração (g / ΓΠ-β, medido por espectrof otometr ia UV)/(150 + 3015) x 340 [0153] em que 3015 representa o tamanho do vetor T (3015 pb) , e 150 representa o tamanho do molde de RNA do vírus da hepatite C (150 pb) . Depois de calcular o número de cópias o molde de RNA foi diluído serialmente 10 vezes com 1 χ tampão TE (10 mM Tris-HC1, pH 8,0, EDTA 0,1 mM) e foi armazenado a -70°C até seu uso. Usando o RNA construído como um molde, PCR de transcrição reversa em tempo real foi realizada utilizando 30 nM do iniciador direto do vírus da hepatite C 51-ACCGGGTCCTTTCTTGGAT-3' (SEQ ID NO: 6), o iniciador reverso 5'-CCCTATCAGGCAGTACCACA- 3' (SEQ ID NO: 7) e a sonda [5'FAM]-CGTGCCCCCGCRAGACTGCT-[3'BHQl] (SEQ ID NO: 8) . Os reagentes utilizados no PCR de transcrição reversa em tempo real foram os mesmos como descrito no Exemplo 3, e o molde de RNA com um número de cópias de 1010, 109, 108, 107, 106, 105, 104 , 103, 102 ou 10 foi adicionado. A reação foi realizada do mesmo modo como descrito no Exemplo 3, exceto o iniciador, a sonda e o molde de RNA.

[0154] Como resultado, o molde de RNA com um número de cópias que varia 1010-10 podería ser detectado e um gráfico padrão do modelo padrão de PCR de transcrição reversa em tempo real que foi repetido duas vezes mostrou uma inclinação de -3,21 a -3,73 e um valor de R2 linear de 0,995-0, 998 (Fig. 4) . Aqui, R2 é uma correlação que indica que a linearidade da curva padrão traçada da PCR em tempo real, e um R2 mais próximo de 1 (mais próximo de uma linha reta) indica que a PCR foi realizada com mais precisão.

[0155] Exemplo 5: Análise do efeito do PPi e PPase na inibição da reação não especifica em PCR de transcrição reversa em tempo real [0156] A fim de examinar o efeito do PPi e PPase sobre a reação não especifica de RNA purificado de uma amostra clinica real, 1 jLíg de RNA total extraído de células Hela em adição ao molde de RNA alvo foi adicionado aos mesmos iniciadores, sonda e solução de PCR de transcrição reversa em tempo real, como descrito no Exemplo 4. Como um controle, uma solução de reação não tendo função de transcrição reversa hot-start (isto é, não tendo qualquer PPi e PPase) . A fim de examinar a inibição de reações não específicas, 1 jUg de RNA total extraído de células humanas foi adicionado para reagir com cada um de uma solução de reação de transcrição reversa hot-start e uma solução de reação não tendo função de transcrição reversa hot-start. Este Exemplo foi realizado da mesma forma que o descrito no Exemplo 4, exceto em que o RNA extraído foi adicionado.

[0157] Como resultado, verificou-se que, quando a reação de transcrição reversa hot-start foi realizada na presença de PPi e PPase, as reações não específicas por outros RNAs além do RNA alvo foram inibidas, e outras RNAs além do RNA alvo não resultaram em uma redução na eficiência da reação e as alterações na sensibilidade e capacidade de detecção. No entanto, foi demonstrado que, na transcrição reversa hot-start que foi realizada na ausência de PPi e PPase, as reações não específicas foram causadas pela RNA celular humano adicionado, e a eficiência da reação, a capacidade de detecção e sensibilidade diminuíram significativamente (FIG. 5a). O produto da PCR transcrição reversa em tempo real foi analisado por eletroforese em gel de agarose a 2%, e, como resultado, foi demonstrado que, no caso do produto não submetido à reação de transcrição reversa hot-start, as reações não especificas mais ativamente ocorreram devido ao RNA total extraído a partir das células humanas (Fig. 5b). Assim, pode ser observado que os problemas, como uma diminuição na eficiência da reação em reações não específicas de transcrição reversa em reações de PCR podem ser resolvidos por uma reação de transcrição reversa hot-start na presença de PPi e PPase.

[0158] Exemplo 6: Comparação da inibição de reações não específicas entre o uso de reação de transcrição reversa ho t -start e utilização de PCR hot-start em PCR de transcrição reversa em tempo real [0159] A fim de examinar qual de uma reação de transcrição reversa hot-start e um PCR hot-start é mais eficaz na reação de especificidade e sensibilidade em PCR de transcrição reversa em tempo real, o experimento seguinte foi executado. Em adição aos mesmos iniciadores, sonda e solução de reação de PCR de transcrição reversa em tempo real, como descrito no Exemplo 5, molde de RNA alvo e um 1 p.g de RNA total extraído de células humanas foram usados. Uma solução de reação não tendo função de transcrição reversa hot-start (isto é, não tendo qualquer PPi e PPase) foi usada em uma mistura de reação de PCR hot-start compreendendo Taq anticorpo. Para examinar o efeito da reação de transcrição reversa hot-start na inibição de reações não especificas, o PPi e PPase foram adicionados a uma mistura de reação de PCR hot-start compreendendo Taq anticorpo, e uma reação de transcrição reversa hot-start e um PCR hot-start foram utilizados simultaneamente.

[0160] Como resultado, verificou-se que, na transcrição reversa e PCR, as reações não especificas não poderíam ser inibidas pela reação de PCR hot-start sozinha, e quando a reação de transcrição reversa hot-start foi realizada na presença de PPi e PPase, as reações não específicas para uma grande quantidade de RNA poderíam ser inibidas. Além disso, foi demonstrado que a reação de PCR hot-start empregando Taq anticorpo inibiu as reações não específicas de PCR em baixa temperatura, mas não poderia inibir as reações não específicas na reação de transcrição reversa. Assim, pode ser observado que a reação de transcrição reversa hot-start é necessária para eliminar as reações não específicas na reação de transcrição reversa e a reação de PCR. Em ambas reação de transcrição reversa e a reação de PCR, produtos de reação não específicos reduziram na reação de PCR realizada utilizando Taq anticorpo (B da FIG. 6b) em comparação com aqueles na reação não tendo função hot-start (B da FIG. 5b), as reações não específicas ainda ocorreram, e, assim, foi difícil detectar o vírus da doença, como o DNA do vírus da hepatite C alvo possuindo um número de cópias de 100 ou menos em amostras contendo grandes quantidades de RNAs humanos derivados de células humanas (B da FIG. 6a) . Por outro lado, na reação que compreende o PPi e PPase, as reações não específicas de RNA derivadas de células humanas não ocorreram (D da FIG 6b. ) , o DNA do vírus da hepatite C alvo com um número de cópias de 10 ou mais pode ser detectado com alta densidade (D da FIG. 6a) .

[0161] Exemplo 7 : Análise do molde padrão de PCR de transcrição reversa em tempo real, utilizando uma transcrição reversa tipo seca/composição de PCR

[0162] A fim de examinar a estabilidade térmica de um material seco da solução de mistura de transcrição reversa/PCR, uma solução de mistura de PCR contendo o PPi e PPase, como descrito no Exemplo 4, foi preparada e seca, e PCR de transcrição reversa em tempo real foi realizada em um Exicycler Quantitativa Thermal Block (Bioneer, Coréia) usando a mistura seca. Especificamente, 5 μβ de 10 x tampão, 3 U de Taq DNA polimerase, 5 μβ de dNTP 20 mM, PPi, PPase, estabilizador e outros semelhantes foram introduzidos em um único tubo, e água destilada foi adicionada a um volume total de 25 μβ. A solução mistura foi dispensada para dentro do tubo de Exicycler Quantitative Thermal Block (Bioneer, Coréia) e seca usando SuperCentra (Bioneer, Coréia) por 50-60 minutos. Em seguida, os iniciadores e sonda utilizados no Exemplo 4 foram misturados uns com os outros para um volume total de 5 U.Q e adicionados à mistura seca, seguida por secagem durante 30 minutos. À mistura seca, o molde de RNA como usado no Exemplo 6 foi adicionado, e água destilada foi adicionada à mesma, para um volume total de 50μβ, e a solução resultante foi suficientemente misturada de modo que o material seco foi dissolvido facilmente. PCR de transcrição reversa em tempo real foi realizada do mesmo modo que o descrito no Exemplo 4, exceto que Exicycler Quantitative Therma Block (Bioneer, Coréia do Sul) foi usado, um controle negativo (amostra em branco não tendo molde de RNA) também foi reagido, e um molde de RNA foi utilizado com um número de cópias de ΙΟ6, ΙΟ5, ΙΟ4, ΙΟ3, 102 ou 10 .

[0163] Como resultado, como o Exemplo 4, o molde de RNA com um número de cópias de 10 ou mais pode ser detectado, e quando o gráfico padrão do modelo padrão de PCR de transcrição reversa em tempo real foi plotado, este mostrou uma inclinação de -0,2932 e um valor de R2 de 0,9991. Os resultados acima sugerem que a mistura seca mostrou o mesmo desempenho de uma mistura em estado de solução em PCR de transcrição reversa em tempo real (FIG. 7).

[0164] Exemplo 8: Teste para a estabilidade da composição de transcrição reversa seca/reação de PCR em vários períodos de armazenamento [0165] Usando a mesma composição e método como descrito no Exemplo 7, uma mistura de PCR contendo o PPi e PPase foi preparada, e, em seguida, armazenada a 50QC em intervalos de 1 dia, durante 8 dias. Em seguida, a composição de PCR seca de acordo com cada período de armazenamento foi tratada usando Exicycler96 Quantitative Thermal Block, e o molde de RNA foi utilizado com um número de cópias de ΙΟ6, ΙΟ5, 104 ou 103, e PCR de transcrição reversa em tempo real foi realizada sob as mesmas condições como descrito no Exemplo 7. Este é um método que torna possível prever o período de manutenção do desempenho da composição seca a -20°C (temperatura de armazenamento recomendada real) por um teste acelerado. Quando a composição foi armazenada a 40°C durante 1 dia, é considerado como sendo armazenado a -20°C por cerca de 128 dias. Especificamente, a composição seca foi preparada em uma quantidade correspondente a 6 testes, e foi seca. Imediatamente após secagem, uma porção da mistura seca foi preparada em uma quantidade correspondente a 5 testes sob as mesmas condições como descrito no Exemplo 7 . Em seguida, PCR de transcrição reversa em tempo real foi realizado da mesma forma que descrito no Exemplo 4, exceto que o molde de RNA foi utilizado com um número de cópias de ΙΟ6, ΙΟ5, 104 ou 103, obtendo-se assim os resultados de um controle. A composição seca foi armazenada em uma incubadora a 50°C, e a quantidade necessária para a reação foi tomada em intervalos de um dia e submetida a PCR de transcrição reversa em tempo real. Nesta altura, a reação foi realizada utilizando quatro números de cópias (variando de 103-106) de RNA. A composição seca armazenada para cada período foi submetida a PCR de reação de transcrição reversa em tempo real utilizando Exicycler96 Quantitativo Thermal Block (Bioneer, Coréia), e entre os resultados da reação com misturas secas classificadas por dias de armazenamento, o valor da inclinação e o valor de R2 foram comparados com os do grupo de controle, comparando, assim, o desempenho da mistura seca imediatamente após a preparação com a da mistura seca armazenada a 50°C para cada período.

[0166] Como resultado, a mistura líquida (grupo de controle) armazenada a 50°C em intervalos de 1 dia, durante 5 dias mostrou uma inclinação de -0,345 e um valor de R2 de 0,9922, e a composição seca armazenada a 50°C mostrou uma inclinação de - 0,31 a -0,34 e um valor de R2 de 0,995-0,998. Em outras palavras, os resultados após 5 dias de armazenamento a 50 °C foram iguais aos resultados imediatamente após a secagem, e estes resultados foram substancialmente semelhantes aos resultados obtidos após armazenamento durante cerca de 640 dias a -20°C (FIGS. 8A e 8B).

[0167] Exemplo 9: Inibição da ligação não especifica de iniciadores por reação de PCR de transcrição reversa hot-start [0168] Para induzir a ligação não especifica de iniciadores, a sequência de nucleotideos do iniciador reverso entre os iniciadores e sonda utilizados no Exemplo 4 foi sintetizada como mostrado na Tabela 2 abaixo.

[0169] Iniciador reversor 5'-CCCTATCAGGCAGTACCACA-3' (SEQ ID NO: 7) Tabela 2 [0170] A fim de examinar o efeito de iniciadores não específicos, cada um de um iniciador reverso correspondendo exatamente ao molde de RNA alvo, um iniciador reverso (SEQ ID NO: 9) com 6 nucleotídeos descombinados na extremidade 5' e um iniciador (SEQ ID NO: 10) com 6 nucleotideos descombinados no meio da sequência de nucleotídeos foi utilizado. Como um controle, uma solução de reação não tendo função de transcrição reversa hot-start (isto é, não tendo qualquer PPi e PPase) foi usada. A fim de analisar se iniciadores não específicos causam resultados falsos positivos, se cada iniciador reverso causar reações não específicas foi examinado usando uma solução de reação de transcrição reversa hot-start e uma solução de reação não tendo função de transcrição reversa hot-start. 0 procedimento do Exemplo 4 foi repetido, exceto que o iniciador reverso descombinado foi utilizado e apenas um molde de RNA com um número de cópias de 104 foi utilizado.

[0171] A Fig. 9a mostra os resultados da realização de um PCR de transcrição reversa em tempo real, utilizando o iniciador tendo 6 nucleotídeos descombinados na extremidade 5' , e a FIG. 9b mostra uma realização de PCR de transcrição reversa em tempo real, utilizando o iniciador possuindo 6 nucleotídeos descombinados na sequência de nucleotídeos. Na FIG. 9, "A" indica os resultados da realização da reação usando a solução de reação não tendo função de transcrição reversa hot-start, e "B" indica os resultados da realização da reação usando a mistura de reação de PCR de transcrição hot-start.

[0172] Como resultado, no caso da transcrição reversa hot-start realizada na presença de PPi e PPase, o produto de amplificação foi detectado no iniciador reverso correspondendo exatamente ao molde de RNA, mas não foi detectado no iniciador reverso possuindo nucleotideos descombinados. No entanto, no caso da transcrição reversa hot-start realizada na ausência de PPi e PPase, o produto de amplificação foi detectado mesmo nos iniciadores reversos tendo nucleotideos descombinados. Isto sugere que as reações enzimáticas ocorrem devido à reação não especifica do iniciador reverso em uma temperatura inferior à temperatura de reação (Figs. 9a e 9b). Assim, pode ser observado que os problemas como resultados falsos positivos causados por reações não especificas na reação de PCR de transcrição reversa podem ser resolvidos pela reação de transcrição reversa hot-start na presença de PPi e PPase.

[0173] Exemplo 10: Análise de polimorfismo de nucleotideo único por reação de PCR de transcrição de reversa hot-start [0174] Para analisar o polimorfismo de único nucleotideo do RNA alvo usando a reação de PCR de transcrição reversa hot-start da presente invenção, um iniciador reverso foi desenhado de tal modo que contenha uma mutação pontual. A sequência de nucleotideos do iniciador reverso entre os iniciadores e sonda utilizados no Exemplo 4 foi sintetizada como mostrado na Tabela 3 abaixo.

Tabela 3 [0175] Para a análise do polimorfismo de nucleotideo único, foram utilizados um iniciador reverso correspondendo exatamente ao molde de RNA e um iniciador reverso com um único nucleotideo descombinado. Como um controle, uma solução de reação não tendo função de transcrição reversa hot-start (isto é, não tendo qualquer PPi e PPase) foi usada. A fim de analisar se a análise do polimorfismo de nucleotideo único é possível, uma reação para cada iniciador reverso foi analisada utilizando uma solução reação de a transcrição reversa hot-start e solução de reação não tendo função de transcrição reversa hot-start. A análise foi realizada do mesmo modo como descrito no Exemplo 4, exceto que um iniciador reverso com um nucleotideo descombinado foi utilizado e um molde de RNA com um número de cópias de 104 foi utilizado. A Fig. 10a mostra os resultados da reação de PCR de transcrição reversa hot-start, e a FIG. 10b mostra os resultados da realização da reação usando a solução de reação não tendo função de transcrição reversa hot-start. Na FIG. 10, "A" indica os resultados obtidos usando o iniciador tendo uma sequência de nucleotídeos combinando exatamente, e "B" mostra os resultados obtidos utilizando o iniciador tendo um único nucleotideo descombinado.

[0176] Como resultado, verificou-se que, quando a reação de transcrição reversa hot-start foi realizada na presença de PPi e PPase, os resultados obtidos utilizando o iniciador correspondendo exatamente ao molde de RNA diferiram na eficiência de PCR a partir dos resultados obtidos utilizando o iniciador reverso tendo um único nucleotideo descombinado. No entanto, a reação de transcrição reversa hot-start realizada na ausência de PPi e PPase foi detectada no mesmo ciclo sem diferença entre o iniciador reverso combinando exatamente e o iniciador reverso descombinado. Isto sugere que a reação de transcrição reversa hot-start torna possivel a análise de polimorfismo de nucleotideo único utilizando um método de PCR em tempo real, mas para uma reação realizada na ausência de uma mistura de reação de transcrição reversa hot-start, é difícil analisar polimorfismo de nucleotideo único (Figs. 10a e 10b) . Assim, foi verificado que a reação de transcrição reversa hot-start permite a análise de um nucleotideo único para o molde de RNA e pode ser utilizada em vários campos.

[0177] Exemplo 11: Inibição da auto-iniciação RNA-RNA por reação de transcrição reversa hot-start [0178] 0 efeito de reação PCR de transcrição reversa hot-start da presente invenção na inibição de reações não especificas resultantes de auto-iniciação de um ácido nucleico de cadeia simples contido em um ácido nucleico extraído foi examinado.

[0179] Ο RNA total foi extraido a partir de 106 células Hela usando solução AccuZole Extração de RNA total (Bioneer, Coréia), e um volume final de 50 μΐ foi obtido utilizando DEPC-DW.

[0180] O RNA extraido foi quantificado utilizando NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, EUA), e 2 pg do RNA foi utilizado. Uma reação de transcrição reversa foi realizada utilizando uma solução de reação não tendo função de transcrição reversa hot-start (isto é, não tendo qualquer PPi e PPase) como um controle. A reação de PCR em tempo real foi realizada utilizando kit AccuPower Dualstar qPCR Premix (Bioneer, Coréia). A reação de PCR em tempo real foi realizada utilizando os iniciadores direto e reverso e sonda utilizados no Exemplo 3. A Reação de transcrição reversa foi realizada utilizando o iniciador 5'- TTTTTTTTTTTTTTTTTT_3, (SEq ID N0. 12).

[0181] A fim de examinar se o RNA extraido contém DNA genômico, uma reação de transcrição reversa foi realizada utilizando uma solução de reação não tendo a função de transcrição reversa hot-start (isto é, não tendo qualquer PPi e PPase) como um controle, e o RNA total extraido como um molde foi submetido a PCR em tempo real utilizando AccuPower Dualstar qPCR Premix (Bioneer, Coréia) sem reação de transcrição reversa.

[0182] Na FIG. 11, A mostra os resultados da realização de uma reação de PCR em tempo real utilizando RNA isolado, sem reação de transcrição reversa; e B mostra os resultados da realização de uma reação de transcrição reversa utilizando o iniciador e depois realização de uma reação de PCR em tempo real. B-A na FIG. 11 indica o resultado da realização uma reação de transcrição reversa hot-start, e B-B indica o resultado da realização de uma reação utilizando uma solução de reação não tendo função de transcrição reversa hot-start.

[0183] A Fig. 11C mostra os resultados da realização de uma reação de transcrição reversa utilizando RNA isolado em uma solução de reação não tendo função de transcrição reversa hot-start e em seguida realizando uma reação de PCR em tempo real. A Fig. 11D mostra os resultados da realização de uma reação de transcrição reversa utilizando RNA isolado em uma mistura de reação de transcrição reversa hot-start e, em seguida, realizando uma reação de PCR em tempo real.

[0184] Como resultado, foi demonstrado que nenhuma detecção foi encontrada na ausência de reação de transcrição reversa, o que sugere que o RNA total extraido não continha nenhum DNA genômico.

[0185] Como um controle, uma solução de reação não tendo função hot-start (isto é, não tendo qualquer PPi e PPase), e uma reação de transcrição reversa foi realizada com RNA total isolado na solução de reação sem a adição de um iniciador. A reação de transcrição reversa foi realizada a 50°C durante 1 hora e 95°C durante 5 minutos . A reação de PCR em tempo real foi realizada em 5 μ£ do produto de reação de transcrição reversa como um modelo.

[0186] Como resultado, na solução de reação não tendo função hot-start (isto é, não tendo qualquer PPi e PPase) , a detecção foi encontrada a 37 C (t) por auto-iniciação, e na solução de reação de transcrição reversa hot-start, a detecção foi encontrada em 41 C (t) (fig. 11) . Assim, foi verificado que as reações não especificas por auto-iniciação foram mais inibidas na solução de reação de transcrição reversa hot-start em comparação com aquelas na solução de reação não tendo função hot-start (isto é, não tendo nenhum (PPi e PPase).

[0187] Exemplo 12: Efeito de terminação de RNA sobre a inibição não especifica de PCR de transcrição reversa causada pela auto-iniciação de RNA

[0188] (1) Terminação da reação com um fragmento de RNA com poli (A) polimerase e 3'-desoxiadenosina 5'-trifosfato (3'-dATP) [0189] Utilizando um kit de extração de RNA como descrito no Exemplo 11, o RNA foi extraído a partir de células Hela C humanas. A extremidade 3' do RNA extraído foi terminada com poli (A) polimerase e 3'-desoxiadenosina 5'-trifosfato (3'-dATP) (C e D) .

[0190] Para remover o restante 3'-desoxiadenosina 5'-trifosfato (3'-dATP), o RNA terminado foi purificado utilizando kit de purificação de PCR AccuPrep (Bioneer, Coréia). Para comparação, RNA (A e B) que não foi terminado na extremidade 3' foi purificado do mesmo modo como acima. Para examinar o efeito de uma PCR de transcrição reversa hot-start, uma reação de PCR foi realizada em cada uma de solução de reação de PCR de transcrição reversa hot-start (B e D) e a solução de reação de PCR não tendo função hot-start (A e C).

[0191] 5 pg de RNA foi utilizado em cada reação de PCR. A reação geral de PCR foi realizada utilizando AccuPower RocketScript RT Premix (Bioneer, Coréia), e a reação quente de PCR hot-start foi realizada utilizando AccuPower RocketScript RT Premix (Bioneer, Coréia), que compreende pirofosfato e fosfatase adicionadas a esta e água destilada a um volume final de 20 μΐ. Para examinar a auto-iniciação de RNA, qualquer iniciador necessário para PCR de transcrição reversa não foi adicionado.

[0192] A PCR de transcrição reversa foi realizada utilizando Mygenie 96 Gradient Thermal Block (Bioneer, Coréia), e para analisar o efeito de auto-iniciação de RNA durante a mistura dos reagentes, a mistura de reação de PCR foi incubada a 25°C durante 20 minutos.

[0193] Para examinar se a PCR de transcrição reversa é causada por auto-iniciação de RNA, PCR de transcrição reversa em tempo real foi realizada utilizando cada mistura de reação de PCR de transcrição reversa como um molde, AccuPower Dualstar qPCR Premix (Bioneer, Coréia) e os iniciadores de direcionamento para GAPDH humano e sonda utilizados no Exemplo 3.

[0194] A PCR em tempo real foi realizada utilizando Exicycler 96 Real-Time Quantitative Thermal Block (Bioneer, Coréia) , sob as seguintes condições: pré-desnaturação a 95°C durante 5 min, e em seguida 45 ciclos, cada ciclo consistindo em desnaturação a 95°C durante 5 seg, anelamento e extensão a 60°C durante 5 segundos, e varredura para detecção de fluorescência.

[0195] Os resultados são mostrados na FIG. 12. Como se pode ver nesta, no caso de os RNAs não terminados (A e B) , o gene de GAPDH humano foi detectado, sugerindo que o cDNA foi sintetizado mesmo quando nenhum iniciador foi adicionado. Este resultado indica que o cDNA foi sintetizado pela auto-iniciação e amplificado na PCR.

[0196] Além disso, a amplificação por PCR resultante da síntese de cDNA não específica pode não ser per feitamente evitado pela reação de PCR de transcrição reversa hot-start isolado, e a reação de PCR de transcrição inversa causada por auto-iniciação de RNA pode ser parcialmente inibida, e, assim, o valor Ct foi reduzido em cerca de 5, o que indica que a reação não específica poderia ser inibida em cerca de 1/30.

[0197] No entanto, foi demonstrado que, nas amostras que compreendem o RNA terminado na extremidade 3' (C e D) , o cDNA não foi amplificado até 45 ciclos em todas as reações de PCR de transcrição reversa, indicando que nenhum cDNA foi sintetizado. Os resultados acima sugerem que muitas reações de PCR de transcrição reversa não específicas ocorrem durante a mistura de reação de PCR de transcrição reversa misturada, e por esta razão, muitos cDNAs não específicos são preparados. A partir dos resultados acima, pode ser observado que reações indesejadas não podem ser inibidas por reação de PCR de transcrição reversa hot-start isolada. Como resultado, pode observar-se que tais reações de PCR de transcrição reversa não especificas resultantes a partir de auto-iniciação de RNA podem ser inibidas perfeitamente por terminação de RNA utilizando a reação de terminação da presente invenção.

[0198] Na FIG. 12, "A" e "B" mostram os resultados obtidos utilizando RNA não terminado, e C e D mostram os resultados obtidos usando o RNA terminado. Além disso, para "A" e "C", a reação de transcrição reversa geral foi realizada, e para "B" e "D", a reação de transcrição reversa hot-start foi realizada.

[0199] Exemplo 13: Aumento do limite de detecção do marcador de câncer por terminação de RNA e PCR de transcrição reversa hot-start [0200] A informação da sequência de nucleotideos de Homo sapiens queratina 8 (KRT8; No. de Acessão NM_00125693) como um marcador de câncer foi obtida a partir do National Center for Biotechnology Information (NCBI, EUA). Utilizando o kit de extração de RNA como descrito no Exemplo 11, o RNA foi extraído a partir de células Hela C humanas. PCR de transcrição reversa em tempo real foi realizada utilizando 850 ng, 85 ng, 8,5 ng, 0,85 ng ou 0, 085 ng do RNA extraído como um molde, em 30 nM do iniciador direto 5'-GGAGCAGATCAAGACCCTCA-3' (SEQ ID NO: 13), o iniciador reverso 5'-TTGTCCATGTTGCTTCGAGC-3' (SEQ ID NO: 14) e a sonda [5'FAM]-TGCTGCTCCAGGAACCGTACCTTGT-[3'BHQ1] (SEQ ID NO: 15) , a fim de se obter uma curva padrão para realização de análise quantitativa utilizando uma reação de PCR de transcrição reversa hot-start.

[0201] Os resultados são mostrados na FIG. 13-A.

[0202] A fim de examinar o limite de detecção, 10.000, 1.000, 100 ou 10 células Hela foram adicionados a 1 ml de soro humano, e a extração de RNA e quantificação foram realizados como descrito no Exemplo 11.

[0203] Como resultado, foi verificado que as concentrações de RNA eram de 57,5 ng/mL, 53,8 ng/mL, 52,5 ng/mL e 52,1 ng/mL. 500 ng de cada RNA extraido foram terminados de acordo com o método do Exemplo 12, e depois quantificados. Para examinar o efeito da terminação de RNA no limite de detecção, o RNA não terminado foi utilizado como um controle. PCR de transcrição reversa em tempo real foi realizada utilizando 100 ng de cada RNA em cada um de uma solução de reação não tendo função de transcrição reversa hot-start (isto é, não tendo qualquer PPi e PPase) e uma solução de reação de PCR de transcrição reversa hot-start. O PCR de transcrição reversa em tempo real foi realizado utilizando 96 Exicycler Real-Time Quantitativo Thermal Block (Bioneer, Coréia), sob as seguintes condições: reação de transcrição reversa a 50°C durante 15 minutos e, em seguida, pré-desnaturação a 95°C durante 5 min, seguido pelo total de 45 ciclos, cada ciclo consistindo em desnaturação a 95°C durante 5 segundos, anelamento a 60°C durante 5 seg, extensão a 72°C durante 6 seg, e varredura para a detecção de fluorescência.

[0204] Como resultado, no caso das amostras que compreendem o RNA terminado, a solução de reação de transcrição reversa hot-start foi detectada nas amostras contendo 10 ou mais células Hela adicionadas a 1 ml de soro humano (ver figura 13b.). As soluções de reação não tendo função de transcrição reversa hot-start foram detectadas apenas na amostra que compreende 100 ou mais células Hela (Fig. 13c) . No caso das amostras não tendo RNA terminado, a solução de transcrição reversa hot-start foi detectada nas amostras compreendendo 100 ou mais células Hela (FIG. 13d) . Além disso, a reação não tendo função de transcrição reversa hot-start foi detectada nas amostras compreendendo 1.000 ou mais células Hela (Fig. 13e).

[0205] Assim, pode ser observado que o limite de detecção foi aumentado mesmo pela reação de transcrição reversa hot-start isolada, mas um melhor efeito podería ser obtido quando a reação de transcrição reversa hot-start foi realizada em conjunto com a terminação de RNA.

[0206] APLICABILIDADE INDUSTRIAL

[0207] Como descrito acima, a composição para reação de transcrição reversa hot-start e a composição para PCR de transcrição reversa hot-start, de acordo com a presente invenção podem resolver vários problemas que ocorrem em reações de transcrição reversa hot-start convencionais e podem detectar especificamente o RNA alvo com alta sensibilidade através da realização de uma reação de transcrição reversa utilizando PPi e PPase. Assim, as composições da presente invenção podem fornecer um kit estável relacionada com as tecnologias de transcrição reversa hot-start/transcrição reversa hot-start, que podem ser utilizadas eficazmente como um kit de diagnóstico de RNA de alta sensibilidade para detecção em alta sensibilidade de RNA.

Claims (37)

1 . COMPOSIÇÃO PARA REAÇÃO DE TRANSCRIÇÃO REVERSA HOT-START, caracterizada por compreender um ion Mg2+, quatro tipos de dNIPs, polimerase de transcrição reversa, pirofosfato (PPi), e pirofosfatase (PPase).

2 . COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a composição compreende pirofosfato (PPi) em uma concentração de 0,1-5 mM, e a pirofosfatase em uma quantidade de 0,005-0,25 U.

3. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por compreender ainda um ou mais iniciadores de transcrição reversa.

4. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a composição é congelada ou seca.

5. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por compreender ainda molde de ácido nucleico.

6. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que o molde de ácido nucleico é um RNA.

7 . COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por compreender ainda um corante que não é reativo com ácido nucleico.

8 . COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por compreender ainda pelo menos um selecionado do grupo que consiste em um poliol, gelatina, albumina sérica bovina, Thesit, e PEG-8000.

9. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que o molde de ácido nucleico tem um terminador de polimerização de ácido nucleico ligado à extremidade 3' do mesmo para prevenir a polimerização de ácido nucleico especifico.

10. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que o terminador de polimerização de ácido nucleico é um composto tipo ácido nucleico que é ativado na forma de trifosfato capaz de atuar na polimerase de ácido nucleico e te grupos além do grupo hidroxil na extremidade 3'.

11. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que o composto tipo ácido nucleico compreende pelo menos um selecionado de entre 2'3'-dideoxinucleosídeo 5'-trifosfato, 3'-deoxiadenosina 5'-trifosfato, 3'-azido-3'-deoxitimidina 5'-trifosfato, Ι-β-d-Arabinofuranosilnucleosídeo 5 '-Trifosfato, aciclo-guanosina trifosfato, 3'-amino-2'-deoxinucleosídeo 5'-trifosfato, e 3'-fluoro-3'-deoxinucleosídeo 5'-trifosfato.

12. COMPOSIÇÃO PARA PCR DE TRANSCRIÇÃO REVERSA HOT-START, caracterizada pelo fato de compreender um ion Mg2 + , quatro tipos de dNTPs, polimerase de transcrição reversa, pirofosfato (PPi), e pirofosfatase (PPase), e ainda compreende DNA polimerase.

13. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que a composição compreender pirofosfato (PPi) em uma concentração de 0,1-5 mM, e a pirofosfatase em uma quantidade de 0,005-0,25 U.

14. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de compreender ainda um ou mais iniciadores de transcrição reversa.

15. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de compreender ainda sondas.

16. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que a composição é congelada ou seca.

17. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de compreender ainda molde de ácido nucleico.

18. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de compreender ainda um corante fluorescente que se liga a DNA.

19. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que a DNA polimerase compreende pelo menos um selecionado do grupo que consiste em uma polimerase tendo atividade 51->3' exonuclease, uma polimerase tendo atividade 3'->5' exonuclease, e uma polimerase que não tem atividade 5'->31 e atividade 3'->5' exonuclease.

20. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de compreender ainda um corante que é não reativo com ácido nucleico.

21. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que o molde de ácido nucleico tem um terminador de polimerização de ácido nucleico ligado à extremidade 3' do mesmo para prevenir a polimerização de ácido nucleico não especifico.

22. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 21, caracterizada pelo fato de que o terminador de polimerização de ácido nucleico é um composto tipo ácido nucleico que é ativado na forma de trifosfato capaz de atuar em polimerase de ácido nucleico e tem grupos além de um grupo hidroxil na extremidade 3 ' .

23. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 22, caracterizada pelo fato de que o composto tipo ácido nucleico compreende pelo menos um selecionado de entre 2'3'-dideoxinucleosideo 5'-trifosfato, 3'-deoxiadenosina 5'-trifosfato, 3'-azido-3'-deoxitimidina 5'-trifosfato, Ι-β-d-Arabinofuranosilnucleosídeo 5'-Trifosfato, aciclo-guanosina trifosfato, 3'-amino-2'-deoxinucleosídeo 5'-trifosfato, e 3'-fluoro-3'-deoxinucleosídeo 5'-trifosfato.

24. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de compreender ainda pelo menos um selecionado do grupo que consiste em um poliol, gelatina, albumina de soro bovino, Thesit, e PEG-8000.

25. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de compreender ainda uma substância que mostra um efeito de PCR hot-start pela ligação a DNA polimerase ou regulando a ação de DNA polimerase.

26. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que a DNA polimerase mostra efeito de PCR hot-start com uma forma modificada da mesma.

27. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 26, caracterizada pelo fato de que a substância é selecionada a partir do grupo que consiste em um anticorpo, um aptâmeros, e um affibody, que liga ao DNA polimerase.

28. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que a composição é usada em qualquer um de uma reação de PCR de transcrição reversa multiplex, uma reação de PCR de transcrição reversa em tempo real, uma reação de PCR de transcrição reversa quantitativa em tempo real, e uma reação de PCR de transcrição reversa em tempo real multiplex.

29. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que a composição é uma composição para diagnóstico de um câncer.

30. MÉTODO PARA PREPARAR UMA COMPOSIÇÃO PARA UMA REAÇÃO DE TRANSCRIÇÃO REVERSA HOT-START, caracterizado pelo fato de compreender introduzir a composição para a reação de transcrição reversa hot-start, de acordo com a reivindicação 1, em um tubo de reação único.

31. MÉTODO PARA PREPARAR UMA COMPOSIÇÃO PARA UM PCR DE TRANSCRIÇÃO REVERSA HOT-START, caracterizado pelo fato de compreender introduzir a composição para o PCR de transcrição reversa hot-start, de acordo com a reivindicação 12, em um tubo de reação único.

32. KIT PARA REAÇÃO DE TRANSCRIÇÃO REVERSA HOT-START, caracterizado pelo fato de compreender composição para reação de transcrição reversa hot-start, de acordo com a reivindicação 1.

33. KIT PARA REAÇÃO DE TRANSCRIÇÃO REVERSA HOT-START, caracterizado pelo fato de compreender composição para reação de transcrição reversa hot-start, de acordo com a reivindicação 12.

34. MÉTODO PARA TRANSCRIÇÃO REVERSA DE MOLDE DE RNA, caracterizada pelo fato de compreender as etapas de: misturar composição para reação de transcrição reversa hot-start, de acordo com a reivindicação 1, com uma amostra contendo o molde de RNA para formar uma mistura de reação; e realizar uma reação de modo que a mistura de reação possa ser transcrita de modo reverso.

35. MÉTODO PARA AMPLIFICAR ÁCIDO NUCLEICO, caracterizada pelo fato de compreender as etapas de: misturar composição para PCR de transcrição reversa hot-start, de acordo com a reivindicação 12 com uma amostra contendo molde de RNA para obter uma mistura de reação; realizar uma reação de modo a amplificar a mistura de reação para, assim, obter um produto de amplificação; e analisar o produto de amplificação.

36. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 35, caracterizada pelo fato de que o PCR é selecionado do grupo que consiste em PCR, PCR multiplex, PCR tempo real, e PCR quantitativo tempo real.

37 . COMPOSIÇÃO DE PCR DE TRANSCRIÇÃO REVERSA, para diagnóstico de um câncer, caracterizada pelo fato de compreender um molde de ácido nucleico que tem um terminador de polimerização de ácido nucleico ligado à extremidade 3' para prevenir polimerização de ácido nucleico não especifico, um ion de Mg2+, quatro tipos de dNTPs, polimerase de transcrição reversa, ácido nucleico, iniciador para síntese de cDNA, pirofosfato, pirofosfatase, e um iniciador para amplificação de um biomarcador para diagnóstico de um câncer.