KR20130103438A - 핫스타트 역전사반응 또는 핫스타트 역전사 중합효소 연쇄반응용 조성물 - Google Patents

핫스타트 역전사반응 또는 핫스타트 역전사 중합효소 연쇄반응용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 핫스타트 역전사반응용 조성물 및 이를 포함하는 역전사 PCR용 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 한 반응튜브 내에 반응용 완충용액, MgCl2, 4종의 dNTP, 역전사 중합효소를 포함하는 수용액에 피로포스페이트 및 피로포스파타제를 첨가한 반응조성물과 상기 반응혼합물을 동결하거나 건조시킴으로써 안정성 및 장기보관성이 개선된 핫스타트 역전사반응 조성물에 관한 것이며, 여기에 DNA 중합효소가 추가로 첨가됨으로써 한 반응튜브에서 핫스타트 역전사반응과 PCR 반응을 순차적으로 수행하는 조성물과 이를 이용한 핵산 증폭 방법에 관한 것이다. 상기 핫스타트 역전사반응용 조성물은 기존의 역전사반응 조성물에 비해 상온 혼합과정에서의 비특이적 역전사반응을 방지하고 반응 온도에서 표적 RNA에 대해 선택적으로 역전사반응을 수행하여 PCR을 진행할 수 있어 높은 민감도로 RNA의 증폭 반응을 수행할 수 있으므로, 다중 역전사 PCR, 또는 실시간 정량적 역전사 PCR 방법 등에 간편하고 유용하게 사용될 수 있다.

Description

핫스타트 역전사반응 또는 핫스타트 역전사 중합효소 연쇄반응용 조성물{Compositions for hot start reverse transcription reaction or hot start reverse transcription polymerase chain reaction}
본 발명은 핫스타트(Hot Start) 역전사반응 또는 핫스타트 역전사 중합효소 연쇄반응용 조성물에 관한 것이다.
역전사반응은 랜덤 프라이머를 사용하는 방법과 표적 특이적인 프라이머를 사용하는 방법으로 나누어진다. RNA 바이러스 등을 검출하는 진단 키트 등과 같이 특정 표적을 검출하는 역전사 반응에서는 표적 특이적인 프라이머를 사용하는 것이 보다 높은 민감도를 보이고 있어 일반적으로 이용되고 있다. 이러한 역전사 반응에 있어서, 특이도(specificity) 및 민감도(sensitivity)는 표적 RNA 서열에 선택적으로 결합하는 프라이머의 높은 선택성에 의해 결정된다. 그러나, 역전사반응 수행 시 반응에 필요한 모든 성분들은 실온에서 혼합되므로, 이 조건에서 비특이적인 프라이밍(priming)에 의해 비특이 역전사반응이 발생하게 된다. 상온에서도 역전사 효소의 활성이 높기 때문에 비특이 프라이밍이 발생하여 이에 따른 불특정 다수의 cDNA가 생성되기 때문에, 비특이적인 증폭반응을 증가시키는 주요한 요인이 된다. 이러한 비특이적 역전사반응으로 인하여, 이어지는 PCR 반응에 필요한 프라이머 및 제한된 농도의 다른 필요 성분들이 소비되었기 때문에 결과적으로 경쟁적인 저해제로서 작용하게 된다. 비특이적 역전사반응은 낮은 농도의 RNA를 검출할 때 문제가 되며 특히, 세포나 체액에서 추출한 염기서열 복잡도가 높은 RNA를 다량 포함하고 있는 용액에서 상대적으로 극소량으로 존재하는 표적 RNA를 검출하는 것을 방해한다. 그리하여 낮은 농도로 존재하는 바이러스나 유전자의 검출을 어렵게 한다. 또한, 여러 가지 프라이머를 동시에 사용하여 다중 역전사반응을 수행하는데 있어서도 특이도를 떨어뜨려 다중 검출을 어렵게 만드는 원인이 되고 있다. 이러한 비특이적인 증폭은 표적 핵산의 절대적인 양보다는 표적 핵산과 생체시료로부터 유래된 다른 핵산들과의 상대적인 양에 크게 영향을 받는다. 그것은 반응물 내에 원하는 표적 이외에 많은 RNA가 존재하게 되면 프라이머의 비특이적인 혼성화가 늘어나게 되어 비특이적인 반응이 일어나기 때문이다.
이러한 원하지 않는 비특이적 역전사반응과 증폭을 줄이기 위해서 여러 가지 시도들이 이루어지고 있다. 프라이머를 좀 더 표적에 강하게 혼성화시켜 특정 표적의 검출 한계를 높이려고 시도하였다. 예를 들면, 프라이머의 5' 말단을 LNA로 치환하여 좀더 강하게 표적에 혼성화되게 함으로써 결과적으로 비특이 증폭을 줄일 수 있게 하는 방법이 보고되었다(Malgoyre A. 등., Biochem Biophys Res Commun. 2007 Mar 2;354(1):246-52). 특수한 프라이머 구조로 문제를 해결하기 위한 다른 방법으로 프라이머 다이머를 방지하는 방법도 개발되었다. 역전사반응 단계에 있어서, 특히 낮은 온도에서 역전사반응을 수행할 때 프라이머들 간의 부분적인 혼성화에 의해 중합이 진행되어 다이머 형성이 일어날 수 있고, 이는 역전사반응에서 민감도를 급격히 떨어뜨리는 중요한 원인 중의 하나이다. 이것을 해결하기 위해, 프라이머가 낮은 온도에서 5'의 염기서열 중 5개의 염기가 헤어핀을 형성할 수 있게 상보적인 염기서열을 더 늘려서 형성시킨 프라이머를 사용하는 것이 개발되었다(JiYoung Hong. 등., Virol J. 2011; 8: 330. Published online 2011, 대한민국특허 제 10-0987352호). 그러나, 이러한 록프라이머 방법은 5'에 추가적으로 들어간 염기서열에 의해 높은 혼성화 온도를 가지게 되므로, 이어지는 PCR 반응에서 염기서열이 비슷한 비특이적 표적에 대해 비특이적인 혼성화를 유도할 수 있고, 혼성화 단계에서도 내부의 헤어핀 구조에 의해 효율성이 떨어지는 문제점을 가지고 있다.
이러한 문제를 해결하기 위해 프라이머에 부분적으로 상보적이면서 3'말단이 블로킹된 블로킹 프라이머를 사용하는 방법이 개발되었다. 이 블로킹 프라이머는 3'이 블로킹되어 있어 핵산 중합반응에 프라이머로서 작용하지 않을 뿐만 아니라 길이가 짧아서 상온에서만 프라이머에 혼성화되어 프라이머 다이머의 형성을 방지하고 이어지는 반응에서 온도가 올라가면 바로 떨어져 작동하지 않으므로 인스턴트 역전사 PCR을 수행할 수 있는 장점이 있다(대한민국 특허출원 10-2011-0017226호).
또한, 좀 더 표적 RNA에 특이적인 혼성화를 위해 고온에서 역전사반응을 실시하는 방법이 개발되었다. 고온에서 혼성화되는 프라이머를 사용하고 고온에서도 작동하는 역전사 중합효소를 이용하여 70℃와 같은 고온에서 cDNA를 합성하면 좀더 특이적으로 증폭을 할 수 있다는 것이 발표되었다(Fuchs B, 등., Mol Biotechnol, 1999 Oct;12(3):237-40).
다중 역전사 PCR에서는 특이도가 더욱 중요하다. 여러 개의 프라이머가 반응에 사용되므로 역전사반응 단계에서의 비특이적인 반응에 의해, 이어지는 PCR 반응에서도 비특이적인 반응이 일어날 수 있기 때문이다. 이러한 비특이 반응을 피하기 위해 다중 역전사 PCR에서는 일반적으로 역전사반응과 PCR 반응을 분리하여 먼저 역전사반응을 수행한 다음, PCR을 수행하면 좀더 특이적으로 반응시킬 수 있다. 그러나, 이 경우 반응튜브를 다시 열고 용액을 가해주어야 하므로 번거로울 뿐만 아니라 반응튜브를 열고 조작하는 과정에서 오염의 가능성도 더 높아 일반적으로 한 튜브 내에서 역전사반응과 PCR을 연이어 실시하는 것이 선호된다. 이를 위해 한 튜브에서 튜브를 열지 않고 역전사 PCR을 하면서도 물리적으로 각각의 반응을 분리하는 방법으로, 역전사 반응물은 튜브의 바닥에 있고 PCR 반응물은 뚜껑에 매달어서 반응시키는 방법도 개발되었다. 튜브에서 역전사반응을 시키는 동안 PCR 반응물은 뚜껑에 매달려서 반응을 하지 않고 있다가 역전사반응이 끝나고 나서 반응튜브를 원심분리기로 돌려서 반응튜브 뚜껑에 달려 있는 PCR 용액이 역전사 반응물과 섞이게 한 후 PCR을 수행하는 방법이다(Rodney Mark Ratcliff, 등., 2002 November; 40(11): 40914099. doi: 10.1128/JCM.40.11.4091-4099.2002).
일반적인 역전사반응에서 나타나는 이러한 문제점을 해결하기 위한 노력의 결과로 "핫스타트 역전사반응"이 개발되었다. 핫스타트 역전사반응은 극소량의 표적 RNA를 검출하기 위한 방법으로서, 프라이머가 정확하게 상보적인 염기서열의 RNA에 대해서만 프라이밍이 일어날 수 있는 높은 온도조건에서 역전사 반응이 시작될 수 있게 하여, 실온에서 발생하는 비특이적 프라이밍 및 그로 인한 비특이적인 프라이머의 올리고머화를 방지함으로써 역전사반응의 특이성을 증가시키는 효과적인 방법이다. 이를 구현하기 위해, 내열성 중합효소와 앱타머를 사용하는 방법이 개발되어 상용화되고 있다. 로슈 사의 LighCycler-RNA master Kits는 Tth DNA 중합효소와 앱타머를 사용하는 방법이다. Tth DNA 중합효소는 RNA를 주형으로 DNA를 중합하는 기능과 DNA를 주형으로 DNA를 중합하는 기능을 겸비한 효소이다. 여기에 사용된 앱타머는 Tth DNA 중합효소의 반응부위에 부착되어 있어 상온에서는 활성을 가지지 않는다. 반응용액의 온도를 고온으로 올리면 앱타머의 3차 구조가 변형되어 Tth DNA 중합효소로부터 이탈됨으로써 활성을 가지게 되고, 고온에서 특이적으로 표적 RNA에 프라이밍된 것을 대상으로 역전사반응을 수행하고 이어서 PCR을 수행할 수 있다. 그 밖에도, GeneAmp AccuRT Hot Start RNA PCR kit(어플라이드 바이오시스템 사)는 Thermus specie Z05에서 유래된 내열성 중합효소로서 상기 Tth DNA 중합효소와 같이 역전사반응과 PCR을 하나의 효소를 이용하여 수행할 수 있다. 그리고 여기에 특이적인 앱타머를 이용하여 반응을 수행한다. 이러한 제품들은 앱타머를 이용하여 상온에서 효소활성을 저해함으로써 비특이적인 역전사반응을 감소시켜 역전사 PCR의 비특이적인 증폭을 줄일 수 있다. 그러나 앱타머는 고온으로 올리면 3차 구조가 변형되지만 다시 온도를 내리면 원래의 구조로 되돌아와서 DNA 중합효소들을 저해한다. 즉, 가역적인 저해를 하는 문제점을 가지고 있다. 상기 GeneAmp AccuRT Hot Start RNA PCR kit의 경우 55℃에서도 여전히 앱타머가 DNA 중합효소에 부착되어 있고 65℃가 되어야 완전히 떨어져 나간다고 설명되어 있다. 그러므로 일반적으로 많이 사용되는 프라이머의 어닐링 온도가 55℃ 이하인 반응에서는 DNA 중합효소의 활성이 저해되어 PCR 효율을 떨어뜨리는 문제점이 있다. 그래서 여기에서는 Tth DNA 중합효소와 같은 역전사 기능을 보유한 내열성 DNA 중합효소를 사용한다. 이러한 내열성 DNA 중합효소는 효소 활성이 유지되는 후속 PCR 과정 동안 역전사반응 기능을 가지고 있어서 지속적인 비특이적 역전사 반응을 일으켜 비특이적 증폭을 일으키는 문제점이 있다.
항체를 이용한 핫스타트 PCR 반응법은 Taq DNA 중합효소에만 적용 가능한 방법으로(Enneth, G. 등., 1994, Biotechnology, 12; 506-509), 다른 종류의 역전사중합효소를 이용하여 핫스타트 역전사반응을 수행하기 위해서는 높은 온도에서 견디는 내열성 역전사효소가 있어야 하고, 역전사 PCR의 경우에 낮은 온도에서 떨어지는 역전사효소 특이 항체와 고온에서 떨어지는 DNA 중합효소에 대한 항체가 각각 필요하므로 각각의 내열성 중합효소에 대한 특이적인 항체를 개발하여야 하므로 현실적으로 어려운 기술적 한계가 있다.
본 발명자들은 핫스타트 PCR을 위해서, 피로포스페이트(pyrophosphate, PPi) 및 내열성 피로포스파타제(pyrophosphatase, PPase)를 이용한 핫스타트 PCR 방법을 개발하였다(대한민국 특허등록 제10-0292883호). 이 방법은 DNA 중합에 필수적인 마그네슘 이온과 강하게 결합하는 PPi를 첨가해주어 상온에서 중합효소반응을 억제한 다음, 고온에서 PPase를 반응시켜 PPi를 제거함으로써 반응을 시작시키는 원리이다. 역전사 효소는 낮은 활성 온도로 인하여 항체에 의한 핫스타트 방법을 적용할 수 없다. 종래 항체에 의한 핫스타트 PCR 방법은 낮은 온도에서는 효소와 항체의 결합으로 효소의 활성을 억제하는 방법으로 높은 온도에 도달 시 항체의 안정성 저하로 인하여 효소와의 결합을 상실함으로 PCR 반응이 수행되는 것이다. 역전사 효소는 DNA 중합효소와 달리 높은 온도에서의 열안정성을 갖지 못한다. 항체의 결합을 상실시키기 위해서 높은 온도에 도달하게 되면 역전사 효소의 활성을 억제하는 요인이 된다. 이러한 문제를 해결하기 위해 PPi 및 PPase를 이용한 핫스타트 역전사 반응 방법은 DNA 중합효소의 종류와 상관없이 일반적으로 적용할 수 있고 PCR시 dNTP로부터 발생하는 PPi를 지속적으로 제거해 줌으로써, 지속적으로 반응성을 유지시킬 수 있는 장점이 있다. 그러나, 이 방법을 이용하여 핫스타트 PCR 마스터믹스(mastermix) 용액을 만들어 놓으면, 낮은 온도에서도 PPase가 Mg2+ 이온으로부터 서서히 PPi를 분해하여 DNA 중합효소의 활성이 나타나게 되고, 결국 원하는 핫스타트 PCR반응 효과는 상실하는 결과가 발생한다. 또한, PPase는 매우 불안정하기 때문에 역전사반응 마스터믹스 용액으로 만들어두면, 상온 또는 4℃에서 PPase의 활성이 오래가지 못하는 문제가 있다. 이에, 안정성을 높이기 위하여 건조된 형태의 혼합물을 개발하였다. (대한민국 특허등록 제 10-1098764호) 따라서, 상기와 같은 핫스타트 역전사반응의 문제점을 해결하기 위해 보다 고감도의 핫스타트 역전사 및 역전사 PCR에 대한 기술이 필요한 실정이다.
본 발명의 목적은 피로포스페이트 및 피로포스파타제를 사용한 핫스타트 역전사반응 또는 핫스타트 역전사 PCR용 조성물을 제공하고자 하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 Mg 2+ 이온, 4종의 dNTP, 역전사 중합효소, PPi 및 PPase를 포함하는 핫스타트 역전사반응용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, Mg 2+ 이온, 4종의 dNTP, 역전사효소, 피로포스페이트 및 피로포스파타제를 포함하고, DNA 중합효소를 추가로 포함하는 핫스타트 역전사 PCR용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 핫스타트 역전사반응용 조성물을 한 반응튜브 내에 제공하는 단계를 포함하는 핫스타트 역전사반응용 조성물의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 핫스타트 역전사반응용 조성물을 포함하는 핫스타트 역전사반응용 키트를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 핫스타트 역전사 PCR용 조성물에 주형 RNA를 함유한 시료를 혼합하는 단계; 상기 반응 혼합물이 증폭될 수 있도록 반응을 수행하는 단계; 및 상기 증폭 산물을 분석하는 단계를 포함하는 핵산 증폭 방법을 제공한다.
본 발명의 핫스타트 역전사반응용 조성물 및 핫스타트 역전사 PCR용 조성물은 PPi 및 PPase를 이용하여 역전사반응을 수행함으로써 기존의 핫스타트 역전사반응의 여러 가지 문제들을 해결하여 표적 핵산인 RNA를 고감도로 특이적으로 검출할 수 있으므로, 핫스타트 역전사반응 및 이를 포함하는 핫스타트 역전사 PCR 기술과 관련된 안정화된 키트를 제공하며 고감도로 RNA를 검출하는 고감도 RNA 진단키트로서 효과적으로 이용될 수 있다.
도 1은 PPi에 의한 역전사반응 억제 효과를 나타내는 도면이다:
레인 1, 2, 3 및 4: 각각 역전사반응 수행 시 RNA 농도를 100 ng, 10 ng, 1 ng 및 100 pg을 사용한 것;
A: 양성 대조군으로 PPi가 첨가되지 않고 역전사반응 후 PCR 반응을 수행한 것;
B, C, D, E, 및 F: PPi를 각 농도별로 첨가하여 역전사반응 후 PCR 반응을 수행한 것; 및
레인 M: PCR 산물의 크기를 확인할 수 있는 100 bp DNA Ladder (바이오니아사제, 대한민국).
도 2는 PPi를 2개의 포스페이트로 가수분해하는 PPase를 첨가함으로써 역전사반응이 다시 활성화되는 효과를 나타내는 도면이다:
레인 1, 2, 3 및 4: 각각 역전사 반응 수행 시 RNA 농도를 100 ng, 10 ng, 1 ng 및 100 pg을 사용한 것;
A: 양성 대조군으로 PPi가 첨가되지 않고 역전사반응 후 PCR을 수행한 것;
B, C, D, E 및 F: PPi를 각 농도별로 첨가한 것; 및
B-1, C-1, D-1, E-1 및 F-1: PPase를 첨가하여 역전사반응 후 PCR 반응을 수행한 것;
레인 M: 1kb DNA Laddder.
도 3은 PPi 및 PPase의 첨가가 실시간 역전사 PCR에 미치는 영향을 나타내는 도면이다:
레인 1, 2, 3 및 : 각각 100 ng, 10 ng, 1 ng 및 100 pg의 인간 총 RNA를 사용하여 실시간 역전사 PCR을 수행한 것.
도 4는 핫스타트 역전사반응을 통해 C형 간염바이러스 RNA를 검출한 결과를 나타내는 도면이다.
도 5a는 실시간 역전사 PCR에서 PPi 및 PPase에 의한 비특이적 반응이 억제되는 효과를 나타내는 도면이다:
A: 핫스타트 역전사 기능이 없는 반응물을 사용한 것;
B: A의 반응물에 1 ㎍의 인간 세포 총 RNA을 첨가한 것;
C: PPi 및 PPase를 사용한 핫스타트 역전사 기능이 포함된 반응물; 및
D: C의 반응물에 1 ㎍의 인간 세포 총 RNA를 첨가한 것.
도 5b는 실시간 역전사 PCR을 통하여 얻어진 산물을 2%의 아가로스 겔에 전기영동한 결과는 나타내는 도면이다:
레인 1, 2, 3, 4, 5 및 6: 106,105, 104, 103, 102 및 10 카피수의 주형 C형 감염바이러스 RNA을 사용하여 얻은 산물;
A: 핫스타트 역전사 기능이 없는 반응물을 사용한 것;
B: A의 반응물에 1 ㎍의 인간 세포 총 RNA을 첨가한 것;
C: PPi 및 PPase를 사용한 핫스타트 역전사 기능이 포함된 반응물; 및
D: C의 반응물에 1 ㎍의 인간 세포 총 RNA를 첨가한 것.
도 6a은 실시간 역전사 PCR에서 핫스타트 역전사반응을 사용한 것과 Taq 항체를 이용한 것과의 비특이적 반응 억제 효과를 비교한 것을 나타내는 도면이다:
A: Taq 항체를 사용한 핫스타트 PCR 반응물에 핫스타트 역전사 기능이 없는 반응물을 사용한 것;
B: A의 반응물에 1 ㎍의 인간 세포 총 RNA을 첨가한 것;
C: PPi 및 PPase를 사용하여 핫스타트 PCR 반응에 핫스타트 역전사 기능이 포함된 반응물; 및
D: C의 반응물에 1 ㎍의 인간 세포 총 RNA를 첨가한 것.
도 6b는 실시간 역전사 PCR을 통하여 얻어진 산물을 2%의 아가로스 겔에 전기영동한 결과를 나타내는 도면이다:
레인 1, 2, 3, 4, 5 및 6: 106,105, 104, 103, 102 및 10 카피수의 주형 C형 감염바이러스 RNA를 사용하여 얻은 산물;
A: Taq 항체를 사용한 핫스타트 PCR 반응물에 핫스타트 역전사 기능이 없는 반응물을 사용한 것;
B: A의 반응물에 1 ㎍의 인간 세포 총 RNA을 첨가한 것;
C: PPi 및 PPase를 사용하여 핫스타트 PCR 반응에 핫스타트 역전사 기능이 포함된 반응물; 및
D: C의 반응물에 1 ㎍의 인간 세포 총 RNA를 첨가한 것.
도 7a, 7c는 실시간 역전사 PCR에 있어서 역전사반응 및 역전사 PCR용 조성물이 용액 상태와 건조시켰을 때 동등한 성능을 유지함을 실시간 역전사 PCR의 그래프로서 나타내는 도면이다. (도 7a : 용액상태, 도 7c : 건조상태)
도 7b, 7d는 실시간 역전사 PCR에 있어서 역전사반응 및 역전사 PCR용 조성물이 용액 상태와 건조시켰을 때 동등한 성능을 유지함을 실시간 역전사 PCR 그래프의 표준 곡선으로 나타내는 도면이다. (도 7b : 용액상태, 도 7d : 건조상태)
도 8a는 건조된 상태의 역전사반응 및 역전사 PCR용 조성물의 보관 기간에 따른 안정성 시험을 위하여 액체 상태의 혼합물인 대조군을 사용하여 실시간 역전사 PCR을 수행한 그래프를 나타내는 도면이다.
도 8b는 건조 상태의 혼합물의 보관안정성 시험을 위하여 건조한 혼합물을 50℃에 보관한 뒤, 하루 간격으로 총 5일간의 보관 기간에 대하여 실시간 역전사 PCR을 수행한 그래프를 나타내는 도면이다:
1일 내지 5일: 50℃에서 총 보관된 일수.
도 9a는 5'쪽 6개의 염기서열이 불일치하는 프라이머를 사용한 실시간 역전사 중합효소 반응을 수행한 것이며 도 9b는 중간 6개의 염기서열이 불일치하는 프라이머를 사용한 실시간 역전사 중합효소 반응을 수행한 것이다. 핫스타트 역전사 PCR 반응물에서 템플레이트와 비특이적인 프라이머의 결합을 억제하는 것에 대하여 실시간 역전사 PCR을 수행한 그래프를 나타내는 도면이다.
도 10a 및 도 10b는 핫스타트 역전사 PCR반응을 통하여 RNA 단일 염기 다형성 분석에 대하여 실시간 역전사 PCR을 수행한 그래프를 나타내는 도면이다.
A는 정확히 일치하는 염기서열을 갖는 프라이머를 사용한 것이며 B는 단일 염기 서열이 불일치하는 프라이머를 사용한 것이다.
도 11은 핫스타트 역전사 반응이 RNA-RNA 셀프프라이밍에 의한 비특이적 반응을 억제하는 것에 대하여 실시간 역전사 PCR을 수행한 그래프를 나타내는 도면이다.
도 11에서 A는 역전사 반응 없이 RNA만을 첨가하여 실시간 중합효소 반응을 수행한 것이며 B는 역전사 반응 시 프라이머를 첨가해서 역전사 반응 후 실시간 중합효소 반응을 수행한 그래프를 나타내는 도면이다. B-A는 핫스타트 역전사 반응물로 수행한 것이며 B-B는 핫스타트 역전사 기능이 없는 반응물 수행한 그래프를 나타내는 도면이다. C는 핫스타트 역전사 기능이 없는 반응액에 RNA만 넣고 역전사 반응 후 실시간 중합효소 반응을 수행한 그래프를 나타내는 도면이다. D는 핫스타트 역전사 반응물에 RNA만 넣고 역전사 반응 후 실시간 중합효소 반응을 수행한 그래프를 나타내는 도면이다.
도 12는 RNA 터미네이션에 의해 역전사 반응에서 RNA-RNA 셀프프라이밍 반응을 억제하는 것에 대하여 실시간 역전사 PCR을 수행한 그래프를 나타내는 도면이다. A와 B는 터미네이션 시키지 않은 RNA을 사용한 것이고, C와 D는 터미네이션반응을 한 RNA를 사용한 것이다. A와 C는 일반적인 역전사 반응을 수행하였고, B와 D는 핫스타트 역전사 반응을 수행한 그래프를 나타내는 도면이다.
도 13a는 휠라셀에서 추출한 RNA을 이용하여 암 마커인 케라틴 8을 검출한 것이며 정량 분석을 하기위하여 추출한 RNA을 순차적으로 10배씩 희석하여 스텐다드 커브를 만들기 위한 실시간 역전사 PCR반응을 수행한 그래프를 나타내는 도면이다. 도 13b, 도13c, 도13d, 도13e는 RNA 터미네이션과 핫스타트 역전사 PCR 반응을 통하여 암 마커에 대한 검출 한계를 향상시킨 것에 대하여 실시간 역전사 PCR을 수행한 그래프를 나타내는 도면이다.
일 관점에서, 본 발명은 Mg 2+ 이온, 4종의 dNTP, 역전사 중합효소, PPi 및 PPase를 포함하는 핫스타트 역전사반응용 조성물에 관한 것이다.
상기 역전사 중합효소는 공지된 임의의 역전사 중합효소를 특별한 제한없이 사용할 수 있으며, 상업적으로 시판되고 있는 AMV 또는 MMLV 등을 통상적으로 사용할 수 있다.
상기 PPase는 시판되는 통상의 PPase를 제한없이 사용할 수 있으며, B35 (Thermus thermophilus B35) 유래의 무기 피로포스파타제 유전자를 클론화한 대장균에서 유래된 티티이(Tte)-무기 피로포스파타제(Sibzyme 사), 또는 피크로필러스 토리두스(Picrophilus torridus, 바이오니아 사) 유래의 무기 피로포스파타제 유전자를 클론화한 대장균에서 유래된 프토(Pto)-무기 피로포스파타제를 사용하는 것이 바람직하다. 상기 프토(Pto)-무기 피로포스파타제 효소의 1 U은 1분간 피로포스페이트로부터 포스페이트 40 nmole을 생성하는데 필요한 효소의 양으로 정의되며, Tris-HCl(pH 7.5), 5 mM MgCl2, 2.0 mM PPi를 사용하고, 반응 부피를 0.5로 하여, 70℃에서 10분간의 반응으로 확인한다.
상기 조성물에 포함되는 PPi는 최종 반응액을 기준으로 0.1 mM 내지 5.0 mM의 농도로 가해질 수 있고, 0.2 내지 3.0 mM인 것이 바람직하다. PPi 농도가 5.0 mM 보다 높을 경우에는 비례적으로 PPase의 농도 또한 높게 적용하여야 하는데, 이 경우 역전사 반응 산물의 양이 감소할 수 있다. 또한, PPi 농도가 0.1 mM 보다 낮을 경우에는 역전사 반응조성물 중의 Mg2+ 이온을 포집하는 능력이 떨어져 비특이적 프라이밍(mispriming)에 의한 비특이적 산물의 생성을 억제하는 효과를 얻을 수 없다. 또한, PPase는 역전사 반응혼합물에 Ppi 가 0.1mM 내지 5mM 일때 0.005U 내지 0.25U을 포함시켜 사용하는 것이 보다 바람직하다. PPase 사용 농도는 Ppi 0.1mM 당 0.005U을 사용하고 초과할 경우에는 높은 사본수의 주형에 적용시 낮은 사본수의 주형에 적용시보다 과농도에서 그 결과가 확인되고, 역전사 반응성이 감소되어 반응 산물이 현저하게 감소될 수 있으며, PPase 처리 농도가 Ppi 0.1mM 당 0.005U 미만일 경우에는 역전사 반응을 저해될 수 있는 문제점이 있다.
상기 반응용 완충용액은 10 mM TrisHCl, 40 mM KCl, pH 9.0을 사용하는 것이 바람직하고, 상기 4종의 dNTP는 dATP, dTTP, dGTP 및 dCTP를 나타낸다. 상기 조성물은 필요에 따라 프라이머, 주형 핵산 등 역전사반응에 필요한 물질을 추가로 포함할 수 있다. 상기 프라이머는 랜덤 프라이머 또는 주형 핵산에 특이적인 프라이머일 수 있고, 상기 주형 핵산은 역전사반응을 필요로 하는 RNA인 것이 바람직하다. 추가로, 상기 조성물은 형광염료를 포함할 수 있고, 상기 형광염료는 SyBr Green, EtBr 및 HRdye로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 역전사 반응용 조성물은 역전사 프라이머를 추가로 포함할 수 있고, 역전사 프라이머는 주형 RNA에 어닐링하여 역전사를 수행할 수 있는 프라이머라면 제한없이 사용될 수 있으며, 폴리 A 프라이머나, 주형 RNA에 특이적인 프라이머 등을 모두 사용할 수 있다.
한편, 본 발명의 역전사반응용 조성물은 실험상의 편의, 역전사반응 반응 산물에 의한 오염방지, 역전사 반응효소와 dNTP의 안정화 및 반응성의 향상을 위하여 핵산에 대해 비반응성인 염료 물질 및/또는 다가알코올류를 포함할 수 있다.
상기 "비반응성 염료 물질"이란 역전사반응 반응에 영향을 미치지 않는 물질로부터 선택되어야 하며, 역전사반응 산물을 이용한 PCR 반응 분석이나 식별을 위해 사용되는 것을 목적으로 한다. 이러한 조건을 만족시키는 물질로는 로다민, 탐라, 락스, 브로모페놀 블루(bromophenol blue), 크실렌 시아놀(xylene cyanole), 브로모크레졸 레드(bromocresol red), 크레졸 레드(cresol red) 등의 수용성 염료를 들 수 있고, 이중에서도 크실렌 시아놀을 사용하는 것이 바람직하다. 상기 비반응성 염료 물질은 전체 조성물에 대해 0.0001 내지 0.01 중량%의 함량으로 포함될 수 있으며, 0.001 내지 0.005 중량%의 함량으로 포함되는 것이 바람직하고, 0.001 내지 0.003 중량%의 함량으로 포함되는 것이 보다 바람직하다. 만일, 상기 비반응성 염료 물질이 0.0001 중량% 미만의 함량으로 첨가되는 경우에는 역전사반응 반응후의 분석을 위한 아가로스젤 전기영동시 염료의 농도가 낮아 시료의 이동을 육안으로 관측하기 어렵다는 문제점이 있고, 비반응성 염료 물질이 0.01 중량% 초과의 함량으로 첨가되는 경우에는 역전사반응 반응시 고농도의 수용성 염료가 반응 저해제로 작용할 수 있다는 문제점이 있다. 또한, 아가로스젤로의 침강이 이루어진 후 전기영동시 시료의 이동을 방해할 수 있다는 문제점이 있다.
또한, 상기 다가알코올류는 본 발명의 조성물을 보다 안정화시키기 위한 추가 안정화물질로 사용될 수 있으며, 글루코스, 글리세롤, 만니톨, 갈락시톨, 글루시톨, 솔비톨 중 하나 이상의 물질을 사용하는 것이 바람직하다. 상기 다가알코올류는 10 내지 500 mM의 함량으로 포함될 수 있으며, 50 내지 300 mM의 함량으로 포함되는 것이 바람직하다. 만일, 다가알코올류가 500 mM을 초과하게 되면 수용성 중합체 자체의 용해도로 인해 수용액으로 용해하기 어려우며, 높은 점도로 인해 충분한 혼합이 이루어지기 어렵고, 부피가 필요 이상으로 커지며, 역전사반응 반응을 위해 유전자 용액과 멸균된 증류수로 용해시 용해가 쉽게 되지 않는다. 또한, 역전사반응 반응시 고농도의 수용성 중합체가 반응 저해제로 작용할 수 있다는 문제점이 있다. 그리고, 10 mM 미만이면 대상효소와 표면 물분자를 충분히 코팅하여 보호할 수 없기 때문에 효율적인 효소의 안정화 효과를 기대하기 어려우며 또한, 용액의 점도가 너무 낮아 튜브 바닥면 전체에 넓게 퍼지면서 이상적인 형태로 건조되지 못하는 문제점과 효소가 충분히 보호되지 못하는 문제점이 있다. 본 발명에서는 다가알코올류 이외에도 안정화 물질로서 젤라틴, 소혈청 알부민, Thesit, PEG-8000을 사용하는 것이 가능하다.
상기 조성물은 안정성, 보관의 간편성 및 장기 보관성을 증가시키기 위하여 동결되거나 건조된 상태인 것이 바람직하다. 상기 건조는 일반적인 상온건조, 가온건조, 예를 들면 40℃ 내지 60℃에서의 가온건조, 또는 동결건조, 감압건조와 같은 공지의 건조 방법에 의해 수행될 수 있으며, 조성물의 성분이 손실되지 않는 한, 임의의 건조 방법은 모두 사용가능하다. 상기와 같은 건조 방법은 사용되는 효소의 종류 및 양에 따라 상이하게 적용될 수 있으며, 본 발명에서는 바람직하게는 동결건조 또는 진공원심분리를 이용한 감압 건조 방법이 사용될 수 있다.
상기 핫스타트 역전사 PCR용 조성물은 상기 반응혼합물을 한 반응 튜브 내에혼합시킨 후 바로 동결하거나 건조시킴으로써 안정화된 상태로 제조할 수 있다.
상기 반응혼합물은 필요에 따라 프라이머, 프로브, 주형 핵산, 형광염료, 비반응성인 염료 물질 및/또는 다가알코올류 등을 추가로 포함할 수도 있다.
상기 DNA 중합효소는 공지된 임의의 DNA 중합효소를 특별한 제한없이 사용할 수 있으며, 이 중에서도 5'->3' 엑소뉴클레아제 활성를 갖는 중합효소, 3'->5' 엑소뉴클레아제 활성를 갖는 중합효소, 및 5'->3' 엑소뉴클레아제 활성과 3'->5' 엑소뉴클레아제 활성이 없는 중합효소를 단독으로 사용하거나, 또는 상기 DNA 중합효소들을 조합하여 사용할 수 있다. 상기 5'->3' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 중합효소의 예로는 Taq DNA 중합효소, 3'->5' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 중합효소의 예로는 Pfu DNA 중합효소 또는 TLA DNA 중합효소(바이오니아 사), 5'->3' 엑소뉴클레아제 활성과 3'->5' 엑소뉴클레아제 활성이 없는 중합효소의 예로는 Top DNA 중합효소(바이오니아 사)를 포함할 수 있다. DNA 중합효소는 역전사 PCR용 조성물에 0.1 내지 10 U(unit), 바람직하게는 0.5 내지 2 U, 가장 바람직하게는 1 U의 농도로 포함시켜 사용할 수 있다. 상기 Taq, Pfu, Top 및 TLA DNA 중합효소는 하기 표 1과 같은 특성을 갖는다.
Taq.
DNA 중합효소		 Pfu
DNA 중합효소		 Top
DNA 중합효소		 TLA
DNA 중합효소
5'->3'
엑소뉴클레아제 활성		 있음 없음 없음 없음
3'->5'
엑소뉴클레아제 활성		 없음 있음 없음 있음
말단 트랜스퍼라제 활성 있음 NO 있음 없음
에러율(x10-6) 4.91 1.90 미확인 미확인
절편의 크기 ≤ 10 kbp ≤ 5 kbp ≤ 10 kbp ≤ 15 kbp
최적 활성 온도(℃) 72 72 72 72
Half life(분, 95℃에서) 80 미확인 미확인 미확인
MgCl2(mM) 1.5 - 1.5 1.0
MgSO4(mM) - 2.0 - -
KCl(mM) 40 10 30 70
최적 pH(25℃에서) 9.0 8.8 9.0 9.0
또한, 상기 역전사 PCR용 조성물은 통상의 역전사 PCR 반응 이외에도 다중 역전사 PCR 반응, 실시간 역전사 PCR 반응, 실시간 정량적 역전사 PCR 반응 또는 다중 실시간 역전사 PCR 반응과 같은 임의의 핵산 증폭 방법이 제한없이 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 역전사 PCR용 조성물은 DNA 중합효소와 결합하거나, DNA 중합효소의 작용을 조절하여 핫스타트 PCR 효과를 갖는 물질을 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 물질은 DNA 중합효소에 결합하는 항체, 앱타머 및 Affibody로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 DNA 중합효소는 변형된 형태로 이러한 중합효소 자체를 사용하는 것으로 핫스타트 PCR 효과를 가질 수 있는 것을 특징으로 할 수 있으며, 이러한 효소의 예로는 Tth polymerase가 있으며 이에 국한되는 것은 아니다.
본 발명에 사용되는 PPase는 바람직하게는 70℃ 이상의 고온에서도 열에 안정한 열안정성 효소로서, 역전사 및 PCR 과정 동안 열에 안정하며, 특히 PPase는 역전사 중합효소 및 DNA 중합효소가 반응하는 온도조건과 유사하게 효소활성을 나타낸다. 그렇기 때문에, 혼합과정에서 역전사반응 및 PCR을 방지하고 프라이머가 특이적으로 혼성화되는 온도 이상에서 일정시간 PPase를 반응시켜 PPi를 분해시킴으로써, 역전사효소가 활성화되면서 역전사반응이 프라이머의 혼성화 온도에서 시작되어 비특이적인 cDNA 합성을 제거할 수 있게 한다. 또한, DNA 중합효소가 혼성화되면 비특이적인 핵산 증폭을 방지할 있다. 결과적으로, 기존의 역전사 및 역전사 PCR에 비해 선택성이 크게 증가될 뿐만 아니라 극미량의 표적 핵산을 성공적으로 검출해 낼 수 있다. 이에, PPi 및 PPase를 포함하는 본 발명의 핫스타트 역전사 반응 및 역전사 PCR 반응용 조성물은 종래의 역전사반응이 가지고 있던 비특이적 역전사반응과 그 뒤에 이어지는 비특이적 PCR 증폭의 문제점을 해결하였으며, 번거로움 없이 원하는 표적 산물만을 선택적으로 증폭시켜 정확한 증폭 결과를 얻을 수 있는 안정적인 조성물이다.
즉, 본 발명의 핫스타트 역전사반응용 조성물은 종래에 보고되고 상용화된 여러 가지 역전사반응 조성물과 비교하여 하기와 같은 이점들이 있다:
1) 본 발명의 핫스타트 역전사 PCR 반응용 조성물은 표적 RNA가 반응액의 전체 RNA중에 극미량으로 포함되어 있는 경우에서도 선택적으로 표적 RNA를 역전사반응시켜 표적 핵산에 특이적으로 PCR 증폭을 수행할 수 있음으로써, 극미량의 RNA 바이러스 검출이나 암 관련 RNA 유전자분석을 가능하게 한다;
2) 비특이적 프라이밍에 의한 증폭 산물의 생성을 방지하므로, 다양한 표적에 대한 역전사 PCR 반응을 동시에 수행하는 다중 역전사 PCR 반응을 수행함에 있어서 다양한 표적을 동시에 검출할 수 있다.
3) 본 발명에 사용되는 모든 역전사 PCR 반응의 반응혼합물 구성 성분은 하나의 혼합물로 제조하여 사용하게 됨으로써, 역전사 PCR 동안에 별도의 혼합 과정이 필요하지 않으므로 반응중 혼합으로 인한 오류를 방지할 수 있다. 비특이적 PCR 산물의 발생 제거, 실험상의 편의, 역전사 PCR 반응 산물에 의한 오염방지, 역전사 중합효소, DNA 중합효소 및 dNTP의 안정화 및 반응성을 향상시킬 수 있다.
4) 핵산에 안정화제를 함께 섞어 사용하는 경우, 사용성 및 안정성이 더욱 증가되고 저장이 용이하다.
본 발명의 바람직한 구현예에 있어서, 본 발명자들은 종래에 비특이적으로 일어나는 역전사반응의 문제점들을 개선하여 핫스타트 역전사반응을 표적 특이적으로 수행하고자, 원하는 RNA만을 cDNA로 합성하고 이와 같이 합성된 cDNA에 대해 특이적인 PCR 반응을 수행함으로써 원하는 RNA를 고감도로 증폭하기 위해, PPi 및 PPase를 역전사반응에 사용하였다. 구체적으로, 역전사 중합효소를 포함하는 역전사 반응혼합물에 0.5 mM 내지 2.0 mM 농도, 바람직하게는 2.0 mM 농도의 PPi, 및 0.005U 내지 0.25U 농도, 바람직하게는 0.1 U 농도의 PPase를 첨가한 후 42℃에서 60분간 역전사반응을 실시하였다. 그 결과, PPase를 첨가하지 않은 경우에는 PPi에 의해 역전사반응이 억제된 반면에(도 1 참조), PPi 및 PPase를 첨가한 경우 역전사 및 PCR 반응이 활성화되어 반응 산물의 양이 증가한 것으로 나타났다(도 2 및 도 3 참조). 또한, PPi 및 PPase를 사용하여 C형 간염바이러스의 유전자를 증폭한 결과, 주형 RNA는 1010 내지 10의 카피수까지 모두 검출이 가능하였고(도 4 참조), 상기 C형 간염바이러스의 주형 RNA 이외의 인간 세포에서 추출한 총 RNA를 혼합한 결과, 상기 인간 유래 RNA에 의한 비특이적 반응이 억제됨을 확인하였으며, 표적 이외의 RNA에 의해 반응 효율 감소, 민감도 및 검출 능력에 변화가 없음을 확인하였다. 반면에 PPi 및 PPase가 없는 경우에는 첨가한 인간 유래 RNA에 의해 비특이적인 반응이 일어났다(도 5a 및 5b 참조). 또한, 본 발명의 핫스타트 역전사 PCR 방법은 기존의 Taq 항체를 사용한 핫스타트 PCR 방법과 비교하여 비특이적인 반응이 현저히 감소함으로써, 10 카피수까지 고감도로 표적 RNA만을 검출하는 것을 확인하였다(도 6a 및 6b 참조). 아울러, 본 발명의 핫스타트 역전사 PCR용 조성물의 안정성 및 보관저장성을 높이기 위해, 상기 조성물을 건조시켰고, 건조된 조성물은 건조하지 않은 조성물과 비교하여 유사한 반응성 및 증폭 결과를 안정되게 얻을 수 있음을 확인하였다(도 7 내지 8 참조).
따라서, 상기 핫스타트 역전사반응용 조성물 및 이를 이용한 역전사 PCR용 조성물을 사용하여 RNA를 대상으로 고감도의 역전사 및 역전사 PCR을 수행할 수 있으므로, 각종 바이러스 검사 및 암 유전자 발현 검사 등 RNA 증폭을 대상으로 하는 유전자 증폭 기술에 유용하게 사용할 수 있다.
본 발명에서는 타깃 핵산을 검출하기 위한 PCR 반응 또는 실시간 정량 PCR 반응 등 핵산증폭검사에서, 주형핵산 자체가 비특이적으로 셀프프라이밍되어 주로 증폭됨으로 인해 문제가 발생되는 것을 방지하기위하여, 주형 핵산에 중합반응을 종결시키는 물질과 핵산중합효소를 첨가하여 터미네이션 반응시킴으로써 주형핵산이 프라이머로 작용할 수 없게 하여 타깃 핵산만을 증폭하여 고민감도로 검출할 수 있는 방법을 추가적으로 사용할 수 있다.
따라서, 본 발명은 추가적으로, 3' 말단에 핵산중합 터미네이터가 결합되어 비특이 핵산중합이 방지된 주형핵산을 포함하는 것을 특징을 할 수 있으며, 상기 핵산중합 터미네이터는 핵산중합효소에 작용할 수 있는 트리포스페이트 형태로 활성화되고, 3'에 수산기 이외의 다른 잔기를 가지는 핵산유사 화합물인것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 핵산중합 터미네이터가 결합되어 비특이 핵산중합이 방지된 주형핵산은 다음의 핵산준비방법을 거쳐 제조된다:
1) 핵산중합효소, 효소반응 완충용액, 및 핵산중합 터미네이터를 포함하는 반응 혼합물을 이용하여 주형 핵산의 3' 말단을 터미네이션(termination)시키는 단계; 및 2) 상기 반응 혼합물로부터 핵산중합 터미네이터를 불활화 또는 제거시키는 단계.
상기 핵산준비방법은 보다 상세하게는, 1) 핵산을 포함하는 생물학적 시료로부터 핵산을 분리 정제하는 단계;2) 핵산중합효소, 효소반응 완충용액, 및 핵산중합 터미네이터를 포함하는 반응 혼합물을 이용하여 상기 1) 단계의 분리정제된 주형 핵산의 3' 말단을 터미네이션(termination)시키는 단계; 및 3) 상기 3' 말단이 터미네이션(termination)된 핵산을 포함하는 반응 혼합물로부터 핵산중합 터미네이터를 불활화 또는 제거시키는 단계; 를 포함하는 방법을 통하여 준비할 수 있다.
본 발명에 기재된 핵산준비방법은 통상의 공지된 자동핵산추출장치를 사용할 수 있으며, 예를 들면 한국등록특허 10-0148239호, US5702590, US5647994, EP 0691541, US 5336760호, US5897783호, US6187270호, 한국특허출원 10-2008-0032904호에 기재된 장치가 사용될 수 있다. 또한 바이오니아사의 ExiPrepTM 16-fully Automated DNA/RNA/Proteins Purification System이 본 발명의 자동핵산추출장치로 바람직하게 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 시료는 폴리뉴클레오티드인 핵산을 포함하는 임의 식물, 동물, 세균 또는 바이러스로부터 유래되는 샘플로 구성될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 핵산은 RNA 또는 DNA이고, 상기 핵산중합효소는 DNA 또는 RNA의 3'말단에 더 이상 중합이 진행되지 못하게 터미네이터를 붙일 수 있는 모든 핵산중합효소를 포함하다.
보다 상세하게는 본 발명의 핵산중합효소는 3' → 5' 엑소뉴클리아제(exonuclease) 활성을 가지고 있지 않아서 터미네이터를 다시 가수분해하지 않는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 90℃ 이상의 고온에서 효소역가를 상실하는 것이 좋다. 상기 핵산중합효소는 RNA-의존성 RNA-중합효소, RNA-의존성 DNA-중합효소, DNA-중합효소, 및 RNA-중합효소로부터 선택되는 하나 이상인 것을 포함할 수 있다.
본 발명에서 "핵산중합 터미네이터"라 함은 핵산이 더 이상 늘어나지 않게 모든 주형 핵산 절편의 중합반응을 종결시키는 물질을 말하며, 주형 핵산 절편의 말단에 결합되어 더 이상의 핵산 사슬 신장(chain elongation)이 일어날 수 없게 하는 물질을 말한다.
본 발명에서 "터미네이션(termination)"이라 함은 "상기 핵산중합 터미네이터"를 핵산의 3'말단에 공유결합시켜 더 이상 핵산중합반응을 진행할 수 없게 만드는 것을 의미하고 여기에 사용되는 물질을 터미네이터(terminator)라고 정의한다.
보다 상세하게는 본 발명에서 언급되는 "터미네이션(termination)"은 핵산의 3'위치에 히드록시(hydroxy)기가 없거나 또는 중합효소에 의한 중합반응을 진행시키지 못하는 화학기를 가진 물질을 핵산의 3'말단에 공유결합시켜 더 이상 핵산중합반응을 진행할 수 없게 만드는 것을 의미하고 여기에 사용되는 물질을 터미네이터(terminator)라고 정의한다.
본 발명에 있어서, 상기 핵산중합 터미네이터는 핵산중합효소에 작용할 수 있는 트리포스페이트 형태로 활성화된 핵산유사화합물로서, 핵산이 연결되는 3' 수산기가 결여되거나 다른 것으로 치환된 다양한 종류의 뉴클레오티드 트리포스페이트를 사용할 수 있으며, 각각의 핵산중합효소와 반응성이 좋은 핵산중합 터미네이터를 선택하여 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 핵산유사화합물은
2'3'-디데옥시 뉴클레오시드 5'-트리포스페이트(2'3'-dideoxynucleoside 5'-triphosphate) 3'-데옥시아데노신 5'-트리포스페이트(3'-deoxyadenosine 5'-triphosphate), 3'-아지도-3'디옥시티미딘 5'-트리포스페이트 (3'-azido-3'-deoxythymidine 5'-triphosphate), 1-β-d-아라비노실뉴크레오시드 5'-트리포스페이트(1-β-d-Arabinofuranosylnucleoside 5′-Triphosphate), 아시클로 구아노신트리포스페이트(acyclo-guanosine triphosphate), 3'-아미노-3'디옥시뉴클레오시드 5'-트리포스페이트(3'-amino-2'-deoxynucleoside 5'-triphosphate), 및 3'-플로르-3'디옥시뉴클레오시드 5'-트리포스페이트(3'-fluoro-3'-deoxynucleoside 5'-triphosphate)로부터 선택되는 하나 이상인 것을 사용할 수 있다.
보다 상세하게는 대장균이나 내열성 세균에서 유래된 DNA-중합효소는 생거에 의해 개발된 dideoxy 염기서열 결정법에서 많이 사용되어 왔던 디데옥시 뉴클레오티드 트리포스페이트(2'3'-dideoxynuclreotide triphosphate, ddNTP)를 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 디데옥시 뉴클레오티드 트리포스페이트(ddNTP)는 디데옥시 구아노신 트리포스페이트(ddGTP), 디데옥시 아데노신 트리포스페이트(ddATP), 디데옥시 티미딘 트리포스페이트(ddTTP) 및 디데옥시 시티딘 트리포스페이트(ddCTP)로부터 선택되는 하나 이상인 것을 포함할 수 있다.
상기 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트(dNTP)는 구아노신, 아데노신, 티미딘, 유리딘 및 시티딘으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 포함할 수 있다.
그것의 예시로서, DNA-중합효소를 이용해서 터미네이션 반응을 시키기 위해서는 다양한 핵산중합 터미네이터들을 사용할 수 있다. 포유동물 유래의 DNA-중합효소를 사용할 경우, 이 효소에 반응성이 높은 5′-Triphosphate 1-β-d-Arabinofuranosylcytosine나 5′-Triphosphate 9-β-d-Arabinofuranosyladenine을 사용할 수 있다(Inhibition of Mammalian DNA Polymerase by the 5′-Triphosphate of 1-β-d-Arabinofuranosylcytosine and the 5′-Triphosphate of 9-β-d-Arabinofuranosyladenine, J. J. Furth, and Seymour S. Cohen, Cancer Res October 1968 28; 2061).
또한, 바이러스 유래의 DNA-중합효소들을 저해하는 항바이러스제로 많이 사용되어 왔던 아시클로비어핵산(acyclonucleoside)의 트리포스페이트도 핵산중합 터미네이터로 사용될 수 있다(Inhibition of herpes simplex virus-induced DNA polymerase activity and viral DNA replication by 9-(2-hydroxyethoxymethyl)guanine and its triphosphate. P A Furman, M H St Clair, J A Fyfe, J L Rideout, P M Keller and G B Elion, J. Virol. October 1979 vol. 32 no. 1 72-77 ).
또 다른 예시로서, RNA 중합효소인 Poly A 중합효소는 RNA의 3' 말단에 아데노신을 붙이는 효소로서 본 발명의 핵산중합 터미네이션 반응에 잘 맞는 효소이다. 상기 효소를 사용할 경우에는 poly A 중합효소의 저해제로 알려져 있는 3'-데옥시아데노신 트리포스페이트(3'-dATP, cordycepin)를 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 2) 단계는 1) 단계 후, 미반응 핵산중합 터미네이터를 불활화 또는 제거하는 과정으로, 상기 핵산중합 터미네이터의 불활화는 중합에 사용되는 각종 핵산중합 터미네이터의 트리포스페이트결합을 가수분해할 수 있는 다양한 효소들을 모두 사용할 수 있다,
보다 상세하게는 핵산중합 터미네이터의 불활화는 상기의 핵산중합 터미네이터들을 가수분해하여 불활화시킨 후, 효소의 기능이 없어야 하므로 열에 의해 쉽게 활성을 잃어버리는 것이 좋다. 이는 이어지는 역전사 반응이나 PCR 반응의 뉴클레오티드 트리포스페이트를 분해하지 말아야 하기 때문이다.
예를 들면 상기 포스포결합 가수분해효소는 트리포스페이트를 분해하는 기질특성을 가지고 있는 알칼라인 포스파타제로서 BAP(Bacterial Alkaline Phosphatase)와 CIP(calf intestinal phosphatase) 등을 사용할 수 있으며, 보다 바람직하게는 열에 의해 쉽게 불활화 되는 CIP를 사용하는 것이 바람직하다.
또한 피로포스페이트와 ATP 등을 가수분해하는 다양한 생물체 즉, 대장균유래, 소의 소장유래, 새우유래의 알칼리성 포스파타제, Autotaxin(Clair T, Lee HY, Liotta LA, Stracke ML (1997). "Autotaxin is an exoenzyme possessing 5'-nucleotide phosphodiesterase/ATP pyrophosphatase and ATPase activities". J. Biol. Chem. 272 (2): 996-1001. doi:10.1074/jbc.272.2.996. PMID 8995394.)도 사용할 수 있다. 뉴클레오시트 트리포스페이트를 비특이적으로 분해하는 황색포도상구균 아데노신 합성효소(Staphylococcus aureus adenosine synthase; AdsA)를 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 핵산준비방법은 핵산 분리 정제과정을 수행하고, 연속하여 핵산중합효소와 핵산중합 터미네이터를 추출된 핵산에 가함으로써 상보 핵산의 중합반응을 종결시켜 주형 핵산에 의한 비특이 프라이밍을 제거할 수 있다. 상기 반응 후, 미반응 핵산중합 터미네이터들은 이어지는 중합연쇄반응이나 PCR 반응의 저해제로 작용하므로, 미반응 핵산중합 터미네이터의 제거단계가 필요하다.
상기 핵산중합 터미네이터의 제거는 gel filtration, 또는 caotropic agent 및 실리카비드를 이용할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 핵산준비방법은 공지의 자동핵산추출장치 및 유전자 증폭장치를 통합적으로 관리하는 공지의 핵산 분석 통합 장치를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 상기 Exiprep 16 DX((주)바이오니아) 제품이 사용될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
보다 상세하게는 핵산 분리 정제과정을 수행하고, 연속하여 핵산중합효소와 핵산중합 터미네이터를 추출된 핵산에 가하여 핵산중합 터미네이션 반응을 시켜 모든 핵산들의 프라이밍의 기능을 불활화 시킬 수 있다. 반응 후에 남아있는 터미네이터들은 이어지는 역전사 반응이나 PCR 반응의 저해제로 작용하므로 이를 제거하기 위해서는 두가지 방법을 사용할 수 있다.
상기 두가지 방법은 상기 Exiprep 16 DX((주)바이오니아) 장비를 사용해서 다시 RNA 정제를 수행하는 방법과 핵산중합 터미네이터를 분해시켜 더 이상 반응을 하지 못하게 하는 방법이다.
상기 장비를 사용하여 정제를 하는 방법은 caotropic agent 존재하에 실리카자성 입자에 붙이고 다시 세척과 용출을 하는 방법으로서, 여러 단계를 거치므로 시간이 많이 들고, 이 과정에서 정제된 RNA의 손실이 발생하는 문제점이 있다. 반면에 활성화된 핵산중합 터미네이터인 뉴클레오티드 트리포스페이트를 가수분해효소로 다이 또는 모노트리뉴클레오티드로 분해하여 불활화시키는 방법은 빠르고 간단하며 수율을 떨어뜨리지 않기 때문에 장점이 많다.
상기 효소를 사용한 불활화 방법을 좀 더 자세히 기술하면 Exiprep 16 DX의 자성입자를 포집하고 있는 용출단계에 사용되는 웰은 온도가 조절가능한 웰이므로 용출버퍼로 용출시킨 후, 여기에 트리포스페이트 가수분해효소인 알칼리성 포스파타제, 오토탁신, 황색포도상구균 아데노신 합성효소(Staphylococcus aureus adenosine synthase; AdsA)를 가하여 37℃에서 반응시킴으로써 간단하게 터미네이터 제거반응을 시킬 수 있는 장점을 가지고 있다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 핫스타트 역전사반응 또는 핫스타트 역전사 PCR용 조성물의 제조방법에 관한 것이다.
상기 제조방법은 구체적으로, 한 반응튜브 내에 반응용 완충용액, MgCl2, 4종의 dNTP, 역전사 중합효소, PPi 및 PPase로 이루어진 반응혼합물을 제공하는 단계를 포함하고, 특히 핫스타트 역전사 PCR용 조성물의 제조에 있어서는 상기 반응혼합물에 DNA 중합효소를 추가로 포함한다.
상기 DNA 중합효소는 5'->3' 엑소뉴클레아제 활성를 갖는 중합효소, 3'->5' 엑소뉴클레아제 활성를 갖는 중합효소 및 5'->3' 엑소뉴클레아제 활성과 3'->5' 엑소뉴클레아제 활성이 없는 중합효소로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 반응혼합물의 안정성 및 장기보관성을 증가시키기 위하여 동결 또는 건조시킴으로써 건조한 상태의 조성물을 형성시키는 단계를 추가로 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 PPi는 최종 반응액을 기준으로 0.1 mM 내지 5 mM의 농도, 바람직하게는 0.5 mM 내지 2.0 mM의 농도로 포함되는 것이 더욱 바람직하고, 상기 피로포스파타제는 PPi 0.1mM 당 0.005U 의 양으로 포함되는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
추가로, 상기 반응혼합물에는 하나 이상의 프라이머 또는 프로브, DNA에 결합하는 형광 염료, 주형 핵산, 핵산에 대해 비반응성인 염료 물질, 또는 다가알코올, 젤라틴, 소혈청 알부민, Thesit 및 PEG-8000으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 물질을 포함할 수 있다. 이 때, 상기 형광 염료는 SyBr Green, EtBr 및 HRdye로 이루어진 군에서 선택되고, 상기 염료 물질은 로다민, 탐라, 락스, 브로모페놀 블루, 크실렌 시아놀, 브로모크레졸 레드, 크레졸 레드로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 물질일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 핫스타트 역전사반응용 조성물을 포함하는 핫스타트 역전사반응용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 핫스타트 역전사 PCR용 조성물을 포함하는 핫스타트 역전사 PCR용 키트를 제공한다.
상기 키트는 통상적인 역전사반응용 키트 또는 역전사 PCR용 키트의 제조방법에 따라 제조할 수 있다.
또다른 관점에서,본 발명은 상기 핫스타트 역전사반응용 조성물에 주형 RNA를 함유한 시료를 혼합하는 단계; 및 상기 반응 혼합물이 역전사될 수 있도록 반응을 수행하는 단계를 포함하는 주형 RNA의 역전사 방법에 관한 것이다.
아울러, 본 발명은 상기 핫스타트 역전사 PCR용 조성물에 주형 RNA를 함유한 시료를 혼합하는 단계;
상기 반응 혼합물이 증폭될 수 있도록 반응을 수행하는 단계; 및
상기 증폭 산물을 분석하는 단계를 포함하는 핵산 증폭 방법을 제공한다.
이때, 상기 역전사 PCR 반응은 다중 역전사 PCR, 실시간 역전사 PCR 및 실시간 정량적 역전사 PCR이 모두 가능하다.
본 발명의 바람직한 구현예에 있어서, 상기 주형 핵산은 역전사 및 PCR을 통해 핵산 증폭이 일어날 수 있는 RNA인 것이 바람직하다.
본 발명의 핫스타트 역전사반응용 조성물 및 이를 이용한 역전사 PCR용 조성물은 반응용 완충용액, MgCl2, 4종의 dNTP 및 역전사 중합효소를 포함하는 역전사 반응혼합물에 PPi 및 PPase를 추가함으로써, 상온의 혼합과정에서 역전사반응을 방지하고 프라이머가 특이적으로 혼성화되는 온도 이상에서 일정시간 PPase를 반응시켜 PPi를 분해시켜서 역전사효소를 활성화시키므로, 역전사반응이 프라이머의 혼성화 온도에서 시작되어 비특이적인 cDNA 합성을 제거할 수 있다. 따라서, 기존의 역전사반응에 비해 선택성이 현저히 증가될 뿐만 아니라 극미량의 표적 RNA도 성공적으로 검출해 낼 수 있는 효과가 있다. 게다가, 상기의 조성물을 동결하거나 안정화제를 첨가하여 건조하여 줌으로써 종래 조성물에 비해 안정적이고 간편하게 사용할 수 있으므로 보다 안정화된 핫스타트 역전사반응용 조성물로서 유용하게 사용할 수 있다.
본 발명의 일 양태에서는, 주형 RNA와 정확히 일치한 역방향 프라이머와 주형 RNA와 불일치하는 염기서열을 갖는 프라이머를 이용한 PPi 및 PPase를 첨가한 핫스타트 역전사반응을 수행하였으며, 그 결과, 주형 RNA와 정확히 일치한 역방향 프라이머에서는 증폭산물이 검출되었으나, 불일치하는 염기서열을 갖는 역방향 프라이머에서는 검출되지 않았다. 반면에 PPi 및 PPase가 없는 핫스타트 역전사반응은 불일치하는 염기서열을 갖는 역방향 프라이머에서도 검출되는 것을 확인하였다.
본 발명의 다른 양태에서는 본 발명의 핫스타트 역전사 PCR 반응을 이용하여 타겟 RNA에 대한 단일 염기 다형성을 분석하였으며, PPi 및 PPase를 첨가한 핫스타트 역전사반응의 경우, 주형 RNA와 정확히 일치하는 프라이머를 사용한 결과와 단일염기가 불일치하는 역방향 프라이머를 사용한 결과에서 PCR 효율차이가 나타났다. 반면에 PPi 및 PPase가 없는 핫스타트 역전사반응은 정확히 일치하는 역방향 프라이머와 단일염기 서열이 다른 역방향 프라이머 간에 PCR 효율 차이 없이 동일 사이클에서 검출되었다. 이는 리얼 타임 PCR 방법을 이용한 단일 염기 다형성 분석에 있어 본 발명에 따른 핫스타트 역전사 반응은 단일 염기 다형성 분석이 가능하나 핫스타트 역전사 반응이 없는 반응물에서는 단일 염기 다형성 분석이 어렵다고 할 수 있다
본 발명의 또 다른 양태에서는, 본 발명에 따른 핫스타트 역전사 PCR 반응을 이용한 추출된 핵산에 포함되어 있는 단일나선 핵산에 의한 셀프프라이밍에 의해 나타나는 비특이적인 반응을 억제하는 효과를 확인한 결과, 핫스타트 역전사 반응은 핫스타트 기능이 없는 반응액(PPi 및 PPase 가 제외된)보다 셀프프라이밍에 의한 비특이적 반응에 대해 억제가 되는 것을 확인하였다.
본 발명의 또다른 양태에서는 RNA 터미네이션을 통한 RNA 셀프프라이밍에 의한 비특이 역전사 중합연쇄반응 억제 효과를 확인하였다. poly(A) polymerase와 3′-데옥시아데노신 5′-트리포스페이트(3′-dATP)를 사용하여 추출된 RNA의 3′말단을 터미네이션시켜 주형으로 사용한 경우, 터미네이션 시키지 않은 RNA에서는 어떤 프라이머를 넣어 주지 않아도 cDNA가 만들어지는 것을 확인하였다. 이는 셀프 프라이밍에 의해 cDNA가 합성되었기 때문에 PCR에서 증폭이 된 것이다. 그리고 핫스타트 역전사 중합연쇄반응으로도 비특이적인 cDNA 합성과 이어지는 PCR 증폭을 막는다고 해도 완벽하게 저해할 수 없고 부분적으로만 RNA 셀프프라이밍에 의한 역전사 중합연쇄반응을 저해시킬 수 있어서 Ct 값이 약 5정도 늦추어져 1/30 정도로 반응을 저해시킬 수 있었다.
그러나 RNA의 3' 말단을 터미네이션한 시료에서 모든 역전사 중합효소연쇄반응에서 45 cycle까지 증폭되지 않음으로써 전혀 cDNA가 합성되지 않음을 확인하였다. 상기의 결과는 역전사 중합효소연쇄반응물 혼합시에 많은 비특이 역전사 중합효소연쇄반응들이 일어나고, 이로 인해 많은 비특이 cDNA들이 만들어 진다는 것을 알 수 있다. 그리고 상기 결과로부터 원하지 않는 반응들은 핫스타트 역전사 중합효소연쇄반응만으로 억제할 수 없다는 것을 확인할 수 있었으며 결국, 이러한 RNA 셀프프라이밍에 의한 비특이 역전사 중합효소연쇄반응은 본 발명의 터미네이션 반응을 이용하여 차단함으로써 완벽하게 억제시킬 수 있음을 확인할 수 있었다.
본 발명의 또다른 양태에서는 본 발명의 핫스타트 PCR을 이용하는 경우, 암 마커 검출 한계가 향상되는 것을 확인하였다.
암마커로는 호모사피언스 케라틴 8(KRT8)으로 National Center for Biotechnology information (NCBI,미국)을 통해 염기서열 정보를 확인하였으며, 인간 세포 종인 휄라 C세포에서 RNA을 추출하고, RNA 터미네이션 반응을 수행하였다. 그 결과, RNA 터미네이션 반응을 수행한 샘플에서는 핫스타트 역전사 반응은 인간혈청 1ml에 10개의 휠라셀을 첨가한 샘플까지 검출되었다. 핫스타트 역전사반응 기능이 없는 반응액에서는 휠라셀 100개 첨가한 샘플에서만 검출 되었다. RNA 터미네이션 시키지 않은 샘플에서는 핫스타트 역전사 반응액은 휠라셀 100개 첨가한 샘플까지만 검출되었다. 핫스타트 역전사 기능이 없는 반응액에서는 휠라셀 1,000개 첨가한 샘플까지만 검출되었다.
따라서, 핫스타트 역전사 반응만으로도 검출한계가 향상되었지만 RNA 터미네이션과 같이 수행했을 때 더 좋은 효과를 확인할 수 있었다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 더욱 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> PPi에 의한 역전사반응 억제 효과 확인
PPi에 의해 역전사반응이 억제되는 조건을 확인하기 위해, 마그네슘 이온은 1.5 mM로 고정하고 PPi를 다양한 농도로 첨가하여 역전사반응한 후 그 산물을 이용하여 PCR을 수행하였다. 이를 위하여 Accupower RT Premix (바이오니아,대한민국)에 PPi를 0.5 mM 내지 2 mM의 농도로 첨가하여 역전사반응 및 PCR을 수행하였다. 역전사반응은 인간 세포종 중 하나인 헬라(Hela) 세포에서 추출한 RNA를 각각 100 ng, 10 ng, 1 ng 또는 100 pg을 첨가하였으며 PPi 농도를 0, 0.5, 1, 1.5, 2 또는 2.5 mM이 되도록 각각 첨가하여 역전사반응을 수행하였다. 역전사 반응은 Accupower RT Premix (바이오니아, 대한민국)의 최적 온도인 42℃에서 60분 동안 1회 수행하였으며, 역전사 효소의 불활성을 위하여 95℃에서 5분 동안 1회 수행하였다. 역전사반응을 통해 얻어진 산물 20 ㎕ 중 5 ㎕를 Accupower PCR Premix (바이오니아,대한민국)에 첨가하였으며, 인간 GAPDH 프라이머 염기 서열을 표적으로 하여 GAPDH 정방향 프라이머 5'-GGAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'(서열번호 1) 및 GAPDH 역방향 프라이머 5'-GCCAAATTCGTTGTCATACC-3'(서열번호 2)를 설계 및 합성하여 PCR 반응을 수행하였다. PCR 반응은 95℃에서 5분간 예비 변성한 뒤 95℃에서 20초, 55℃에서 40초, 72℃에서 60초의 과정을 1회로 하여 총 30회를 수행하였고, 최종 신장을 72℃에서 5분 동안 수행하였다. PCR 반응에서 수득된 생성물을 아가로스겔에 DNA 분자량 마커와 함께 전기영동한 후, 에티튬브로마이드(ethidium bromide)로 염색하였고, 폴라로이드 카메라로 PCR 반응에 의해 증폭된 DNA 밴드를 촬영하였다. 양성대조군으로 PPi가 첨가되지 않은 RT PreMix (바이오니아,대한민국)를 이용하여 생성된 산물을 이용하여 PCR 반응을 수행하였다.
그 결과, PPi가 첨가된 대조군에서는 0,5 mM 부터 역전사반응이 억제되는 것을 확인할 수 있었고, 2 mM 까지 PPi를 첨가함으로써 보다 확실하게 역전사반응을 억제하는 것을 확인하였다(도 1).
<실시예 2> PPi를 2개의 포스페이트로 가수분해하는 PPase에 의한 역전사 반응의 확인.
상기 <실시예 1>에서 나타난 결과에서와 같이, PPi를 첨가함으로써 역전사반응이 이뤄지지 않은 것을 확인하였으므로, 이렇게 억제된 역전사반응에 대하여 PPi를 2개의 포스페이트로 분해하는 피로인산가수분해효소인 PPase를 첨가하여 역전사반응의 활성화를 확인하고자 하였다. 구체적으로, 상기 <실시예 1>과 동일하게 PPi가 첨가된 조건에서 0.1U의 PPase를 첨가하여 42℃에서 60분간 PPi 효소 반응과 역전사반응을 동시에 수행한 후, 역전사 효소의 불활성을 위하여 95℃에서 5분간 방치한 후 이어서 PCR을 수행하였다.
그 결과, PPase를 첨가한 경우 PCR 활성화되어 PCR 산물의 양이 가장 많은 것으로 확인되었다(도 2).
<실시예 3> PPi 및 PPase의 첨가에 따른 실시간 역전사 PCR의 확인
실시간 역전사 PCR에서 PPi 및 PPase가 첨가된 조성물에 의한 반응을 확인하기 위하여, 2X PCR PreMix 용액(10 mM Tris HCl pH 9.0, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 각각 250 uM의 4종류의 dNTP, 1U taq DNA 중합효소, 200 U 역전사 중합효소, 1 mM DTT, 0.01% Tween 20 및 안정화제를 포함)에 2 mM의 PPi 및 0.1 U의 PPase를 첨가하여 한 반응에 25 ㎕ 부피로 실시하였다. 인간 GAPDH를 표적 유전자로 하여 정방향 프라이머 5'-CGTGGAAGGACTCATGACCACA-3'(서열번호 3), 역방향 프라이머 GCCTTGGCAGCGCCAGTAGA-3' (서열번호 4) 및 GAPDH 탐침 프로브 5'-CTGTGGATGGCCCCTCCGGGAAA-3'(서열번호 5)을 각각 합성하였으며 각 10 nM이 되도록 첨가하였다. 주형 RNA로는 헬라 세포에서 추출한 총 RNA를 각 100 ng, 10 ng, 1 ng 또는 100 pg의 농도로 사용하였다. 그런 다음, 최종 부피 50 ㎕가 되도록 증류수로 첨가하였다. 실시간 역전사 PCR은 Exicycler 96 Real-Time Quantitative Thermal Block ((주)바이오니아, 대한민국)을 이용하여 수행하였고, 반응 조건은 50℃에서 15분간 역전사반응한 후, 95℃에서 5분간 예비 변성 단계를 거쳐, 95℃에서 5초간의 변성 단계, 60℃에서 5초간간의 어닐링 단계 및 72℃에서 6초간의 신장 단계, 형광을 검출하는 스캔 단계의 동시 반응을 1 사이클로 하여 총 45 사이클을 진행하였다.
그 결과, PPi 및 PPase에 의해 실시간 역전사 PCR에 영향을 주지 않음을 확인하였고, 표준 그래프를 작성했을 때, 기울기는 -3.1, 직선성 R2값은 0.9994이었다(도 3).
<실시예 4> 핫스타트 역전사 반응을 통한 hepatitis C virus RNA 검출
실시간 역전사 PCR을 실시하기 위해, 먼저 주형 RNA를 제조하였다. 구체적으로, C형 간염바이러스(Hepatitis C virus) 부분을 유전자 합성법(Biochem. Biophys, Res. Commun 1998, 248, 200-203 참조)으로 합성하고 그 중 일부를 pGEM-T-Easy vector (Cat. A1360, Promega 사제, 미국)에 클로닝하였다. 구체적으로, 2X Rapid ligation buffer (promega 사제,미국) 5 ㎕, T-easy vector (promega 사제, 미국) 1 ㎕, T4 DNA ligase 1 ㎕ (Promega 사제, 미국), 합성된 유전자 3 ㎕(8 ng)를 동일한 튜프에 넣어 혼합한 다음 37℃에서 1시간 정온배치하였다. 그 후, E.Coli 만능세포(Competent cell) 50 ㎕에 상기의 정온배치한 반응액 5 ㎕를 첨가하고 얼음 상에 40분간 놓아둔 뒤 42℃에서 40초간 배양하고 다시 얼음 상에 2분간 놓아두었다. 앰피실린(ampicillin), 이소프로필 1-티오-β-D-갈락토시드(isopropyl 1-thio-β-Dgalactoside; IPTG) 및 X-gal이 포함된 LB 플레이트에 상기 반응액을 접종한 후 37℃에서 16시간 배양하였다. 배양 후, 하얀색 콜로니를 취하여 LB 액체 배지에서 16시간 배양한 후 원심분리하여 상층액은 버리고 AccuPrep Plasmid Prep kit(바이오니아 사제, 대한민국)를 사용하여 펠렛으로부터 플라스미드 DNA를 추출하였다. 플라스미드 DNA는 UV 분광계 (Shimazu 사제, 일본)로 농도와 순도를 측정한 다음 순도가 1.8~2.0 사이인 것을 확인하고 MAXIscript In vitro transcription kit (Ambion사제, 미국)를 사용하여 플라스미드 DNA를 RNA로 전사시켰다. 전사 후 UV 분광계로 농도와 순도를 측정하여 순도가 1.8~2.0 사이에 있으면 이후의 실시간 역전사 PCR에서 주형 RNA로 사용하였다. RNA 카피수(copy number)는 아래의 수학식 1에 의하여 계산하였다.
[수학식 1]
6.02 ㅧ 1023 ㅧ 농도 (UV 분광계로 측정된 농도 g/㎖)/ (3015 + 150) ㅧ 340
여기서, 상기 3015는 T-vector의 크기(3015bp), 150는 C형 간염바이러스 ㅈ주형 RNA의 크기(150bp)를 나타냈다. 주형 RNA의 카피수를 계산한 후 1ㅧ TE buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 0.1 mM EDTA)로 10진 희석하여 사용시까지 -70℃에 보관하였다. 제작된 RNA를 주형으로 하고 C형 간염바이러스 정방향 프라이머 5'-ACCGGGTCCTTTCTTGGAT-3' (서열번호 6), 역방향 프라이머 5'-CCCTATCAGGCAGTACCACA-3' (서열번호 7) 및 탐침 프로브 [5'FAM]-CGTGCCCCCGCRAGACTGCT-[3'BHQ1] (서열번호 8)를 30 nM이 되도록 첨가하여 실시간 역전사 PCR을 수행하였다. 실시간 역전사 PCR에 사용한 반응물은 상기 <실시예 3>과 동일한 조건으로 하였으며, 주형 RNA는 제작된 RNA로 각각 1010, 109, 108, 107, 106, 105 ,104, 103 ,102 또는 10 카피수로 첨가하였다. 프라이머, 탐침 및 주형 RNA을 제외하고는 상기 <실시예 3>과 동일하게 반응하였다.
그 결과, 주형 RNA은 카피수 1010 내지 10까지 모두 검출이 가능하였고, 두 번 반복 수행하여 표준 주형 실시간 역전사 PCR의 표준 그래프를 작성한 결과, 기울기는 -3.21~-3.73, 직선성 R2값은 0.995~0.998을 나타냈다(도 4). 여기서, R2은 실시간 PCR의 표준그래프를 그렸을 때, 그래프의 직선성을 나타내는 상관계수로서 1에 가까울수록(직선에 가까울수록), PCR이 제대로 진행되었음을 의미하는 것이다.
<실시예 5> 실시간 역전사 PCR에서 PPi 및 PPase에 의한 비특이적 반응 억제 효과 확인
상기 <실시예 4>와 동일한 프라이머, 프로브 및 실시간 역전사 PCR 반응액에 실제 임상시료에서 정제된 RNA에 의한 비특이적 반응의 영향을 확인하기 위해, 표적 주형 RNA 외에 헬라 세포에서 추출한 총 RNA을 1 ㎍ 첨가하였다. 대조군으로는 핫스타트 역전사반응 기능이 없는 반응액(PPi 및 PPase가 제외된)을 사용하였다. 비특이적 반응 억제 효과를 확인하기 위해 핫스타트 역전사반응액과 핫스타트 역전사 기능이 없는 반응액에 인간 세포에서 추출한 총 RNA을 1 ㎍을 첨가하여 반응시켜 비교하였다. 추출한 RNA를 첨가하는 것 외에는 상기 <실시예 4>와 동일한 방법으로 수행하였다.
그 결과, PPi 및 PPase를 첨가해 줌으로써 핫스타트 역전사반응을 수행했을 때, 표적 이외의 RNA에 의한 비특이적 반응이 억제됨을 확인하였으며, 표적 이외의 RNA에 의해 반응 효율 감소 및 민감도, 검출 능력에 변화가 없음을 확인하였다. 반면에 PPi 및 PPase가 없는 핫스타트 역전사반응은 첨가한 인간 세포 RNA에 의해 비특이적인 반응이 일어남이 확인되었으며 반응 효율 감소 및 검출 능력, 민감도가 현저히 떨어지는 것을 확인할 수 있었다(도 5a). 실시간 역전사 PCR을 통해 얻어진 산물을 2%의 아가로즈 겔에서 전기영동하여 확인한 결과, 핫스타트 역전사반응이 되지 않은 산물에서 인간 세포 총 RNA에 의해 비특이적 반응이 더욱 활발히 일어났음을 확인하였다(도 5b). 따라서, 역전사 PCR 반응에서 비특이적인 반응으로 인한 반응 효율 감소 등의 문제점을 PPi 및 PPase를 첨가한 핫스타트 역전사반응으로 해결할 수 있음을 확인하였다.
<실시예 6> 실시간 역전사 PCR에서 핫스타트 역전사반응을 사용한 것과 핫스타트 PCR과의 비특이적 반응 억제 효과의 비교
실시간 역전사 PCR에서 핫스타트 역전사반응과 핫스타트 PCR 중 어떠한 것이 더 반응 특이성과 그에 따른 민감도에 효과적인지 알아보기 위한 실험을 실시하였다. 상기 <실시예 5>와 동일한 프라이머, 탐침 프로브 및 실시간 역전사 PCR 반응액에 표적 주형 RNA와 인간 세포에서 추출한 총 RNA 1 ㎍이 첨가된 것을 사용하였다. Taq 항체를 이용한 핫스타트 PCR 반응물에 핫스타트 역전사반응 기능이 없는 반응액(PPi 및 PPase가 제외됨)을 사용하였고, 핫스타트 역전사반응에 대한 비특이적 반응 억제 효과를 확인하기 위해 Taq 항체에 의한 핫스타트 PCR 반응물에 PPi 및 PPase를 첨가하여 핫스타트 역전사반응과 핫스타트 PCR을 동시에 수행하였다.
그 결과, 역전사 및 PCR에 있어서, 핫스타트 PCR 반응만으로는 비특이적 반응을 억제할 수 없는 것을 확인하였으며, PPi 및 PPase를 첨가하여 핫스타트 역전사반응을 수행했을 때 다량의 RNA에 대해서도 비특이적 반응을 억제할 수 있었다. 또한, Taq 항체를 이용한 핫스타트 PCR 반응은 낮은 온도에서 PCR 반응을 억제할 뿐 역전사반응에서의 비특이적 반응은 억제할 수 없는 것이 확인되었으며, 따라서, 역전사반응 및 PCR에서 비특이적인 반응을 제거하기 위해서는 핫스타트 역전사반응이 필요하다는 것을 확인할 수 있었다. 역전사반응과 PCR 반응 모두 핫스타트 기능이 없는 것(도 5b 의 B)에 비해 Taq 항체를 이용하여 핫스타트 PCR 반응을 수행한 것(도 6b 의 B)에서 비특이적인 반응 산물이 줄어들기는 했지만 여전히 비특이적인 반응이 일어나서 인간 세포에서 유래한 인간 RNA들이 다량 섞여 있는 시료에서는 100 카피수 이하의 표적 C형 간염바이러스 RNA 같은 질병 바이러스를 검출하기 어려웠다(도 6a 의 B). 반면에 PPi 및 PPase을 포함한 반응에서는 인간 세포에서 유래한 RNA에 의한 비특이적 반응이 일어나지 않아서(도 6b의 D), 10 카피까지 고감도로 표적 C형 간염바이러스 RNA를 검출할 수 있었다(도 6a의 D).
<실시예 7> 건조 타입 역전사 및 PCR 조성물을 사용한 표준 주형 실시간 역전사 PCR의 확인
역전사 및 PCR 혼합액 건조물에 대한 열안정성 성능을 검사하기 위하여, 상기 < 실시예 4>과 같은 PPi 및 PPase가 첨가된 PCR 혼합액을 제조하여 건조한 후, 이를 사용하여 Exicycler Quantitative Thermal Block(바이오니아 사제, 대한민국)로 실시간 역전사 PCR을 실시하였다. 구체적으로, 10ㅧ buffer 5 ㎕, Taq DNA polymerase 3 U, dNTP 20 mM 5 ㎕, PPi, PPase, 안정화제 등을 한 튜브에 넣고 증류수를 넣어 총 용량이 25 ㎕가 되도록 혼합한 후 Exicycler Quantitative Thermal Block (바이오니아 사제, 대한민국)에 사용되는 튜브에 분주하고, SuperCentra (바이오니아 사제, 대한민국)를 이용하여 50~60분간 건조하였다. 이후 상기 <실시예 4>에서 사용된 프라이머 및 프로브를 총 5 ㎕가 되도록 혼합한 후 1차 건조물에 추가 분주하여 30분간 건조하였다. 건조한 혼합물에 상기 <실시예 6>에서 사용한 주형 RNA를 첨가하고, 증류수를 첨가하여 총용량이 50 ㎕가 되도록 분주하여 건조물이 잘 풀리도록 완전 혼합하였다. Exicycler Quantitative Thermal Block (바이오니아, 대한민국)을 이용하고 음성 대조군(주형 RNA가 없는 공 시료)을 함께 반응시켰다는 점 및 주형 RNA의 사용 카피수를 106 , 105 ,104 , 103 , 102 또는 10로 각각 사용했다는 점 이외에는 상기 <실시예 4>와 동일한 조건 및 성분으로 실시간 역전사 PCR을 실시하였다.
그 결과, 상기 <실시예 4>의 방법과 같이, 주형 RNA는 최저 10 카피수까지 검출이 가능하였고, 표준 주형 실시간 역전사 PCR의 표준 그래프를 작성했을 때, 기울기는 -0.2932, R2 값은 0.9991이었다. 상기 결과에 의해 건조된 상태의 혼합물을 사용한 것은 실시간 역전사 PCR을 수행함에 있어서 용액 상태의 혼합물을 사용한 것과 동등한 성능이 유지됨을 알 수 있었다(도 7).
<실시예 8> 건조 타입의 역전사 및 PCR 반응 조성물의 보관 기간에 따른 안정성 시험
상기 <실시예 7>과 동일한 조성과 방법을 이용하여 PPi 및 PPase가 첨가된 PCR 혼합액을 제조한 뒤, 50℃에서 1일 간격으로 8일 동안 정온배치하였다. 그런 다음, 각 보관 기간별 건조 타입 PCR 조성물을 Exicycler96 Quantitative Thermal Block을 이용하여 주형 RNA의 사용 카피수를 106, 105, 104 또는 103으로 하였고, 상기 <실시예 7>과 동일한 조건으로 실시간 역전사 PCR을 실시하였다. 이는 실제 보관 권장 온도인 -20℃에서 건조한 조성물의 성능 유지 기간을 가속화 실험을 통해 단기간에 예측할 수 있는 방법으로, 40℃에서 1일 보관한 경우 -20℃에서 약 128일 보관한 것으로 간주한다. 구체적으로, 건조 타입 조성물을 동일 배치로 6회 테스트 분량을 한번에 제조한 후, 건조 직후의 혼합물 일부를 상기 <실시예 7>과 동일한 조건으로 5회 테스트 분량을 한번에 제조한 후, 건조 직후의 혼합물 일부를 주형 RNA의 사용 카피수 106 , 105 ,104 또는 103로 각각 사용했다는 점 이외에는 상기 <실시예 4>와 동일한 조건 및 성분으로 실시간 역전사 PCR에 사용하여 대조군 결과를 얻었다. 그 외의 건조 타입 조성물을 모두 50℃ 항온기에 동시에 넣어두었으며, 반응에 필요한 수량만큼 하루 간격으로 꺼내어 각각 실시간 역전사 PCR을 실시하였다. 이때, 최고 106 부터 최저 103 카피수까지 4 가지 농도를 사용하여 반응을 진행하였다. Exicycler96 Quantitative Thermal Block(바이오니아사제, 대한민국)을 이용하여 얻은 각 보관 일수별 건조 혼합물의 실시간 역전사 중합효소연쇄반응 결과 중 기울기값과 R2값을 대조군 결과와 비교하여 제조 직후의 건조 혼합물과 50℃에서 보관한 일수에 따른 건조 혼합물의 성능을 비교하였다.
그 결과, 50℃에서 1일 간격으로 5일 동안 정온 배치한, 액체 상태의 혼합물인 대조군에서 기울기는 -0.345, R2값은 0.9922이었으며, 50℃에서 보관한 건조된 조성물은 기울기 -0.31~-0.34, R2값은 0.995 ~ 0.998 값으로 확인되었다. 이는 50℃에서 정온배치 5일 후에도 건조 직후의 결과와 동등 수준의 결과값을 얻은 것으로, -20℃에서의 보관일수로 환산하면 약 640일 동안 건조한 직후와 거의 유사한 결과를 안정되게 얻을 수 있음을 나타냈다(도 8a 및 8b).
<실시예 9> 핫스타트 역전사 PCR 반응을 통한 프라이머의 비특이적 결합 억제
프라이머의 비특이적 결합을 유도하기 위해 상기 <실시예 4> 에 사용한 프라이머와 프로브 중 역방향 프라이머의 염기서열을 하기 표 2와 같이 합성하였다.
역방향 프라이머 5'-CCCTATCAGGCAGTACCACA-3'(서열번호 7)
염기서열
역방향 프라이머 5'-CCCTATCAGGCAGTACCACA-3'(서열번호 7)
5'쪽 6개 불일치 5'- GGGGGG CAGGCAGTACCACA-3'(염기서열 9)
중간 6개 불일치 5'-CCCTAT TTTTTT GTACCACA-3'(염기서열 10)
비특이적 프라이머의 반응에 의한 영향을 확인하기 위해, 표적 주형 RNA와 정확히 일치하는 역방향 프라이머와 5'쪽에 6개의 염기서열이 불일치하는 역방향 프라이머(서열번호 9), 총 역방향 프라이머 염기서열 중 가운데 6개의 염기서열이 불일치하는 프라이머(서열번호 10)를 각 각 사용하였다. 대조군으로는 핫스타트 역전사반응 기능이 없는 반응액(PPi 및 PPase가 제외된)을 사용하였다. 비특이적 프라이머에 의한 위양성 유무를 확인하기 위해 핫스타트 역전사반응액과 핫스타트 역전사 기능이 없는 반응액을 사용하여 각 역방향 프라이머에 대한 비특이적 반응 유무를 확인하였다. 불일치 역방향 프라이머를 사용한 것과 주형 RNA을 104 카피 농도만을 사용했다는 것 외에는 상기 <실시예 4>와 동일한 방법으로 수행하였다.
5'쪽 6개의 염기서열이 불일치 프라이머를 사용하여 실시간 역전사 중합효소 반응을 수행한 결과를 도 9a에 나타내었으며, 중간 6개의 염기서열이 불일치하는 프라이머를 사용한 결과를 도 9b에 나타내었다. 도 9에서 A는 핫스타트 역전사 기능이 없는 반응물로 반응을 수행한 결과이며, B는 핫스타트 역전사 PCR반응물로 수행한 결과이다.
그 결과, PPi 및 PPase를 첨가한 핫스타트 역전사반응의 경우, 주형 RNA와 정확히 일치한 역방향 프라이머에서는 증폭산물이 검출되었으나, 불일치하는 염기서열을 갖는 역방향 프라이머에서는 검출되지 않았다. 반면에 PPi 및 PPase가 없는 핫스타트 역전사반응은 불일치하는 염기서열을 갖는 역방향 프라이머에서도 검출되는 것을 확인하였다. 이는 반응 온도 이하의 낮은 온도에서 역방향 프라이머의 비특이적인 반응에 따라 역전사 효소 반응이 일어나는 것을 확인하였다 (도 9a 및 도 9b). 따라서, 역전사 PCR 반응에서 비특이적인 반응으로 인한 위양성 등의 문제점을 PPi 및 PPase를 첨가한 핫스타트 역전사반응으로 해결할 수 있음을 확인하였다.
<실시예 10> 핫스타트 역전사 PCR 반응을 통한 RNA 단일 염기 다형성 분석 본 발명의 핫스타트 역전사 PCR 반응을 이용하여 타겟 RNA에 대한 단일 염기 다형성을 분석하기 위하여, 역방향 프라이머에 포인트 돌연변이 염기서열을 포함되도록 디자인 하였다. 상기 <실시예 4> 에 사용한 프라이머와 프로브 중 역방향 프라이머의 염기서열을 하기 표 3과 같이 합성하였다.
염기서열
역방향 프라이머 5'-CCCTATCAGGCAGTACCACA-3'(서열번호 7)
단일염기 불일치 5'-CCCTATCAGGCAGT C CCACA-3'(염기서열 11)
단일 염기 다형성 분석을 위해 주형 RNA와 정확히 일치하는 역방향 프라이머와 단일 염기가 불일치하는 역방향 프라이머를 사용하였다. 대조군으로는 핫스타트 역전사반응 기능이 없는 반응액(PPi 및 PPase가 제외된)을 사용하였다. 단일 염기 다형성 분석 가능 유무를 확인하기 위해 핫스타트 역전사 반응액과 핫스타트 역전사 기능이 없는 반응액을 사용하여 각 역방향 프라이머에 대한 반응 유무를 확인하였다. 단일 염기가 불일치하는 역방향 프라이머를 사용한 것과 주형 RNA을 104 카피 농도만을 사용했다는 것 외에는 상기 <실시예 4>와 동일한 방법으로 수행하였다. 핫스타트 역전사 PCR 반응물을 수행한 결과를 도 10a에 나타내었으며, 핫스타트 기능이 없는 반응물로 수행한 결과를 도 10b에 나타내었다. A는 정확히 일치하는 염기서열을 갖는 프라이머를 사용한 것이며 B는 단일 염기 서열이 불일치하는 프라이머를 사용한 것이다.
그 결과, PPi 및 PPase를 첨가한 핫스타트 역전사반응의 경우, 주형 RNA와 정확히 일치하는 프라이머를 사용한 결과와 단일염기가 불일치하는 역방향 프라이머를 사용한 결과에서 PCR 효율차이가 나타났다. 반면에 PPi 및 PPase가 없는 핫스타트 역전사반응은 정확히 일치하는 역방향 프라이머와 단일염기 서열이 다른 역방향 프라이머 간에 PCR 효율 차이 없이 동일 사이클에서 검출되었다. 이는 리얼 타임 PCR 방법을 이용한 단일 염기 다형성 분석에 있어 핫스타트 역전사 반응은 단일 염기 다형성 분석이 가능하나 핫스타트 역전사 반응이 없는 반응물에서는 단일 염기 다형성 분석이 어렵다고 할 수 있다(도10a 및 도10b). 따라서, 핫스타트 역전사 PCR 반응은 주형 RNA에 대한 단일 염기 분석뿐 아니라 다양한 분야에 응용 할 수 있음을 확인하였다.
<실시예 11> 핫스타트 역전사 반응을 통한 RNA-RNA 셀프 프라이밍 억제
본 발명에 따른 핫스타트 역전사 PCR 반응을 이용한 추출된 핵산에 포함되어 있는 단일나선 핵산에 의한 셀프프라이밍에 의해 나타나는 비특이적인 반응을 억제하는 효과를 확인하였다.
Hela 세포 106 개에서 Total RNA 추출은 AccuZole Total RNA Extraction solution ((주)바이오니아, 대한민국)을 이용하였으며, DEPC-D.W을 사용하여 최종 부피가 50μl가 되도록 정제하였다.
추출한 RNA는 NanoDrop 2000(Thermo Scientific, 미국) 장비를 이용하여 RNA 정량하여 2μg을 사용하였다. 역전사 반응은 대조군으로 핫스타트 역전사반응 기능이 없는 반응액(PPi 및 PPase가 제외된)으로 하였다. 실시간 중합연쇄반응은 AccuPower Dualstar qPCR Premix kit((주)바이오니아, 대한민국)을 사용하여 수행하였다. <실시예 3>에서 사용한 정방향, 역방향 프라이머, 탐침을 사용하여 실시간 중합 연쇄반응을 수행하였다. 역전사 반응에는 5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'(염기서열 12) 역전사 반응용 프라이머를 사용하여 수행하였다.
추출된 Total RNA 에 Genomic DNA 가 포함되어 있는 지 유무는 대조군으로 핫스타트 기능이 없는 반응액(PPi 및 PPase가 제외된)을 사용하여 역전사 반응 후 수행하였으며, 추출된 total RNA을 역전사 반응 없이 주형으로 하여 AccuPower Dualstar qPCR Premix((주)바이오니아사제, 대한민국)을 사용하여 실시하였다.
도 11에서 A는 역전사 반응 없이 RNA만을 첨가하여 실시간 중합효소 반응을 수행한 것이며 B는 역전사 반응 시 프라이머를 첨가해서 역전사 반응 후 실시간 중합효소 반응을 수행한 것이다. B-A은 핫스타트 역전사 반응물을 수행한 것이며B-B 는 핫스타트 역전사 기능이 없는 반응물로 수행한 것이다.
C는 핫스타트 역전사 기능이 없는 반응액에 RNA만 넣고 역전사 반응 후 실시간 중합효소 반응을 수행한 결과이다. D는 핫스타트 역전사 반응물에 RNA만 넣고 역전사 반응 후 실시간 중합효소 반응을 수행한 결과이다.
그 결과, 역전사 반응 없이는 검출이 되지 않아 추출한 total RNA에 Genomic DNA가 포함되어 있지 않은 것을 확인하였다.
대조군으로 핫스타트 기능이 없는 반응액(PPi 및 PPase가 제외된)을 사용하였으며 프라이머 첨가 없이 Total RNA만을 첨가하여 역전사 반응을 수행하였다. 역전사 반응은 50℃에서 1시간, 95℃ 5분으로 수행하였다. 역전사 반응 후 생성된 산물 5㎕을 템플레이트로 하여 실시간 중합연쇄반응을 수행하였다.
그 결과, 핫스타트 기능이 없는 반응액(PPi 및 PPase가 제외된)에서는 37 C(t)에서 셀프프라이밍에 의해 검출되는 것이 확인되었으며, 핫스타트 역전사 반응에서는 41C(t)에서 검출되는 것을 확인하였다 (도 11). 따라서,핫스타트 역전사 반응은 핫스타트 기능이 없는 반응액(PPi 및 PPase 가 제외된)보다 셀프프라이밍에 의한 비특이적 반응에 대해 억제가 되는 것을 확인하였다.
<실시예 12> RNA 터미네이션을 통한 RNA 셀프프라이밍에 의한 비특이 역전사 중합연쇄반응(PCR) 억제 효과
(1) poly(A) polymerase와 3′-데옥시아데노신 5′-트리포스페이트(3′-dATP)에 의한 RNA 조각의 터미네이션 반응
상기 <실시예 11> 에서와 같은 RNA 추출 키트를 이용하여 인간 세포 종인 HeLa C세포에서 RNA을 추출하였다. poly(A) polymerase와 3′-데옥시아데노신 5′-트리포스페이트(3′-dATP)를 사용하여 추출된 RNA의 3′말단을 터미네이션시켰다(C, D).
잔류 3′-데옥시아데노신 5′-트리포스페이트(3′-dATP)를 제거하기 위해 터미네이션된 RNA를 AccuPrep PCR Purification kit((주)바이오니아, 대한민국)을 이용하여 정제하였다. RNA의 3′을 터미네이션 시키지 않은 RNA(A 및 B)도 같은 조건에서 비교를 위해 상기와 동일한 방법으로 정제하였다. 핫스타트 역전사 중합효소연쇄반응의 영향을 비교하기 위해, 핫스타트 기능이 있는 역전사 중합효소연쇄반응(B 및 D)과 핫스타트 기능이 없는 역전사 중합효소연쇄반응(A 및 C)으로 수행하였다.
각각의 RNA 5μg을 각각 사용하였으며, 일반 중합연쇄반응은 AccuPower RocketScript RT Premix((주)바이오니아, 대한민국)를 사용하였고, 핫스타트 역전사 중합연쇄반응은 AccuPower RocketScript RT Premix((주)바이오니아, 대한민국)에 피로포스페이트와 포스파타제를 첨가하고, 최종 볼륨이 20μl가 되도록 증류수를 첨가하여 핫스타트 역전사 중합효소연쇄반응을 수행하였다. RNA 셀프 프라이밍의 효과를 확인하기 위해 역전사 중합효소연쇄반응에 필요한 어떠한 종류의 프라이머도 첨가하지 않았다.
역전사 중합효소연쇄반응은 Mygenie 96 Gradient Thermal Block((주)바이오니아, 대한민국)을 이용하여 수행하였고, 반응 혼합과정 상의 RNA 셀프프라이밍 효과를 보기 위해 25℃에서 20분 동안 인큐베이션을 하였다.
이후 RNA 셀프 프라이밍에 의한 역전사 중합효소연쇄반응의 진행유무를 확인하기 위해, 각각의 역전사 중합효소연쇄반응물을 주형 템플레이트로 사용하고 AccuPower Dualstar qPCR Premix((주)바이오니아,대한민국)을 이용하여 <실시예 3>에서 사용한 인간 GAPDH를 표적 유전자의 프라이머 및 탐침을 사용하여 실시간 중합연쇄반응을 수행하였다.
실시간 PCR은 Exicycler 96 Real-Time Quantitative Thermal Block ((주)바이오니아, 대한민국)을 이용하여 수행하였고, 반응 조건은 95℃ 5분 동안 사전 변성 단계를 거쳐, 95℃에서 5초 동안의 변성단계, 60℃에서 5초 동안의 어닐링 단계 및 신장 단계, 형광을 검출하는 스캔 단계의 동시 반응을 1회 반응 주기로 하여, 총 45회 반응 주기를 진행하였다.
그 결과는, 도 12 에 나타내었다. 터미네이션 시키지 않은 RNA(A 및 B)에서는 어떤 프라이머를 넣어 주지 않아도 cDNA가 만들어지는 것을 인간 GAPDH 유전자가 검출되는 것으로서 확인할 수 있었다. 상기의 결과는 셀프 프라이밍에 의해 cDNA가 합성되었기 때문에 PCR에서 증폭이 된 것이다.
그리고 핫스타트 역전사 중합효소연쇄반응으로도 비특이적인 cDNA 합성과 이어지는 PCR 증폭을 막는다고 해도 완벽하게 저해할 수 없고 부분적으로만 RNA 셀프프라이밍에 의한 역전사 중합효소연쇄반응을 저해시킬 수 있어서 Ct 값이 약 5정도 늦추어져 1/30 정도로 반응을 저해시킬 수 있었다.
그러나 RNA의 3' 말단을 터미네이션한 시료(C 및 D)에서 모든 역전사 중합효소연쇄반응에서 45 cycle까지 증폭되지 않음으로써 전혀 cDNA가 합성되지 않음을 확인하였다.
상기의 결과는 역전사 중합효소연쇄반응물 혼합시에 많은 비특이 역전사 중합효소연쇄반응들이 일어나고, 이로 인해 많은 비특이 cDNA들이 만들어 진다는 것을 알 수 있다. 그리고 상기 결과로부터 원하지 않는 반응들은 핫스타트 역전사 중합효소연쇄반응만으로 억제할 수 없다는 것을 확인할 수 있었으며, 결국, 이러한 RNA 셀프프라이밍에 의한 비특이 역전사 중합연쇄반응은 본 발명의 터미네이션 반응을 이용하여 차단함으로써 완벽하게 억제시킬 수 있음을 확인할 수 있었다.
도 12에서 A와 B는 터미네이션 시키지 않은 RNA을 사용한 것이고, C와 D는 터미네이션반응을 한 RNA를 사용한 것이다. A와 C는 일반적인 역전사 반응을 수행하였고, B와 D는 핫스타트 역전사 반응을 수행한 것이다.
<실시예 13> RNA 터미네이션과 핫스타트 역전사 PCR을 통한 암 마커 검출 한계 향상.
암마커로는 호모사피언스 케라틴 8(KRT8)으로 National Center for Biotechnology information (NCBI,미국)을 통해 염기서열 정보를 확인하였으며 Accession 번호는 NM_00125693이다. 상기 <실시예 11> 에서와 같은 RNA 추출 키트를 이용하여 인간 세포 종인 휄라 C세포에서 RNA을 추출하였다. 추출된 RNA을 850ng, 85ng, 8.5ng, 0.85ng, 0.085ng을 각 주형으로 하여 핫스타트 역전사 PCR 반응을 사용하여 정량 분석을 하기 위한 스텐다드 커브를 확인하고자 정방향 프라이머 5'-GGAGCAGATCAAGACCCTCA-3' (서열번호 13), 역방향 프라이머 5'-TTGTCCATGTTGCTTCGAGC-3' (서열번호 14) 및 탐침 프로브 [5'FAM]-TGCTGCTCCAGGAACCGTACCTTGT-[3'BHQ1] (서열번호 15)를 30 nM이 되도록 첨가하여 실시간 역전사 PCR을 수행하였다.
그 결과, 하기 도13a와 같은 결과를 확인하였다.
검출한계에 대해 확인하고자 인간 혈청 1 ml에 휄라 셀을 각 10,000, 1,000, 100, 10개을 첨가하여 <실시예 11>과 같이 RNA 추출 및 정량을 수행하였다.
그 결과, 각 RNA 농도가 57.5ng/μl, 53.8ng/μl, 52.5ng/μl, 52.1ng/μl으로 확인되었다. 추출된 각 RNA 500ng을 사용하여 <실시예12> 와 같은 방법으로 RNA 터미네이션을 수행 후 RNA 정량을 수행하였다. RNA 터미네이션에 따른 검출 한계를 확인하고자 대조군으로 RNA 터미네이션을 하지 않은 RNA로 사용하였다.각 RNA 100ng 을 사용하여 핫스타트 역전사반응 기능이 없는 반응액(PPi 및 PPase가 제외된)과 핫스타트 역전사 PCR 반응액을 사용하여 실시간 역전사 중합효소연쇄 반응을 수행하였다. 실시간 역전사 PCR은 Exicycler 96 Real-Time Quantitative Thermal Block ((주)바이오니아, 대한민국)을 이용하여 수행하였고, 반응 조건은 50℃에서 15분간 역전사반응한 후, 95℃에서 5분간 예비 변성 단계를 거쳐, 95℃에서 5초간의 변성 단계, 60℃에서 5초간간의 어닐링 단계 및 72℃에서 6초간의 신장 단계, 형광을 검출하는 스캔 단계의 동시 반응을 1 사이클로 하여 총 45 사이클을 진행하였다.
그 결과, RNA 터미네이션 반응한 샘플에서는 핫스타트 역전사 반응은 인간혈철 1ml에 10개의 휠라셀을 첨가한 샘플까지 검출되었다.(도13b 참조) 핫스타트 역전사반응 기능이 없는 반응액에서는 휠라셀 100개 첨가한 샘플에서만 검출 되었다.(도13c) RNA 터미네이션 시키지 않은 샘플에서는 핫스타트 역전사 반응액은 휠라셀 100개 첨가한 샘플까지만 검출되었다.(도13d) 핫스타트 역전사 기능이 없는 반응액에서는 휠라셀 1,000개 첨가한 샘플까지만 검출되었다.(도13e)
따라서, 핫스타트 역전사 반응만으로도 검출한계가 향상되었지만 RNA 터미네이션과 같이 수행했을 때 더 좋은 효과를 확인할 수 있었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
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Claims (37)

  1. Mg 2+ 이온 , 4종의 dNTP, 역전사 효소, 피로포스페이트 및 피로포스파타제를 포함하는 핫스타트 역전사반응용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 피로포스페이트는 0.1 mM 내지 5 mM의 농도로 포함되고, 상기 피로포스파타제는 0.005U 내지 0.25U 양으로 포함되는 것을 특징으로 하는 핫스타트 역전사 반응용 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 하나 이상의 역전사 프라이머를 추가로 포함하는 핫스타트 역전사반응용 조성물.
  4. 제1항에 있어서,상기 조성물은 동결 또는 건조된 상태인 핫스타트 역전사반응용 조성물.
  5. 제1항에 있어서,상기 조성물은 주형 핵산을 추가로 포함하는 핫스타트 역전사반응용 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 주형 핵산을 RNA인 핫스타트 역전사반응용 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 핵산에 대해 비반응성인 염료 물질을 추가로 포함하는 핫스타트 역전사반응용 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 다가 알코올, 젤라틴, 소혈청 알부민, Thesit, PEG-8000로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 물질을 추가로 포함하는 핫스타트 역전사반응용 조성물.
  9. 제5항에 있어서, 주형핵산은 3' 말단에 핵산중합 터미네이터가 결합되어 비특이 핵산중합이 방지된 것임을 특징으로 하는 핫스타트 역전사반응용 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 핵산중합 터미네이터는 핵산중합효소에 작용할 수 있는 트리포스페이트 형태로 활성화되고, 3'에 수산기 이외의 다른 잔기를 가지는 핵산유사 화합물인 을 특징으로 하는 핫스타트 역전사반응용 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 핵산 유사 화합물은 2'3-디데옥시 뉴클레오티드 5' 트리포스페이트, 3-데옥시아데노신, 5-트리포스페이트, 3'아지도-3디옥시티미딘 5'-트리포스페이트, 1-β-d-아라비노실뉴크레오시드 5' -트리포스페이트, 아시클로 구아노신트리포스페이트, 3' 아미노-3'-디옥시뉴클레오시드 5'-트리포스페이트 및 3'프로르-3'디옥시뉴클레오시드 5' 트리포스페이트로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 핫스타트 역전사반응용 조성물.
  12. Mg 2+ 이온, 4종의 dNTP, 역전사효소, 피로포스페이트 및 피로포스파타제를 포함하고, DNA 중합효소를 추가로 포함하는 핫스타트 역전사 PCR용 조성물.
  13. 제12항에 있어서,상기 피로포스페이트는 최종 반응액을 기준으로 0.1 mM 내지 5 mM의 농도로 포함되고, 상기 피로포스파타제는 0.005U 내지 0.25U 양으로 포함되는 핫스타트 역전사 PCR용 조성물.
  14. 제12항에 있어서,하나 이상의 역전사 프라이머를 추가로 포함하는 핫스타트 역전사 PCR용 조성물.
  15. 제12항에 있어서,상기 조성물은 프로브를 추가로 포함하는 핫스타트 역전사 PCR용 조성물.
  16. 제12항에 있어서,상기 조성물은 동결 또는 건조된 상태인 핫스타트 역전사 PCR용 조성물.
  17. 제12항에 있어서,상기 조성물은 주형 핵산을 추가로 포함하는 핫스타트 역전사 PCR용 조성물.
  18. 제12항에 있어서,상기 조성물은 DNA에 결합하는 형광 염료를 추가로 포함하는 핫스타트 역전사 PCR용 조성물.
  19. 제12항에 있어서,상기 DNA 중합효소는 5'->3' 엑소뉴클레아제 활성를 갖는 중합효소, 3'->5' 엑소뉴클레아제 활성를 갖는 중합효소 및 5'->3' 엑소뉴클레아제 활성과 3'->5' 엑소뉴클레아제 활성이 없는 중합효소로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상인 핫스타트 역전사 PCR용 조성물.
  20. 제12항에 있어서,상기 조성물은 핵산에 대해 비반응성인 염료 물질을 추가로 포함하는 핫스타트 역전사 PCR용 조성물.
  21. 제17항에 있어서, 주형핵산은 3' 말단에 핵산중합 터미네이터가 결합되어 비특이 핵산중합이 방지된 것임을 특징으로 하는 핫스타트 역전사 PCR용 조성물.
  22. 제21항에 있어서, 상기 핵산중합 터미네이터는 핵산중합효소에 작용할 수 있는 트리포스페이트 형태로 활성화되고, 3'에 수산기 이외의 다른 잔기를 가지는 핵산유사 화합물인것을 특징으로 하는 핫스타트 역전사 PCR용 조성물.
  23. 제22항에 있어서, 상기 핵산 유사 화합물은 2'3-디데옥시 뉴클레오티드 5' 트리포스페이트, 3-데옥시아데노신, 5-트리포스페이트, 3'아지도-3디옥시티미딘 5'-트리포스페이트, 1-β-d-아라비노실뉴크레오시드 5' -트리포스페이트, 아시클로 구아노신트리포스페이트, 3' 아미노-3'-디옥시뉴클레오시드 5'-트리포스페이트 및 3'프로르-3'디옥시뉴클레오시드 5' 트리포스페이트로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 핫스타트 역전사 PCR용 조성물.
  24. 제12항에 있어서, 상기 조성물은 다가 알코올, 젤라틴, 소혈청 알부민, Thesit, PEG-8000로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 물질을 추가로 포함하는 핫스타트 역전사 PCR용 조성물.
  25. 제12항에 있어서, 상기 조성물은 DNA 중합효소와 결합하거나, DNA 중합효소의 작용을 조절하여 핫스타트 PCR 효과를 갖는 물질을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 핫스타트 역전사 PCR용 조성물.
  26. 제12항에 있어서, 상기 DNA 중합효소는 변형된 형태로 핫스타트 PCR 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 핫스타트 역전사 PCR용 조성물,
  27. 제26항에 있어서, 상기 물질은 DNA 중합효소에 결합하는 항체, 앱타머 및 Affibody로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 핫스타트 역전사 PCR용 조성물
  28. 제12항에 있어서, 상기 조성물은 멀티플렉스 역전사 PCR 반응, 실시간 역전사 PCR 반응, 실시간 정량적 역전사 PCR 반응 및 멀티플렉스 실시간 역전사 PCR 반응 중 어느 하나의 역전사 PCR 반응에 사용되는 핫스타트 역전사 PCR용 조성물.
  29. 제12항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 암 진단을 위한 조성물인 것을 특징으로 하는 핫스타트 역전사 PCR용 조성물.
  30. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 핫스타트 역전사반응용 조성물을 한 반응튜브 내에 제공하는 단계를 포함하는 핫스타트 역전사반응용 조성물의 제조방법.
  31. 제12항 내지 제28항 중 어느 한 항에 따른 핫스타트 역전사 PCR용 조성물을 한 반응튜브 내에 제공하는 단계를 포함하는 핫스타트 역전사 PCR용 조성물의 제조방법.
  32. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 핫스타트 역전사반응용 조성물을 포함하는 핫스타트 역전사반응용 키트.
  33. 제12항 내지 제28항 중 어느 한 항에 따른 핫스타트 역전사 PCR용 조성물을 포함하는 핫스타트 역전사 PCR용 키트.
  34. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 핫스타트 역전사반응용 조성물에 주형 RNA를 함유한 시료를 혼합하는 단계; 및
    상기 반응 혼합물이 역전사될 수 있도록 반응을 수행하는 단계를 포함하는 주형 RNA의 역전사 방법.
  35. 제12항 내지 제28항 중 어느 한 항에 따른 핫스타트 역전사 PCR용 조성물에 주형 RNA를 함유한 시료를 혼합하는 단계;
    상기 반응 혼합물이 증폭될 수 있도록 반응을 수행하는 단계; 및
    상기 증폭 산물을 분석하는 단계를 포함하는 핵산 증폭 방법.
  36. 제35항에 있어서, 상기 PCR은 PCR, 다중 PCR, 실시간 PCR 및 실시간 정량적 PCR로 구성된 군으로부터 선택되는 핵산 증폭 방법.
  37. 3' 말단에 핵산중합 터미네이터가 결합되어 비특이 핵산중합이 방지된 주형핵산, Mg 2+ 이온, 4종의 dNT, 역전사효소, 핵산, cDNA합성용 프라이머 피로포스페이트, 피로포스파타제 및 암진단용 바이오마커 증폭용 프라이머를 포함하는 암 진단용 역전사 PCR용 조성물.
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