JPH09506255A - 核酸の保護方法および分析方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 核酸の特定の領域を、この核酸をＰＮＡタイプの核酸類似体と複合体を形成させることによりヌクレアーゼの攻撃から保護する。残存する配列を、必要に応じ増幅した後、アッセイで検出する。ＰＣＲ反応は不妊化され、ＰＮＡハイブリダイゼーションによる該生産物の特定領域の保護及びそれに続く非保護核酸のヌクレアーゼによる分解により、その生産物をアッセイすることができる。

Description

【発明の詳細な説明】核酸の保護方法および分析方法 本発明は、たとえばヌクレアーゼによる攻撃から核酸を保護する方法、および 分析方法、とりわけ核酸含有試料における対象配列の存在を検出する方法に関す る。 核酸試料に特定の塩基配列が含まれているかどうかを判定する目的で現在よく 使われている方法はフィルターハイブリダイゼーションである。原料物質から核 酸を抽出し、精製するが、ＰＣＲなどの工程による増幅を要することもある。次 いで、核酸を一本鎖型でフィルター上に固定し、検出対象の配列に対して相補的 な配列を有する標識オリゴヌクレオチドをプローブとしてこれを探索する。固定 化に先立ち、核酸をゲル上で泳動させることで分子量の異なる核酸断片を分離し てもよい。これが広く使われているサザーンブロット法である。この方法には多 くの欠点がある。核酸を他の物質と分離する必要がある。また、核酸がＤＮＡで ある場合、通常は変性段階に付す必要がある。ハイブリダイゼーションは厳密な 条件下で行なわれ、疑陽性反応を避けるとともに、希望レベルで類似配列を識別 するために条件を慎重に調節しなければならない。フィルターハイブリダイゼー ションは対ノイズの信号比に制限があるので、十分量の検出対象配列を作成する ためにしばしば増幅段階を必要とする。その結果、疑陰性反応が起こる可能性が 高くなる。 アッセイ手順および診断薬分野において従来にない重要な有用性をもった核酸 類似体がＷＯ９２／２０７０３号に記載されている。これらの核酸類似体は、と くに診断薬ならびに アンチセンス治療の分野において重要視されるいくつかの新規特徴を有している 。本明細書では、上記核酸類似体を「ＰＮＡ」と称する。 ＰＮＡは、核酸塩基から成るリガンドの配列を保持するポリアミドバックボー ンを有することを特徴とする。上記文献に記載の類似体は、相補的配列を有する 天然型核酸と高度の特異性と安定性でハイブリダイズする性質がある。 本発明者らは、上記核酸類似体がさらに別の有用な性質、すなわち特定の試薬 が該一本鎖核酸の分解を通常効果的に引き起こす状況および条件下での分解から ハイブリダイズ相手の一本鎖核酸の配列を保護するという性質を有することを発 見した。核酸類似体にハイブリダイズしない核酸領域は通常どおりに分解される 。 すなわち、本発明は、核酸の特定領域を試薬による攻撃から保護する方法を提 供する。この方法は、該核酸とそれと配列選択的にハイブリダイズする核酸類似 体との間に複合体を形成させた後、該核酸を核酸攻撃試薬と接触させることを含 む方法であり、該複合体が該原料核酸よりも該試薬による攻撃に対する安定性が 高いという方法である。 核酸はＲＮＡでもよいし、ＤＮＡでもよい。 該試薬はヌクレアーゼであって、完全にまたは特定位置で切断することによっ て該核酸を分解する能力を有するものが好ましい。 最も直接的なケースでは、保護対象の核酸の特定領域は、該核酸類似体のハイ ブリダイズ相手の核酸配列で構成される が、使用条件下で５’および３’末端からだけ作用することにより核酸を分解す る能力を示すエキソヌクレアーゼが攻撃試薬である場合、それぞれの核酸類似体 を該特定領域の各末端に置くことで、その特定領域の一部を該二つの核酸類似体 配列間でハイブリダイズしていない状態とすることによって、さらに大型の特定 領域を保護することができる。該特定領域の介入部分はエキソヌクレアーゼの接 近から遮断される。使用条件下でエキソヌクレアーゼが５’または３’末端から しか攻撃できない場合、単一の核酸類似体配列を用いて、核酸類似体に対してそ れぞれ３’または５’側に位置する核酸部分全体を遮断することができる。 攻撃試薬としてエンドヌクレアーゼを使用する場合、核酸上で互いに隣接する 二つの核酸類似体オリゴマー間でハイブリダイズしていない状態で曝露された短 い核酸部分は、そのような状態であるにも関わらず保護された特定領域の一部を 形成することがある。これは該二つの核酸類似体配列の末端塩基間の相互作用が あるため、または核酸類似体によりエンドヌクレアーゼ活性が阻害されるためで ある。 該核酸類似体は、連結バックボーン部分より構成されるバックボーンに結合し たリガンドの配列を含むポリマー鎖から成るものが好ましく、そのような類似体 は相補的配列を有する核酸にハイブリダイズする能力を有する。 該核酸類似体のバックボーンとしては、ポリアミド、ポリチオアミド、ポリス ルフィンアミド、またはポリスルホンアミドが好ましい。 該連結バックボーン部分としては、ペプチド結合したアミノ酸部分が好ましい 。 核酸類似体は相補的配列の核酸とハイブリダイズして、配列上該類似体に対応 する通常のデオキシリボヌクレオチドと該核酸との間のハイブリッドよりも熱変 性に対しより安定なハイブリッドを形成することができるものであることが好ま しい。 好ましくは、該核酸類似体はそのバックボーンがポリアミドバックボーンであ るペプチド核酸であり、該リガンドはいずれも該バックボーン中のアザ窒素原子 に直接的又は間接的に結合しており、そして該リガンドを保持する窒素原子は主 として該バックボーン中で４〜８個の介入原子により相互に隔てられているもの である。 また、核酸類似体は、一方の鎖が該類似体に相補的な配列を有する二本鎖にハ イブリダイズして該一方の鎖から他方の鎖を置換(displace)することができるも のであることが好ましい。 核酸類似体は、下記の一般式１を有するものであることが好ましい。 式中、 ｎは少なくとも２であり、 Ｌ¹〜Ｌⁿはそれぞれ独立に、水素、水酸基、（Ｃ₁〜Ｃ₄）アルカノイル基、天然 に生ずる核酸塩基類、天然に生じない核酸塩基類、芳香族部分、ＤＮＡインター カーレーター類、核酸塩基結合基、複素環部分、及びレポーターリガンド類から なる群より選択されるものであるが、通常は少なくとも１個のＬは、天然に生ず る核酸塩基などの核酸塩基結合基であり、Ｌ群の少なくとも９０％がこのような 核酸塩基結合基であることが好ましい。 Ｃ¹〜Ｃⁿはそれぞれ（ＣＲ⁶Ｒ⁷）ｙであり、ここでＲ⁶は水素であり、Ｒ⁷は天然 に生ずるαアミノ酸類の側鎖からなる群より選択されるものであり、又はＲ⁶と Ｒ⁷は独立に水素、（Ｃ₂〜Ｃ₆）アルキル基、アリール基、アラルキル基、ヘテ ロアリール基、水酸基、（Ｃ₁〜Ｃ₆）アルコキシ基、（Ｃ₁〜Ｃ₆）アルキルチオ 基、ＮＲ³Ｒ⁴及びＳＲ⁵からなる群より選択されるものであり、ここでＲ³とＲ⁴ は以下に定義され、Ｒ⁵は水素、（Ｃ₁〜Ｃ₆）アルキル基、水酸基、アルコキシ 基、又はアルキルチオ−置換（Ｃ₁〜Ｃ₆）アルキル基であり、又はＲ⁶とＲ⁷は一 緒になって脂環系又は複素環系を作り、 Ｄ¹〜Ｄⁿはそれぞれ、（ＣＲ⁶Ｒ⁷）_zであり、ここでＲ⁶とＲ⁷は上記のように定 義され、 ｙ及びｚはそれぞれゼロ又は１〜１０の整数であり、ｙ＋ｚの和は２〜１０（好 ましくは２より大、最も好ましくはｙ及 びｚはそれぞれ１又は２）であり、 Ｇ¹〜Ｇ^n-1はそれぞれ−ＮＲ³ＣＯ−、−ＮＲ³Ｃ^S−、−ＮＲ³ＳＯ−、又は−Ｎ Ｒ³ＳＯ₂−であり、いずれの方向でもよく、ここでＲ³は以下に定義され、 Ａ¹〜Ａⁿ及びＢ¹〜Ｂⁿはそれぞれ以下のものから選択され、 （ａ）Ａは式(IIa)、(IIb)、(IIc)又は(IId)の群であり、かつＢはＮ又はＲ³Ｎ⁺ であり、又は （ｂ）Ａは式(IId)の群であり、かつＢはＣＨであり、 式中、 ＸはＯ、Ｓ、Ｓｅ、ＮＲ³、ＣＨ₂又はＣ（ＣＨ₃）₂であり、 Ｙは単結合、Ｏ、Ｓ又はＮＲ⁴であり、 ｐとｑはそれぞれゼロ又は１〜５の整数であり、ｐ＋ｑの和は１０以下であり、 ｒとｓはそれぞれゼロ又は１〜５の整数であり、ｒ＋ｓの和は１０以下であり、 Ｒ¹とＲ²はそれぞれ独立に、水素、ヒドロキシ−，アルコキシ−，又はアルキル チオ−で置換されていてもよい（Ｃ₁〜Ｃ₄）アルキル基、水酸基、アルコキシ基 、アルキルチオ基、アミノ基及びハロゲンからなる群より選択されるものであり 、そして Ｒ³及びＲ⁴はそれぞれ独立に、水素、（Ｃ₁〜Ｃ₄）アルキル基、ヒドロキシ−， アルコキシ−，アルキルチオ−置換（Ｃ₁〜Ｃ₄）アルキル基、水酸基、アルコキ シ基、アルキルチオ基及びアミノ基からなる群から選択されるものであり、 Ｑは−ＣＯ₂Ｈ、−ＣＯＮＲ’Ｒ”、−ＳＯ₃Ｈ又は−ＳＯ₂ＮＲ’Ｒ”、又は− ＣＯ₂Ｈ又は−ＳＯ₃Ｈの活性誘導体、及び Ｉは−ＮＲ’Ｒ''であり、ここでＲ’及びＲ''は独立に水素、アルキル基、アミ ノ保護基、レポーターリガンド、インターカーレーター、キレーター、ペプチド 、タンパク質、炭水化物、リピド、ステロイド、ヌクレオシド、ヌクレオチド、 ヌクレオシド二リン酸、ヌクレオシド三リン酸、オリゴリボ ヌクレオチドとオリゴデオキシリボヌクレオチドの両者を含むオリゴヌクレオチ ド、オリゴヌクレオシド、及び可溶性及び不溶性ポリマーからなる群より選択さ れるものである。該核酸類似体が一般式III、IV又はＶの化合物を含むものであ るときはさらに好ましい。 式中、 Ｌはそれぞれ独立に水素、フェニル基、複素環部分、天然に生ずる核酸塩基、及 び天然に生じない核酸塩基からなる群より選択されるものであり、 Ｒ⁷はそれぞれ独立に水素及び天然に生ずるαアミノ酸の側鎖からなる群より選 択されるものであり、 ｎは１より大きな整数であり、 ｋ、１及びｍはそれぞれ独立にゼロ又は１〜５の整数であり、 ｐはそれぞれゼロ又は１であり、 Ｒ^hはＯＨ、ＮＨ₂又は−ＮＨＬｙｓＮＨ₂であり、そしてＲⁱは水素又はＣＯＣＨ₃ である。 上記の核酸保護方法は核酸配列を検出する方法に利用することができる。した がって、本発明は、第２の側面において、核酸試料に含まれる特定の配列の存在 を検出する方法を含む。この方法は、まず該核酸試料を配列選択的に該配列（該 核酸試料中に含まれている場合）とハイブリダイズする能力を有する核酸類似体 にハイブリダイゼーションの条件下で接 触させ、該核酸類似体と該核酸の該配列含有領域の間に複合体を形成させ、次い で該複合体を形成する該核酸の該領域が該試薬による攻撃から保護されるが該核 酸の残り部分は分解されるような条件下で該核酸を分解する能力を有する試薬と 該核酸を接触させ、最後に該複合体の存在を検出することを含んでなる方法であ る。 該複合体の存在を検出する手段は多数存在するが、複合体をそのまま検出する 方法と、複合体を核酸と核酸類似体という２成分に分解した後、該核酸または核 酸類似体(the nucelic acid analogue)の存在を検出する方法とに分けられる。 複合体の存在は、該核酸の残存を根拠に推定することができる。 上記第１の群の方法は、核酸類似体と核酸／核酸類似体ハイブリッドの間の性 質の違いを基準とするものである。したがって、該複合体の存在は、該複合体の 電気泳動における泳動度を同条件下での該核酸類似体の泳動度と比較することに よって検出するのが好ましい。 核酸類似体または核酸は検出可能な標識を保持していることが好ましく、核酸 類似体の標識として適当なものとしては、蛍光標識、放射標識、酵素標識、ビオ チン、スピン標識、化学発光標識、抗原標識、または抗体標識などが挙げられる 。これらの標識のなかでも蛍光体または放射性同位体を標識として使用するのが 最も好ましいが、ペプチドに適用できる標識方法であればどのようなものでも使 用することができるのが普通である。 本発明の第２の側面の好ましい実施態様においては、標識化反応で酵素の基質 として機能することができるペプチドモチーフを核酸類似体に与え、酵素の影響 下で核酸類似体のペプチドモチーフを標識源と反応させることを含む該標識化反 応を実施することを含んでなる核酸類似体標識方法によって製造された標識化核 酸類似体が核酸類似体として使用される。 該標識は放射標識が好ましい。 該標識源は放射標識ＡＴＰが好ましい。 該酵素はプロテインキナーゼが好ましい。 ペプチドモチーフはケンプチドモチーフ（kemptide motif）が好ましい。 標識化反応は該ペプチドモチーフのセリン残基におけるリン酸化が好ましい。 別の核酸類似体標識方法では、少なくとも１個の金属イオンとキレート化結合 するとともに直接的または間接的に放射性同位体または発蛍光団をそれにキレー ト化させる能力を有するキレート化部分を、好ましくは核酸類似体の１端におい て提供することを含む。たとえば、核酸類似体によって保持される適当なキレー ト性部分によってユーロピウムイオンをキレート化することで、このイオンを蛍 光標識として作用させることができる。 この第１の群に属するもう一つの検出方法では、保護された核酸配列を利用し て、他のやり方では会合しない二つの核酸類似体配列を連結する手段とする。二 つの標識が互いに異 なる種類の標識を有する場合、両者の会合を検出することができる。たとえば、 二つの核酸類似体オリゴマーを標的核酸配列の各末端にハイブリダイズさせるこ とで、より大型の核酸配列の一部を形成することができる。一方の核酸類似体を 、たとえばＨｉｓ₅などのキレート性ペプチドモチーフなどの固相への連結に適 した部分で標識する。他方の核酸類似体には、たとえば放射標識するなどして、 検出可能な標識を付与する。未保護核酸を消化した後、上記二つの核酸類似体配 列を標的核酸の保護配列とハイブリダイズさせることで連結する。生じた複合体 は、キレート化可能ニッケルイオンを保持する固体支持体上で第１の核酸類似体 によるキレート化によって捕捉することができる。放射標識した第２の核酸類似 体の過剰分を洗い落とし、第２の標識核酸類似体の放射能を固体支持体上で、ま たは該支持体から溶出させた後で、検出することができる。 上記以外の例としては、固相への連結に適した部分としてキレート性ペプチド モチーフの替わりにビオチンを保持する一つの核酸類似体を使用し、第２の核酸 類似体はたとえば酵素や発蛍光団などの検出可能標識に連結させる方法などが挙 げられる。検出可能標識が、検出可能産物の生成を触媒しうる酵素である場合、 免疫測定の分野で十分に確立されたエライザ原理と同様のアッセイ法を用いる。 ハイブリダイズした核酸類似体をハイブリダイズしなかった核酸類似体から分 離するもう１つの手段としては、逆相またはイオン交換クロマトグラフィーやゲ ル濾過などが挙げら れる。無傷の核酸に対して特異性を示す抗体や核酸／核酸類似体ハイブリッドに 対して特異性を示す抗体を利用する抗体選択法も使用することができる。 第２の群の検出方法においては、核酸と核酸類似体の間に形成された複合体を 変性させ、保護された核酸配列の残存を、好ましくはハイブリダイゼーションア ッセイなどの既知の核酸配列検出方法によって証明する。また、核酸配列を増幅 手順に付してもよい。通常、短い保護配列の増幅にはＬＣＲが好ましく、長い保 護配列にはＰＣＲが好ましい。 核酸増幅法とくによく知られたＰＣＲ法は、増幅対象の標的配列がそれ以外の 大量の核酸と共存している場合には困難を伴うことが多い。 上記したように、本発明は核酸試料に含まれる標的配列以外のすべての核酸を 分解することによってその試料を「クリーンアップ」する簡便な手段を提供する ものであるから、アッセイ用であるか分取用であるかの目的を問わず、より簡便 に増幅を実施することができる。 すなわち、本発明は、第３の側面において、配列特異的にハイブリダイズ可能 な核酸類似体を核酸試料に含まれる核酸にハイブリダイズさせることによって、 該核酸の特定領域を保護し、該試料を核酸攻撃試薬と接触させることで試料に含 まれる該特定領域以外の核酸を分解させ、該特定領域を増幅することを含んでな る核酸増幅実施方法を提供する。 増幅させたい保護配列を遊離させるために、核酸／核酸類似体ハイブリッドを 熱変性させることができる。ＰＣＲおよ びその変法であるＬＣＲおよび３ＳＲなど現在既知の方法をすべて含むあらゆる 増幅方法が使用可能である。 ＷＯ（ＰＣＴ／ＥＰ９３／０１４３５）には、核酸類似体を増幅産物にハイブ リダイズさせることによって、核酸増幅産物自体が増幅可能標的として作用する ことを防止する核酸増幅不妊化法(a method for sterilising a nucleic acid a mplification)が記載されている。この方法は、本発明の第４の側面に従いさら に改良することができる。すなわち、本発明の第１の側面による増幅方法の反復 に必要な少なくとも１つのプライマー結合部位以外の増幅産物の領域を保護し、 増幅産物のプライマー結合部位を含む残りの核酸を分解し、保護された核酸の残 存を上記のようにして検出することによって、改良することができる。すべての プライマー結合配列のうちの少なくとも一部、より好ましくは全部を分解するの が好ましい。 核酸類似体から核酸を溶解除去させるのに十分な高温を使用する場合、核酸類 似体はＰＣＲ法の実施中常に存在していてもよいし、増幅終了時点でこれを添加 することもできる。攻撃試薬は増幅後に添加しなければならないが、増幅産物の 逸出による汚染の機会をなくすために、閉鎖系増幅装置内に設けた別の部屋から 添加してもよい。 以下、図面を参照しながら下記実施例により本発明を説明する。 図１は、実施例３〜５で得られた結果を示すゲルのオートラジオグラフである 。 本発明に使用するのにとくに好ましい高度特異的放射標識を保持するＰＮＡの 簡便な製造方法の一つが、本発明者らを出願人として本願と同じ日付をもって出 願された同時係属出願の英国特許出願（庁の参照番号Ｐ３６８５ＧＢ）に記載さ れている。上記方法の好ましい実施態様によれば、プロテインキナーゼＡが媒介 する³²Ｐ−ＡＴＰとの反応に付される末端ケンプチド伸張部を有するＰＮＡを製 造し、セリン残基に結合した³²Ｐ標識を得る。ＷＯ９２／２０７０３号に記載の Ｂｏｃ固相合成法を用いて原料のＰＮＡ配列が固体支持体上に適切に（suitably ）構築されていれば、目的のアミノ酸配列を有するペプチド伸張部を有するＰＮ Ａを当該技術において既知のＢｏｃまたはＦｍｏｃ固相法で簡便に製造すること ができる。 本発明の第１の側面の好適な実施態様によれば、保護対象の配列を含む核酸を その目的の配列に対して相補的な配列を有するＰＮＡで処理する。核酸がＤＮＡ である場合、二本鎖型であってもよく、核酸類似体が二本鎖型の標的配列にハイ ブリダイズする能力を利用することができるが、その二本鎖型標的ＤＮＡは変性 を要する場合があり、通常はそのような変性が望ましい。また、この変性は熱に よって行なわれるのが普通である。該ＤＮＡは非常に低純度のものであってよく 、他の細胞産物が混在していてもよい。また、該ＤＮＡは、細胞から抽出後に短 い断片へと消化されていないゲノムＤＮＡ全体や全細胞ＲＮＡであってもよい。 該ＤＮＡまたはＲＮＡは、ＬＣＲやＰＣＲやＮＡＳＢＡ（３ＳＲ）増幅などの核 酸増幅法の産物であってもよい。標的ＤＮＡが二本鎖型であっても高い親和性を もって選択的に配列と結合するＰＮＡが好ましい。次いで、核酸試料をヌクレア ーゼまたはヌクレアーゼ混合物で処理して、ＰＮＡとのハイブリダイゼーション による保護を受けていない核酸をすべて分解させる。正しい配列が核酸試料中に 一つしか含まれていない場合でも確実にハイブリダイズされ保護されるように、 ＰＮＡは大過剰量含まれていてもよい。 反応生成物をゲル上または毛細管内の電気泳動に付して、核酸にハイブリダイ ズしたＰＮＡをハイブリダイズしなかったＰＮＡと分離することができる。ＰＮ Ａは実質的に中性の分子であって、通常は１分子あたり１個の正電荷を末端アミ ノ基部分に保持しているので、電気泳動中にはほとんど泳動傾向を示さない。一 方、核酸は負帯電度が高いので、ＰＮＡが核酸断片にハイブリダイズすると、電 気泳動中にＰＮＡ自体とは逆の方向に泳動される負帯電のハイブリッドができる 。これにより、ハイブリダイズされたＰＮＡとハイブリダイズされなかったＰＮ Ａを容易かつ高度に特異的に分離することができる。ＰＮＡを適切に標識すれば 、ごく微量のＰＮＡの検出が可能となり、本発明の第２の側面による分析方法で 良好な信号ノイズ比を得ることができる。 ＰＮＡは１残基しか異ならない核酸配列を区別することができる。したがって 、上記方法は、特定のゲノムＤＮＡ試料が特定の遺伝子内に特定の対立遺伝子変 異を有するかどうかを判定することができる非常に迅速かつ簡便なアッセイ法が 実現できる。さらに、核酸にハイブリダイズした長さの異なるＰＮＡは電気泳動 によって容易に分離できるので、同時に複数のＰＮＡをプローブとして核酸試料 を調べ、すべてのハイブリダイズしない核酸を消化した後、電気泳動を行なって すべてのＰＮＡ／核酸ハイブリッドを過剰量のハイブリダイズしていないＰＮＡ から分離したり、ハイブリッド同士を分離することもできる。したがって、おそ らくは異なる遺伝子上に特定の組み合わせの対立遺伝子変異、たとえば疾患状態 などの特定の表現型をもたらす変異がＤＮＡ試料に含まれていることを１回のア ッセイで証明することができる。実施例１ ＰＮＡ−ケンプチドキメラの製造 ＷＯ９２／２０７０３に記載の固相ＰＮＡ合成法を用いて下記配列を作成した 。 Ｂｏｃ−ＮＨ（ＣＨ₂）₅ＣＯＮＨ−ＴＧ（Ｚ）Ｔ．Ａ（Ｚ）Ｃ（Ｚ）Ｇ（Ｚ）． ＴＣ（Ｚ）Ａ（Ｚ）．Ｃ（Ｚ）Ａ（Ｚ）Ａ（Ｚ）．Ｃ（Ｚ）ＴＡ（Ｚ）−ＣＯＮ Ｈ−樹脂 ＴＦＡ処理によりＮ末端Ｂｏｃ基を除去したものをリンカーの６−アミノ−ヘ キサン酸を介してケンプチドモチーフの標準的ｂｏｃ型固相ペプチド合成法の開 始点として使用して下記のキメラを製造した。 Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）−Ａｌａ−Ｓｅｒ−（Ｂ ｚｌ）−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＮＨ（ＣＨ₂）₅ＣＯＮＨ−ＴＧ（Ｚ）Ｔ．Ａ（Ｚ）Ｃ （Ｚ）Ｇ（Ｚ）．ＴＣ（Ｚ）Ａ（Ｚ）．Ｃ（Ｚ）Ａ（Ｚ） Ａ（Ｚ）．Ｃ（Ｚ ）ＴＡ（Ｚ）−ＣＯＮＨ−樹脂 保護基を除去し、生成物を低速／高速ＴＦＭＳＡ法で樹脂から切断した。得ら れた粗製物を分取用ＨＰＬＣ（水（MilliQ）中０．１％ＴＦＡ溶液（溶媒Ａ）お よび０．１％ＴＦＡと１０％水と９０％アセトニトリルの混合物（溶媒Ｂ）の密 度勾配上で逆相Ｃ₁₈溶出を行なった）により精製した。精製キメラＰＮＡ−ケン プチドの特性を分析ＨＰＬＣとＦＡＢ−ＭＳにより明らかにした。実施例２ プロテインキナーゼＡによるケンプチドモチーフ（Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａ ｌａ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ）の放射標識 下記式のＰＮＡ−ケンプチドキメラを³²Ｐで標識した。 Ｈ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＴＧＴＡＣＧ ＴＣＡＣＡＡＣＴＡ−ＮＨ₂ 標識は、下記成分を含む反応混合物中で行なった。 ＰＮＡ−ケンプチド、１０μＭ．．．．．５μｌ １０ｘプロテインキナーゼＡ緩衝液．．．．．５μｌ γ³²Ｐ−ＡＴＰ（＞５０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ；５０μＣｉ／μｌ）．．．．．１ ０μｌ プロテインキナーゼＡ（ベーリンガー社製；５ｍＵ／μｌ）．．．．．０．２μ ｌ Ｈ₂Ｏ．．．．．３０μｌ 反応物を３０℃で３０分間、次いで６５℃で１０分間インキュベートした後、 １５０００ｇで３０秒間遠心分離した。 上清を別のエッペンドルフ管に移し、全体量が１ｍｌになるように水を加え、Ｄ ＥＡＥセファデックスＡ−５０アニオン交換カラムを用いるアニオン交換クロマ トグラフィーにより、組み込まれていないγ³²Ｐ−ＡＴＰから標識ＰＮＡ−ケン プチドを分離した。 ＰＮＡ−ケンプチドの比放射能はＰＮＡ−ケンプチド１μｇあたり１ｘ１０⁸ ｃｐｍと推定された。実施例３：ＰＮＡによる保護を介したＤＮＡ配列の検出 実施例２で得た放射標識ケンプチドモチーフを保持する１５マーＰＮＡを下記 核酸のぞれぞれとともに１５分間インキュベートした。 １．核酸なし（図１のレーン１参照）。 ２．相補的ＤＮＡ１５マー（図１のレーン２と５参照）。 ３．ＰＮＡの配列の一部に対して相補的なＤＮＡ１０マー（図１のレーン３参照 ）。 ４．配列の中心部においてＰＮＡに対して相補的な１５塩基配列を含有するＤＮ Ａ４０マー５’ＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＴＡＧＴＴＧＴＧＡＣＧＴＡＣＡＧＧＡＴ ＣＴＴＴＴＴＣＡＴＡＧ−３（図１のレーン４と６参照）。 いずれの場合も、３０ｍＭのＮａＡｃ（ｐＨ５．０）、５０ｍＭのＮａＣｌ、 １０ｍＭのＺｎＣｌ₂、および５５％ｖ／ｖのグリセリンを含む１０μｌの反応 液中で４μｌの１０μＭオリゴヌクレオチド溶液を５μｌの標識化ＰＮＡと混合 した。室温で１５分間インキュベートした。 ４０マーのＤＮＡを用いた２つの反応の一方の場合と１５ マーのＤＮＡを用いた２つの反応の一方の場合では、１５単位のリョクトウヌク レアーゼを添加し、反応物を３７°で５分間インキュベートした。 いずれの反応も１０μｌの負荷緩衝液（３０％ｖ／ｖグリセリン、０．２５％ ｗ／ｖブロモフェノールブルー、０．２５％キシレンシアノール、０．０１％Ｓ ＤＳ）の添加で停止させ、反応混合物を１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動 に付した後、オートラジオグラフィーを行なった。 結果を図１のレーン１〜６に示す。レーン１では、標識ＰＮＡだけがで泳動さ れ、ゲル上で移動できないためバンドは見られない。レーン２では、標識ＰＮＡ は１５マーのＤＮＡにハイブリダイズし、ハイブリッドのバンドが見られる。レ ーン３では、標識ＤＮＡは１０マーのＤＮＡにハイブリダイズし、生じたバンド はレーン２で見られたものと距離的に明確に識別できることがわかるが、これは 関与する二つのオリゴＤＮＡのサイズの違いによるものである。レーン４では、 ＰＮＡは４０マーのＤＮＡにハイブリダイズし、ここでもゲル上のバンドの泳動 距離から¹⁵ＰＮＡ／¹⁰ＤＮＡおよび¹⁵ＰＮＡ／¹⁵ＤＮＡハイブリッドと¹⁵ＰＮＡ ／⁴⁰ＤＮＡハイブリッドとを区別することができる。 レーン５には、¹⁵ＰＮＡ／¹⁵ＤＮＡのハイブリッドの場合のヌクレアーゼ消化 の結果を示した。バンドはレーン２で見られるものと同じで、ヌクレアーゼはハ イブリダイズしたＤＮＡを分解することができなかったことがわかる。レーン６ には、¹⁵ＰＮＡ／⁴⁰ＤＮＡハイブリッドのヌクレアーゼ消化 の結果を示す。ここでも、バンドはレーン２のものと同じであり、ＰＮＡにハイ ブリダイズしたＤＮＡ部分だけがヌクレアーゼから保護されていることがわかる 。したがって、ＰＮＡに対して相補的な４０マーＤＮＡの内部１５マー配列が、 レーン６について上記した手順によって検出されたのである。実施例４：ＰＮＡによるヌクレアーゼからのＲＮＡの保護 実施例２と同様にしてケンプチドモチーフを保持するＰＮＡＴ₁₀を標識した。 下記手順に従い、標識ＰＮＡをポリアデニル化ＲＮＡの混合物とともにインキュ ベートした。実施例３と同様の時間および温度条件下で、他の成分を含有する反 応液１０μｌ中でＰＮＡ（５μｌ）を４μｌの１００ｎｇ／μｌイン・ビトロ混 合ＲＮＡ転写物（ギブコBRL社製）とともにインキュベートした。同様のインキ ュベート混合物を実施例３と同様にしてリョクトウヌクレアーゼとともにさらに インキュベートし、反応混合物を電気泳動用に処理し、実施例３と同様にして電 気泳動とオートラジオグラフィーに付した。結果を図１のレーン７と８に示す。 レーン７には、サイズの異なるＰＮＡ／ＲＮＡハイブリッドの未切断梯子状態 を示した。レーン８では、ヌクレアーゼがすべてのＲＮＡを整理してＰＮＡによ り保護されたＡ₁₀部分とすることで梯子を単一のバンドに分解している。実施例５：１５マーＤＮＡに含まれる単一塩基変異の検出 実施例３で使用した１５マーの標識化ＰＮＡを下記のようにして二つの異なる 温度条件下で２種類のＤＮＡにハイブリ ダイズさせた。 標識ＰＮＡはそれぞれ５５℃と６５℃のインキュベーション温度で相補的１５ マーＤＮＡにハイブリダイズさせ、いずれの場合も反応混合物を当該温度でリョ クトウヌクレアーゼ処理した。それ以外は実施例３と同様の条件を用いた。単一 塩基不適合１５マーＤＮＡである５’−ＴＡＧＴＴＧＣＧＡＣＧＴＡＣＡ−３’ を上記と同じ２つの温度で用いる２通りのインキュベーションを行なった後、リ ョクトウヌクレアーゼを添加した。得られたオートラジオグラムを図１のレーン ９〜１２に示す。 レーン９には、ＰＮＡをその完全相補ＤＮＡに対してハイブリダイズさせた後 ６５℃におけるヌクレアーゼ分解に付したところ、ＰＮＡによるＤＮＡ保護に対 応したバンドが出現したことを示す。レーン１０は、６５℃で単一塩基不適合を 用いたハイブリダイゼーシヨンの結果を示す。ＤＮＡは保護されず、ハイブリッ ドは見られない。レーン１１は、５５℃で完全相補配列を用いた実験の結果を示 し、レーン１２は、単一不適合を用いた５５℃実験の結果を示す。いずれのレー ンにおいても、保護ＤＮＡが検出される。 完全適合１５マーハイブリッドの融点は６９℃である。この融点に近い温度で 操作することによってもたらされる厳格なハイブリダイズゼーション条件下では 、ＰＮＡは完全適合ＤＮＡと融点６１℃の単一塩基不適合ＤＮＡとが区別される が、５５℃では、ハイブリッドの融点から予想されるように完全適合と単一塩基 不適合の両者とハイブリッドが形成され る。 以上、実施例により説明した好適実施態様に言及することによって本発明を詳 細に説明したが、本発明の実施態様は、本発明の範囲を逸脱しないかぎり様々な 変更や改良が可能であるものとする。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】１９９５年９月１５日 【補正内容】 原文明細書５頁補正 Ｒ⁶とＲ⁷は一緒になって脂環系又は複素環系を作り、 Ｄ¹〜Ｄⁿはそれぞれ、（ＣＲ⁶Ｒ⁷）_zであり、ここでＲ⁶とＲ⁷は上記のように定 義され、 ｙ及びｚはそれぞれゼロ又は１〜１０の整数であり、ｙ＋ｚの和は２〜１０（好 ましくは２より大、最も好ましくはｙ及びｚはそれぞれ１又は２）であり、 Ｇ¹〜Ｇ^n-1はそれぞれ−ＮＲ³ＣＯ−、−ＮＲ³ＣＳ−、−ＮＲ³ＳＯ−、又は− ＮＲ³ＳＯ₂−であり、いずれの方向でもよく、ここでＲ³は以下に定義され、 Ａ¹〜Ａⁿ及びＢ¹〜Ｂⁿはそれぞれ以下のものから選択され、 （ａ）Ａは式(IIa)、(IIb)、(IIc)又は(IId)の群であり、かつＢはＮ又はＲ³Ｎ⁺ であり、又は （ｂ）Ａは式(IId)の群であり、かつＢはＣＨであり、 原文明細書９頁補正 この方法は、まず該核酸試料を配列選択的に該配列（該核酸試料中に含まれてい る場合）とハイブリダイズする能力を有する核酸類似体にハイブリダイゼーショ ンの条件下で接触させ、該核酸類似体と該核酸の該配列含有領域の間に複合体を 形成させ、次いで該複合体を形成する該核酸の該領域が該試薬による攻撃から保 護されるが該核酸の残り部分は分解されるような条件下で該核酸を分解する能力 を有する試薬と該核酸を接触させ、最後に該複合体の存在を検出することを含ん でなる方法である。 該複合体の存在を検出する手段は多数存在するが、複合体をそのまま検出する 方法と、複合体を核酸と核酸類似体という２成分に分解した後、該核酸または核 酸類似体の存在を検出する方法とに分けられる。複合体の存在は、該核酸の残存 を根拠に推定することができる。 上記第１の群の方法は、核酸類似体と核酸／核酸類似体ハイブリッドの間の性 質の違いを基準とするものである。したがって、該複合体の存在は、該複合体の 電気泳動における泳動度を同条件下での該核酸類似体の泳動度と比較することに よって検出するのが好ましい。 核酸類似体または核酸は検出可能な標識を保持していることが好ましく、核酸 類似体の標識として適当なものとしては、蛍光標識、放射標識、酵素標識、ビオ チン、スピン標識、化学発光標識、抗原標識、または抗体標識などが挙げられる 。これらの標識のなかでも蛍光体または放射性同位体を標識 として使用するのが最も好ましいが、ペプチドに適用できる標識方法であればど のようなものでも使用することができるのが普通である。 本発明の第２の側面の好ましい実施態様においては、標識化反応で酵素の基質 として機能することができるペプチドモチーフを核酸類似体に与え、酵素の影響 下で核酸類似体のペプチドモチーフを標識源と反応させることを含む該標識化反 応を実施することを含んでなる核酸類似体標識方法によって製造された標識化核 酸類似体が核酸類似体として使用される。 原文明細書１２頁補正 すなわち、本発明は、第３の側面において、配列特異的にハイブリダイズ可能 な核酸類似体を核酸試料に含まれる核酸にハイブリダイズさせることによって、 該核酸の特定領域を保護し、該試料を核酸攻撃試薬と接触させることで試料に含 まれる該特定領域以外の核酸を分解させ、該特定領域を増幅することを含んでな る核酸増幅実施方法を提供する。 増幅させたい保護配列を遊離させるために、核酸／核酸類似体ハイブリッドを 熱変性させることができる。ＰＣＲおよびその変法であるＬＣＲおよび３ＳＲな ど現在既知の方法をすべて含むあらゆる増幅方法が使用可能である。 ＷＯ９３／２５７０６（ＰＣＴ／ＥＰ９３／０１４３５）には、核酸類似体を 増幅産物にハイブリダイズさせることによって、核酸増幅産物自体が増幅可能標 的として作用することを防止する核酸増幅不妊化法(a method for sterilising a nucleic acid amplification)が記載されている。この方法は、本発明の第４ の側面に従いさらに改良することができる。すなわち、本発明の第１の側面によ る増幅方法の反復に必要な少なくとも１つのプライマー結合部位以外の増幅産物 の領域を保護し、増幅産物のプライマー結合部位を含む残りの核酸を分解し、保 護された核酸の残存を上記のようにして検出することによって、改良することが できる。すべてのプライマー結合配列のうちの少なくとも一部、より好ましくは 全部を分解するのが好ましい。 核酸類似体から核酸を溶解除去させるのに十分な高温を使 用する場合、核酸類似体はＰＣＲ法の実施中常に存在していてもよいし、増幅終 了時点でこれを添加することもできる。攻撃試薬は増幅後に添加しなければなら ないが、増幅産物の逸出による汚染の機会をなくすために、閉鎖系増幅装置内に 設けた別の部屋から添加してもよい。 原文明細書１３頁補正 以下、図面を参照しながら下記実施例により本発明を説明する。 図１は、実施例３〜５で得られた結果を示すゲルのオートラジオグラフである 。 本発明に使用するのにとくに好ましい高度特異的放射標識を保持するＰＮＡの 簡便な製造方法の一つが、本発明者らを出願人として本願と同じ日付をもって出 願された同時係属出願の英国特許出願Ｎｏ．９３２４９５６．３（庁の参照番号 Ｐ３６８５ＧＢ）に記載されている。上記方法の好ましい実施態様によれば、プ ロテインキナーゼＡが媒介する³²Ｐ−ＡＴＰとの反応に付される末端ケンプチド 伸張部を有するＰＮＡを製造し、セリン残基に結合した³²Ｐ標識を得る。ＷＯ９ ２／２０７０３号に記載のＢｏｃ固相合成法を用いて原料のＰＮＡ配列が適当な （suitable）固体支持体上に構築されていれば、目的のアミノ酸配列を有するペ プチド伸張部を有するＰＮＡを当該技術において既知のＢｏｃまたはＦｍｏｃ固 相法で簡便に製造することができる。 本発明の第１の側面の好適な実施態様によれば、保護対象の配列を含む核酸を その目的の配列に対して相補的な配列を有するＰＮＡで処理する。核酸がＤＮＡ である場合、二本鎖型であってもよく、核酸類似体が二本鎖型の標的配列にハイ ブリダイズする能力を利用することができるが、その二本鎖型標的ＤＮＡは変性 を要する場合があり、通常はそのような変性が望ましい。また、この変性は熱に よって行なわれるの が普通である。該ＤＮＡは非常に低純度のものであってよく、他の細胞産物が混 在していてもよい。また、該ＤＮＡは、細胞から抽出後に短い断片へと消化され ていないゲノムＤＮＡ全体や全細胞ＲＮＡであってもよい。該ＤＮＡまたはＲＮ Ａは、ＬＣＲやＰＣＲやＮＡＳＢＡ（３ＳＲ）増幅などの核酸増幅法の産物であ ってもよい。標的ＤＮＡが二本鎖型であっても高い親和性をもって選択的に配列 と結合するＰＮＡが好ましい。次いで、核酸試料をヌクレアーゼまたはヌクレア ーゼ混合物で処理して、ＰＮＡとのハイブリダイゼーションによる保護を受けて いない核酸をすべて分解させる。 原文明細書１５頁補正 実施例１ ＰＮＡ−ケンプチドキメラの製造 ＷＯ９２／２０７０３に記載の固相ＰＮＡ合成法を用いて下記配列を作成した 。 Ｂｏｃ−ＮＨ（ＣＨ₂）₅ＣＯＮＨ−ＴＧ（Ｚ）Ｔ．Ａ（Ｚ）Ｃ（Ｚ）Ｇ（Ｚ）． ＴＣ（Ｚ）Ａ（Ｚ）．Ｃ（Ｚ）Ａ（Ｚ）Ａ（Ｚ）．Ｃ（Ｚ）ＴＡ（Ｚ）−ＣＯＮ Ｈ−樹脂 ＴＦＡ処理によりＮ末端Ｂｏｃ基を除去したものをリンカーの６−アミノ−ヘ キサン酸を介してケンプチドモチーフの標準的ｂｏｃ型固相ペプチド合成法の開 始点として使用して下記のキメラを製造した。 Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）−Ａｌａ−Ｓｅｒ−（Ｂ ｚｌ）−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＮＨ（ＣＨ₂）₅ＣＯＮＨ−ＴＧ（Ｚ）Ｔ．Ａ（Ｚ）Ｃ （Ｚ）Ｇ（Ｚ）．ＴＣ（Ｚ）Ａ（Ｚ）．Ｃ（Ｚ）Ａ（Ｚ） Ａ（Ｚ）．Ｃ（Ｚ） ＴＡ（Ｚ）−ＣＯＮＨ−樹脂 保護基を除去し、生成物を低速／高速ＴＦＭＳＡ法で樹脂から切断した。得ら れた粗製物を分取用ＨＰＬＣ（水（MilliQ^TM）中０．１％ＴＦＡ溶液（溶媒Ａ） および０．１％ＴＦＡと１０％水と９０％アセトニトリルの混合物（溶媒Ｂ）の 密度勾配上で逆相Ｃ₁₈溶出を行なった）により精製した。精製キメラＰＮＡ−ケ ンプチドの特性を分析ＨＰＬＣとＦＡＢ−ＭＳにより明らかにした。実施例２ プロテインキナーゼＡによるケンプチドモチーフ（Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａ ｌａ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ）の放射標識 下記式のＰＮＡ−ケンプチドキメラを³²Ｐで標識した。 Ｈ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＴＧＴＡＣＧ ＴＣＡＣＡＡＣＴＡ−ＮＨ₂ 標識は、下記成分を含む反応混合物中で行なった。 原文明細書１６頁補正 ＰＮＡ−ケンプチド、１０μＭ．．．．．５μｌ １０ｘプロテインキナーゼＡ緩衝液．．．．．５μｌ γ³²Ｐ−ＡＴＰ（＞５０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ；５０μＣｉ／μｌ）．．．．．１ ０μｌ プロテインキナーゼＡ（ベーリンガー社製；５ｍＵ／μｌ）．．．．．０．２μ ｌ Ｈ₂Ｏ．．．．．３０μｌ 反応物を３０℃で３０分間、次いで６５℃で１０分間インキュベートした後、 １５０００ｇで３０秒間遠心分離した。上清を別のエッペンドルフ管に移し、全 体量が１ｍｌになるように水を加え、ＤＥＡＥセファデックスＡ−５０^TMアニオ ン交換カラムを用いるアニオン交換クロマトグラフィーにより、組み込まれてい ないγ³²Ｐ−ＡＴＰから標識ＰＮＡ−ケンプチドを分離した。 ＰＮＡ−ケンプチドの比放射能はＰＮＡ−ケンプチド１μｇあたり１ｘ１０⁸ ｃｐｍと推定された。実施例３：ＰＮＡによる保護を介したＤＮＡ配列の検出 実施例２で得た放射標識ケンプチドモチーフを保持する１５マーＰＮＡを下記 核酸のぞれぞれとともに１５分間インキュベートした。 １．核酸なし（図１のレーン１参照）。 ２．相補的ＤＮＡ１５マー（図１のレーン２と５参照）。 ３．ＰＮＡの配列の一部に対して相補的なＤＮＡ１０マー（図１のレーン３参照 ）。 ４．配列の中心部においてＰＮＡに対して相補的な１５塩基配列を含有するＤＮ Ａ４０マー５’ＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＴＡＧＴＴＧＴＧＡＣＧＴＡＣＡＧＧＡＴ ＣＴＴＴＴＴＣＡＴＡＧ−３（図１のレーン４と６参照）。 いずれの場合も、３０ｍＭのＮａＡｃ（ｐＨ５．０）、５０ｍＭのＮａＣｌ、 １０ｍＭのＺｎＣｌ₂、および５５％ｖ／ｖのグリセリンを含む１０μｌの反応 液中で４μｌの１０μＭオリゴヌクレオチド溶液を５μｌの標識化ＰＮＡと混合 した。室温で１５分間インキュベートした。 原文明細書１７頁補正 ４０マーのＤＮＡを用いた２つの反応の一方の場合と１５マーのＤＮＡを用い た２つの反応の一方の場合では、１５単位のリョクトウヌクレアーゼを添加し、 反応物を３７℃で５分間インキュベートした。 いずれの反応も１０μｌの負荷緩衝液（３０％ｖ／ｖグリセリン、０．２５％ ｗ／ｖブロモフェノールブルー、０．２５％キシレンシアノール、０．０１％Ｓ ＤＳ）の添加で停止させ、反応混合物を１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動 に付した後、オートラジオグラフィーを行なった。 結果を図１のレーン１〜６に示す。レーン１では、標識ＰＮＡだけがで泳動さ れ、ゲル上で移動できないためバンドは見られない。レーン２では、標識ＰＮＡ は１５マーのＤＮＡにハイブリダイズし、ハイブリッドのバンドが見られる。レ ーン３では、標識ＤＮＡは１０マーのＤＮＡにハイブリダイズし、生じたバンド はレーン２で見られたものと距離的に明確に識別できることがわかるが、これは 関与する二つのオリゴＤＮＡのサイズの違いによるものである。レーン４では、 ＰＮＡは４０マーのＤＮＡにハイブリダイズし、ここでもゲル上のバンドの泳動 距離から¹⁵ＰＮＡ／¹⁰ＤＮＡおよび¹⁵ＰＮＡ／¹⁵ＤＮＡハイブリッドと¹⁵ＰＮＡ ／⁴⁰ＤＮＡハイブリッドとを区別することができる。 レーン５には、¹⁵ＰＮＡ／¹⁵ＤＮＡのハイブリッドの場合のヌクレアーゼ消化 の結果を示した。バンドはレーン２で見られるものと同じで、ヌクレアーゼはハ イブリダイズしたＤ ＮＡを分解することができなかったことがわかる。レーン６には、¹⁵ＰＮＡ／⁴⁰ ＤＮＡハイブリッドのヌクレアーゼ消化の結果を示す。ここでも、バンドはレー ン２のものと同じであり、ＰＮＡにハイブリダイズしたＤＮＡ部分だけがヌクレ アーゼから保護されていることがわかる。したがって、ＰＮＡに対して相補的な ４０マーＤＮＡの内部１５マー配列が、レーン６について上記した手順によって 検出されたのである。実施例４：ＰＮＡによるヌクレアーゼからのＲＮＡの保護 実施例２と同様にしてケンプチドモチーフを保持するＰＮＡＴ₁₀を標識した。 下記手順に従い、標識ＰＮＡをポリアデニル化ＲＮＡの混合物とともにインキュ ベートした。 原文明細書１９頁補正 レーン１２は、単一不適合を用いた５５℃実験の結果を示す。いずれのレーンに おいても、保護ＤＮＡが検出される。 完全適合１５マーハイブリッドの融点は６９℃である。この融点に近い温度で 操作することによってもたらされる厳格なハイブリダイズゼーション条件下では 、ＰＮＡは完全適合ＤＮＡと融点６１℃の単一塩基不適合ＤＮＡとが区別される が、５５℃では、ハイブリッドの融点から予想されるように完全適合と単一塩基 不適合の両者とハイブリッドが形成される。補正後の請求の範囲 １．試料中に含まれるある核酸配列の存在を検出する方法であって、該配列が該 試料中に存在すれば配列特異的にそれにハイブリダイズすることができる核酸類 似体に該試料をハイブリッド形成条件下で接触させて該核酸類似体と該配列を含 む該核酸との間に複合体を形成させ、核酸を分解することができる試薬による攻 撃から該核酸複合体の該配列は保護されるが該核酸の残りは分解されるような条 件下で該核酸を該試薬に接触させ、そして核酸類似体の性質とは異なる核酸−核 酸類似体複合体の性質に基づいて該複合体の存在を検出することを含んでなる方 法。 ２．試料中に含まれる核酸配列の存在を検出する方法であって、該配列が該試料 中に存在すれば配列特異的にそれにハイブリダイズすることができる核酸類似体 に該試料をハイブリッド形成条件下で接触させて該核酸類似体と該核酸の間の複 合体を形成させ、該核酸複合体の該配列が核酸を分解し得る試薬による攻撃から 保護されるが該核酸の残りは分解される条件の下で該試薬に接触させ、該核酸に ハイブリダイズした核酸類似体の該複合体をハイブリダイズしていない核酸類似 体から分離することを含んでなる方法。 ３．試料中に含まれる核酸配列の存在を検出する方法であって、該試料中に該配 列が存在すればそれに配列特異的にハイ ブリダイズすることができる核酸類似体に該試料をハイブリッド形成条件下で接 触させて該核酸類似体と該配列を含む該核酸との間に複合体を形成させ、該核酸 複合体の該配列が該核酸を分解し得る試薬による攻撃から保護されるが該核酸の 残りは分解されるような条件下で該核酸を該試薬に接触させ、ついで該複合体を 変性させ該配列の残存を証明することにより該複合体を検出することを含んでな る方法。 ４．該試薬がヌクレアーゼである、請求項１〜請求項３いずれか１項に記載の方 法。 ５．核酸類似体が、連結バックボーン部分からなるバックボーンに結合したリガ ンドの配列を含むポリマー鎖を含み、かつ相補的配列の核酸にハイブリダイズす ることができるものである、請求項１〜請求項３いずれか１項に記載の方法。 ６．該核酸類似体バックボーンがポリアミド、ポリチオアミド、ポリスルフィン アミド又はポリスルホンアミドのバックボーンである、請求項５記載の方法。 ７．該連結バックボーン部分がペプチド結合したアミノ酸部分である、請求項６ 記載の方法。 ８．核酸類似体が相補的配列の核酸とハイブリダイズして、配列上該類似体に対 応する通常のデオキシリボヌクレオチド と該核酸との間のハイブリッドよりも熱変性に対してより安定なハイブリッドを 形成することができるものである、請求項１〜請求項７いずれか１項に記載の方 法。 ９．該核酸類似体がそのバックボーンがポリアミドバックボーンであるペプチド 核酸であり、該リガンドが該バックボーン中のアザ窒素原子に直接的又は間接的 に結合しているものであり、そして該リガンドを保持する窒素原子が主として４ 〜８個の介入原子により該バックボーン中で相互に隔てられているものである、 請求項１〜請求項８いずれか１項に記載の方法。 １０．核酸類似体が一方の鎖が該類似体に相補的な配列を持つ二本鎖核酸にハイ ブリダイズして一方の鎖から他方の鎖を置換することができるものである、請求 項１〜請求項９いずれか１項に記載の方法。 １１．核酸類似体が下記一般式１を持つものである、請求項１〜請求項１０いず れか１項に記載の方法、 式中、 ｎは少なくとも２であり、 Ｌ¹〜Ｌⁿはそれぞれ独立に、水素、水酸基、（Ｃ₁〜Ｃ₄）アルカノイル基、天然 に生ずる核酸塩基類、天然に生じない核酸塩基類、芳香族部分、ＤＮＡインター カーレーター類、核酸塩基結合基、複素環部分、及びレポーターからなる群より 選択されるものであり、 Ｃ¹〜Ｃⁿはそれぞれ（ＣＲ⁶Ｒ⁷）ｙであり、ここでＲ⁶は水素であり、Ｒ⁷は天然 に生ずるαアミノ酸類の側鎖からなる群より選択されるものであり、又はＲ⁶と Ｒ⁷は独立に水素、（Ｃ₁〜Ｃ₆）アルキル基、アリール基、アラルキル基、ヘテ ロアリール基、水酸基、（Ｃ₁〜Ｃ₆）アルコキシ基、（Ｃ₁〜Ｃ₆）アルキルチオ 基、ＮＲ³Ｒ⁴及びＳＲ⁵からなる群より選択されるものであり、ここでＲ³とＲ⁴ は以下に定義され、Ｒ⁵は水素、（Ｃ₁〜Ｃ₆）アルキル基、水酸基、アルコキシ 基、又はアルキルチオ−置換（Ｃ₁〜Ｃ₆）アルキル基であり、又はＲ⁶とＲ⁷は一 緒になって脂環系又は複素環系を作り、 Ｄ¹〜Ｄⁿはそれぞれ、（ＣＲ⁶Ｒ⁷）_zであり、ここでＲ⁶とＲ⁷は上記のように定 義され、 ｙ及びｚはそれぞれゼロ又は１〜１０の整数であり、ｙ＋ｚの和は２〜１０であ り、 Ｇ¹〜Ｇ^n-1はそれぞれ−ＮＲ³ＣＯ−、−ＮＲ³ＣＳ−、−ＮＲ³ＳＯ−、又は− ＮＲ³ＳＯ₂−であり、いずれの方向でもよく、ここでＲ³は以下に定義され、 Ａ¹〜Ａⁿ及びＢ¹〜Ｂⁿはそれぞれ以下のものから選択される、 （ａ）Ａは式(IIa)、(IIb)、(IIc)又は(IId)の群であり、かつＢはＮ又はＲ³Ｎ⁺ であり、又は （ｂ）Ａは式(IId)の群であり、かつＢはＣＨであり、 式中、 ＸはＯ、Ｓ、Ｓｅ、ＮＲ³、ＣＨ₂又はＣ（ＣＨ₃）₂であり、 Ｙは単結合、Ｏ、Ｓ又はＮＲ⁴であり、 ｐとｑはそれぞれゼロ又は１〜５の整数であり、ｒ＋ｓの和 は１０以下であり、 ｒとｓはそれぞれゼロ又は１〜５の整数であり、ｒ＋ｓの和は１０以下であり、 Ｒ¹とＲ²はそれぞれ独立に、水素、ヒドロキシ−，アルコキシ−，又はアルキル チオ−で置換されていてもよい（Ｃ₁〜Ｃ₄）アルキル基、水酸基、アルコキシ基 、アルキルチオ基、アミノ基及びハロゲンからなる群より選択されるものであり 、そして Ｒ³及びＲ⁴はそれぞれ独立に、水素、（Ｃ₃〜Ｃ₄）アルキル基、ヒドロキシ−， アルコキシ−，アルキルチオ−置換（Ｃ₁〜Ｃ₄）アルキル基、水酸基、アルコキ シ基、アルキルチオ基及びアミノ基からなる群から選択されるものであり、 Ｑは−ＣＯ₃Ｈ、−ＣＯＮＲ’Ｒ”、−ＳＯ₃Ｈ又は−ＳＯ₂ＮＲ’Ｒ”、又は− ＣＯ₂Ｈ又は−ＳＯ₃Ｈの活性誘導体、及び Ｉは−ＮＲ’Ｒ''であり、ここでＲ’及びＲ''は独立に水素、アルキル基、アミ ノ保護基、レポーターリガンド、インターカーレーター、キレーター、ペプチド 、タンパク質、炭水化物、リピド、ステロイド、ヌクレオシド、ヌクレオチド、 ヌクレオシド二リン酸、ヌクレオシド三リン酸、オリゴリボヌクレオチドとオリ ゴデオキシリボヌクレオチドの両者を含むオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオ シド、及び可溶性及び不溶性ポリマーからなる群より選択されるものである。 １２．該核酸類似体が一般式III、IV又はＶの化合物を含むものである、請求項 １０記載の方法、 式中、 Ｌはそれぞれ独立に水素、フェニル基、複素環部分、天然に生ずる核酸塩基、及 び天然に生じない核酸塩基からなる群より選択されるものであり、 Ｒ⁷はそれぞれ独立に水素及び天然に生ずるαアミノ酸の側鎖からなる群より選 択されるものであり、 ｎは１より大きな整数であり、 ｋ、１及びｍはそれぞれ独立にゼロ又は１〜５の整数であり、 ｐはそれぞれゼロ又は１であり、 Ｒ^hはＯＨ、ＮＨ₂又は−ＮＨＬｙｓＮＨ₂であり、そして Ｒⁱは水素又はＣＯＣＨ₃である。 １３．該複合体の存在が、電気泳動における該複合体の泳動と同様の条件下での 該核酸類似体の泳動とを比較することにより検出されるものである、請求項１記 載の方法。 １４．核酸類似体が一つ以上の検出可能な標識を保持するも のである、請求項１〜請求項３いずれか１項に記載の方法。 １５．核酸の増幅を実施する方法であって、核酸にそれに配列特異的にハイブリ ダイズする核酸類似体をハイブリダイズさせることにより核酸試料中の核酸の特 定領域を保護し、該特定領域を除き試料中の核酸を分解する核酸攻撃試薬に該試 料を接触させ、生成する核酸と核酸類似体との複合体を変性させ、そして該特定 領域を増幅することを含んでなる方法。 １６．核酸増幅法の反応産物を調製する方法であって、核酸とそれに配列選択的 にハイブリダイズする核酸類似体との間の複合体の形成により核酸増幅産物の特 定領域を保護し、ついで該核酸を核酸攻撃試薬に接触させることを含む方法であ って、該複合体が該試薬による攻撃に対しもとの該核酸よりもより安定である方 法。 １７．保護対象となる該特定領域が該増幅手順の繰り返しに必要な少なくとも１ 個のプライマー結合部位をも含まないものである、請求項１６記載の方法。 １８．核酸類似体が、相補的配列の核酸にハイブリダイズして、配列上該類似体 に対応する通常のデオキシリボヌクレオチドと該核酸との間のハイブリッドより も熱変性に対してより安定なハイブリッドを形成することができるものである、 請求項１５〜請求項１７いずれか１項に記載の方法。 １９．核酸類似体がそのバックボーンがポリアミドバックボーンであるペプチド 核酸であり、該リガンドがそれぞれ直接的に又は間接的に該バックボーン中のア ザ窒素原子に結合しており、そして該リガンドを保持する窒素原子が主として該 バックボーン中で４〜８個の介入原子により相互に隔てられているものである、 請求項１５〜請求項１８いずれか１項に記載の方法。 ２０．核酸類似体が一方の鎖が該類似体に相補的な配列を有する二本鎖核酸にハ イブリダイズして、該一方の鎖から他方の鎖を置換することができるものである 、請求項１５〜請求項１９いずれか１項に記載の方法。 ２１．核酸類似体が一般式１を有するものである、請求項１５〜請求項２０いず れか１項に記載の方法、 式中、 ｎは少なくとも２であり、 Ｌ¹〜Ｌⁿはそれぞれ独立に、水素、水酸基、（Ｃ₁〜Ｃ₄）アルカノイル基、天然 に生ずる核酸塩基類、天然に生じない核酸塩基類、芳香族部分、ＤＮＡインター カーレーター類、核酸塩基結合基、複素環部分、及びレポーターからなる群より 選択されるものであり、 Ｃ¹〜Ｃⁿはそれぞれ（ＣＲ⁶Ｒ⁷）ｙであり、ここでＲ⁶は水素であり、Ｒ⁷は天然 に生ずるαアミノ酸類の側鎖からなる群より選択されるものであり、又はＲ⁶と Ｒ⁷は独立に水素、（Ｃ₁〜Ｃ₆）アルキル基、アリール基、アラルキル基、ヘテ ロアリール基、水酸基、（Ｃ₁〜Ｃ₆）アルコキシ基、（Ｃ₁〜Ｃ₆）アルキルチオ 基、ＮＲ³Ｒ⁴及びＳＲ⁵からなる群より選択されるものであり、ここでＲ³とＲ⁴ は以下に定義され、Ｒ⁵は水素、（Ｃ₁〜Ｃ₆）アルキル基、水酸基、アルコキシ 基、又はアルキルチオ−置換（Ｃ₁〜Ｃ₆）アルキル基であり、又はＲ⁶とＲ⁷は一 緒になって脂環系又は複素環系を作り、 Ｄ¹〜Ｄⁿはそれぞれ、（ＣＲ⁶Ｒ⁷）_zであり、ここでＲ⁶とＲ⁷は上記のように定 義され、 ｙ及びｚはそれぞれゼロ又は１〜１０の整数であり、ｙ＋ｚの和は２〜１０であ り、 Ｇ¹〜Ｇ^n-1はそれぞれ−ＮＲ³ＣＯ−、−ＮＲ³ＣＳ−、−ＮＲ³ＳＯ−、又は− ＮＲ³ＳＯ₂−でありいずれの方向でもよく、ここでＲ³は以下に定義され、 Ａ¹〜Ａⁿ及びＢ¹〜Ｂⁿはそれぞれ以下のものから選択される、 （ａ）Ａは式(IIa)、(IIb)、(IIc)又は(IId)の群であり、かつＢはＮ又はＲ³Ｎ⁺ であり、又は （ｂ）Ａは式(IId)の群であり、かつＢはＣＨであり、 式中、 ＸはＯ、Ｓ、Ｓｅ、ＮＲ³、ＣＨ₂又はＣ（ＣＨ₃）₂であり、 Ｙは単結合、Ｏ、Ｓ又はＮＲ⁴であり、 ｐとｑはそれぞれゼロ又は１〜５の整数であり、ｐ＋ｑの和は１０以下であり、 ｒとｓはそれぞれゼロ又は１〜５の整数であり、ｒ＋ｓの和は１０以下であり、 Ｒ¹とＲ²はそれぞれ独立に水素、ヒドロキシ−，アルコキシ−，又はアルキルチ オ−で置換されていてもよい（Ｃ₁〜Ｃ₄）アルキル基、水酸基、アルコキシ基、 アルキルチオ基、アミノ基及びハロゲンからなる群より選択されるものであり、 そして Ｒ³及びＲ⁴はそれぞれ独立に水素、（Ｃ₁〜Ｃ₄）アルキル基、ヒドロキシ−，ア ルコキシ−又はアルキルチオ−置換（Ｃ₁〜Ｃ₄）アルキル基、水酸基、アルコキ シ基、アルキルチオ基及びアミノ基からなる群から選択されるものであり、 Ｑは−ＣＯ₂Ｈ、−ＣＯＮＲ’Ｒ”、−ＳＯ₃Ｈ又は−ＳＯ₂ＮＲ’Ｒ”、又は− ＣＯ₂Ｈ又は−ＳＯ₃Ｈの活性誘導体であり、及び Ｉは−ＮＲ’Ｒ''であり、ここでＲ’及びＲ''は独立に水素、アルキル基、アミ ノ保護基、レポーターリガンド、インターカーレーター、キレーター、ペプチド 、タンパク質、炭水化物、リピド、ステロイド、ヌクレオシド、ヌクレオチド、 ヌクレオシド二リン酸、ヌクレオシド三リン酸、オリゴリボヌクレオチドとオリ ゴデオキシリボヌクレオチドの両者を含むオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオ シド、及び可溶性及び不溶性ポリマーからなる群より選択されるものである。 ２２．該核酸類似体が一般式III、IV又はＶの化合物を含ん でなるものである、請求項２１記載の方法、 式中、Ｌはそれぞれ独立に水素、フェニル、複素環部分、天然に生ずる核酸塩基 、及び天然に生じない核酸塩基からなる群より選択されるものであり、 Ｒ⁷はそれぞれ独立に水素及び天然に生ずるαアミノ酸の側鎖からなる群より選 択されるものであり、 ｎは１より大きな整数であり、 ｋ、１及びｍはそれぞれ独立にゼロ又は１〜５の整数であり、 ｐはそれぞれゼロ又は１であり、 Ｒ^hはＯＨ、ＮＨ₂又は−ＮＨＬｙｓＮＨ₂であり、そして Ｒⁱは水素又はＣＯＣＨ₃である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 オルム，ヘンリック デンマーク国 ヴァルロース デーカー− 3500 ハレスコフビー，ヴィルドロスヴェ イ ３ (72)発明者 ジョーゲンセン，ミケル デンマーク国 グロストラップ デーカー −2600 イーバス アール 19 (72)発明者 バスボール，オーレ デンマーク国 バークロッド デーカー− 3460 ピー．オー．ボックス 108，カー ル プロウグスヴェイ 65

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．核酸の特定領域を試薬による攻撃から保護する方法であって、この核酸に配 列特異的にハイブリダイズする核酸類似体とこの核酸との間に複合体を形成させ 、ついで該核酸を核酸攻撃試薬と接触させることを含んでなる方法であり、該複 合体が該出発核酸よりも該試薬による攻撃に対しより安定である方法。 ２．該試薬がヌクレアーゼである、請求項１記載の方法。 ３．この核酸類似体が、連結バックボーン部分より構成されるバックボーンに結 合したリガンドの配列を含むポリマー鎖を含み、かつ相補的配列の核酸とハイブ リダイズすることができるものである、請求項１又は請求項２記載の方法。 ４．該核酸類似体バックボーンがポリアミド、ポリチオアミド、ポリスルフィン アミド又はポリスルホンアミドのバックボーンである、請求項３記載の方法。 ５．該連結バックボーン部分がペプチド結合したアミノ酸部分である、請求項４ 記載の方法。 ６．核酸類似体が相補的配列の核酸とハイブリダイズして、配列上該類似体に対 応する通常のデオキシリボヌクレオチド と該核酸との間のハイブリッドよりも熱変性に対してより安定なハイブリッドを 形成することができるものである、請求項１〜請求項５いずれか１項に記載の方 法。 ７．該核酸類似体がそのバックボーンがポリアミドバックボーンであるペプチド 核酸であり、該リガンドが該バックボーン中のアザ窒素原子に直接的又は間接的 に結合しているものであり、そして該リガンドを保持する窒素原子が主として４ 〜８個の介入原子により該バックボーン中で相互に隔てられているものである、 請求項１〜請求項６いずれか１項に記載の方法。 ８．核酸類似体が一方の鎖が該類似体に相補的な配列を持つ二本鎖核酸にハイブ リダイズして該一方の鎖から他方の鎖を置換することができるものである、請求 項１〜請求項７いずれか１項に記載の方法。 ９．核酸類似体が下記一般式１を持つものである、請求項１〜請求項８いずれか １項に記載の方法、 式中、 ｎは少なくとも２であり、 Ｌ¹〜Ｌⁿはそれぞれ独立に、水素、水酸基、（Ｃ₁〜Ｃ₄）アルカノイル基、天然 に生ずる核酸塩基類、天然に生じない核酸塩基類、芳香族部分、ＤＮＡインター カーレーター類、核酸塩基結合基、複素環部分、及びレポーターリガンド類から なる群より選択されるものであり、 Ｃ¹〜Ｃⁿはそれぞれ（ＣＲ⁶Ｒ⁷）ｙであり、ここでＲ⁶は水素であり、Ｒ⁷は天然 に生ずるαアミノ酸類の側鎖からなる群より選択されるものであり、又はＲ⁶と Ｒ⁷は独立に水素、（Ｃ₂〜Ｃ₆）アルキル基、アリール基、アラルキル基、ヘテ ロアリール基、水酸基、（Ｃ₁〜Ｃ₆）アルコキシ基、（Ｃ₁〜Ｃ₆）アルキルチオ 基、ＮＲ³Ｒ⁴及びＳＲ⁵からなる群より選択されるものであり、ここでＲ³とＲ⁴ は以下に定義され、Ｒ⁵は水素、（Ｃ₁〜Ｃ₆）アルキル基、水酸基、アルコキシ 基、又はアルキルチオ−置換（Ｃ₁〜Ｃ₆）アルキル基であり、又はＲ⁶とＲ⁷は一 緒になって脂環系又は複素環系を作り、 Ｄ¹〜Ｄⁿはそれぞれ、（ＣＲ⁶Ｒ⁷）_zであり、ここでＲ⁶とＲ⁷は上記のように定 義され、 ｙ及びｚはそれぞれゼロ又は１〜１０の整数であり、ｙ＋ｚの和は２〜１０であ り、 Ｇ¹〜Ｇ^n-1はそれぞれ−ＮＲ³ＣＯ−、−ＮＲ³ＣＳ−、−ＮＲ³ＳＯ−、又は− ＮＲ³ＳＯ₂−であり、いずれの方向でもよく、ここでＲ³は以下に定義され、 Ａ¹〜Ａⁿ及びＢ¹〜Ｂⁿはそれぞれ以下のものから選択される、 （ａ）Ａは式(IIa)、(IIb)、(IIc)又は(IId)の群であり、かつＢはＮ又はＲ³Ｎ⁺ であり、又は （ｂ）Ａは式(IId)の群であり、かつＢはＣＨであり、 式中、 ＸはＯ、Ｓ、Ｓｅ、ＮＲ³、ＣＨ₂又はＣ（ＣＨ₃）₂であり、 Ｙは単結合、Ｏ、Ｓ又はＮＲ⁴であり、 ｐとｑはそれぞれゼロ又は１〜５の整数であり、ｐ＋ｑの和 は１０以下であり、 ｒとｓはそれぞれゼロ又は１〜５の整数であり、ｒ＋ｓの和は１０以下であり、 Ｒ¹とＲ²はそれぞれ独立に、水素、ヒドロキシ−，アルコキシ−，又はアルキル チオ−で置換されていてもよい（Ｃ₁〜Ｃ₄）アルキル基、水酸基、アルコキシ基 、アルキルチオ基、アミノ基及びハロゲンからなる群より選択されるものであり 、そして Ｒ³及びＲ⁴はそれぞれ独立に、水素、（Ｃ₁〜Ｃ₄）アルキル基、ヒドロキシ−， アルコキシ−，アルキルチオ−置換（Ｃ₁〜Ｃ₄）アルキル基、水酸基、アルコキ シ基、アルキルチオ基及びアミノ基からなる群から選択されるものであり、 Ｑは−ＣＯ₂Ｈ、−ＣＯＮＲ’Ｒ”、−ＳＯ₃Ｈ又は−ＳＯ₂ＮＲ’Ｒ”、又は− ＣＯ₂Ｈ又は−ＳＯ₃Ｈの活性誘導体、及び Ｉは−ＮＲ’Ｒ''であり、ここでＲ’及びＲ''は独立に水素、アルキル基、アミ ノ保護基、レポーターリガンド、インターカーレーター、キレーター、ペプチド 、タンパク質、炭水化物、リピド、ステロイド、ヌクレオシド、ヌクレオチド、 ヌクレオシド二リン酸、ヌクレオシド三リン酸、オリゴリボヌクレオチドとオリ ゴデオキシリボヌクレオチドの両者を含むオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオ シド、及び可溶性及び不溶性ポリマーからなる群より選択されるものである。 １０．該核酸類似体が一般式III、IV又はＶの化合物を含むものである、請求項 ９記載の方法、 式中、 Ｌはそれぞれ独立に水素、フェニル基、複素環部分、天然に生ずる核酸塩基、及 び天然に生じない核酸塩基からなる群より選択されるものであり、 Ｒ⁷はそれぞれ独立に水素及び天然に生ずるαアミノ酸の側鎖からなる群より選 択されるものであり、 ｎは１より大きな整数であり、 ｋ、１及びｍはそれぞれ独立にゼロ又は１〜５の整数であり、 ｐはそれぞれゼロ又は１であり、 Ｒ^hはＯＨ、ＮＨ₂又は−ＮＨＬｙｓＮＨ₂であり、そして Ｒⁱは水素又はＣＯＣＨ₃である。 １１．核酸試料中に存在するある配列を検出する方法であって、ハイブリダイゼ ーション条件下に、該核酸試料中に存在するときは該配列と配列選択的にハイブ リダイズすることができる核酸類似体に核酸試料を接触させて、該核酸類似体と 該配列を含む該核酸の領域との間に複合体を形成させ、つい で該核酸を、該核酸複合体の該配列が試薬の攻撃から保護されるが該核酸の残り の部分は分解されるような条件の下に、該核酸を分解することができる試薬と接 触させ、そして該複合体の存在を検出することを含む方法。 １２．該複合体の存在が、電気泳動における該複合体の泳動と同様の条件下での 該核酸類似体の泳動とを比較することにより検出されるものである、請求項１１ 記載の方法。 １３．核酸類似体が一つ以上の検出可能な標識を保持するものである、請求項１ １又は請求項１２記載の方法。 １４．該標識が蛍光標識又は放射標識である、請求項１１〜請求項１３いずれか １項に記載の方法。 １５．核酸の増幅を実施する方法であって、核酸にそれに配列特異的にハイブリ ダイズする核酸類似体をハイブリダイズさせることにより核酸試料中の核酸の特 定領域を保護し、該特定領域を除き試料中の核酸を分解する核酸攻撃試薬に該試 料を接触させ、そして該特定領域を増幅することを含んでなる方法。 １６．核酸増幅法による反応産物を作成する方法であって、核酸とそれに配列選 択的にハイブリダイズする核酸類似体との間の複合体の形成により核酸増幅産物 の特定領域を保護し 、ついで該核酸を核酸攻撃試薬に接触させることを含む方法であって、該複合体 が該試薬による攻撃に対しもとの該核酸よりもより安定である方法。 １７．保護対象となる該特定領域が該増幅手順の繰り返しに必要な少なくとも１ 個のプライマー結合部位をも含まないものである、請求項１６記載の方法。 １８．核酸類似体が、相補的配列の核酸にハイブリダイズして、配列上該類似体 に対応する通常のデオキシリボヌクレオチドと該核酸との間のハイブリッドより も熱変性に対してより安定なハイブリッドを形成することができるものである、 請求項１１〜請求項１７いずれか１項に記載の方法。 １９．核酸類似体がそのバックボーンがポリアミドバックボーンであるペプチド 核酸であり、該リガンドがそれぞれ直接的に又は間接的に該バックボーン中のア ザ窒素原子に結合しており、そして該リガンドを保持する窒素原子が主として該 バックボーン中で４〜８個の介入原子により相互に隔てられているものである、 請求項１１〜請求項１８いずれか１項に記載の方法。 ２０．核酸類似体が一方の鎖が該類似体に相補的な配列を有する二本鎖核酸にハ イブリダイズして、該一方の鎖から他方の鎖を置換することができるものである 、請求項１１〜請求 項１９いずれか１項に記載の方法。 ２１．核酸類似体が一般式１を有するものである、請求項１１〜請求項２０いず れか１項に記載の方法、 式中、 ｎは少なくとも２であり、 Ｌ¹〜Ｌⁿはそれぞれ独立に、水素、水酸基、（Ｃ₁〜Ｃ₄）アルカノイル基、天然 に生ずる核酸塩基類、天然に生じない核酸塩基類、芳香族部分、ＤＮＡインター カーレーター類、核酸塩基結合基、複素環部分、及びレポーター類からなる群よ り選択されるものであり、 Ｃ¹〜Ｃⁿはそれぞれ（ＣＲ⁶Ｒ⁷）ｙであり、ここでＲ⁶は水素であり、Ｒ⁷は天然 に生ずるαアミノ酸類の側鎖からなる群より選択されるものであり、又はＲ⁶と Ｒ⁷は独立に水素、（Ｃ₂〜Ｃ₆）アルキル基、アリール基、アラルキル基、ヘテ ロアリール基、水酸基、（Ｃ₁〜Ｃ₆）アルコキシ 基、（Ｃ₁〜Ｃ₆）アルキルチオ基、ＮＲ³Ｒ⁴及びＳＲ⁵からなる群より選択され るものであり、ここでＲ³とＲ⁴は以下に定義され、Ｒ⁵は水素、（Ｃ₁〜Ｃ₆）ア ルキル基、水酸基、アルコキシ基、又はアルキルチオ−置換（Ｃ₁〜Ｃ₆）アルキ ル基であり、又はＲ⁶とＲ⁷は一緒になって脂環系又は複素環系を作り、 Ｄ¹〜Ｄⁿはそれぞれ、（ＣＲ⁶Ｒ⁷）_zであり、ここでＲ⁶とＲ⁷は上記のように定 義され、 ｙ及びｚはそれぞれゼロ又は１〜１０の整数であり、ｙ＋ｚの和は２〜１０であ り、 Ｇ¹〜Ｇ^n-1はそれぞれ−ＮＲ³ＣＯ−、−ＮＲ³ＣＳ−、−ＮＲ³ＳＯ−、又は− ＮＲ³ＳＯ₂−でありいずれの方向でもよく、ここでＲ³は以下に定義され、 Ａ¹〜Ａⁿ及びＢ¹〜Ｂⁿはそれぞれ以下のものから選択される、 （ａ）Ａは式(IIa)、(IIb)、(IIc)又は(IId)の群であり、かつＢはＮ又はＲ³Ｎ⁺ であり、又は （ｂ）Ａは式(IId)の群であり、かつＢはＣＨであり、 式中、 ＸはＯ、Ｓ、Ｓｅ、ＮＲ³、ＣＨ₂又はＣ（ＣＨ₃）₂であり、 Ｙは単結合、Ｏ、Ｓ又はＮＲ⁴であり、 ｐとｑはそれぞれゼロ又は１〜５の整数であり、ｐ＋ｑの和は１０以下であり、 ｒとｓはそれぞれゼロ又は１〜５の整数であり、ｒ＋ｓの和は１０以下であり、 Ｒ¹とＲ²はそれぞれ独立に水素、ヒドロキシ−，アルコキシ−，又はアルキルチ オ−で置換されていてもよい（Ｃ₁〜Ｃ₄）アルキル基、水酸基、アルコキシ基、 アルキルチオ基、アミノ基及びハロゲンからなる群より選択されるものであり、 そして Ｒ³及びＲ⁴はそれぞれ独立に水素、（Ｃ₁〜Ｃ₄）アルキル基、ヒドロキシ−，ア ルコキシ−，アルキルチオ−置換（Ｃ₁〜Ｃ₄）アルキル基、水酸基、アルコキシ 基、アルキルチオ基及びアミノ基からなる群から選択されるものであり、 Ｑは−ＣＯ₂Ｈ、−ＣＯＮＲ’Ｒ”、−ＳＯ₃Ｈ又は−ＳＯ₂ＮＲ’Ｒ”、又は− ＣＯ₂Ｈ又は−ＳＯ₃Ｈの活性誘導体であり、及び Ｉは−ＮＲ’Ｒ''であり、ここでＲ’及びＲ''は独立に水素、アルキル基、アミ ノ保護基、レポーターリガンド、インターカーレーター、キレーター、ペプチド 、タンパク質、炭水化物、リピド、ステロイド、ヌクレオシド、ヌクレオチド、 ヌクレオシド二リン酸、ヌクレオシド三リン酸、オリゴリボヌクレオチドとオリ ゴデオキシリボヌクレオチドの両者を含むオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオ シド、及び可溶性及び不溶性ポリマーからなる群より選択されるものである。 ２２．該核酸類似体が一般式III、IV又はＶの化合物を含んでなるものである、 請求項２１記載の方法、 式中、 Ｌはそれぞれ独立に水素、フェニル、複素環部分、天然に生ずる核酸塩基、及び 天然に生じない核酸塩基からなる群より選択されるものであり、 Ｒ⁷はそれぞれ独立に水素及び天然に生ずるαアミノ酸の側鎖からなる群より選 択されるものであり、 ｎは１より大きな整数であり、 ｋ、１及びｍはそれぞれ独立にゼロ又は１〜５の整数であり、 ｐはそれぞれゼロ又は１であり、 Ｒ^hはＯＨ、ＮＨ₂又は−ＮＨＬｙｓＮＨ₂であり、そして Ｒⁱは水素又はＣＯＣＨ₃である。 ２３．実施例３で実質的に既に記述したようにして核酸配列を検出する方法。 ２４．実施例３又は実施例４又は実施例５で実質的に既に記述したようにして、 攻撃試薬による消化から核酸を保護する方法。 ２５．実施例５で既に実質的に記述したようにして配列変異を検出する方法。