KR100221399B1 - 핵산의 보호 방법 및 분석 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 PNA 유형의 핵산 유사체를 핵산에 복합체화시켜, 핵산의 선택된 영역을 뉴클레아제의 공격으로부터 보호하는 방법에 관한 것이다. 생존 서열을 선택적으로 증폭시킨후, 분석법으로 검출할 수 있다. PCR 반응을 무력화시킬 수 있고, PNA 혼성화에 의해 그것의 생성물의 특정 영역을 보호하고, 비보호된 핵산을 뉴클레아제 분해시켜 그것의 생성물을 분석할 수 있다.

Description

핵산의 보호 방법 및 분석 방법
본 발명은 핵산을 공격, 예를 들어 뉴클레아제에 의한 공격으로부터 보호하는 방법 및 분석 방법에 관한 것이며, 특히, 관심있는 서열의 샘플을 함유하는 핵산의 존재를 검출하는 방법에 관한 것이다.
현재, 특정 염기 서열이 핵산의 샘플내에 존재하는 지를 결정하는 통상적인 방법은 필터 혼성화법이다. 핵산은 출발 물질로부터 추출되고, 정제된다. 핵산은 PCR과 같은 방법에 의해 증폭될 필요가 있을 수 있다. 그 후, 핵산은 필터상에서 단일가닥 형태로 고정되고, 검출하려는 핵산의 서열에 상보적인 서열을 갖는 표지된 올리고뉴클레오티드로 프로빙된다. 고정되기 전에, 핵산은 분자량이 상이한 핵산 단편을 분리시키기 위해 겔상에서 조작될 수 있다. 이것이 광범위하게 사용되는 서던 블롯법이다. 이 방법은 많은 결점을 갖는다. 핵산은 기타 물질로부터 분리될 필요가 있다. 핵산이 DNA 인 경우에, 보통은 변성 단계를 거칠 필요가 있을 것이다. 허위포지티브를 방지하고, 유사한 서열 사이의 바람직한 식별 수준을 달성하기 위해, 혼성화의 스트링젠시(stringency) 조건은 신중한 조정을 필요로 할 것이다. 필터 혼성화법의 제한된 신호 대 잡음으로 인해, 검출하기에 충분한 관심 서열을 생성시키기 위해서는 증폭 단계가 종종 필요할 것이다. 이는 허위 네거티브의 생성을 위한 많은 기회를 발생시킨다.
제 WO 92/20703호에는 검정 방법 및 진단학 분야에서 중요한 새로운 이용성을 갖는 핵산 유사체가 기재되어 있다. 이들 핵산 유사체는 진단학 분야 뿐만 아니라 앤티센스 치료학 분야에서 이들을 특히 중요시 여기게 하는 다수의 새로운 특성을 지녔다. 본원에서는, 이러한 핵산 유사체가 "PNA"로 언급된다.
전형적으로, 이들은 핵산 염기인 리간드의 서열을 함유하는 폴리아미드 골격을 특징으로 한다. 상기 문헌에 기재된 유사체는 상보적인 서열을 갖는 천연 핵산에 높은 특이성 및 안정성을 가지면서 혼성화되는 특성을 갖는다.
본 발명자들은, 이러한 핵산 유사체가 이들이 혼성화되는 단일 가닥 핵산의 서열이, 시약이 단일 가닥 핵산의 분해를 생성시키기에 보통 효과적일 환경 및 조건하에서, 특정 시약에 의해 분해되는 것으로부터 보호하는 추가의 가치있는 특성을 지닌다는 것을 현재 발견하였다. 일반적으로, 핵산 유사체와 비-혼성화되는 핵산의 영역은 분해될 수 있다.
따라서, 본 발명은 핵산과 이 핵산의 서열 선택적 방식으로 혼성화되는 핵산 유사체의 복합체를 형성시키고, 상기 핵산을 핵산 공격 시약에 노출시키는 것을 포함하여, 핵산의 선택된 영역을 시약에 의해 공격으로부터 보호하는 방법으로서, 복합체가 출발 핵산 보다 시약에 의한 공격에 더 안정한 방법을 제공한다.
핵산은 RNA 또 DNA일 수 있다.
바람직하게는, 시약은 뉴클레아제이며, 상기 핵산을 완전 분해시키거나 특정 위치에서 절단함으로써 분해시킬 수 있다.
가장 간단한 경우에, 보호하려는 핵산의 선택된 영역은 핵산 유사체가 혼성화되는 핵산 서열에 의해 구성될 것이다. 그러나, 공격 시약이 사용되는 조건하에서 5' 말단 및 3' 말단으로부터 작용함으로써 핵산을 분해시킬 수 있는 엑소뉴클레아제인 경우에, 각각의 핵산 유사체를 선택된 영역의 각각의 말단에 위치시켜서 선택된 영역의 일부를 두 핵산 유사체 서열 사이에 비혼성화된 상태로 남겨둠으로써 선택된 영역이 보다 넓게 보호될 수 있다. 선택된 영역의 사이에 있는 부분은 엑소뉴클레아제의 접근으로부터 보호된다. 엑소뉴클레아제가 사용되는 조건하에서 단지 5' 또는 3' 말단으로부터 공격할 수 있는 경우에, 핵산 유사체에 대해 각각 3' 또는 5'에 있는 핵산의 모든 부분이 보호될 수 있다.
엔도뉴클레아제가 공격 시약으로서 사용되는 경우에, 핵산 상에서 서로 근접하게 위치한 두 핵산 유사체 올리고머 사이에 비혼성화된 채로 노출된 핵산의 짧은 스트레치는, 두 핵산 유사체 서열의 말단 염기 사이의 상호 작용에 의해 또는 핵산 유사체에 의한 엔도뉴클레아제의 활성의 간섭으로 인해, 보호되는 선택된 영역의 일부를 형성시킬 수 있다.
핵산 유사체는 결합된 골격 부분으로 구성된 골격에 결합되는 리간드의 서열을 포함하는 중합체 가닥을 포함하는 것이 바람직하며, 이 유사체는 상보적인 서열을 갖는 핵산에 혼성화될 수 있다.
상기 핵산 유사체 골격은 폴리아미드, 폴리티오아미드, 폴리술핀아미드 또는 폴리술폰아미드 골격인 것이 바람직하다.
바람직하게는, 상기 결합된 골격 부분은 펩티드 결합된 아미노산 부분이다.
바람직하게는, 핵산 유사체가 상보적인 서열을 갖는 핵산에 혼성화되어, 상기 유사체에 서열이 상응하는 통상의 데옥시리보뉴클레오티드와 상기 핵산의 혼성체 보다 열에 의한 변성에 더 안정한 혼성체를 형성시킬 수 있다.
핵산 유사체는, 골격이 폴리아미드 골격이고, 각각의 리간드가 상기 골격내의 아자 질소 원자에 직접 또는 간접 결합되어 있고, 주로 질소 원자를 함유하는 상기 리간드가 4개 내지 8개의 간섭 원자에 의해 상기 골격내에서 서로에 대해 분리되는 펩티드 핵산인 것이 바람직하다.
핵산 유사체가 이 유사체에 상보적인 서열을 갖는 한 가닥으로부터 나머지 한 가닥을 대체시키는 방식으로 이중 가닥 핵산에 혼성화될 수 있는 것이 또한 바람직하다.
바람직하게는, 핵산 유사체는 하기 일반식(1)을 갖는다:
일반식(1) 상기 식에서, n은 2 이상이고, L1-Ln은 각각 수소, 히드록시, (C1-C4)알카노일, 천연 뉴클레오염기, 비천연 뉴클레오염기, 방향족 부분, DNA 인터칼레이터, 뉴클레오염기 결합 그룹, 헤테로고리 부분 및 리포터 리간드로 구성된 군으로부터 선택되지만, 일반적으로 하나 이상의 L은 뉴클레오염기 결합 그룹, 예를 들어 천연 뉴클레오염기일 것이며, 바람직하게는 그룹 L의 90이상이 이러한 뉴클레오염기 결합기일 것이고;
C1-Cn은 각각 (CR6R7)y이며,여기서, R6은 수소이고, R7은 천연 알파아미노산의 측쇄로 구성된 군으로부터 선택되거나, R6및 R7은 각각 수소, (C2-C6)알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴, 히드록시, (C1-C6)알콕시, (C1-C6)알킬티오, NR3R4및 SR5로 구성된 군으로부터 선택되며, 여기서, R3및 R4는 R3및 R4는 각각 수소, (C1-C4)알킬, 히드록시 또는 알콕시 또는 알칼티오 치환된 (C1-C4) 알킬, 히드록시, 알콕시, 알킬티오 및 아미노로 구성된 군으로부터 선택되고, R5는 수소, (C1-C6)알킬, 히드록시, 알콕시 또는 알칼티오 치환된 (C1내지 C6)알킬이거나, R6또는 R7은 함께 지환족 또는 헤테로고리계를 형성하고;
D1-Dn은 각각 (CR6R7)Z며,여기서, R6및 R7은 상기에 규정된 바와 같고;
y 및 z는 각각 0 또는 1 내지 10의 정수이고, y+z의 합은 2 내지 10(바람직하게는 2 보다 크고, 가장 바람직하게는 y 및 z가 각각 1 또는 2임)이고;
G1-Gn-1은 각각 어느 한 배향에서, -NR3CO-, NR3CS-, NR3SO-, 또는 NR3SO2-이며, 여기서, R3은 상기에 규정된 바와 같고;
Q는 -CO2H, -CONR'R", -SO3H 또는 -SO2NR'R", 또는 -CO2H 또는 -SO3H의 활성화된 유도체이고; 및
I는 -NR'R"이며, 여기서, R' 및 R"는 각각 수소, 알킬, 아미노 보호 그룹, 리포터 리간드, 인터칼레이터, 킬레이터, 펩티드, 단백질, 탄수화물, 지질, 스테로이드, 뉴클레오시드, 뉴클레오티드, 2인산 뉴클레오티드, 3인산 뉴클레오티드, 올리고리보뉴클레오티드 및 올리고데옥시리보뉴클레오티드를 모두 포함하는 올리고뉴클레오티드, 올리고뉴클레오시드, 및 가용성 및 불용성 중합체로 구성된 군으로부터 선택되고; 및
A1-An및 B1-Bn은 각각,
(a) A가 일반식 (11a), (11b), (11c) 또 (11d)이며, B가 N 또는 R3N+되거나;
(b) A가 일반식 (11d)의 그룹이고, B가 CH가 되도록 선택된다.
상기 식에서, X는 0, S, Se, NR3, CH2또는 C(CH3)2이고; Y는 단일 결합, 0, S 또는 NR4이고; p 또는 q 는 각각 0 또는 1 내지 5의 정수이고, p + q의 합은 10 이하이고; r 및 s는 0 또는 1 내지 5의 정수이고, r+s의 합은 10 이하이고; R1및 R2은 각각 수소, 히드록시 또는 알콕시 또는 알킬티오 치환될 수 있는 (C1-C4) 알킬, 히드록시, 알콕시, 알킬티오, 아미노 및 할로겐으로 구성된 군으로부터 선택된다.
보다 바람직하게는, 핵산 유사체가 하기 일반식(Ⅲ), (Ⅳ) 또는 (Ⅴ)의 화합물을 포함한다:
일반식(Ⅲ)
일반식(Ⅳ)
일반식(Ⅴ)
상기 식들에서, L은 각각 수소, 페닐, 헤테로고리성 부분, 천연 뉴클레오염기, 및 비천연 뉴클레오염기로 구성된 군으로부터 선택되고; R7은 각각 수소 및 천연 알파 아미노산의 측쇄로 구성된 군으로부터 선택되고; n은 1보다 큰 정수이고, k, I 및 m은 각각 0 또는 1내지 5의 정수이고; p는 각각 0 또는 1이고; Rh은 OH, NF2또는 -NHLysNH2이고; 및 Ri는 H 또는 -COCH3이다.
전술한 핵산의 보호 방법은 핵산 서열을 검출하는 방법에서 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 제 2 일면에서, 핵산 샘플내에서 특정 서열의 존재를 검출하는 방법을 포함하며, 이 방법은 핵산의 샘플을, 혼성화 조건하에 상기 핵산 샘플 중의 상기 서열(존재하는 경우)에 서열 선택적 방식으로 혼성화될 수 있는 핵산 유사체에 노출시켜서, 상기 핵산 유사체와 상기 서열을 함유하는 핵산의 영역의 복합체를 형성시키고, 상기 핵산의 나머지 부분이 분해되는 동안에는 상기 복합체를 형성하는 상기 핵산의 영역이 시약의 공격으로부터 보호되도록 하는 조건하에 상기 핵산을 이 핵산을 분해시킬 수 있는 시약에 노출시키며, 상기 복합체의 존재를 검출하는 것을 포함한다.
상기 복합체의 존재를 검출하는 다수의 방법이 있을 것이다. 이들 방법은 복합체를 그 자체로 검출하는 방법 및 복합체를 핵산 및 핵산 유사체의 성분으로 파괴시켜서, 핵산 또는 핵산 유사체의 존재를 검출하는 방법으로 이분된다. 복합체의 존재는 핵산의 잔존으로부터 유추될 수 있다.
방법의 제 1 그룹에서는, 핵산 유사체 및 핵산/핵산 유사체 혼성체의 특성의 차이가 신뢰될 수 있다. 따라서, 바람직하게는, 상기 복합체의 존재는 전기영동에서의 상기 복합체의 이동을 유사한 조건하의 상기 핵산 유사체의 이동과 비교함으로써 검출된다.
바람직하게는, 핵산 유사체 또는 핵산이 검출성 표지를 함유하며, 핵산 유사체에 대한 적당한 표지로는 형광 표지, 방사성 표지, 효소 표지, 비오틴, 스핀(spin) 표지, 화학발광 표지, 항원 표지 또는 항체 표지가 있다. 이들 중에서, 플루오로포어(fluorophore) 또는 방사성 이소토프를 표지로 사용하는 것이 가장 바람직하지만, 일반적으로 펩티드에 적용가능한 모든 표지 방법이 사용될 수 있다.
본 발명의 제 2 일면의 바람직한 실시에 있어서, 핵산 유사체는, 핵산 유사체를 표지시키는 방법에 의해 생성된 표지된 핵산 유사체이며, 표지 방법은 핵산 유사체에 표지 반응에서 효소에 대한 기질로서 작용할 수 있는 펩티드 모티프를 제공하고, 핵산 유사체의 펩티드 모티프를 효소의 영향하에 상기 표지 공급원과 반응시키는 것을 포함하는 상기 표지 반응을 수행하는 것을 포함한다.
바람직하게는, 상기 표지는 방사성 표지이다.
표지의 공급원은 방사성 표지된 ATP 인 것이 바람직하다.
상기 효소는 단백질 키나아제인 것이 바람직하다.
바람직하게는, 펜티드 모티프가 켐프티드 모티프이다.
바람직하게는, 표지 반응이 상기 펩티드 모티프의 세린 잔기에서의 인산화이다.
핵산 유사체를 표지시키는 대안적인 방법은, 바람직하게는 핵산 유사체의 한 쪽 말단에 킬레이티화에 의해 하나 이상의 금속 이온과 결합할 수 있는 킬레이팅 부분을 제공하고, 방사성이소토프 또는 플루오로포어를 상기 킬레이팅 부분에 직접 또는 간접 킬레이트화시키는 것을 포함한다. 예를 들어, 유로피움(europium) 이온은, 핵산 유사체에 함유된 적당한 킬레이팅 부분에 의해 킬레이트화되어, 형광 표지로서 작용할 수 있다.
이러한 제 1 그룹에서의 또 다른 검출 방법은 결합하지 않을 두 핵산 유사체를 결합시키는 수단으로서 작용하도록 보호되는 핵산 서열을 사용하는 것이다. 두 핵산 유사체가 각각 상이한 유형의 표지를 함유하는 경우에, 두 표지의 결합이 검출될 수 있다. 예로서, 두 핵산 유사체 올리고머가 표적 핵산 서열의 각각의 말단에 혼성화되어 보다 넓은 핵산 서열의 부분을 형성시킬 수 있다. 하나의 핵산 유사체는 고체상, 예를 들어 His5와 같은 킬레이팅 펩티드 모티프에 결합하기에 적당한 부분으로 표지된다. 나머지 하나에는, 검출성 표지가 제공되며, 예를 들어 방사성 표지된다. 비보호되는 핵산의 분해후, 두 핵산 유사체 서열은 표적 핵산 서열로의 혼성화에 의해 결합된 채로 남아 있는다. 복합체는 킬레이트성 니켈 이온을 함유하는 고체 지지체상에서 제 1 핵산 유사체에 의한 킬레이트화에 의해 포획될 수 있다. 방사성 표지된 과량의 제 2 핵산 유사체는 세척될 수 있고, 표지된 제 2 핵산 유사체의 방사활성은 고체 지지체상에서 또는 지지체로부터 용출된 후에 검출될 수 있다.
그 밖의 예에서는, 하나의 핵산 유사체가 고체상에 결합하기에 적당한 부분으로서 킬레이팅 펩티드 모티프 대신에 비오틴을 함유하며, 제 2 핵산 유사체가 검출성 표지, 예를 들어 효소 또는 플루오로포어에 결합된 것이 있을 것이다. 검출성 표지가 검출성 생성물의 생성의 촉매화할 수 있는 효소인 경우에, 검정은 면역검정에서 잘 정립된 ELISA 원리와 유사하다.
비혼성화된 핵산 유사체로부터 혼성체를 분리하기 위한 대안적인 수단으로는 역상 또는 이온 교환 크로마토그래피 또는 겔 여과가 있다. 온전한 핵산에 특이성을 갖는 항체 또는 핵산/핵산 유사체 혼성체에 대해 특이성을 갖는 항체를 사용하는 항체 선택 방법이 사용될 수 있다.
검출 방법의 제 2 그룹에서는, 핵산과 핵산 유사체의 복합체가 변성되고, 보호되는 핵산 서열의 잔존이 공지된 핵산 서열 검출 방법, 예를 들어 혼성화 검정에 의해 적당하게 입증된다. 임의로, 핵산 서열은 증폭 과정을 거칠 수 있다. 짧게 보호되는 서열의 증폭에는 LCR이, 보다 긴 서열의 증폭에는 PCR이 일반적으로 바람직하다.
핵산 증폭 방법, 특히 널리 공지된 PCR 방법에서는, 증폭하려는 표적 서열이 대량의 다른 핵산 중에 존재하는 경우에 종종 난관에 부딪힌다.
상기 기재된 바와 같이, 본 발명은 표적 서열 이외에 존재하는 모든 핵산을 분해시킴으로써 핵산 샘플을 "정화하는(cleaning up)" 용이한 수단을 제공하여, 검정 목적 또는 예비 목적과 무관하게 증폭이 보다 용이하게 수행되게 한다.
따라서, 본 발명은 제 3 일면에서 핵산 증폭을 수행하는 방법을 제공하며, 이 방법은 서열 특이적 방법으로 핵산에 혼성화되는 핵산 유사체를 상기 핵산에 혼성화시킴으로써 핵산 샘플내의 핵산의 선택된 영역을 보호하고, 상기 샘플을 핵산 공격 시약에 노출시켜 상기 선택된 영역 이외의 샘플내의 핵산을 분해시키고, 상기 선택된 영역을 증폭시키는 것을 포함한다.
증폭을 위해 보호되는 서열을 유리시키기 위해, 핵산/핵산 유사체 혼성체가 열에 의해 변성될 수 있다. 현재 공지된 모든 방법, 예를 들어 PCR 및 이것의 변형법, LCR 및 3SR을 포함하는 모든 증폭 방법이 사용될 수 있다.
제 WO 93/25706호 (PCT/EP93/01435)에는, 임의의 증폭이 증폭가능한 표적으로서 작용하지 못하게 하는 핵산 유사체를 증폭 생성물에 혼성화시킴으로써 핵산 증폭을 무력화시키는 방법이 기재되어 있다. 이것은, 증폭의 반복에 필요한 하나 이상의 프라이머 결합 부위를 배제하는 증폭 생성물의 영역을 본 발명의 제 1 일면에 따른 방법에 의해 보호시키고, 증폭 생성물의 프라이머 결합 부위를 포함하는 잔여 핵산을 분해시키고, 상기 논의된 바와 같이 보호되는 핵산의 잔존을 검출함으로써 본 발명의 제 4 일면에 따라 추가로 개선될 수 있다. 바람직하게는, 모든 프라이머 결합 서열의 일부가, 보다 바랍직하게는, 전부가 분해된다.
핵산 유사체는 사용되는 온도가 핵산 이외의 핵산 유사체를 융해시킬 정도로 충분히 높은 경우에, PCR 방법 도중에 존재할 수 있거나, 증폭의 종결시에 첨가될 수 있다. 공격 시약은 증폭후에 첨가될 필요가 있을 것이지만, 밀폐된 증폭 장치내의 별도의 구획으로부터 첨가되어, 증폭된 생성물이 이탈되고 오염물이 될 기회를 갖지 못하게 할 수 있다.
본 발명은 첨부되는 도면을 참조로 하여 하기 실시예에 의해 예시될 것이다:
제1도는 실시예 3 내지 5의 결과를 도시하는 겔의 자동방사선사진이다.
본 발명에 사용하기에 특히 바람직한 고특이적 활성을 갖는 방사성표지를 함유하는 PNA를 제조하는 한 가지 편리한 방법은 본원과 동일자에 출원된 본 발명자들의 공동 계류중인 영국 특허 출원 제 9324956.3호(대리인 참고번호: P3685GB)에 기재되어 있다. 바람직한 형태의 이러한 방법에 따르면, 단백질 키나아제 A에 의해 매개되는32P ATP와의 반응을 거쳐서 세린 잔기에 결합된32P 표지를 획득하게 되는 말단 켐프티드 신장부를 갖는 PNA 가 제조된다. 출발 PNA 서열이 제 WO92/20703호에 기재된 Boc 고체상 합성을 이용함으로써 적당하게 고체 지지체상에 축적된 경우에, 바람직한 아미노산 서열의 펩티드 신장부를 갖는 PNA 가 당 분야에 잘 이해되어 있는 Boc 또는 Fmoc 고체상 기법에 의해 생성될 수 있다.
본 발명의 제 1 일면의 바람직한 형태에 따르면, 보호하려는 서열을 함유하는 핵산은 관심있는 서열에 상보적인 서열을 갖는 PNA 로 처리될 수 있다. 헥산이 DNA인 경우에, 핵산은 이중 가닥 형태일 수 있고, 이중 가닥 형태의 표적 서열은 혼성화되는 핵산 유사체의 능력이 신뢰될 수 있다. 그러나, 이중 가닥의 표적 DNA를, 보통, 가열에 의해 변성시키는 것이 필요할 수 있으며, 일반적으로 바람직할 것이다. DNA는 매우 불순할 수 있는데, 즉, 다른 세포 생성물이 존재할 수 있다. 또한, DNA는 세포로부터 추출된 전체 게놈 DNA 또는 전체 세포 RNA 일 수 있으며, 짧은 길이로 가수분해될 수 있다. DNA 또는 RNA는 또한 핵산 증폭 방법, 예를 들어 LCR 또는 PCR 또는 NASBA(3SR) 증폭의 생성물일 수 있다. 표적 DNA 가 이중가닥이라고 하더라도, 바람직한 PNA는 고친화성을 가지면서 서열과 선택적으로 결합할 것이다. 그 후, 핵산 샘플이 뉴클레아제 또는 뉴클레아제 혼합물로 처리되어, PNA로의 혼성화에 의해 보호되지 않은 모든 핵산이 불해될 수 있다. PNA는, 핵산 샘플내에 하나의 정확한 서열이 존재하는 경우에, 이것이 혼성화되고, 보호될 것임을 보장하기 위해 매우 과량으로 존재할 수 있다.
반응 생성물은 핵산에 혼성화된 PNA를 비혼성화된 PNA와 분리시키기 위해, 겔상에서 또는 모세관내에서 전기영동될 수 있다. PNA가 전형적으로 말단 아민기에서 분자당 하나의 양 전하를 갖는 본질적으로 중성 분자이기 때문에, 전기영동 도중에 이동하는 경향을 거의 나타내지 않는다. 반면에, 핵산은 매우 음하전되어 있으며, PNA가 핵산 단편에 혼성화되면 음하전된 혼성체가 생성되어, 전기영동하에 PNA 자체에 대해 반대 방향으로 이동할 것이다. 이로 인해 혼성화되고 비혼성화된 PNA의 용이하고 고도로 특이적인 분리가 달성된다. PNA가 적당하게 표지되는 경우에, 극히 소량의 PNA가 검출될 수 있으며, 본 발명의 제 2 일면에 따른 분석 방법은 우수한 신호 대 잡음 비를 제공한다.
PNA는 단 하나의 잔기에 의해 달라지는 핵산 서열을 식별할 수 있다. 따라서, 전술한 방법은 게놈 DNA의 샘플이 특정 유전자내에 특정 대립 유전자 변이를 함유하는 지를 결정할 수 있는 매우 신속하고 간단한 검정의 가능성을 제공한다. 또한, 핵산에 혼성화되는 길이가 상이한 PNA가 전기영동하에서 용이하게 분리될 수 있기 때문에, 핵산 샘플을 다수의 PNA로 동시 프로빙시키고, 모든 비혼성화된 핵산을 분해시키며, 전기영동에 의해 모든 PNA/핵산 혼성체를 서로에 대해 및 비혼성화된 과량의 PNA와 분리시키는 가능성이 존재한다. 따라서, DNA 샘플이 가능하게는 상이한 유전자상에서, 예를 들면 병세 같은 특이한 표현형을 야기시키는 것과 같은 관심있는 대립 유전자 변이의 일부 특정 조합, 예를 들어 병세와 같은 특정 표현형을 야기시키는 것으로 밝혀진 조합을 함유한다는 것이 1회 검정으로 입증될 수 있다.
[PNA-켐프티드 키메라의 제조]
제 WO 92/20703호에 기재된 고체상 PNA 합성을 이용하여 서열 Boc-NH(CH2)5CONH-TG(Z)T.A(Z)C(Z)G(Z).TC(Z)A(Z).C(Z)A(Z)A(Z).C(Z)TA(Z)-CONH-수지를 축적하였다.
N 말단 Boc 기를 TFA로 처리하여 분리시키고, 링커인 6-아미노-헥사노산에 의한 켐프티드 모티프의 표준 boc 타입 고체상 펩티드 합성을 위한 출발점으로 사용하여 하기 키메라를 생성시켰다:
Boc-Leu-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Ala-Ser-(Bzl)-Leu-Gly-NH(CH2)5CONH-TG(Z)T.A(Z) C(Z)G(Z).TC(Z)A(Z).C(Z)A(Z)A(Z).C(Z)TA(Z)-CONH-수지.
보호 그룹을 분리시키고, 로우-하이(Low-High) TFMSA 방법에 의해 생성물을 수지로부터 절단시켰다. 미정제 생성물을 제조 HPLC에 의해 정제시켰다(A : 물중 TFA(MilliQTM) 0.1및 B : TFA 0.1, 물 10, 아세토니트릴 90의 구배로 용출되는 역상 C18). 정제된 키메라 PNA-켐프티드를 분석 HPLC 및 FAB-MS에 의해 특정화하였다.
[실시예 2]
[단백질 키나아제 A에 의한 켐프티드 모티프(Leu-Arg-Arg-Ala-Ser-Leu-Gly)의 방사성 표지화]
일반식 H-Leu-Arg-Arg-Ala-Ser-Leu-Gly-TGTACGTCACAACTA-NH2의 하기 성분을 함유하는 반응 혼합물내에서32P로 표지시켰다:
PNA-켐프티드, 10M ........................ 5
10 ×단백지 키나아제 A 완충액.............. 5
γ32P ATP (>5000 Ci/mmol; 50Ci/......... 10
단백질 키나아제 A(뵈링거; 5mU/).......... 0.2
H2O........................................ 30
반응물을 30에서 30분간 인큐베이팅시킨후, 65에서 10분간 인큐베이팅시킨 다음, 15000g에서 30초간 원심분리시켰다. 상등액을 새로운 에펜도르프 튜브에 옮겼다. 물을 1ml가 되도록 첨가시키고, 표지된 PNA-켐프티드를 DEAE 세파덱스(Sephadex) A-50TM음이온 교환 컬럼을 사용하는 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 비통합된 γ32P ATP와 분리시켰다.
PNA-켐프티드의 비방사능을 1 ×108cpm/PNA-켐프티드에서 평가하였다.
[실시예 3]
[ PNA 에 의한 보호를 통한 DNA 서열의 검출]
실시예 2에서 제조된 방사성 표지된 켐프티드 모티프를 함유하는 15량체 PNA를, 각각의 하기 핵산과 함께 15분가 개별적으로 인큐메이팅시켰다:
1. 없음 (제1도의 레인 1 참조).
2. 상보적인 DNA 15량체 (제1도의 레인 2 및 5 참조).
3. PNA 의 일부 서열에 상보적인 DNA 10량체 (제1도의 레인 3 참조).
4. 서열의 중심에 PNA 에 상보적인 15개의 염기 서열을 함유하는 DNA 40량체 5' CTAGAGGATCTAGTTGTGACGTACAGGATCTTTTTCATAG-3 (제1도의 레인 4 및 6 참조).
각각의 경우에, 10M의 올리고뉴클레오티드 용액 4를 30mM NaAc(pH 5.0), 50mM NaCl, 10mM ZnCl2및 55v/v의 글리세롤을 함유하는 반응물 부피 10중에서 표지된 PNA 5와 혼합시켰다. 실온에서 15분간 인큐베이팅시켰다.
40량체 DNA를 사용하는 두 반응중의 하나 및 15량체 DNA를 사용하는 두 반응중의 하나의 경우에, 15 단위의 녹두 뉴클레아제를 첨가시키고, 반응을 37에서 5분간 인큐베이팅시켰다.
모든 반응을 10의 로딩 완충액(30v/v 글리세롤, 0.25w/v 브로모페놀 블루, 0.25의 크실렌 시아놀, 0.01의 SDS)을 첨가시킴으로써 종결시키고, 반응 혼합물을 10폴리아크릴아미드 겔 내에서 전기영동시킨 후, 자동방사선사진법을 수행하였다.
결과를 제1도에 레인 1 및 6에 도시하였다. 레인 1에서는, 표지된 PNA 만이 조작되었고, 이것은 겔상에서 부동성이기 때문에, 아무것도 나타나지 않았다. 레인 2에서는, 표지된 PNA 가 15량체 DNA 에 혼성화되었고, 하나의 벤드가 혼성체에 대해 나타났다. 레인 3에서는, 표지된 PNA 가 10량체의 DNA 에 혼성화되었고, 생성된 밴드는 포함된 2개의 올리고 DNA 의 크기차로 인해, 이동 거리면에서 레인 2에서의 밴드와 명확히 구별될 수 있음을 알 수 있다. 레인 4에서는, PNA 가 40량체 DNA 에 혼성화되었고, 재차 겔상에서의 밴드의 이동 거리에 의해15PNA/10DNA 및15PNA/15DNA 혼성체와15PNA/40DNA 혼성체가 구별되어 졌다.
레인 5에서는,15PNA/15DNA 혼성체의 경우에서의 뉴클레아제 분해의 결과가 나타났다. 밴드는 뉴클레아제가 혼성화된 DNA를 분해시킬 수 없음을 나타내는 레인 2에서의 밴드와 동일하였다. 레인 6은15PNA/40DNA 혼성체의 뉴클레아제 분해의 결과를 나타내었다. 재차, 밴드는 레인 2에서와 동일하였으며, PNA 에 혼성화되는 DNA 의 부분만이 뉴클레아제로부터 보호됨을 나타내었다. 따라서, PNADP 상보적인 40량체 DNA 의 내부 15체 서열은 레인 6을 참조로 하여 전술한 방법에 의해 검출하였다.
[실시예 4]
[PNA 에 의한 뉴클레아제로부터의 RNA 의 보호]
켐프티드 모티프를 함유하는 PNA T10을 실시예 2에서와 같이 표지시켰다. 표지된 PNA를 하기 방법에 따라 폴리아데닐화 RNA의 혼합물과 함께 인큐베이팅시켰다. PNA(5)를, 기타 성분을 함유하는 반응 부피 10중에 및 실시예 3에서의 시간 및 온도 조건하에 시험관내에서 혼합된 RNA 전사체(Gibco BRL) 10mg/의 4와 함께 인큐베이팅시켰다. 유사한 인큐베이팅된 혼합물을 실시예 3에서와 같이 녹두 뉴클레아제와 함께 추가로 인큐베이팅시키고, 반응 혼합물을 제조하여, 실시예 3에서와 같이 전기영동 및 자동방사선사진법을 수행하였다. 결과를 제1도의 레인 7 및 레인 8에 나타내었다.
레인 7은 크기가 상이한 PNA/RNA 혼성체의 미분해된 사다리를 타나낸다. 레인 8에서는, 뉴클레아제가 PNA 에 의해 보호되는 A10부분에 대해 모든 RNA를 트리밍시킴으로써 사다리를 하나의 밴드로 분해시켰다.
[실시예 5]
[15량체 DNA 에서의 단일 염기쌍 변이의 검출]
실시예 3에 사용된 15량체 표지된 PNA를 하기와 같은 2가지의 상이한 온도 조건 둘 모두하에 2개의 상이한 DNA 에 혼성화시켰다.
표지된 PNA를 각각 50및 65의 인큐베이팅 온도에서 상보적인 15량체 DNA 에 혼성화시키고, 각각의 경우에, 그 온도에서 반응 혼합물을 녹두 뉴클레아제로 처리시켰다. 그 밖의 조건은 실시예 3과 동일하였다. 녹두 뉴클레아제를 후속 첨가하면서 동일한 두 온도에서 단일 염기 매스매치된(mismatched) 15량체 DNA 5'-TAGTTGCGACGTACA-3'을 사용하여 두 가지의 유사한 인큐베이팅을 수행하였다. 생성된 자동방사선사진을 제1도의 레인 9 내지 12에 도시하였다.
레인 9에서, 뉴클레아제로 분해시키면서 65에서 PNA를 이것에 완전 상보적인 DNA 에 혼성화시킨 결과는 PNA 에 의한 DNA 의 보호에 상응하는 하나의 벤드였다. 레인 10은 단일 염기 매스매치를 사용한 65에서의 혼성화의 결과를 도시한다. DNA는 보호되지 않았고, 혼성체도 나타나지 않았다. 레인 11은 완전 상보적 서열을 사용한 55에서의 실험 결과를 도시하고 있으며, 레인 12는 단일 미스매치를 사용한 55실험의 결과를 도시한다. 이들 두 레인 모두에게, 보호되는 DNA 가 검출되었다.
완전 매치된 15량체 혼성체에 대한 융점은 69였다. 이 융점에 근접하게 조작함으로써 부과된 스트링젠트 혼성화 조건하에서, PNA 는 완전 매치된 DNA와 융점이 61인 단일 염기 미스매치된 DNA를 식별하였다. 그러나, 55에서는, 혼성체의 융점으로부터 예측되는 바와 같이, 완전 매치 및 단일 염기 미스매치에 의해 혼성체가 형성되었다.

Claims (23)

  1. 샘플을 혼성화 조건하에 샘플 중의 서열에 서열 선택적 방식으로 혼성화될 수 있는 핵산 유사체에 노출시켜서, 핵산 유사체와 상기 서열을 함유하는 핵산의 복합체를 형성시키는 단계로서, 핵산 유사체가 결합된 골격 부분으로 구성된 폴리아미드, 폴리티오아미드, 폴리술핀아미드 또는 폴리술폰아미드 골격의 아자 질소 원자에 직접 또는 간접 결합된 리간드의 서열을 포함하는 중합체 가닥을 포함하며, 주로 질소 원자를 함유하는 상기 리간드가 4개 내지 8개의 간섭 원자에 의해 상기 골격내에서 서로에 대해 분리되는, 상기 핵산 서열에 혼성화될 수 있는 핵산 유사체인 단계, 핵산 나머지 부분이 분해되는 동안에는 핵산 복합체의 상기 서열이 뉴클레아제의 공격으로부터 보호되도록 하는 조건하에 핵산을 이 핵산을 분해시킬 수 있는 뉴클레아제에 노출시키는 단계, 및 핵산 유사체의 특성과는 상이한 핵산과 핵산 유사체의 복합체의 특성을 기초로 하여 복합체의 존재를 검출하는 단계를 포함하여, 샘플내 핵산 서열의 존재를 검출하는 방법.
  2. 샘플을 혼성화 조건하에 샘플 중의 서열에 서열 선택적 방식으로 혼성화될 수 있는 핵산 유사체에 노출시켜서, 핵산 유사체와 상기 서열을 함유하는 핵산의 복합체를 형성시키는 단계로서, 핵산 유사체가 결합된 골격 부분으로 구성된 폴리아미드, 폴리티오아미드, 폴리술핀아미드 또는 폴리술폰아미드 골격의 아자 질소 원자에 직접 또는 간접 결합된 리간드의 서열을 포함하는 중합체 가닥을 포함하며, 주로 질소 원자를 함유하는 상기 리간드가 4개 내지 8개의 간섭 원자에 의해 상기 골격내에서 서로에 대해 분리되는, 상기 핵산 서열에 혼성화될 수 있는 핵산 유사체인 단계, 핵산 나머지 부분이 분해되는 동안에는 핵산 복합체의 상기 서열이 뉴클레아제의 공격으로부터 보호되도록 하는 조건하에 핵산을 이 핵산을 분해시킬 수 있는 뉴클레아제에 노출시키는 단계, 핵산에 혼성화된 핵산 유사체의 복합체를 혼성화되지 않은 핵산 유사체와 분리시키는 단계, 및 복합체의 검출하는 단계를 포함하여, 샘플내 핵산 서열의 존재를 검출하는 방법.
  3. 샘플을 혼성화 조건하에 샘플 중의 서열에 서열 선택적 방식으로 혼성화될 수 있는 핵산 유사체에 노출시켜서, 핵산 유사체와 상기 서열을 함유하는 핵산의 복합체를 형성시키는 단계로서, 핵산 유사체가 결합된 골격 부분으로 구성된 폴리아미드, 폴리티오아미드, 폴리술핀아미드 또는 폴리술폴아미드 공격의 아자 질소 원자에 직접 또는 간접 결합된 리간드의 서열을 포함하는 중합체 가닥을 포함하며, 주로 질소 원자를 함유하는 상기 리간드가 4개 내지 8개의 간섭 원자에 의해 상기 골격내에서 서로에 대해 분리되는, 상기 핵산 서열에 혼성화될 수 있는 핵산 유사체인 단계, 핵산 나머지 부분이 분해되는 동안에는 핵산 복합체의 상기 서열이 뉴클레아제의 공격으로부터 보호되도록 하는 조건하에 핵산을 이 핵산을 분해시킬 수 있는 뉴클레아제에 노출시키는 단계, 및 복합체를 변성시키고 상기 서열의 잔존을 입증함으로써 복합체의 존재를 검출하는 단계를 포함하여, 샘플내 핵산 서열의 존재를 검출하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 결합된 골격 부분이 펩티드 결합된 아미노산 부분임을 특징으로 하는 방법.
  5. 제2항에 있어서, 핵산 유사체가 상보적인 서열을 갖는 핵산에 혼성화되어, 핵산 유사체에 서열이 상응하는 통상의 데옥시리보뉴클레오티드와 상기 핵산의 혼성체 보다 열에 의한 변성에 더 안정한 혼성체를 형성시킬 수 있음을 특징으로 하는 방법.
  6. 제3항에 있어서, 핵산 유사체가 이 유사체에 상보적인 서열을 갖는 한 가닥으로 나머지 한 가닥을 대체시키는 방식으로 이중 가닥 핵산에 혼성화될 수 있음을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 핵산 유사체가 하기 일반식(1)을 가짐을 특징으로 하는 방법:
    일반식(1) 상기 식에서, n은 2 이상이고, L1내지 Ln은 각각 수소, 히드록시, (C1-C4)알카노일, 천연 뉴클레오염기, 비천연 뉴클레오염기, 방향족 부분, DNA 인터칼레이터, 뉴클레오염기 결합 그룹, 헤테로고리 부분 및 리포터로 구성된 군으로부터 선택되고; C1내지 Cn은 각각 (CR6R7)y이며, 여기서, R6은 수소이고, R7은 천연 알파 아미노산의 측쇄로 구성된 군으로부터 선택되거나, R6및 R7은 각각 수소, (C2-C6)알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴, 히드록시, (C1-C6)알콕시, (C1-C6)알킬티오, NR3R4및 SR5로 구성된 군으로부터 선택되며, 여기서, R3및 R4는 각각 수소, (C1-C4)알킬, 또는 히드록시, 알콕시 또는 알킬티오 치환된 (C1-C4)알킬, 히드록시, 알콕시, 알킬티오 및 아미노로 구성된 군으로부터 선택되고, R5는 수소, (C1-C6)알킬, 히드록시 알콕시 또는 알칼티오 치환된 (C1-C6)알킬이거나, R6및 R7은 함께 지환족 또는 헤테로고리계를 형성시키고; D1-Dn은 각각 (CR6R7)Z며, 여기서, R6및 R7은 상기에 규정된 바와 같고; y 및 z는 각각 0 또는 1 내지 10의 정수이고, y+z의 합은 2 내지 10이고; G1-Gn-1은 각각 어느 한 배향에서, -NR3CO-, NR3CS-, NR3SO-, 또는 NR3SO2-이며, 여기서, R3은 상기에 규정된 바와 같고; Q는 -CO2H, -CONR'R", -SO3H 또는 -SO2NR'R", 또는 CO2H 또는 -SO3H의 활성화된 유도체이고; I는 -NR'R"이며, 여기서, R' 및 R"는 각각 수소, 알킬, 아미노보호 그룹, 리포터 리간드, 인터칼레이터, 킬레이터, 펩티드, 단백질, 탄수화물, 지질, 스테로이드, 뉴클레오시드, 뉴클레오티드, 뉴클레오티드 2인산염, 뉴클레오티드 3인산염, 올리고리보뉴클레오티드 및 올리고데옥시리보뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드, 올리고뉴클레오시드, 및 가용성 중합체로 구성된 군으로부터 선택되고; 및 A1-An및 B1-Bn은 각각, (a) A가 일반식 (11a), (11b), (11c) 또는 (11d)의 그룹이고, B가 N 또는 R3N+되거나; (b) A가 일반식 (11d)의 그룹이고, B가 CH가 되도록 선택된다:
    상기 식들에서, X는 0, S, Se, NR3, CH2또는 C(CH3)2이고; Y는 단일 결합, 0, S 또는 NR4이고; p 및 q 는 각각 0 또는 1 내지 5의 정수이고, r +s의 합은 10 이하이고; r 및 s는 각각 0 또는 1 내지 5의 정수이고, r+s의 합은 10 이하이고; R1및 R2은 각각 수소 또는 히드록시, 알콕시 또는 알킬티오 치환될 수 있는 (C1-C4) 알킬, 히드록시, 알콕시, 알킬티오, 아미노 및 할로겐으로 구성된 군으로부터 선택된다.
  8. 제1항에 있어서, 핵산 유사체가 하기 일반식 (Ⅲ), (Ⅳ) 또는 (Ⅴ)의 화합물을 포함함을 특징으로 하는 방법:
    일반식(Ⅲ)
    일반식(Ⅳ)
    일반식(Ⅴ)
    상기 식들에서, L은 각각 수소, 페닐, 헤테로고리 부분, 천연 뉴클레오염기 및 비천연 뉴클레오염기로 구성된 군으로부터 선택되고; R7은 각각 수소 및 천연 알파 아미노산의 측쇄로 구성된 군으로부터 선택되고; n은 1보다 큰 정수이고, k, I 및 m은 각각 0 또는 1내지 5의 정수이고; p는 각각 0 또는 1이고; Rh은 OH, NF2또는 -NHLysNH2이고; 및 Ri는 H 또는 -COCH3이다.
  9. 제2항에 있어서, 복합체의 존재가 전기영동에서의 복합체의 이동을 유사한 조건에서의 핵산 유사체의 이동과 비교함으로써 검출됨을 특징으로 하는 방법.
  10. 제2항에 있어서, 핵산 유사체가 하나 이상의 검출성 표지를 함유함을 특징으로 하는 방법.
  11. 서열 특이적인 방법으로 핵산에 혼성화되는 핵산 유사체를 핵산에 혼성화시킴으로써 핵산 샘플내의 핵산의 선택된 영역을 보호시키는 단계로서, 핵산 유사체가 결합된 골격 부분으로 구성된 폴리아미드, 폴리티오아미드, 폴리술핀아미드 또는 폴리술폰아미드 골격의 아자 질소 원자에 직접 또는 간접 결합된 리간드의 서열을 포함하는 중합체 가닥을 포함하며, 주로 질소 원자를 함유하는 상기 리간드가 4개 내지 8개의 간섭 원자에 의해 상기 골격내에서 서로에 대해 분리되는, 상기 핵산 서열에 혼성화될 수 있는 핵산 유사체인 단계, 샘플을 뉴클레아제에 노출시켜 선택된 영역 이외의 샘플내의 핵산을 분해시키는 단계, 형성된 핵산과 핵산 유사체의 복합체를 변성시키는 단계, 및 선택된 영역을 증폭시키는 단계를 포함하는 핵산의 증폭 방법.
  12. 핵산과 이 핵산에 서열 선택적 방식으로 혼성화되는 핵산 유사체의 복합체를 형성시킴으로써 증폭의 핵산 생성물의 선택된 영역을 보호시키는 단계로서, 핵산 유사체가 결합된 골격 부분으로 구성된 폴리아미드, 폴리티오아미드, 폴리술핀아미드 또는 폴리술폰아미드 골격의 아자 질소 원자에 직접 또는 간접 결합된 리간드의 서열을 포함하는 중합체 가닥을 포함하며, 주로 질소 원자를 함유하는 상기 리간드가 4개 내지 8개의 간섭 원자에 의해 상기 골격내에서 서로에 대해 분리되는, 상기 핵산 서열에 혼성화 될 수 있는 핵산 유사체인 단계 및 핵산을 뉴클레아제에 노출시키는 단계를 포함하여 핵산 증폭 과정의 반응 생성물을 조작하는 방법으로서, 복합체가 출발 핵산 보다 뉴클레아제에 의한 공격에 더 안정함을 특징으로 하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 보호하려는 선택된 영역이 증폭 과정의 반복에 필요한 하나 이상의 프라이머 결합 부위를 포함하지 않음을 특징으로 하는 방법.
  14. 제12항에 있어서, 핵산 유사체가 상보적인 서열을 갖는 핵산에 혼성화되어, 핵산 유사체에 서열이 상응하는 통상의 데옥시리보뉴클레오티드와 상기 핵산의 혼성체 보다 열에 의한 변성에 더 안정한 혼성체를 형성시킬 수 있음을 특징으로 하는 방법.
  15. 제12항에 있어서, 핵상 유사체가 이 유사체에 상보적인 서열을 갖는 한 가닥으로 나머지 한 가닥을 대체시키는 방식으로 이중 가닥 핵산에 혼성화될 수 있음을 특징으로 하는 방법.
  16. 제11항에 있어서, 핵산 유사체가 하기 일반식(1)을 가짐을 특징으로 하는 방법:
    일반식(1) 상기 식에서, n은 2 이상이고, L1내지 Ln은 각각 수소, 히드록시, (C1-C4)알카노일, 천연 뉴클레오염기, 비천연 뉴클레오염기, 방향족 부분, DNA 인터칼레이터, 뉴클레오염기 결합 그룹, 헤테로고리 부분 및 리포터로 구성된 군으로부터 선택되고; C1내지 Cn은 각각 (CR6R7)y이며, 여기서, R6은 수소이고, R7은 천연 알파 아미노산의 측쇄로 구성된 군으로부터 선택되거나, R6및 R7은 각각 수소, (C2-C6)알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴, 히드록시, (C1-C6)알콕시, (C1-C6)알킬티오, NR3R4및 SR5로 구성된 군으로부터 선택되며, 여기서, R3및 R4는 각각 수소, (C1-C4)알킬, 또는 히드록시, 알콕시 또는 알킬티오 치환된 (C1-C4)알킬, 히드록시, 알콕시, 알킬티오 및 아미노로 구성된 군으로부터 선택되고, R5은 수소, (C1-C6)알킬, 히드록시 알콕시 또는 알칼티오 치환된 (C1-C6)알킬이거나, R6및 R7은 함께 지환족 또는 헤테로고리계를 형성시키고; D1-Dn은 각각 (CR6R7)Z며, 여기서, R6및 R7은 상기에 규정된 바와 같고; y 및 z는 각각 0 또는 1 내지 10의 정수이고, y+z의 합은 2 내지 10이고; G1-Gn-1은 각각 어느 한 배향에서, -NR3CO-, NR3CS-, NR3SO-, 또는 NR3SO2-이며, 여기서, R3은 상기에 규정된 바와 같고; Q는 -CO2H, -CONR'R", -SO3H 또는 -SO2NR'R", 또는 CO2H 또는 -SO3H의 활성화된 유도체이고; I는 -NR'R"이며, 여기서, R' 및 R"는 각각 수소, 알킬, 아미노보호 그룹, 리포터 리간드, 인터칼레이터, 킬레이터, 펩티드, 단백질, 탄수화물, 지질, 스테로이드, 뉴클레오시드, 큐클레오티드, 뉴클레오티드 2인산염, 뉴클레오티드 3인산염, 올리고리보뉴클레오티드 및 올리고데옥시리보뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드, 올리고뉴클레오시드, 및 가용성 불용성 중합체로 구성된 군으로부터 선택되고; 및 A1-An및 B1-Bn은 각각, (a) A가 일반식 (11a), (11b), (11c) 또는 (11d)의 그룹이고, B가 N 또는 R3N+되거나; (b) A가 일반식 (11d)의 그룹이고, B가 CH가 되도록 선택된다:
    상기 식들에서, X는 0, S, Se, NR3, CH2또는 C(CH3)2이고; Y는 단일 결합, 0, S 또는 NR4이고; p 또는 q 는 각각 0 또는 1 내지 5의 정수이고, r + s의 합은 10 이하이고; r 및 s는 0 또는 1 내지 5의 정수이고, r+s의 합은 10 이하이고; R1및 R2은 각각 수소, 또는 히드록시, 알콕시 또는 알킬티오 치환될 수 있는 (C1-C4) 알킬, 히드록시, 알콕시, 알킬티오, 아미노 및 할로겐으로 구성된 군으로부터 선택된다.
  17. 제16항에 있어서, 핵산이 하기 일반식 (Ⅲ), (Ⅳ) 또는 (Ⅴ)의 화합물을 포함함을 특징으로 하는 방법:
    일반식(Ⅲ)
    일반식(Ⅳ)
    일반식(Ⅴ)
    상기 식들에서, L은 각각 수소, 페닐, 헤테로고리 부분, 천연 뉴클레오염기 및 비천연 뉴클레오염기로 구성된 군으로부터 선택되고; R7은 각각 수소 및 천연 알파 아미노산의 측쇄로 구성된 군으로부터 선택되고; n은 1보다 큰 정수이고, k, I 및 m은 각각 0 또는 1내지 5의 정수이고; p는 각각 0 또는 1이고; Rh은 OH, NF2또는 -NHLysNH2이고; 및 Ri는 H 또는 -COCH3이다.
  18. 제2항에 있어서, 핵산 유사체가 하기 일반식(1)을 가짐을 특징으로 하는 방법:
    일반식(1) 상기 식에서, n은 2 이상이고, L1내지 Ln은 각각 수소, 히드록시, (C1-C4)알카노일, 천연 뉴클레오염기, 비천연 뉴클레오염기, 방향족 부분, DNA 인터칼레이터, 뉴클레오염기 결합 그룹, 헤테로고리 부분 및 리포터로 구성된 군으로부터 선택되고; C1내지 Cn은 각각 (CR6R7)y이며, 여기서, R6은 수소이고, R7은 천연 알파 아미노산의 측쇄로 구성된 군으로부터 선택되거나, R6및 R7은 각각 수소, (C2-C6)알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴, 히드록시, (C1-C6)알콕시, (C1-C6)알킬티오, NR3R4및 SR5로 구성된 군으로부터 선택되며, 여기서, R3및 R4는 각각 수소, (C1-C4)알킬, 또는 히드록시, 알콕시 또는 알킬티오 치환된 (C1-C4)알킬, 히드록시, 알콕시, 알킬티오 및 아미노로 구성된 군으로부터 선택되고, R5는 수소, (C1-C6)알킬, 히드록시 알콕시 또는 알칼티오 치환된 (C1-C6)알킬이거나, R6및 R7은 함께 지환족 또는 헤테로고리계를 형성시키고; D1-Dn은 각각 (CR6R7)Z며, 여기서, R6및 R7은 상기에 규정된 바와 같고; y 및 z는 각각 0 또는 1 내지 10의 정수이고, y+z의 합은 2 내지 10이고; G1-Gn-1은 각각 어느 한 배향에서, -NR3CO-, NR3CS-, NR3SO-, 또는 NR3SO2-이며, 여기서, R3은 상기에 규정된 바와 같고; Q는 -CO2H, -CONR'R", -SO3H 또는 -SO2NR'R", 또는 -CO2H 또는 -SO3H의 활성화된 유도체이고; I는 -NR'R"이며, 여기서, R' 및 R"는 각각 수소, 알킬, 아미노보호 그룹, 리포터 리간드, 인터칼레이터, 킬레이터, 펩티드, 단백질, 탄수화물, 지질, 스테로이드, 뉴클레오시드, 뉴클레오티드, 뉴클레오티드 2인산염, 뉴클레오티드 3인산염, 올리고리보뉴클레오티드 및 올리고데옥시리보뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드, 올리고뉴클레오시드, 및 가용성 불용성 중합체로 구성된 군으로부터 선택되고; 및 A1-An및 B1-Bn은 각각, (a) A가 일반식 (11a), (11b), (11c) 또는 (11d)의 그룹이고, B가 N 또는 R3N+되거나; (b) A가 일반식 (11d)의 그룹이고, B가 CH가 되도록 선택된다:
    상기 식들에서, X는 0, S, Se, NR3, CH2또는 C(CH3)2이고; Y는 단일 결합, 0, S 또는 NR4이고; p 및 q 는 각각 0 또는 1 내지 5의 정수이고, r + s의 합은 10 이하이고; r 및 s는 각각 0 또는 1 내지 5의 정수이고, r+s의 합은 10 이하이고; R1및 R2은 각각 수소, 또는 히드록시, 알콕시 또는 알킬티오 치환될 수 있는 (C1-C4) 알킬, 히드록시, 알콕시, 알킬티오, 아미노 및 할로겐으로 구성된 군으로부터 선택된다.
  19. 제3항에 있어서, 핵산 유사체가 하기 일반식(1)을 가짐을 특징으로 하는 방법:
    일반식(1) 상기 식에서, n은 2 이상이고, L1내지 Ln은 각각 수소, 히드록시, (C1-C4)알카노일, 천연 뉴클레오염기, 비천연 뉴클레오염기, 방향족 부분, DNA 인터칼레이터, 뉴클레오염기 결합 그룹, 헤테로고리 부분 및 리포터로 구성된 군으로부터 선택되고; C1내지 Cn은 각각 (CR6R7)y이며, 여기서, R6은 수소이고, R7은 천연 알파 아미노산의 측쇄로 구성된 군으로부터 선택되거나, R6및 R7은 각각 수소, (C2-C6)알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴, 히드록시, (C1-C6)알콕시, (C1-C6)알킬티오, NR3R4및 SR5로 구성된 군으로부터 선택되며, 여기서, R3및 R4는 각각 수소, (C1-C4)알킬, 또는 히드록시, 알콕시 또는 알킬티오 치환된 (C1-C4)알킬, 히드록시, 알콕시, 알킬티오 및 아미노로 구성된 군으로부터 선택되고, R5는 수소, (C1-C6)알킬, 히드록시 알콕시 또는 알칼티오 치환된 (C1-C6)알킬이거나, R6및 R7은 함께 지환족 또는 헤테로고리계를 형성시키고; D1-Dn은 각각 (CR6R7)Z며, 여기서, R6및 R7은 상기에 규정된 바와 같고; y 및 z는 각각 0 또는 1 내지 10의 정수이고, y+z의 합은 2 내지 10이고; G1-Gn-1은 각각 어느 한 배향에서, -NR3CO-, NR3CS-, NR3SO-, 또는 NR3SO2-이며, 여기서, R3은 상기에 규정된 바와 같고; Q는 -CO2H, -CONR'R", -SO3H 또는 -SO2NR'R", 또는 CO2H 또는 -SO3H의 활성화된 유도체이고; I는 -NR'R"이며, 여기서, R' 및 R"는 각각 수소, 알킬, 아미노보호 그룹, 리포터 리간드, 인터칼레이터, 킬레이터, 펩티드, 단백질, 탄수화물, 지질, 스테로이드, 뉴클레오시드, 뉴클레오티드, 뉴클레오티드 2인산염, 뉴클레오티드 3인산염, 올리고리보뉴클레오티드 및 올리고데옥시리보뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드, 올리고뉴클레오시드, 및 가용성 불용성 중합체로 구성된 군으로부터 선택되고; 및 A1-An및 B1-Bn은 각각, (a) A가 일반식 (11a), (11b), (11c) 또는 (11d)의 그룹이고, B가 N 또는 R3N+되거나; (b) A가 일반식 (11d)의 그룹이고, B가 CH가 되도록 선택된다:
    상기 식들에서, X는 0, S, Se, NR3, CH2또는 C(CH3)2이고; Y는 단일 결합, 0, S 또는 NR4이고; p 및 q 는 각각 0 또는 1 내지 5의 정수이고, r + s의 합은 10 이하이고; 각각 r 및 s는 0 또는 1 내지 5의 정수이고, r+s의 합은 10 이하이고; R1및 R2은 각각 수소, 또는 히드록시, 알콕시 또는 알킬티오 치환될 수 있는 (C1-C4) 알킬, 히드록시, 알콕시, 알킬티오, 아미노 및 할로겐으로 구성된 군으로부터 선택된다.
  20. 제2항에 있어서, 핵산 유사체가 하기 일반식 (Ⅲ), (Ⅳ) 또는 (Ⅴ)의 화합물을 포함함을 특징으로 하는 방법:
    일반식(Ⅲ)
    일반식(Ⅳ)
    일반식(Ⅴ)
    상기 식들에서, L은 각각 수소, 페닐, 헤테로고리 부분, 천연 뉴클레오염기 및 비천연 뉴클레오염기로 구성된 군으로부터 선택되고; R7은 각각 수소 및 천연 알파 아미노산의 측쇄로 구성된 군으로부터 선택되고; n은 1보다 큰 정수이고, k, I 및 m은 각각 0 또는 1내지 5의 정수이고; p는 각각 0 또는 1이고; Rh은 OH, NF2또는 -NHLysNH2이고; 및 Ri는 H 또는 COCH3이다.
  21. 제3항에 있어서, 핵산 유사체가 하기 일반식 (Ⅲ), (Ⅳ) 또는 (Ⅴ)의 화합물을 포함함을 특징으로 하는 방법:
    일반식(Ⅲ)
    일반식(Ⅳ)
    일반식(Ⅴ)
    상기 식들에서, L은 각각 수소, 페닐, 헤테로고리 부분, 천연 뉴클레오염기 및 비천연 뉴클레오염기로 구성된 군으로부터 선택되고; R7은 각각 수소 및 천연 알파 아미노산의 측쇄로 구성된 군으로부터 선택되고; n은 1보다 큰 정수이고, k, I 및 m은 각각 0 또는 1내지 5의 정수이고; p는 각각 0 또는 1이고; Rh은 OH, NF2또는 -NHLysNH2이고; 및 Ri는 H 또는 COCH3이다.
  22. 제12항에 있어서, 핵산 유사체가 하기 일반식(1)을 가짐을 특징으로 하는 방법:
    일반식(1) 상기 식에서, n은 2 이상이고, L1내지 Ln은 각각 수소, 히드록시, (C1-C4)알카노일, 천연 뉴클레오염기, 비천연 뉴클레오염기, 방향족 부분, DNA 인터칼레이터, 뉴클레오염기 결합 그룹, 헤테로고리 부분 및 리포터로 구성된 군으로부터 선택되고; C1내지 Cn은 각각 (CR6R7)y이며, 여기서, R6은 수소이고, R7은 천연 알파 아미노산의 측쇄로 구성된 군으로부터 선택되거나, R6및 R7은 각각 수소, (C2-C6)알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴, 히드록시, (C1-C6)알콕시, (C1-C6)알킬티오, NR3R4및 SR5로 구성된 군으로부터 선택되며, 여기서, R3및 R4는 각각 수소, (C1-C4)알킬, 또는 히드록시, 알콕시 또는 알킬티오 치환된 (C1-C4)알킬, 히드록시, 알콕시, 알킬티오 및 아미노로 구성된 군으로부터 선택되고, R5는 수소, (C1-C6)알킬, 히드록시 알콕시 또는 알칼티오 치환된 (C1-C6)알킬이거나, R6및 R7은 함께 지환족 또는 헤테로고리계를 형성시키고; D1-Dn은 각각 (CR6R7)Z며, 여기서, R6및 R7은 상기에 규정된 바와 같고; y 및 z는 각각 0 또는 1 내지 10의 정수이고, y+z의 합은 2 내지 10이고; G1-Gn-1은 각각 어느 한 배향에서, -NR3CO-, NR3CS-, NR3SO-, 또는 NR3SO2-이며, 여기서, R3은 상기에 규정된 바와 같고; Q는 -CO2H, -CONR'R", -SO3H 또는 -SO2NR'R", 또는 CO2H 또는 -SO3H의 활성화된 유도체이고; I는 -NR'R"이며, 여기서, R' 및 R"는 각각 수소, 알킬, 아미노보호 그룹, 리포터 리간드, 인터칼레이터, 킬레이터, 펩티드, 단백질, 탄수화물, 지질, 스테로이드, 뉴클레오시드, 뉴클레오티드, 뉴클레오티드 2인산염, 뉴클레오티드 3인산염, 올리고리보뉴클레오티드 및 올리고데옥시리보뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드, 올리고뉴클레오시드, 및 가용성 불용성 중합체로 구성된 군으로부터 선택되고; 및 A1-An및 B1-Bn은 각각, (a) A가 일반식 (11a), (11b), (11c) 또는 (11d)의 그룹이고, B가 N 또는 R3N+되거나; (b) A가 일반식 (11d)의 그룹이고, B가 CH가 되도록 선택된다:
    상기 식들에서, X는 0, S, Se, NR3, CH2또는 C(CH3)2이고; Y는 단일 결합, 0, S 또는 NR4이고; p 및 q 는 각각 0 또는 1 내지 5의 정수이고, r + s의 합은 10 이하이고; r 및 s는 각각 0 또는 1 내지 5의 정수이고, r+s의 합은 10 이하이고; R1및 R2은 각각 수소 또는 히드록시, 알콕시 또는 알킬티오 치환될 수 있는 (C1-C4) 알킬, 히드록시, 알콕시, 알킬티오, 아미노 및 할로겐으로 구성된 군으로부터 선택된다.
  23. 제22항에 있어서, 핵산 유사체가 하기 일반식 (Ⅲ), (Ⅳ) 또는 (Ⅴ)의 화합물을 포함함을 특징으로 하는 방법:
    일반식(Ⅲ)
    일반식(Ⅳ)
    일반식(Ⅴ)
    상기 식들에서, L은 각각 수소, 페닐, 헤테로고리 부분, 천연 뉴클레오염기 및 비천연 뉴클레오염기로 구성된 군으로부터 선택되고; R7은 각각 수소 및 천연 알파 아미노산의 측쇄로 구성된 군으로부터 선택되고; n은 1보다 큰 정수이고, k, I 및 m은 각각 0 또는 1내지 5의 정수이고; p는 각각 0 또는 1이고; Rh은 OH, NF2또는 -NHLysNH2이고; 및 Ri는 H 또는 COCH3이다.
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Families Citing this family (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE201453T1 (de) 1995-03-04 2001-06-15 Pna Diagnostics As Modulation von bindungseigenschaften der nukleinsäure bindungspartner
JPH11511642A (ja) * 1995-06-22 1999-10-12 ダコ アクティーゼルスカブ Ｐｎａ／核酸複合体に結合し得る組換え抗体
WO1996014341A1 (en) * 1995-06-22 1996-05-17 Dako A/S Monoclonal antibody capable of binding to pna/nucleic acid complexes
US5939262A (en) 1996-07-03 1999-08-17 Ambion, Inc. Ribonuclease resistant RNA preparation and utilization
US5677124A (en) * 1996-07-03 1997-10-14 Ambion, Inc. Ribonuclease resistant viral RNA standards
US5853990A (en) 1996-07-26 1998-12-29 Edward E. Winger Real time homogeneous nucleotide assay
DE19633436A1 (de) 1996-08-20 1998-02-26 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren unter Ermittlung der Masse
US6617422B1 (en) 1997-05-23 2003-09-09 Peter Nielsen Peptide nucleic acid monomers and oligomers
WO1999034014A2 (en) * 1997-12-23 1999-07-08 Roche Diagnostics Gmbh A method for the determination of a nucleic acid
CA2318371A1 (en) * 1998-01-13 1999-07-22 Biochip Technologies Gmbh Method for the detection of nucleic acid sequences
US6441152B1 (en) * 1998-12-08 2002-08-27 Boston Probes, Inc. Methods, kits and compositions for the identification of nucleic acids electrostatically bound to matrices
AU1751400A (en) * 1998-12-08 2000-06-26 Boston Probes, Inc. Methods, kits and compositions for the identification of nucleic acids electrostatically bound to matrices
EP1192274A2 (en) * 1999-03-25 2002-04-03 Hyseq, Inc. Solution-based methods and materials for sequence analysis by hybridization
US7816098B2 (en) * 2000-01-31 2010-10-19 Sense Proteomic Limited Methods of making and using a protein array
AU2001233114A1 (en) * 2000-02-04 2001-08-14 Aeomica, Inc. Methods and apparatus for predicting, confirming, and displaying functional information derived from genomic sequence
US6962906B2 (en) * 2000-03-14 2005-11-08 Active Motif Oligonucleotide analogues, methods of synthesis and methods of use
US20040014644A1 (en) * 2000-03-14 2004-01-22 Vladimir Efimov Oligonucleotide analogues and methods of use for modulating gene expression
AU2001247414A1 (en) 2000-03-14 2001-09-24 Active Motif Oligonucleotide analogues, methods of synthesis and methods of use
GB0406864D0 (en) 2004-03-26 2004-04-28 Qiagen As Nucleic acid sequencing
US20080268451A1 (en) * 2007-03-30 2008-10-30 Bruce Seligmann Measurement of an insoluble analyte in a sample
US20100129902A1 (en) 2008-11-24 2010-05-27 Erhard Ralf Schoenbrunner Replication Stable and RNase Resistant Chimeras of Pestivirus with Insertion in 3' Nontranslated Region (3'NTR)
US20110104693A1 (en) * 2009-11-03 2011-05-05 High Throughput Genomics, Inc. QUANTITATIVE NUCLEASE PROTECTION SEQUENCING (qNPS)
CN103649335B (zh) 2011-05-04 2015-11-25 Htg分子诊断有限公司 定量核酸酶保护测定（qnpa）和测序（qnps）的改进
WO2015104684A1 (en) 2014-01-10 2015-07-16 Glaxosmithkline Intellectual Property (No.2) Limited Hydroxy formamide derivatives and their use
US10689689B2 (en) 2015-12-28 2020-06-23 Roche Molecular Systems, Inc. Generic method for the stabilization of specific RNA

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4800159A (en) * 1986-02-07 1989-01-24 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences
US5578468A (en) * 1987-08-10 1996-11-26 Duke University Site-specific RNA cleavage
US5539082A (en) * 1993-04-26 1996-07-23 Nielsen; Peter E. Peptide nucleic acids
DK51092D0 (da) * 1991-05-24 1992-04-15 Ole Buchardt Oligonucleotid-analoge betegnet pna, monomere synthoner og fremgangsmaade til fremstilling deraf samt anvendelser deraf

Also Published As

Publication number Publication date
NO962331L (no) 1996-08-06
EP0733062B1 (en) 1998-05-13
JPH09506255A (ja) 1997-06-24
DK0733062T3 (da) 1999-03-15
ATE166066T1 (de) 1998-05-15
US5861250A (en) 1999-01-19
NO317934B1 (no) 2005-01-10
DE69410291T2 (de) 1998-10-29
ES2119370T3 (es) 1998-10-01
FI111266B (fi) 2003-06-30
WO1995015974A1 (en) 1995-06-15
ZA949643B (en) 1996-06-05
AU1272995A (en) 1995-06-27
DE69410291D1 (de) 1998-06-18
IL111831A0 (en) 1995-01-24
FI962340A0 (fi) 1996-06-05
CA2177603A1 (en) 1995-06-15
NO962331D0 (no) 1996-06-05
FI962340A (fi) 1996-06-05
AU682563B2 (en) 1997-10-09
GB2285445A (en) 1995-07-12
IL111831A (en) 2000-12-06
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